Нуклеиновые кислоты были открыты в 1868 г. швейцарским ученым Ф. Мишером.
В организмах существует несколько видов нуклеиновых кислот, которые встречаются в различных органоидах клетки – ядре, митохондриях, пластидах.
К нуклеиновым кислотам относятся ДНК, и-РНК, т-РНК, р-РНК .

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК)

– линейный полимер, имеющий вид двойной спирали, образованной парой антипараллельных комплементарных (соответствующих друг другу по конфигурации) цепей. Пространственная структура молекулы ДНК была смоделирована американскими учеными Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком в 1953 г.
Мономерами ДНК являются нуклеотиды .
Каждый нуклеотид ДНК состоит из пуринового (А – аденин или Г – гуанин) или пиримидинового (Т – тимин или Ц – цитозин) азотистого основания , пятиуглеродного сахара – дезоксирибозы и фосфатной группы .
Нуклеотиды в молекуле ДНК обращены друг к другу азотистыми основаниями и объединены парами в соответствии с правилами комплементарности : напротив аденина расположен тимин, напротив гуанина – цитозин. Пара А – Т соединена двумя водородными связями, а пара Г – Ц – тремя. При репликации (удвоении) молекулы ДНК водородные связи рвутся и цепи расходятся и на каждой из них синтезируется новая цепь ДНК. Остов цепей ДНК образован сахарофосфатными остатками.
Последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК определяет ее специфичность , а также специфичность белков организма, которые кодируются этой последовательностью. Эти последовательности индивидуальны и для каждого вида организмов, и для отдельных особей.
Пример :
дана последовательность нуклеотидов ДНК: ЦГА – ТТА – ЦАА.
На информационной РНК (и-РНК) будет синтезирована цепь ГЦУ – ААУ – ГУУ, в результате чего выстроится цепочка аминокислот: аланин – аспарагин – валин.
При замене нуклеотидов в одном из триплетов или их перестановке этот триплет будет кодировать другую аминокислоту, а, следовательно изменится и белок, кодируемый данным геном. Изменения в составе нуклеотидов или их последовательности называются мутацией .

Рибонуклеиновая кислота (РНК)

– линейный полимер, состоящий из одной цепи нуклеотидов. В составе РНК тиминовый нуклеотид замещен на урациловый (У). Каждый нуклеотид РНК содержит пятиуглеродный сахар – рибозу, одно из четырех азотистых оснований и остаток фосфорной кислоты.
Синтезируются РНК в ядре. Процесс называется транскрипция - это биосинтез молекул РНК на соответствующих участках ДНК; первый этап реализации генетической информации в клетке, в процессе которого последовательность нуклеотидов ДНК «переписывается» в нуклеотидную последовательность РНК.
Молекулы РНК формируются на матрице, которой служит одна из цепей ДНК, последовательность нуклеотидов в которой определяет порядок включения рибонуклеотидов по принципу комплементарности. РНК-полимераза, продвигаясь вдоль одной из цепей ДНК, соединяет нуклеотиды в том порядке, который определен матрицей. Образовавшиеся молекулы РНК называют транскриптами .
Виды РНК.
Матричная или информационная РНК. Синтезируется в ядре при участии фермента РНК-полимеразы. Комплементарна участку ДНК, на котором происходит синтез. Ее функция – снятие информации с ДНК и передача ее к месту синтеза белка – на рибосомы. Составляет 5% РНК клетки.
Рибосомная РНК – синтезируется в ядрышке и входит в состав рибосом. Составляет 85% РНК клетки.
Транспортная РНК – транспортирует аминокислоты к месту синтеза белка. Имеет форму клеверного листа и состоит из 70-90 нуклеотидов.

Аденозинтрифосфорная кислота – АТФ

– представляет собой нуклеотид, состоящий из азотистого основания аденина, углевода рибозы и трех остатков фосфорной кислоты, в двух из которых запасается большое количество энергии. При отщеплении одного остатка фосфорной кислоты освобождается 40 кДж/моль энергии. Способность запасать такое количество энергии делает АТФ ее универсальным источником. Синтез АТФ происходит в основном в митохондриях.

Таблица. Функции нуклеотидов в клетке.

Таблица. Сравнительная характеристика ДНК и РНК.

Тематические задания.

Часть А

А1 . Мономерами ДНК и РНК являются
1) азотистые основания
2) фосфатные группы
3) аминокислоты
4) нуклеотиды

А2 . Функция информационной РНК:
1) удвоение информации
2) снятие информации с ДНК
3) транспорт аминокислот на рибосомы
4) хранение информации

А3 . Укажите вторую цепь ДНК, комплементарную первой: АТТ – ГЦЦ – ТТГ
1) УАА – ТГГ – ААЦ
3) УЦЦ – ГЦЦ – АЦГ
2) ТАА – ЦГГ – ААЦ
4) ТАА – УГГ – УУЦ

А4 . Подтверждением гипотезы, предполагающей, что ДНК является генетическим материалом клетки, служит:
1) количество нуклеотидов в молекуле
2) индивидуальность ДНК
3) соотношение азотистых оснований (А = Т, Г= Ц)
4) соотношение ДНК в гаметах и соматических клетках (1:2)

А5 . Молекула ДНК способна передавать информацию благодаря:
1) последовательности нуклеотидов
2) количеству нуклеотидов
3) способности к самоудвоению
4) спирализации молекулы

А6 . В каком случае правильно указан состав одного из нуклеотидов РНК
1) тимин – рибоза – фосфат
2) урацил – дезоксирибоза – фосфат
3) урацил – рибоза – фосфат
4) аденин – дезоксирибоза – фосфат

Часть В

В1 . Выберите признаки молекулы ДНК
1) Одноцепочная молекула
2) Нуклеотиды – АТУЦ
3) Нуклеотиды – АТГЦ
4) Углевод – рибоза
5) Углевод – дезоксирибоза
6) Способна к репликации

В2 . Выберите функции, характерные для молекул РНК эукариотических клеток
1) распределение наследственной информации
2) передача наследственной информации к месту синтеза белков
3) транспорт аминокислот к месту синтеза белков
4) инициирование репликации ДНК
5) формирование структуры рибосом
6) хранение наследственной информации

Часть С

С1 . Установление структуры ДНК позволило решить ряд проблем. Какие, по вашему мнению, это были проблемы и как они решились в результате этого открытия?
С2 . Сравните нуклеиновые кислоты по составу и свойствам.

Репликация вирусов 99

бактерий реплицируются по тета-механизму. Механизм «катящегося кольца» изучался преимущественно на стафилококковых и стрептококковых плазмидах.

4.8 Репликация вирусов

Репликация вирусов происходит в несколько стадий:

1. Адсорбция : вирус контактирует с клеткой специфическими молекулами на своей поверхности: например, ортомиксовирусы и парамиксовирусы адсорбируются с помощью гликопротеинов , а аденовирусы - с помощью пентоновых волокон . В адсорбции участвуют специфические клеточные рецепторы: гликопротеины , фосфолипиды или гликолипиды .

Адсорбция может быть нарушена антителами, связывающимися с вирусной оболочкой или самой клеткой хозяина.

2. Проникновение (пенетрация) следует сразу за адсорбцией. После этого вирусную частицу уже невозможно отделить от клетки хозяина, не повредив её. Механизмы проникновения:

а. Прямое проникновение : капсид остаётся связанным с внешней поверхностью клеточной мембраны, а его содержимое попадает внутрь клетки.

б. Слияние с мембраной. в. Эндоцитоз.

3. Разрушение оболочки происходит благодаря закислению среды эндосомы, в которой находится вирусная частица, до pH = 5. За это ответственны протонные насосы H+ -АТФазы в мембранах эндосом. Низкие значения pH приводят к изменению конформации компонентов вирусной оболочки, которые своими гидрофобными участками начинают контактировать с мембранами эндосом, это приводит к попаданию вируса в цитозоль.

4. Репликация вирусного генома становится возможной, благодаря переключению клеточных систем синтеза на репликацию и транскрипцию вируса. Для этого вирус приостанавливает синтез белка клеткой и диссоциирует полирибосомы. Некоторые вирусы не только не блокируют клеточные синтезы, но и ускоряют их.

5. Сборка вирионов.

6. Выход вирионов из клетки .

А Репликация генома ДНК-вирусов

У ДНК-вирусов животных процессы транскрипции и трансляции не сопряжены (кроме поксвирусов): транскрипция происходит в ядре, а трансляция - в цитоплазме. Вирусная ДНК служит матрицей для синтеза вирусной мРНК, которая является матрицей для синтеза вирусных белков. Вирусная ДНК содержит «ранние » и «поздние » гены, которые транскрибираются в разное время.

- «Ранние» гены кодируют белки и ферменты, необходимые для начала репликации вирусного генома.

- «Поздние» гены кодируют белки, участвующие в созревании и сборке вирусных частиц.

Репликация вирусов с дцДНК схожа с нормальной репликацией клеточной ДНК. Геном большинства таких вирусов попадает в ядро, где транскрибируется и реплицируется клеточными полимеразами. Так реплицируются, к примеру, вирусы герпеса и папилломавирусы. Однако есть два исключения:

1. Каждая часть вириона поксвирусов синтезируется и собиратся в цитоплазме. Ядро в их репликации не участвует.

2. Геном вируса гепатита B реплицируется иначе: синтезируется РНК-по- средник, а затем в ходе обратной транскрипции синтезируется ДНК на

матрице РНК.

Репликация вирусов с оцДНК тоже происходит в ядре, куда вирусная ДНК проникает после попадания в клетку. Там синтезируется вторая цепь ДНК, комплементарная вирусной. Вместе они образуют дцДНК. Далее всё происходит по вышеописанному механизму: синтез белков, репликация вирусной ДНК и сборка вирионов.

Примеры репликации у различных семейств вирусов:

1. Аденовирусы реплицируют свой геном ассиметрично: репликация начинается на 3’-конце одной из цепей с помощью белкового праймера. Растущая дочерняя цепь ДНК вытесняет одну материнскую и образует полный дуплекс с другой материнской цепью. Вытесненная цепь тоже реплицируется и образует дуплекс.

2. Герпесвирусы имеют линейный геном с терминальными повторами. После попадания в ядро эти повторы частично отщепляются и соединяются, образуя кольцевой дуплекс ДНК. Далее происходит репликация по механизму «катящегося кольца». В ходе созревания вирусной частицы кольцевая ДНК разрезается и снова становится линейной.

3. Паповавирусы имеют кольцевую ДНК, а её репликация происходит по тета-механизму (симметрично и двунаправленно).

4. Парвовирусы имеют одноцепочечную ДНК (положительную или отрицательную), поэтому их репликация начинается, когда две цепи («+» и «– ») из разных вирусных частиц формируют дуплексную спираль ДНК.

5. Поксвирусы имеют необычную двухцепочечную ДНК, концы которой связаны. Их промежуточные реплицированные ДНК, обнаруживаемые в цитоплазме, представляют собой конкатемеры, соединённые «голова-к- голове» или «хвост-к-хвосту».

6. Гепаднавирусы , как, к примеру, вирус гепатита B, используют обратную транскрипцию для репликации. Их геном состоит из частично двухцепочечной кольцевой ДНК с полной отрицательной цепью и неполной положительной. После попадания в клетку положительная цепь достраивается и транскрибируется. Транскрипты РНК становятся матрицей для синтеза ДНК в ходе обратной транскрипции с помощью вирусных ферментов.

Репликация вирусов 101

Б Репликация генома РНК-вирусов

РНК-вирусы можно разделить на 4 группы (см. Рис. 71 ▼ ):

1. Вирусы с положительной одноцепочечной РНК (оцРНК+).

2. Ретровирусы (разновидность оцРНК+).

3. Вирусы с отрицательной одноцепочечной РНК (оцРНК–).

4. Вирусы с двухцепочечной РНК (дцРНК).

Одноцепочечная РНК, способная быть матрицей в биосинтезе белка (т.е. выполнять роль мРНК), называется положительной РНК или РНК+ . Соответственно, отрицательная РНК или РНК– не способна служить матрицей в синтезе белка.

Репликация вирусов с оцРНК+. Как только вирусная оцРНК+ попадает в клетку хозяина, она сразу же транслируется на белок рибосомами. В ней закодированы белки капсида и вирусная РНК-полимераза. Непосредственно репликация вирусной оцРНК+ идёт в два этапа:

1. Сначала на матрице положительной вирусной оцРНК+ синтезируется комплементарная цепь отрицательной РНК (оцРНК– ). Этот синтез осуществляет вирусная РНК-полимераза.

2. Затем такая отрицательная РНК транскрибируется и образуются новые молекулы положительной оцРНК +. Они и участвуют в сборке вирио-

нов. Этот процесс уникален для вирусов, поскольку ни одна клетка не транскрибирует РНК с РНК.

Примером вируса с оцРНК+ является полиовирус (вирус полиомиелита). Репликация ретровирусов . Ретровирусы тоже содержат оцРНК+. Однако в от-

личие от других подобных вирусов, они не используют её в качестве мРНК. Репликация ретровирусов идёт следующим образом:

1. Обратная транскриптаза вируса, содержащаяся внутри его капсида, синтезирует ДНК на матрице оцРНК+.

2. Затем эта ДНК затем служит матрицей в синтезе новых оцРНК+ , выступающих в качестве мРНК и одновременно образующих новые вирионы.

Примером ретровируса является ВИЧ.

Репликация вирусов с оцРНК– . РНК этих вирусов не может транслироваться на белок напрямую, поскольку не узнается рибосомами. У данных вирусов репликация происходит с помощью собственной РНК-зависимой РНК-транскриптазы (находится внутри капсида и попадает в цитоплазму вместе с вирусным геномом после проникновения в клетку):

1. РНК-транскриптаза синтезирует оцРНК+ на матрице вирусной оцРНК–.

2. Синтезированная оцРНК+ выступает в роли мРНК и служит матрицей в синтезе новых оцРНК– . Последние включаются в состав вирионов.

Примерами вирусов с оцРНК– являются вирусы гриппа и бешенства. Репликация вирусов с дцРНК . Двухцепочечная РНК этих вирусов состоит из

РНК+ и РНК– цепей. Их репликация идёт по следующему сценарию:

1. После попадания в цитоплазму вирусная РНК-полимераза использует дцРНК для синтеза оцРНК+ (матрицей служит отрицательная цепь РНК). ОцРНК+ цепь выполняет роль мРНК, т.е. транслируется рибосомами на

Ниже публикуется статья лауреата Большой золотой медали им. М.В. Ломоносова 2002 г., которая написана на основе доклада, прочитанного 15 мая 2002 г. на Общем собрании Российской академии наук при вручении этой награды.

РИБОНУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
КАК ЦЕНТРАЛЬНОЕ ЗВЕНО ЖИВОЙ МАТЕРИИ

А. С. Спирин
Спирин Александр Сергеевич - академик, советник РАН.

В 30-х годах прошлого столетия моему учителю Андрею Николаевичу Белозерскому удалось поставить последнюю точку в затянувшихся спорах о принадлежности двух разных типов нуклеиновых кислот - рибонуклеиновой (РНК) и дезоксирибонуклеиновой (ДНК) - растительному или животному царствам живого мира. Тогда о генетических функциях обеих нуклеиновых кислот еще ничего не знали. Долгое время РНК считалась компонентом растений, включая грибы, а ДНК рассматривалась как типичный компонент животных клеток, как "животная нуклеиновая кислота", чаще всего называвшаяся тогда "тимонуклеиновой кислотой" (от thymus - латинского названия зобной железы, из которой ее выделяли). Затем оказалось, что РНК, наряду с ДНК, широко распространена у животных. Однако относительно наличия ДНК в растительных клетках существовали большие сомнения: прямых данных не было, а единственное косвенное указание - положительная цветная цитохимическая реакция Фейльгена, которую обнаруживали ядра растительных клеток, - не могло считаться надежным свидетельством. А.Н. Белозерским был сначала выделен и идентифицирован тимин - самый характерный компонент ДНК - из семян гороха , а затем сама ДНК была препаративно выделена из семян конского каштана . Так установилось окончательное понимание того, что и РНК, и ДНК - два универсальных типа нуклеиновых кислот, присущих всем царствам живого мира.

В 40-х годах на основе различных цитологических и биохимических наблюдений и анализов стало складываться представление, что ДНК, постоянно локализующаяся в ядрах клеток, в их хромосомах, самым тесным образом связана с аппаратом наследственности, а РНК - это обязательный компонент клеточной цитоплазмы, ответственный за биосинтез белка [ , ]. Прямые эксперименты Т.Эйвери с сотрудниками доказали, что чистая, изолированная ДНК может быть носителем наследственных признаков организма. (Более подробно об этих экспериментах, а также о составе и строении ДНК см. в обзоре ). Все большее число исследователей, в первую очередь биохимиков и цитологов, начинали склоняться к мысли, что ДНК или ее комплексы с белками могут быть основными носителями генетической информации, а РНК - посредником, воспринимающим эту информацию от ДНК и реализующим ее в виде биосинтеза белков.

К началу 50-х годов Э. Чаргафф установил факт видовой специфичности состава ДНК, показав, что соотношения четырех сортов ее мономеров - гуанилового (G), аденилового (А), цитидилового (С) и тимидилового (Т) - различаются у разных видов организмов [ , ]. Этот факт прямо соответствовал предполагавшейся генетической роли ДНК. При этом были найдены также удивительные закономерности в нуклеотидном составе ДНК, названные "правилами Чаргаффа": независимо от видовых различий, во всех ДНК количество G было равно количеству С, а количество А -количеству Т (G = С, А = Т). В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик, используя эти экспериментальные данные по химическому составу ДНК, а также результаты рентгеноструктурных анализов ориентированных нитей ДНК, указавших на спиральный характер укладки полимерных молекул ДНК [ , ], предложили модель макромолекулярной структуры ДНК . Это была двойная спираль, где две полимерные нити ДНК закручены друг относительно друга вокруг общей оси и удерживаются вместе за счет парных взаимодействий G с С и А с Т. Их догадка оказалась гениальной: непосредственно из структуры вытекал механизм ее точного воспроизведения , что впервые дало объяснение воспроизведению себе подобных структур в процессах размножения и наследственности. Так полвека назад родилась новая наука - молекулярная биология.

Естественно, что молекулярная биология началась с эры ДНК. ДНК была провозглашена "главной молекулой жизни", "нитью жизни", началом начал и основой всего живого. Белки, ранее рассматриваемые как основной компонент живых систем, теперь "увольнялись" со всех руководящих позиций и "назначались" на второстепенные роли катализаторов, обслуживающих существование ДНК. Роль другого типа нуклеиновых кислот - РНК - сводилась к функции посредников, производимых на матрицах ДНК и направляющих синтез белков. Схема "ДНК->РНК -> белок" с необратимостью процессов передачи информации, обозначаемых стрелками, получила название "центральной догмы молекулярной биологии" (подробнее см. [ ,13]).

РНК: РЕПЛИКАЦИЯ НА ДНК И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ФУНКЦИЯ

В основе воспроизведения (репликации) структуры ДНК лежит так называемый принцип комплементарности: в двойной спирали две полимерные цепи ДНК связаны бок о бок водородными связями за счет образования пар G-C, C-G, А-Т и Т-А (см. , рис. 2 и 3). Если две цепи двойной спирали расходятся, то на каждой из них может строиться (полимеризоваться) новая комплементарная цепь, так что напротив G исходной цепи установится С новой цепи, напротив С старой цепи - G новой цепи, напротив А-Т, а напротив Т-А; в результате получатся две дочерние двойные спирали, полностью идентичные исходной - материнской (см. , рис. 4).

РНК химически подобна ДНК. В обоих случаях это линейные, неразветвленные полимеры нуклеотидов с пентозо-фосфатным остовом и четырьмя типами азотистых (пуриновых и пиримидиновых) оснований в качестве боковых групп (рис. 1). Существует только два небольших отличия цепи РНК от одиночной цепи ДНК:

1) пятиуглеродный сахар (пентоза) в РНК представлен рибозой, а в ДНК - его производным 2"-дезоксирибозой;

2) один из двух пиримидиновых нуклеотидов в РНК представлен уридиловым остатком (U) вместо его метилированного производного Т в ДНК.

Тот же вышеупомянутый принцип комплемен-тарности обеспечивает механизм репликации РНК на матрице ДНК. Разница лишь в том, что РНК полимеризуется только на одной из двух разошедшихся цепей двойной спирали ДНК (рис. 2). Разумеется, при синтезе РНК напротив А цепи ДНК становится уридиловый рибонуклеотид (U) вместо тимидилового дезоксирибонуклеотида (Т) при синтезе ДНК. Реплицирующаяся цепь РНК, таким образом, является точной копией противоположной цепи ДНК, с заменой Т на U. Процесс репликации сопровождается отделением цепи РНК от ДНК. В результате такой репликации РНК образуется как гибкий одноцепочечный полимер в отличие от жесткой двойной спирали ДНК.

Будучи копиями определенных функциональных отрезков цепи ДНК - генов, цепи РНК призваны служить матрицами для синтеза другого типа полимеров - полипептидных цепей белков. Так как белки состоят из двадцати разных сортов мономеров (аминокислот), а РНК - только из четырех сортов мономеров (нуклеотидов), детерминация аминокислотной последовательности полипептидной цепи нуклеотидной последовательностью РНК требует того, чтобы каждая аминокислота кодировалась комбинацией из нескольких - не менее трех - нуклеотидов. Именно триплетный код был сначала постулирован на основании теоретических соображений, а затем и доказан экспериментально. За РНК прочно закрепилась генетическая роль посредника между генами и белками: с одной стороны, РНК представлялась как совокупность копий генов, то есть копий отрезков ДНК, а с другой - как непосредственные матрицы, последовательности нуклеотидных триплетов которых декодируются в аминокислотные последовательности полипептидных цепей в процессе синтеза белков.

Исходя из этих представлений, в 1956 г. мной, тогда аспирантом А.Н. Белозерского в Институте биохимии АН СССР, была начата работа по экспериментальной проверке соответствия ДНК и РНК. Сначала мы показали, что нуклеотидный состав (соотношение четырех сортов нуклеотидов) ДНК может очень сильно различаться у разных видов организмов, в частности у бактерий разных таксономических групп. Далее мы исходили из того, что если РНК - копия ДНК, то нуклеотидный состав этих двух типов нуклеиновых кислот должен совпадать или, по крайней мере, быть сходным. Наши анализы дали совершенно неожиданный результат: при сильных вариациях состава ДНК соотношения нуклеотидов в тотальной РНК разных видов оказались удивительно консервативны (табл.) . Вместе с тем статистический анализ этих данных показал, что имеется надежная положительная корреляция состава РНК с составом ДНК, хотя и при малой величине регрессии (рис. 3) . Данные были интерпретированы так, что на фоне основной массы эволюционно консервативной, похожей у разных видов РНК существует относительно малая фракция видоспецифической РНК, копирующей ДНК.

В 1959 г. Ф. Крик так описал этот ранний период истории молекулярной биологии:

"Проблема кодирования прошла к настоящему времени три фазы. На первой - фазе блужданий - были сделаны различные предположения, но ни одно не было достаточно точным, чтобы подвергнуться опровержению. Вторая фаза - оптимистическая - была инициирована в 1954 году Гамовым, который был достаточно смелым, чтобы предложить довольно точный код. Это стимулировало целый ряд исследователей, стремившихся показать, что его предположения неверны, и тем самым они несколько подняли точность мышления в этой области. Третья фаза - фаза замешательства - была инициирована статьей Белозерского и Спирина в 1958 году... Данные, представленные там, показывали, что наши представления по многим важным аспектам были чересчур упрощенными" .

Таким образом, в работе 1956-1958 гг. нами были получены указания на два новых обстоятельства: во-первых, на наличие в клетках основной массы РНК, не являющейся посредником между генами и белками, то есть, по-видимому, негенетической РНК, и, во-вторых, на существование ДНК-подобной - генетической - РНК в виде сравнительно небольшой фракции, которой и могла быть приписана роль посредника между генами и белками.

Несколько ранее было установлено, что ДНК-подобная РНК образуется при заражении бактерий вирусом (бактериофагом): внедрение нового генетического материала - ДНК вируса - в клетку индуцировало синтез РНК, подобной по составу вирусной ДНК и, очевидно, определяющей синтез вирусных белков . В нашей работе было впервые показано, что фракция ДНК-подобной РНК есть нормальный компонент обычных, не зараженных клеток, где она, по-видимому, выполняет функцию переноса генетической информации от своей ДНК, чтобы определять синтез своих белков. Позднее эта фракция РНК получила название messenger RNA , матричной РНК (мРНК), или информационной РНК.

Дальнейшие исследования мРНК в моей группе (с 1960 г. - лаборатории) в Институте биохимии АН СССР и переход от изучения микроорганизмов к высшим организмам привели еще к одному открытию. Оказалось, что в клетках высших организмов - животных и высших растений - мРНК в свободном виде не существует, она представлена в виде рибонуклеопротеидных частиц (мРНП-частиц), названных нами информосомами [ , ].

Этот новый тип внутриклеточных частиц характеризовался рядом уникальных физико-химических свойств, и в частности, постоянным соотношением структурного белка и мРНК со значительным преобладанием белкового компонента. Роль нуклеопротеидной формы существования мРНК в клетках высших организмов в дальнейшем изучалась многими исследователями в связи с механизмами регуляции белкового синтеза на уровне трансляции. Эти работы дали ключ к пониманию ряда молекулярных механизмов оогенеза, сперматогенеза и раннего эмбриогенеза, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эритропоэза и других процессов в жизнедеятельности многоклеточных существ, включая человека (см. обзоры [ , ]).

СТРУКТУРНАЯ РНК

После 1958 г. главные усилия моей группы были направлены на изучение консервативной, негенетической РНК, составляющей основную часть тотальной клеточной РНК. Быстро выяснилось, что преобладающая ее часть (около 90%) представляет собой компонент рибосом - внутриклеточных рибонуклеопротеидных частиц, являющихся молекулярными "фабриками" по производству белков. В серии блестящих работ английских, французских и американских исследователей [ - ] было доказано, что рибосомы и РНК рибосом сами не несут генетической информации для синтеза белков, а служат универсальным, неспецифическим аппаратом, который должен быть программирован информационной РНК (мРНК), чтобы синтезировать специфические, детерминированные соответствующими генами белки.

Первые же исследования рибосомных РНК в нашей лаборатории показали, что это - крупные макромолекулы (молекулярный вес порядка 10 6 ), каждая из которых представляет собой одну ковалентно-непрерывную полинуклеотидную цепь [ , ] в противоположность выдвинутому ранее представлению о субъединичном характере строения молекул рибосомных РНК . Несколько ранее при изучении высокополимерной биологически активной (инфекционной) РНК из вируса табачной мозаики нам удалось обнаружить ее способность к формированию вторичной и третичной структур, то есть к складыванию и сворачиванию ее полинуклеотидной цепи в структуры с ближними и дальними внутрицепными взаимодействиями [ ,30]. Подобное же поведение оказалось возможным продемонстрировать и в случае рибосомных РНК в растворе [ , ]. В совокупности исследования физико-химических свойств и структурных характеристик изолированных высокополимерных РНК в растворе, выполненные в 1958-1962 гг., привели к формулированию следующих общих принципов их пространственной организации:

РНК, в отличие от ДНК, - одноцепочечный полимер",

РНК формирует вторичную структуру - набор коротких спиральных участков - в основном за счет антипараллельного комплементарного спаривания смежных отрезков цепи;

РНК способна образовывать третичную структуру за счет дальних комплементарных взаимодействий внутри цепи и межспиральных взаимодействий;

Высокополимерная РНК способна сворачиваться в компактные частицы;

РНК обладает значительной конформационной подвижностью (рис. 4).

Принцип формирования компактных структур высокополимерными РНК получил подтверждение и дальнейшее развитие в цикле работ Института белка АН СССР, организованного мной и моими коллегами в 1967 г. в Пущине. В электронно-микроскопических исследованиях рибосомных РНК, проведенных В.Д. Васильевым совместно с сотрудниками моей лаборатории, было впервые продемонстрировано, что в соответствующих условиях РНК образуют компактные частицы, специфические по форме, в зависимости от типа РНК, и форма компактно свернутой РНК определяет общую морфологию рибосомной частицы [ , ]. Рибосома включает два типа высо-кополимерных РНК: так называемую 16S, или малую рибосомную РНК (мол. вес около 0.6 х 10 6 ), и 23S, или большую рибосомную РНК (мол. вес около 1.2 х 10 6 ). Каждая из них, совместно с рибосомными белками, входит в состав двух разных по размеру и форме рибонуклеопротеидных частиц, называемых рибосомными 30S и 50S субъединицами. Объединившись (ассоциация рибосомных субъединиц), эти две частицы образуют полную функциональную рибосому. Электронная микроскопия показала, что 16S и 23S РНК, без всяких белков, сами организуют свое сворачивание в компактные частицы специфической формы, похожие на соответствующие рибосомные субъединицы (см. , рис. 4). Отсюда следовал принципиально важный вывод о структурообразующей функции РНК. Ранее и способность к специфическому самосворачиванию в компактные глобулы, и функции структурообразования внутриклеточных частиц приписывались только белкам.

Этим наблюдениям предшествовали наши опыты по индуцированным структурным превращениям рибосом типа разворачивания рибосомных частиц в рибонуклеопротеидные тяжи без потери рибосомных белков [ , ], а также разборки и обратной самосборки рибосомных белков на ядре РНК (реконструкции рибосом) , доказавшие, что при формировании рибосомных частиц РНК служит каркасом. Изучение нейтронного рассеяния рибосом совместно с группой И.Н. Сердюка в Институте белка АН СССР (см. ) дало дополнительные физические свидетельства о взаимном расположении РНК и белков в рибосомных частицах. В целом все это позволило сформулировать три общих принципа структуры рибосом:

рибосома построена из двух неравных разделяемых субчастиц - малой и большой рибосомных субъединиц;

Две специфически самосворачиваемые высокополимерные РНК - рибосомные РНК - образуют компактные структурные ядра двух рибосомных субъединиц;

Разнообразные рибосомные белки и их группы специфически собраны на каркасе рибосомных РНК, в основном на периферии этих компактных ядер.

Рибосомы и их обе субъединицы были успешно кристаллизованы нами в Институте белка и совместной немецко-израильской группой (Г. Виттманн -ФРГ и А. Йонат - Израиль) еще в 80-х годах, после чего в нескольких лабораториях началось кристаллографическое рентгеноструктурное исследование с целью расшифровки их атомной структуры. В 1999-2001 гг. структура бактериальной рибосомы и ее субъединиц была определена с разрешением от 5.5 до 2.4 А в зависимости от объекта исследования американскими, английской и немецко-израильской группами исследователей .

Помимо информации о детальном устройстве рибосомы, полученные результаты полностью подтвердили вышеуказанные общие принципы ее структуры, и в первую очередь тот факт, что форма субъединиц определяется их компактно свернутой РНК, а рибосомные белки располагаются на периферии этих ядер. Полная рибосома - ассоциат двух разных, компактно и специфически свернутых РНК, лишь на части поверхности "декорированной" белками. Важно, что именно рибосомная РНК, как оказалось, образует главные функциональные центры рибосомы и определяет принципиальное устройство рибосомы как молекулярной машины, осуществляющей синтез белка по программе, записанной в мРНК. Вполне вероятно, что на заре жизни рибосома состояла только из РНК, а рибосомные белки - это более позднее эволюционное приобретение для стабилизации рибосомной РНК или улучшения ее функции.

ВСЕМОГУЩАЯ РНК

Способность РНК к формированию компактных трехмерных структур, как и в случае белков, дает основу для специфического взаимодействия с другими молекулами - макромолекулами и малыми лигандами. Для молекул РНК, свернутых в специфическую глобулу, благодаря чему на ее поверхности создается уникальный пространственный узор, приходится допустить возможность функции молекулярного узнавания, как и у белков. В свою очередь, высокоизбирательное узнавание приводит к возможности специфического катализа химических реакций на манер ферментативного катализа реакций белками.

Пожалуй, первыми известными "узнающими" РНК можно считать так называемые "транспортные" РНК, или тРНК, выполняющие адапторную роль в биосинтезе белка (см. , рис. 1). Эти сравнительно небольшие РНК (мол. вес около 30000) представляют собой компактно свернутые молекулы с однотипной пространственной структурой (см. , рис. 3). Их назначение - перенос аминокислот из свободного состояния в состав синтезируемой рибосомой полипептидной цепи белка. Для выполнения этой задачи тРНК должна поочередно и очень избирательно взаимодействовать с целым рядом макромолекулярных структур в клетке: сначала с белком-ферментом (аминоацил-тРНК-синтетазой), несущим определенную активированную аминокислоту, затем, неся на себе ковалентно присоединенную аминокислоту, с другим белком (фактором элонгации EF-Tu), вместе с которым она поступает в рибосому, и потом одновременно с рибосомной РНК и мРНК в рибосоме. Хотя на этом пути, несомненно, реализуются функции специфического узнавания молекулами тРНК других макромолекул, долгое время все же молчаливо принималось, что основную роль играет узнавание тРНК со стороны белков - ферментов, факторов трансляции и рибосомных белков, но не наоборот.

Английский ученый Э. Кандлифф был первым, кто четко и определенно заявил о способности структурированных участков рибосомной РНК специфически узнавать малые лиганды ненуклеиновой и небелковой природы. Он представил экспериментальные данные в пользу избирательного взаимодействия (связывания) именно участков свернутой РНК, а не белков, с рядом антибиотиков рибосомного действия - тиострептоном, эритромицином, аминогликозидами (стрептомицином, канамицином, неомицином) . Через 10 лет другими учеными были представлены прямые структурные данные о специфическом связывании аминогликозидных антибиотиков районом малой (16S) рибосомной РНК (см. также обзор ).

Окончательное признание за РНК способности узнавать самые разнообразные молекулы и весьма специфично взаимодействовать с ними пришло благодаря аптамерам - небольшим по размерам синтетическим РНК, получаемым путем отбора из многих вариантов нуклеотидных последовательностей с помощью процедур так называемой "бесклеточной эволюции", "эволюции в пробирке" [ , ]. Оказалось, что можно отобрать и размножить РНК, обладающие способностью избирательно связывать практически любой вид молекул, начиная от низкомолекулярных органических соединений и кончая различными индивидуальными пептидами и белками (см. обзоры [ , ]). Другими словами, РНК, как и белки, действительно в полной мере могут обладать функцией специфического молекулярного узнавания.

Еще до этих исследований, в начале 80-х годов прошлого века, в лабораториях Т. Чека и С. Олтмана в США было сделано сенсационное открытие, осуществившее революцию в биохимии и молекулярной биологии: было показано, что РНК может быть специфическим катализатором биохимических реакций [ ,47]. В течение всей предшествующей истории биохимии на протяжении десятилетий утверждалось, что биохимический катализ - "прерогатива" исключительно белков-ферментов. Поэтому и все теории происхождения жизни вынуждены были исходить из первичности белков как макромолекул, абсолютно необходимых для возникновения биохимического метаболизма (обмена веществ). Открытие каталитической функции РНК перевернуло все прежние представления об исключительной роли белков не только в возникновении жизни, но и в понимании самого явления жизни.

По аналогии с белками-ферментами - энзимами - каталитические РНК были названы рибозимами. По-видимому, почти все рибозимы, естественно существующие в живой природе в клетках современных организмов, так или иначе участвуют в процессах, связанных с превращениями полинуклеотидных цепей самих РНК. Однако оказалось возможным создавать и искусственные рибозимы с более широким спектром катализируемых реакций . Кроме того, как выясняется из всей совокупности данных по структуре рибосом и особенностей катализируемой рибосомой реакции образования пептидных связей в процессе биосинтеза белка, каталитический центр этой реакции (пептидил-трансферазный центр рибосомы) формируется определенным доменом большой рибосомной РНК, без принципиального участия рибосомных белков, то есть имеет рибозимную природу [ ,50].

Итак, именно после открытия каталитической функции РНК поменялась парадигма, и взоры биологов обратились к РНК. В самом деле, молекулы РНК способны делать все то, что делают белки: складываться в специфические структуры и определять формообразование биологических частиц, с большой точностью узнавать другие макромолекулы и малые лиганды и взаимодействовать с ними, наконец, осуществлять катализ ковалентных превращений узнаваемых молекул. Конечно, белки делают все это более эффективно и разносторонне, чем РНК. Но зато белки в принципе "не умеют" самовоспроизводиться - не существует никаких собственных белковых механизмов для воспроизведения их структуры, кроме как через РНК. В то же время РНК содержит все необходимые структурные предпосылки для точного воспроизведения ее собственной структуры.

РНК - близкий аналог ДНК, современного "вещества наследственности". Структурно ничто не мешает ей образовывать двойные спирали по типу ДНК, с полным соблюдением принципа комплементарности за счет формирования пар G-C, C-G, A-U и U-A между двумя полирибонуклеотидными цепями. В таком случае и воспроизведение (репликация) РНК на РНК представляется вполне разрешенным процессом. Действительно, хорошо известно, что двойные спирали РНК существуют в природе, и в первую очередь - в качестве самостоятельных РНК-геномов у некоторых вирусов (например, реовирусов и ротавирусов животных и человека). Вообще геномы в виде РНК, а не ДНК довольно распространены среди вирусов как животных, так и растений, а также бактериальных вирусов (бактериофагов), но в подавляющем большинстве случаев их геномная РНК представлена одной цепью РНК, на которой лишь после попадания вируса в клетку строится комплементарная цепь.

Так или иначе, вирусология давно доказала наличие таких же генетических репликативных функций у РНК, какие свойственны ДНК в клеточных организмах.

По-видимому, современные клеточные организмы не могли бы существовать без генетического "единоначалия" ДНК, и на самостоятельное воспроизведение РНК эволюцией был наложен строгий запрет, иначе происходила бы дерегуляция генной активности в организмах, нарушение контролируемого генами баланса продуктов и процессов в клетке и полная дезорганизация жизни. Тем не менее репликация РНК на РНК в специальных случаях может осуществляться в нормальных клетках. Об этом свидетельствуют самые последние открытия новых классов малых негенетических РНК в клетках животных и растений - так называемых интерферирующих РНК (siRNA) и микpoPHK (miRNA) - с регуляторной и антивирусной активностью: функционирование и воспроизведение этих РНК требует их самостоятельной репликации .

МИР РНК - ДРЕВНИЙ И СОВРЕМЕННЫЙ

Таким образом, РНК представляется наиболее самодостаточным веществом живой материи. Она принципиально способна выполнять все или почти все функции, которые свойственны белкам, включая формообразование и биохимический катализ, и в то же время может быть полноценным генетическим веществом с его репли-кативной и кодирующей функциями . Осознание этих фактов и привело биологов, химиков и геологов к гипотезе о древнем "мире РНК", который эволюционно предшествовал нашей нынешней ДНК-РНК-белковой жизни (подробнее см. ). В мире РНК не было ни белков, ни ДНК, а лишь ансамбли различных молекул РНК, выполняющих разные вышеперечисленные функции. Это были, скорее всего, бесклеточные системы. Формирование клеточных структур, безусловно, требует участия, по крайней мере, белков и липидов, которых еще не было. Компартментализация ансамблей РНК в виде коацерватных капель также была маловероятна, по причине отсутствия полипептидов, полисахаридов и других полимеров, способных к коацервации. Тем не менее, для того чтобы каждый ансамбль РНК мог существовать как система, наследовать приобретенные признаки, полезные для всей системы, и эволюционировать, его РНК-репликазы, лиганд-связывющие РНК, РНК-синтетазы и продукты синтезов должны быть, очевидно, как-то объединены в пространстве. Поэтому в большинстве теорий происхождения жизни возникновение ограничивающих мембран или хотя бы поверхностей раздела фаз постулируется необходимым условием начала эволюции, в том числе эволюции ансамблей РНК (например, см. ).

Возможна, однако, и альтернатива, на мой взгляд, даже более вероятная. Около десяти лет назад в Институте белка РАН моим учеником А.Б. Четвериным с сотрудниками была экспериментально показана способность молекул РНК формировать молекулярные колонии на гелях или других твердых средах, если на этих средах им были предоставлены условия для репликации [ ,55] (рис. 5). Смешанные колонии РНК на твердых или полутвердых поверхностях и могли быть первыми эволюционирующими бесклеточными ансамблями, где одни молекулы выполняли генетические функции (репликацию молекул РНК всего ансамбля), а другие формировали необходимые для успешного существования структуры (например, такие, которые адсорбировали нужные вещества из окружающей среды) или были рибозимами, ответственными за синтез и подготовку субстратов для синтеза РНК. Такая бесклеточная ситуация создавала условия для очень быстрой эволюции: колонии РНК не были отгорожены от внешней среды и могли легко обмениваться своими молекулами - своим генетическим материалом. Легкое распространение молекул РНК через среду, в том числе атмосферную, также было продемонстрировано в прямых экспериментах . Более того, как показали недавние эксперименты той же группы исследователей, молекулы РНК при столкновениях в водной среде могут спонтанно обмениваться кусками, то есть обладают способностью к неэнзиматической рекомбинации .

Рис. 5. Колонии реплицирующихся молекул РНК на агарозном геле [ , ]
Слева - колонии РНК, выросшие на закрытой чашке Петри
в течение одного часа при температуре 25°С.
Справа - колонии РНК выросшие на открытой чашке Петри в тех же условиях
(заражение молекулами РНК из воздуха)

Именно такие условия постулировал К. Вуз для возникновения Универсального Предшественника живых существ на Земле : высокий уровень мутаций (ошибок репликации) из-за примитивности и несовершенства механизмов репликации генетического материала, свободный обмен генетическим материалом между предшественниками клеток - "прогенотами" - и коммунальный характер бытия этих предшественников, когда любые продукты и инновации одних становились достоянием всех ("от каждого по способностям - каждому по потребностям"). Однако, в отличие от гипотезы К. Вуза, я бы предпочел отдать роль Универсального Предшественника доклеточной - бесклеточной - форме существования мира РНК, когда еще не было ни ДНК, ни механизмов синтеза белка. Универсальным Предшественником могло быть как раз коммунальное сообщество колоний-ансамблей РНК, существующих и размножающихся на твердых или гелеобразных поверхностях первобытной Земли, не ограниченных физически никакими мембранами и фазовыми разделами и потому свободно обменивающихся как генетическим материалом, так и продуктами катализируемых реакций.

Эта коммунальная форма существования мира РНК - своего рода Солярис, - как уже указывалось, должна была очень быстро эволюционировать. Во всяком случае, весь путь эволюции до индивидуальных организмов с клеточной структурой, ДНК и современным аппаратом белкового синтеза был пройден, по-видимому, менее чем за полмиллиарда лет (период от 4 млрд. до 3.5 млрд. лет назад). Совершенствование колоний-ансамблей РНК за счет естественного отбора должно было происходить в направлении как улучшения каталитических механизмов, так и увеличения точности репликации и наследования. Колонии РНК, "научившиеся" делать белковые катализаторы, естественно, приобретали громадное преимущество перед другими в скоростях и качестве катализируемых реакций и потому быстро вытесняли "неумелых" - как за счет конкуренции, так и за счет передачи им этой способности. На базе РНК появлялся и совершенствовался аппарат белкового синтеза, а ввиду коммунального и пандемического характера мира РНК вырабатывался универсальный генетический код.

Однако кодируемый синтез белков требовал повышенной точности репликации генетического материала и упорядочивания продукции разных белков. Это привело к необходимости дифференциации части РНК (генетической РНК) и ее модификации в ДНК, обладающей способностью к более точному копированию, а к тому же и существенно большей химической стабильностью, чем РНК. Наконец, эффективность и устойчивость таких систем могла быть значительно повышена за счет их обособления от окружающей среды, и они окружаются мембранами белково-липидной природы. Коммунальный мир распадается на индивидуальные, но высоко эффективные ячейки - клетки, особи, организмы, и начинается их собственная эволюция и собственные родословные. Из коммунального Универсального Предшественника выходят две основные ветви микроорганизмов - бактерии (эубактерии) и ар-хеи (архебактерии), формируются их клеточные сообщества на основе взаимодействия их метаболизмов, а затем их симбиотические отношения приводят к появлению химер, и возникают первые эукарии - предшественники высших эукариотических организмов.

Что же стало с миром РНК после распада коммуны? Хотя коммуна распалась, мир РНК сохранился в каждой клетке каждого живого организма. Основой современной жизни является наследуемый биосинтез белков, который определяет все признаки ныне существующих живых организмов. В качестве центрального звена этого процесса биосинтеза белков выступает совокупность взаимодействующих друг с другом молекул РНК различных типов, прежде всего рибосомной РНК, формирующей аппарат белкового синтеза, тРНК, доставляющей в рибосому активированные аминокислоты для построения полипептид-ных цепей белков, и мРНК, несущей в своей нук-леотидной последовательности программу для синтеза белка (см. , рис. 1). Кроме этих трех основных представителей внутриклеточного мира РНК, обнаружен целый ряд минорных РНК, обеспечивающих процессы редупликации ДНК и наследования, копирования генов и формирова-

ния мРНК, регуляции синтеза белков, транспорта белков через мембраны, регуляции эмбриогенеза и клеточной дифференцировки, детерминации продолжительности жизни, и так далее. Каждый год открываются все новые виды минорных РНК в клетках современных организмов, выявляется их важнейшая роль в жизни организмов .

Еще до недавнего времени мы очень мало знали о внутриклеточном мире РНК, и сейчас происходит серьезная переоценка относительного вклада негенетических РНК в функционирование живых систем. Можно сказать, что совокупность молекул РНК - мир РНК - по-прежнему составляет ядро жизни. Современная жизнь - это РНК. передавшая часть своих генетических функций рожденному ею же родственному полимеру - ДНК, и синтезирующая белки для всеобъемлющего эффективного функционирования содержащих ее компартментов - клеток и многоклеточного организмов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kiesel A., Belozersky A. Uber die Nucleinsaure und die Nucleoproteide der Erbsenkeime // Hoppe-Seyler"s Z. physiol. Chemie. 1934. Bd. 229. H. 4-6. S. 160-166.

2. Белозерский A .H., Дубровская И.И. О белках и тимонуклеиновой кислоте семян конского каштана // Биохимия. 1936. Т. 1. С. 665-675.

3. Caspersson Т., Landstrom-Hyden H., Aquilonius L. Cytoplasmanukieotide in eiweissproduzierenden Drusenzellen//Chromosoma. 1941. Bd. 2. S. Ill-131.

4. Bracket J. La detection histochimique et le microdosage des acides pentosenucleiques // Enzymologia. 1941-1942, V. 10. P. 87-96.

5. Avery О.Т., MacLeod CM., McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types // J. Exp. Med. 1944. V. 78. P. 137-158.

6. Спирин А.С. Современная биология и биологическая безопасность // Вестник РАН. 1997. № 7.

7. Chargaff E. Chemical specificity of nucleic acids and mechanism of their enzymatic degradation // Experientia. 1950. V. 6. P. 201-209.

8. Chargaff E. Structure and function of nucleic acids as cell constituents // Federation Proc. 1951. V. 10. P. 654-659.

9. Wilkins M.F.H., Stokes A.R., Wilson H.R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids // Nature. 1953. V. 171. P. 738-740.

10. Franklin R.E., Gosling R.G. Molecular configuration in sodium thymonucleate // Nature. 1953. V. 171. P. 740-741.

11. Watson J. D., Crick F. H. C. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid // Nature. 1953. V. 171. P. 737-738.

12. Watson J. D., Crick F. H. C. Genetic implications of the structure of desoxyribose nucleic acid // Nature. 1953. V. 171. P. 964-967.

13. Спирин А.С. Биосинтез белков, мир РНК и происхождение жизни // Вестник РАН. 2001. № 4.

14. Спирин А.С., Белозерский А.Н., Шугаева Н.В., Ванюшин Б.Ф. Изучение видовой специфичности нуклеиновых кислот у бактерий // Биохимия. 1957. Т. 22. С. 744-754.

15. Belozersky A.N., Spirin A.S. A correlation between the compositions of the desoxyribonucleic and ribonucleic acids//Nature. 1958. V. 182. P. 111-112.

16. Crick F.H.C. The present position of the coding problem // Brookhaven Symposia in Biology. 1959. № 12. P. 35-39.

17. Volkin E., Astrachan L. Phosphorus incorporation in Escherichia coli ribonucleic acid after infection with bacteriophage T2 //Virology. 1956. V. 2. P. 149-161.

18. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins // J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 318-356.

19. Спирин А.С., Белицина Н.В., Айтхожин М.А. Информационные РНК в раннем эмбриогенезе // Журнал общей биологии. 1964. Т. 25. С. 321-338.

20. Spirin A.S. Informosomes //European J. Biochem. 1969. V. 10. P. 20-35.

21. Spirin A.S. On "masked" forms of messenger RNA in early embryogenesis and in other differentiating systems // Current Topics in Developmental Biology. 1966. V. 1. P. 1-38.

22. Spirin A.S. Masked and translatable messenger ribonucleoproteins in higher eukaryotes // Translational Control / Eds. Hershey J.W.B., Mathews M.B., Sonenberg N., N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996. P. 319-334.

23. Brenner S., Jacob F., Meselson M. An unstable intermediate carrying information from genes to ribosomes for protein synthesis//Nature. 1961. V. 190. P. 576-581.

24. Gros F., Gilbert W., Hiatt H. et al. Unstable ribonucleic acid revealed by pulse labeling of Escherichia coli // Nature. 1961. V. 190. P. 581-585.

25. Spiegelman S. The relation of informational RNA to DNA // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1961. V. 26. P. 75-90.

26. Богданова E.G., ГавриловаЛ.П.,Дворкин Г.А., Киселев Н.А., Спирин А.С. Изучение макромолеку-лярной структуры высокополимерной (рибосо-мальной) рибонуклеиновой кислоты из Escherichia coli // Биохимия. 1962. Т. 27. С. 387-402.

27. Spirin A.S. Some aspects of macromolecular structure of high-polymer RNA in solution // Acides ribonucleiques et polyphosphates: Structure, synthese et functions / Eds. Ebel J.P., Grunberg-Manago M. Paris: Editions du CNRS, 1962. P. 73-87.

28. Hall B.D., Doty P. The preparation and physical chemical properties of ribonucleic acid from microsomal particles // J. Mol. Biol. 1959. V. 1. P. 111-126.

29. Спирин А.С., ГавриловаЛ.П., Бреслер С.Е., Мосевицкий М.И. Изучение макромолекулярной структуры инфекционной рибонуклеиновой кислоты из вируса табачной мозаики // Биохимия. 1959. Т. 24. С. 938-947.

30. Spirin A.S. On macromolecular structure of native high-polymer ribonucleic acid in solution // J. Mol. Biol. 1960. V. 2. P. 436-446.

31. Vasiliev V.D., Selivanova O.M., Koteliansky V.E. Specific self-packing of the ribosomal 16S RNA // FEBS Letters. 1978. V. 95. P. 273-276.

32. Vasiliev V.D., Serdyuk I.N., Gudkov А.Т., Spirin A.S. Self-organization of ribosomal RNA // Structure, Function, and Genetics of Ribosomes / Eds. Hardesty B., KramerG. N.Y.: Springer-Verlag, 1986. P. 128-142.

33. Спирин А.С., Киселев Н.А., Шакулов Р.С., Богданов А.А. Изучение структуры рибосом: Обратимое разворачивание рибосомных частиц в рибо-нуклеопротеидные тяжи и модель укладки // Биохимия. 1963. Т. 28. С. 920-930.

34. Lerman M.I., Spirin A.S., Gavrilova L.P., Golov V.F. Studies on the structure of ribosomes: II. Stepwise dissociation of protein from ribosomes by caesium chloride and the re-assembly of ribosome-like particles // J. Mol. Biol. 1966. V. 15. P. 268-281.

35. Gavrilova L.P., lvanov DA., Spirin A.S. Studies on the structure of ribosomes: III. Stepwise unfolding of the 50S particles without loss of ribosomal protein // J. Mol. Biol. 1966. V. 16. P. 473-489.

36. Wimberly B.T., Brodersen D.E., Clemons W.M. et al. Structure of the 30S ribosomal subunit // Nature. 2000. V. 407. P. 327-339.

37. Schlunzen F., Tocilj A., Zarivach R. et al. Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 angstroms resolution // Cell. 2000. V. 102. P. 615-623.

38. Ban N., Nissen P., Hansen J. et al. Editions du CNRS, The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 E resolution // Science. 2000. V. 289. P. 905-920.

39. Yusupov MM., Yusupova G.Zh., Baucom A. et al. Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution // Science. 2001. V. 292. P. 883-896.

40. Cundliffe E. Involvement of specific portions of ribosomal RNA in defined ribosomal functions: A study utilizing antibiotics // Structure, Function, and Genetics of Ribosomes / Eds. Hardesty B., Kramer G. N.Y.: Springer-Verlag, 1986. P. 586-604.

41. Fourmy D., Recht M.I., Blanchard S.C., Puglisi J.D. Structure of the A site of E. coli 16S rRNA complexed with an aminoglycoside antibiotic // Science. 1996. V. 274. P. 1364-1371.

42. Puglisi J.D., Williamson J.R. RNA interaction with small ligands and peptides // The RNA World, Second Edition / Eds. Gesteland R.F., Cech T.R., Atkins J.F. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. P. 403^25.

43. Ellington A., SzostakJ. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands // Nature. 1990. V. 346. P. 818-822.

44. Tuerk С., Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment // Science. 1990. V. 249. P. 505-510.

45. GoldL., Polisky B., Uhlenbeck 0., Yarus M. Diversity of oligonucleotide functions // Annual Review Biochem. 1995. V. 64. P. 763-797.

46. Kruger К., Grahowski P.J., Zaug A.J. et al. Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahyrnena // Cell. 1982. V. 31. P. 147-157.

47. Guerrier-Takada С., Gardiner К., March Т. et al. The RNA moiety of ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme // Cell. 1983. V. 35. P. 849-857.

48. Cech T.R., Golden B.L. Building a catalytic active site using only RNA // The RNA World. Sec. Ed./Eds. Gesteland R.F., Cech T.R., Atkins J.F. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. P. 321-347.

49. Noller H.F., Hoffarth V., Zimniak L. Unusual resistance of peptidyl transferase to protein extraction methods // Science. 1992. V. 256. P. 1416-1419.

50. Nissen P., Hansen J., Ban N. et al. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis // Science. 2000. V. 289. P. 920-930.

51. Ahlquist P. RNA-dependent RNA polymerase, viruses, and RNA silencing // Science. 2002. V. 296. P. 1270-1273.

52. Gilbert W. The RNA world // Nature. 1986. V. 319. P. 618.

53. Gilbert W., de Souza SJ. Introns and the RNA world // The RNA World. Sec. Ed./Eds. Gesteland R.F., Cech T.R., Atkins J.F. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. P. 221-231.

54. Chetverin A.B., Chetverina H.V., Munishkin A.V. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Q{3 replicase // J. Mol. Biol. 1991. V. 222. P. 3-9.

55. Chetverina H.V., Chetverin A.B. Cloning of RNA molecules in vitro // Nucleic Acids Research. 1993. V. 21. P. 2349-2353.

56. Chetverina H.V., Demidenko А.А., Ugarov V.I., Chetverin A.B. Spontaneous rearrangements in RNA sequences // FEBS Letters. 1999. V. 450. P. 89-94.

57. Woese C.R. The universal ancestor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 6854-6859.

58. Storz G. An expanding universe of non-coding RNAs // Science. 2002. V. 296. P. 1260-1263.

Текущая страница: 5 (всего у книги 45 страниц) [доступный отрывок для чтения: 11 страниц]

Шрифт:

100% +

Cis-аcting сигналы и специфичность репликации. Репликация и упаковка вирусных РНК являются удивительно специфичными процессами. Оба этих процесса безошибочно выбирают правильные вирусные молекулы из числа тысяч рибонуклеиновых кислот, содержащихся в клетке. Это в основном связано с присутствием сis-аcting сигналов, которые селективно определяют репликацию вирусных РНК и сборку вирионов, но в большинстве РНК-геномов вируса эти сигналы до конца ясно не идентифицированы.

Сигналы, которые были охарактеризованы, включают не линейные нуклеотидные последовательности, а вторичные структуры в виде петель, тРНК-подобных структур и псевдоузлов, которые создают специфические трехмерные молекулярные формы, способные взаимодействовать только с вирусными ферментами и структурными белками вируса. Однако понимание молекулярных основ специфичности репликации РНК и сборки вирионов ограничено недостатком знаний трехмерных структур вирусной РНК и ее действующих сis-аcting сигналов.

Структурные и неструктурные белки вирусов. По определению, вирусоспецифические структурные белки включены в вирусные частицы, а неструктурные белки найдены только в инфицированных клетках. Однако вирусы с негативным, амбиполярным и двунитевыми РНК-геномами включают в потомство вирионов RdRp и ассоциированные ферменты и поэтому кодируют преимущественно или исключительно структурные белки. В дополнение к полимеразе, кодируемые вирусом ферменты часто включают одну или несколько протеаз, РНК-хеликазу, гуанилил– и метилтрансферазы, поли-А-полимеразу, иногда нуклеазу, а в случае ретровирусов – ДНК-интегразу. В тоже время, для нескольких РНК-вирусов установлено участие в репликативном цикле ферментов клетки-хозяина.

Протеазы расщепляют продукт первичной трансляции, частью которого они являются, в высоко определенных последовательностях (сайтах). В некоторых клетках, инфицированных пикорнавирусами, они также выборочно запрещают синтез белка клетки-хозяина путем протеолиза клеточного кэп-связывающего белка. Хеликазы необходимы большим РНК-содержащим вирусам для разрушения внутримолекулярного спаривания оснований в течение синтеза РНК, хотя некоторые RdRp способны расплетать дуплексы РНК без ее помощи. Гуанилил– и метилтрасферазы строят 5’-кэп на мРНК почти у всех РНК-вирусов эукариот, кроме пикорнавирусов, РНК которых не кэпирована, и ортомиксо– и буньявирусов, которые крадут кэп у клеточных мРНК посредством кэп-специфической эндонуклеазы. На 3’-конце мРНК большинства вирусов животных находится поли-А трек, а у РНК-вирусов растений, как правило, тРНК-подобная структура. Полиаденилирование обычно происходит в результате побочной реакции (пробуксовывания) вирусной RdRp, а не в результате работы поли-А-полимеразы, как у поксвирусов.

Белки клетки-хозяина. Существенную роль в репликации РНК-содержащих вирусов могут играть белки клетки-хозяина. Следует отметить, что в различных вирусных системах в этот процесс вовлечены различные клеточные белки. Самым ярким примером является РНК-репликаза бактериофагов Qb и MS2, у которых, в дополнение к единственному фагоспецифическому полипептиду для обеспечения полимеразной активности необходимо четыре клеточных субъединицы: рибосомальный белок S1 E.coli , два фактора элонгации трансляции и РНК-связывающий белок. У некоторых вирусов эукариот в репликацию РНК также могут быть вовлечены факторы трансляции хозяина. Например, у бромовирусов (вирусы растений) субъединица инициирующего фактора eIF-3 связывается с RdRp и увеличивает ее активность. В инфицированных клетках несколько других белков хозяина взаимодействуют с концевыми нуклеотидными последовательностями вирусных РНК. Среди них – поли-A– и полипиримидин-связывающие белки, карлетикулин и белки Ro и L, взаимодействующие с малыми ядерными РНК. Хотя следует отметить, что отличить случайные взаимодействия от тех, которые играют функциональные роли, часто затруднительно.

Мембраны клетки-хозяина. В отличие от фаговых репликаз, RdRp вирусов эукариот неизменно связана с надмолекулярными структурами: мембранами клеткихозяина у (+)РНК-вирусов, нуклеокапсидом у (-)РНК-вирусов и субвирусными частицами у днРНК-вирусов. Внутриклеточные мембраны клеток, инфицированных вирусами с (+)РНК-геномом, подвергаются быстрому перераспределению, формируя места заякоривания вирусных репликативных комплексов. Когда эти комплексы отсоединяются от мембран, они теряют способность катализировать истинную репликацию РНК, хотя часто сохраняют ограниченную способность копировать РНК-матрицу. При изучении нодавирусной инфекции истинная РНК-репликазная активность частично очищенной RdRp была восстановлена путем добавления к бесклеточному экстракту глицеролфосфолипидов. Эти результаты подтвердили идею, что мембранная организация играет центральную роль в репликации (+)РНК. То же самое заключение получено при ингибировании репликации РНК полиовируса брефелдином А, который блокирует внутриклеточные мембранные взаимодействия. Хотя определенная роль мембран неясна, вероятно, они могут ускорять сборку репликативных комплексов, сокращая время процесса и отделяя дочерние молекулы от матриц.

Механизмы репликации РНК-геномов. Как уже отмечалось, репликация РНК-геномов осуществляется вирусоспецифической RdRp, которая может входить в состав вириона или детерминироваться геномом. В отличие от ферментов, которые копируют ДНК с использованием затравки, большинство RdRp могут начать синтез РНК de novo . Исключением является RdRp пикорнавирусов, которая для инициирования синтеза использует маленький вирусный белок (VPg), ковалентно связанный с урацилом. VPg удаляется при трансляции генома, но сохраняется при его инкапсидации.

Интересно, что у тогавирусов (вирус Синдбис), репликация (+)РНК на стадии синтеза минус-нити (образование РФ) осуществляется только переходной версией RdRp, которая впоследствии протеолитически процессируется, что переключает матричную специфику RdRp на синтез положительных нитей.

Репликациция (+)РНК полиовирусов .

Полиовирусы – мелкие (27 нм) безоболочечные икосаэдрические вирусы, поражающие позвоночных. Геном – линейная однонитевая РНК позитивной полярности. На 5"-конце РНК ковалентно связана с терминальным геномным белком через остаток тирозина, 3"-конец полиаденилирован (рисунок 8).

Репликацию/транскрипцию генома осуществляет РНК-полимераза, детерминированная 3"-концом генома, который транслируется сразу после попадания вируса в клетку. На первой стадии репликации происходит образование двухнитевой РФ за счет синтеза минус-нити, инициированного присоединением молекулы урацила к 3"-поли-А концу.

Рисунок 8 – Схема репликации РНК полиовирусов

Кроме РНК-полимеразы в клетке синтезируется вирус-специфический терминальный низкомолекулярный белок (VPg), который через тирозин связывается с молекулой урацила. Данная структура используется РНК-полимеразой в качестве затравки – то есть происходит терминальная инициация с использованием нуклеотидбелковой затравки. Синтез идет с вытеснением цепи. Образующиеся молекулы (+)РНК до накопления достаточного количества вирусоспецифических белков используются как мРНК, после чего они начинают инкапсидироваться в вирусную частицу.

Следует отметить, что представленная схема репликации геномной (+)РНК полиовирусов не является универсальной. Вирусные (+)РНК-геномы различаются организацией 5"– и 3"-концевых структур, что определяет особенности их репликации, связанные с инициацией синтеза.

Репликациция (-)РНК-геномов .

Вирусные (-)РНК-геномы могут быть непрерывными или сегментированными. Во всех случаях РНК находится в составе рибонуклеопротеина, что и определяет особенности ее репликации, поскольку депротеинизированная РНК не может служить матрицей для полимеразы. Все вирусы с (-)РНК-геномом имеют собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу, входящую в состав РНП. Для получения полноразмерного генома должна быть синтезирована репликативная полноразмерная плюс-нить. Однако на первом этапе репродуктивного цикла геномная (-)РНК служит матрицей для транскрипции, которая протекает с последующим процессингом мРНК, и не может служить матрицей для синтеза полноразмерной копии. Синтез репликативной полноразмерной (+)РНК начинается только после накопления соответствующих вирусных белков, подавляющих преждевременную терминацию РНК на внутренних участках матрицы. Каким образом это происходит, остается пока неизвестным. Синтез антигеномной и геномной РНК происходит в составе РНП.

Репликациция днРНК реовирусов .

Реовирусы – двукапсидные (60-75 нм) частицы с икосаэдрическим типом симметрии, инфицируют позвоночных, беспозвоночных, растения. Геном состоит из 10-12 фрагментов днРНК.

Репликация днРНК неразрывно связана с транскрипцией, которая является ее первой стадией.

1 Синтез (+)РНК на двухнитевой матрице протекает по консервативному типу без вытеснения цепи и происходит в составе однокапсидной вирусной частицы при участии белков кора – вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP2) и гуанидилтрансферазы (VP3). мРНК покидают частицу через поры внутреннего капсида.

2 Плюс-нити РНК объединяются с вновь синтезированными белками кора и неструктурными (NS) белками. При созревании вириона РНК-полимераза осуществляет синтез минус-нитей на матрице (+)РНК по репарационному механизму, затягивая ее внутрь формирующегося капсида. Сформированная однокапсидная частица может снова начать синтез плюс-нитей РНК.

Как и в случае полиовирусов, представленный способ репликации генома реовирусов не является универсальным для вирусов с днРНК геномом. Например, у фага φб синтез плюс-нитей на родительском дуплексе происходит по полуконсервативной модели и всегда сопряжен с вытеснением предшествующей нити (+)РНК.

3.7.1.3 Основные принципы и механизмы репликации ДНК-геномов вирусов

В процессе репликации ДНК-содержащие вирусы осуществляют некоторые шаги, которые отсутствуют у РНК-геномных вирусов. Для большинства ДНК-содержащих вирусов генетические стратегии включают: транспорт ДНК вириона в ядро клетки, инициирование транскрипции с этой ДНК, индукцию транскрипции дополнительных вирусных генов, подготовку клетки для репликации ДНК вируса, дублирование ДНК-генома, упаковку ДНК в вирионы и выход вирусных частиц из ядра. Кроме этого, многие ДНК-вирусы развили уникальные механизмы уклонения от иммунной защиты организма и способность вызывать опухоли у животных. В процессе близких отношений со своими хозяевами, вирусы эксплуатируют ключевые клеточные регуляторные системы и узурпируют важные клеточные процессы. В связи с этим, изучение различных аспектов репликации ДНК-вирусов обеспечивает новые фундаментальные знания о молекулярных процессах, происходящих в клетке, включая выражение генов, репликацию ДНК и контроль за циклом клеточного деления.

Подготовка клеток для репликации вирусной ДНК. В ходе продуктивной вирусной инфекции многие ДНК-вирусы из единственной молекулы генома могут получить 100000 или больше копий генома в течение нескольких дней. Для этого требуется работа множества белков, включая ДНК-связывающие белки и полимеразы, а также обильная поставка нуклеотидов. Репликация некоторых ДНК-вирусов происходит только в клетках, которые естественно реплицируют свою собственную ДНК, обеспечивая тем самым необходимую клеточную среду для репликации вирусной ДНК. Другие ДНК-вирусы также в значительной степени полагаются на клеточные системы репликации ДНК, но эти вирусы кодируют белки, стимулирующие клеточный цикл деления. Наконец, некоторые из самых больших ДНК-содержащих вирусов ограничено используют клеточный репликативный аппарат, т.к. сами кодируют вирусные версии многих из необходимых белков.

К первой группе вирусов относятся самые простые ДНК-содержащие вирусы семейства Parvoviridae , которые имеют линейный однонитевой геном. Парвовирусы могут реплицировать свою ДНК и осуществлять полный инфекционный цикл только в клетках, находящихся в стадии репликации ДНК – то есть в S-фазе клеточного цикла.

Фактически, экспрессия вирусных генов не активизируется до тех пор, пока клетка не войдет в S-фазу и ДНК-геном вируса не будет преобразован в двунитевую РФ, которая является матрицей для транскрипции. Однако, в отличие от других вирусов, которые требуют, чтобы клетки активно копировали свою ДНК, парвовирусы неспособны стимулировать переход клетки в S-фазу. В связи с этим, они могут выполнять успешную репродукцию только в том случае, если попадают в клетку, уже осуществляющую синтез ДНК. Некоторые парвовирусы, особенно аденассоциированный вирус (AAV), имеют даже более строгие требования и могут копироваться только в присутствии помощника – аденовируса или вируса герпеса, генные продукты которых активируют экспрессию геновпарвовируса и репликацию его ДНК.

Другие ДНК-вирусы для того, чтобы создать условия для репликации своей ДНК, стимулируют клетки к делению. Для этих вирусов репликация вирусной ДНК является результатом взаимодействия между клеточными репликативными белками и вирусными белками, которые прямым образом участвуют в репликации, а также белками– инициаторами, которые локализуются в точке начала репликации вирусного репликативного аппарата. Эти ДНК-вирусы перестраивают репликативный аппарат клетки на вирусную репликацию, участвуя в белок-белковых взаимодействиях с ключевыми клеточными регуляторными молекулами, некоторые из которых выполняют роль шаперонов, что позволяет им стабилизировать белковые комплексы. Часто, эти взаимодействия приводят к нейтрализации клеточных белков-репрессоров опухоли типа транскрипционного фактора p53 и членов семейства ретинобластомых белков (Rb) и, как следствие, к активации клеточного роста.

Вирусные белки, которые стимулируют репликативное состояние клетки, обычно инактивируют членов семейства Rb – P105Rb, p107, и p130. Инактивация Rb предотвращает репрессию клеточного деления и разрешает E2F-опосредованную транскрипцию, что стимулирует выражение многочисленных клеточных белков, требуемых для S-фазы, включая ДНК-полимеразу α, тимидинкиназу, рибонуклеотидредуктазу и тимидилатсинтазу. Некоторые вирусные белки, например, Е1А аденовирусов и Е7 папиломавирусов человека, непосредственно связывают Rb белки и ингибируют их функцию, и таким образом активируют E2F. Другие вирусные белки регулируют активность циклин-зависимых киназ (Cdks), которые катализируют фосфорилирование Rb, приводя к активации E2F и транскрипции E2F-регулируемых генов. Ряд вирусных белков могут косвенно влиять на регуляцию клеточного цикла деления. Например, E1B-55КБ и E4orf6 белки аденовирусов и E6 папиломавирусов запрещают действие транскрипционного фактора p53 через взаимодействие с CBP/p300, который является коактиватором гена p53. Отмена функции p53 приводит к уменьшенной экспрессии ингибитора клеточного деления p21 (репрессор комплекса Cdk–циклин), таким образом активируя Сdk и соответственно переход клеток в S–фазу. Точно так же, аденовирусный E1A связывает p27, который является ингибитором Сdk, нейтрализуя его эффекты. Большой T антиген обезъяньего вируса SV40 не только связывает и инактивирует Rb и p53, но и выполняет несколько функций, непосредственно требуемых для репликации ДНК вируса. Другой механизм используют средний T-антиген полиомавирусов и белок E5 папиломавирусов быка. Эти белки активируют сигнальный каскад, опосредованный рецептором фактора роста, и возможно стимулируют экспрессию регуляторной субъединицы Сdk – циклина D, таким образом стимулируя активность Сdk и фосфорилирование белков семейства Rb. Некоторые белки вирусов герпеса и гепаднавирусов по всей вероятности также стимулируют каскады сигнальных путей, активизируя внутриклеточные белки передачи сигнала NFKB, P21ras и pp60c-src.

Индукция набора клеточных репликативных белков имеет глубокие последствия на клетку-хозяина, которая насильно побуждается к репликации ДНК. Когда пролиферативный сигнал устойчиво поддерживается, например, в непермиссивных клетках, которые не способны поддерживать репликацию вирусной ДНК, клетки могут подвергнуться устойчивой трансформации. Таким образом, мало того, что многие ДНК– вирусы стимулируют статические клетки к повторным циклам деления, они также трансформируют клетки в культуре и вызывают опухоли у животных. Рассмотренная способность многих опухолеродных ДНК-вирусов стимулировать неограниченный рост клеток не является особенностью нормальной репликации вирусов, а скорее представляет собой аберрантный ответ клеток на вирусную инфекцию. В соответствии с этим, парвовирусы, неспособные стимулировать репликацию клеточной ДНК, являются одними из немногих ДНК-содержащих вирусов, которые не трансформируют клетки. Однако способность вирусов стимулировать синтез клеточной ДНК не всегда коррелирует с их способностью трансформировать клетки. Например, одни вирусы герпеса стимулируют синтез ДНК, другие нет, и, тем не менее, они фактически запрещают быстрое клеточное деление. Такие большие вирусы с их большой кодирующей емкостью способны создать надлежащую среду для репликации вирусной ДНК без активации клеточного репликативного аппарата.

Необходимость нуклеотидов для репликации ДНК. Как описано выше, для репликации парвовирусов необходимо, чтобы клетки находились в S-фазе, а папиломавирусы, полиомавирусы и аденовирусы стимулируют клетки, чтобы ввести Sфазу, требующую для синтеза ДНК большой концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Через воздействие на членов белковых семейств Rb и E2F, папиломавирусы и аденовирусы стимулируют синтез фермента рибонуклеотидредуктазы, который требуется для поддержания достаточного для вирусной репликации уровня дНТФ. Напротив, вирусы герпеса и поксвирусы способны реплицироваться в покоящихся клетках. Одной из причин того, что эти вирусы могут обходить требование к S-фазе является их способность кодировать ферменты для синтеза дНТФ – рибонуклеотидредуктазу и тимидинкиназу. В случаях вируса герпеса и вируса опоясывающего лишая/ветряной оспы вирусная тимидинкиназа является ключевой точкой для противовирусной химиотерапии, потому что этот вирусный фермент фосфорилирует аналоги нуклеозида, такие, как ацикловир, более эффективно, чем это делают клеточные ферменты. Преобразованные в фосфорнокислую форму эти аналоги дНТФ выборочно вредят репликации ДНК герпесвирусов.

Независимо от вида ДНК-генома единицей его репликации является так называемый репликон – единица генома, способная к автономной репликации. Репликон представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную между точкой начала репликации (origin или ori) и точкой окончания репликации (terminus). Процесс репликации ДНК разделен на три стадии: инициация цепи, элонгация (удлинение) цепи и терминация синтеза. Вирусы с различными видами ДНК-генома реализуют оригинальные стратегии репликации. При этом главные особенности наблюдаются при инициации синтеза.

Основные принципы репликации ДНК-геномов вирусов.

Инициация синтеза ДНК. Большинство ДНК вирусов эукариот (кроме поксвирусов) копирует свои геномы в ядре. Репликация ДНК-геномов вирусов инициируется в специфических точках ori.

В отличие от клеточных ориджинов, которые активируются один раз в течение клеточного цикла, вирусные точки ori могут срабатывать много раз в течение отдельного цикла репликации. Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК (смотри пункт 3.7.1.1, с. 63).

Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке-хозяину, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза α. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3’– концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5’– к 3’-концу, считывание – от 3’– к 5’-концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК-матрице синтез идет через образование репликативной вилки (рисунок 9) или с вытеснением цепи, на онДНК матрице – по репарационному механизму.

В репликативных вилках одна нить (ведущая) копируется непрерывно в направлении от 5’– к 3’-концу. Поскольку другая нить (отстающая) должна также синтезироваться от 5’– к 3’-концу, она копируется с перерывами, многократно инициируя синтез и соединяя короткие фрагменты Оказаки. Синтез ДНК в репликативной вилке обеспечивается целым набором белков-ферментов, которые могут иметь разное происхождение. Мелкие ДНК-содержащие вирусы используют клеточные репликативные белки. Лучше всех изучена репликация полиомавируса SV40, где вовлеченные репликативные белки были идентифицированы в бесклеточной системе in vitro .

Рисунок 9 – Схема репликации ДНК с использованием репликативной вилки

Установлено, что в репликации ДНК SV40 принимают участие 10 белков. Девять из них имеют клеточное происхождение: ДНК-полимераза α (ответственна за инициацию синтеза ДНК в точке ori и синтез отстающей нити); праймаза (связана с ДНК-полимеразой и праймирует синтез фрагментов Оказаки); ДНК-полимераза d (ответственна за синтез лидирующей нити и завершение синтеза фрагментов Оказаки); пролиферативный клеточный ядерный антиген (PCNA), который связывается с ДНК-полимеразой d и формирует кольцо вокруг ДНК, увеличивая процессивность полимеразы; гетеропентамерный репликативный фактор C – RF-C (присоединяет кольцо PCNA на ДНК и стимулирует полимеразу d); RPA – онДНК-связывающий белок; РНаза H (удаляет все кроме одного рибонуклеотиды РНК-праймера); экзонуклеаза FEN-1, также известная как MF-1 (удаляет оставшейся рибонуклеотид); ДНК-лигаза I (лигирует фрагменты Оказаки); топоизомераза I и/или топоизомераза II (снимает сверхспирализацию в течение синтеза). Единственный вирусный белок, который требуется для репликации ДНК SV40 – это большой T-антиген, который обладает свойствами хеликазы и обеспечивает расплетение двунитевой структуры в репликативной вилке.

Другие вирусы сами обеспечивают почти все белки репликативной вилки. Например, фаза элонгации при репликации ДНК аденовируса в условиях in vitro обеспечивается одной аденовирусной субъединицей ДНК-полимеразы, аденовирусным однонитевым ДНК-связывающим белком, который может увеличивать процессивность полимеразы, и клеточной топоизомеразой I или II. Это простота частично связана с необычным характером репликации ДНК аденовируса, в которой отсутствует синтез отстающей цепи.

Крупные ДНК-вирусы еще в большей степени обеспечивают себя ферментами репликации. Например, вирусы герпеса кодируют ДНК-полимеразу, фактор элонгации, праймазо-хеликазный комплекс, однонитевой ДНК-связывающий белок и, вероятно, еще ряд вирусных белков, которые не идентифицированы.

Терминация синтеза. В случае кольцевых геномов окончание синтеза и расхождение геномов упрощены, поскольку синтез дочерней цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3’– и 5’-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой. В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3’-концом и пробелом на 5’-конце. Предложено два способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи: с использованием конкатамеров или через образование шпильки.

Основные схемы репликации ДНК-геномных вирусов .

1 Терминальная инициация с помощью самозатравочного механизма.

2 Терминальная инициация с помощью белок-нуклеотидной (Б-Н) затравки.

3 Механизм катящегося кольца.

4 Схема Кернса.

5 Репликация через интеграцию.

1 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи самозатравочного механизма (рисунок 10). Такой тип репликации геномной ДНК имеют парвовирусы, у которых геном представлен линейной онДНК, имеющей на обоих конца самокомплементарные последовательности, формирующие шпилечные структуры. 3’-конец ДНК имеет уникальную последовательность размером 125 нуклеотидов, образующую двунитевую Т-образную шпилечную структуру, которая играет роль затравки для ДНК-полимеразы.

ДНК-полимераза в результате репарационного синтеза комплементарной цепи воссоздает дуплекс, обе цепи которого на одном конце ковалентно соединены. При этом 3’-концевой сегмент родительского генома в качестве матрицы не используется. Следовательно, полного воспроизведения вирусного генома пока не произошло. На следующем этапе вирусоспецифический фермент вносит разрыв в родительскую цепь на границе между реплицированным и нереплицированным участками последовательности (между 125 и 126 нуклеотидами).

Рисунок 10 – Схема первых этапов репликации однонитевой ДНК парвовирусов

Концевые 125 нуклеотидов родительского генома становятся условной частью вновь синтезированной цепи и возникший таким образом 3’-конец родительской цепи используется для ее регенерации. В результате этих реакций возникает дисперсная двунитевая репликативная форма вирусной ДНК (рисунок 10). Далее следует цепь реакций, включающих образование на одном из концов ДНК-затравки в виде «заячьих ушек», синтез новой цепи с вытеснением родительской, образование еще одной репликативной формы. Вторая репликативная форма ДНК используется в качестве матрицы для дальнейшего синтеза вирусной ДНК, а вытесненная из дуплекса однонитевая молекула или вступает в репликативный цикл или входит в состав дочерней вирусной частицы.

2 Репликация с использованием терминальной инициации при помощи белокнуклеотидной затравки (рисунок 11). Такой тип репликации геномной ДНК имеют аденовирусы, геном которых представлен линейной днДНК, имеющей на 5’-концах инвертированные повторы и ковалентно присоединенные геномные белки с м.м. 55 кДа.

В инфицированной аденовирусом клетке синтезируется вирусоспецифический белок массой 80 кДа, который связывается через серин с дезоксицитидином. Образовавшаяся структура Б-Ser – dCTP является затравкой, которая через цитозин комплементарно связывается с 3’-концевым гуанозином генома и инициирует синтез цепи ДНК.

Инициация может наблюдаться на любом конце родительской ДНК и может происходить или одновременно или последовательно. При последовательной инициации синтез дочерней цепи сопровождается вытеснением одной из родительских, а синтез комплементарной цепи идет на однонитевой матрице по репарационному механизму. В тоже время обсуждается и другой механизм синтеза второй нити. Замещенная родительская однонитевая ДНК имеет на концах самокомплементарные инвертированные повторы, которые отжигаются, восстанавливая двунитевую точку ori, узнаваемую инициирующими белками, обеспечивающими синтез родительскодочернего дуплекса. Таким образом, каждый родительский дуплекс копируется полуконсервативно.

Рисунок 11 – Схема репликации генома аденовируса

Однако процесс протекает без синтеза отстающей цепи, т.е. без образования множественных сайтов инициации и синтеза фрагментов Оказаки.

3 Репликация кольцевых геномов по механизму катящегося кольца (рисунок 12). Катящееся кольцо – способ репликации, при котором репликационная вилка совершает множество оборотов на кольцевой матрице. Синтезирующаяся в каждом цикле нить вытесняет прежнюю (гомологичную) цепь двуцепочечной молекулы, синтезированную в предыдущем цикле, образуя хвост, состоящий из набора последовательностей, комплементарных одноцепочечному матричному кольцу. В общих чертах репликация по механизму катящегося кольца имеет следующие стадии:

Рисунок 12 – Схема репликации ДНК-геномов по механизму катящегося кольца

1 Вирусоспецифический фермент вносит однонитевой разрыв в уникальном сайте родительской цепи репликативной формы.

2 Фермент остается связанным с 5’-концом, освободившийся 3’-концевой нуклеотид служит затравкой для ДНК-полимеразы.

3 ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды комплементарно замкнутой цепи, то есть синтезируется только лидирующая цепь. 5’-конец родительской цепи вытесняется. Наблюдается образование сигма-молекул (δ).

4 После того, как репликационная вилка завершит чуть больше полного оборота, вытесненная цепь замыкается в кольцо, а фермент перемещается на вновь синтезированную нить и цикл повторяется. Таким образом, вновь синтезированная нить, имеющая последовательность геномной, становится компонентом РФ, а предшествующая (родительская) оказывается в свободном виде.

Это – IV стадия репродукции вирусов: синтез вирусных белков и репликация нуклеиновых к-т.

1. РНК пикорнавирусов выполняет роль и-РНК, транслируется на рибосомы, служит матрицей для образования единого гигантского полипептида. Последний расщепляется на несколько белков, один из кот-х является полимеразой. Начинается репликация той же РНК, освобождённой от рибосом.

2. РНК других вирусов служит матрицей, на кот-й транскрибируется и-РНК. Она транслируется на рибосомы, образуются определённые вирусные белки, один из кот-х - полимераза. Далее происходит репликация вирусной РНК, причём вначале образуется форма из 2-х нитей.

3. У онкогенных РНК-содержащих вирусов синтез идёт иначе. С матрицы РНК образуется ДНК-копия, имеющая 1 нить ДНК. В этом процессе участвует обратная транскриптаза, кот-я есть в вирионе. Затем идёт репликация этой нити ДНК, образуется 2 нити. На матрице этой ДНК-копии синтезируются молекулы РНК.

54. Какая разница между (+) и (-) вариантами 1-нитчатых РНК геномов?

Вирусные РНК делятся на + нити и - нити РНК.

+РНК представлены одиночными цепочками, имеющими характерные «шапочки» на концах для распознавания рибосом. К этой группе относят РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомах заражённой клетки, то есть выполнять ф-и м-РНК. Ф-и +нитей : служат м-РНК для синтеза структурных белков, матрицей для репликации РНК, упаковываются в капсид с образованием дочерней популяции.

-РНК не способны транслировать генетическую информацию на рибосомах. Служат матрицей для синтеза м-РНК.

Сущность радиоиммунного метода.

Используют очищенные и концентрированные Аг и АТ, меченные радиоизотопом (йодом).

Для выявления АТ – к исследуемой сыворотке добавляют меченый Аг. Титр АТ в сыворотке устанавливают по убыли свободного меченого Аг.

Для выявления Аг – исследуемый материал смешивают с антисывороткой, затем вносят гомологичный меченый Аг. Если меченый Аг остаётся свободным, реакция положительная , так как исследуемый Аг связался с сывороткой. Если меченый Аг уменьшается, это означает, что он взаимодействует с сывороткой – реакция отрицательная .

Используют для диагностики вирусного гепатита.

Как происходит заражение ВИЧ?

ВИЧ-инфекция – типичный антропоноз, у животных воспроизвести заболевание не удаётся. Резервуар вируса – инфицированный человек. Пути передачи:

1. Половой – через повреждения слизистых.

2. Использование одних игл и шприцев наркоманами.

3. Гемотрансфузионный – переливание крови и её препаратов.

4. Передача с донорскими органами.

ВИЧ чувствителен к д-ю высоких t°, этанола, эфира. В биологическом материале при комнатной t° жизнеспособен несколько дней.

Какие клетки поражает ВИЧ и какой рецептор имеют эти клетки? Мех-м развития ВИЧ.

Мишени для ВИЧ – Т-хелперы, моноциты, макрофаги, клетки микроглии.

Патогенез поражений: селективное поражение CD4 + -клеток, так как вирус использует CD4 как рецептор. В патогенезе 4 стадии:

I. Апоптоз – «запрограммированная» смерть клеток – при взаимодействии вирусов с рецепторной системой макрофагов нарушается «распознавание» вируса как чужеродного Аг.

II. Образование синцитиев – вирусы выходят в кровь и внедряются в новые незаражённые лимфоциты. Здоровые лимфоциты прилипают к поражённым. Активность лимфоцитов снижается под д-ем токсинов, образующихся при гибели клеток.

III. Аутоиммунные реакции – появление вирусных гликопротеинов на мембранах Т-хелперов приводит к активации Т-киллеров. Иммунная система не может противостоять даже сапрофитной флоре. Возникают «оппортунистические» инфекции.

IV. Инфицирование клеток-предшественников – при нормальном иммунитете эти клетки разрушаются, а в условиях иммунодефицита – активно размножаются. Возникают болезни злокачественного роста – саркома Капоши.

«Оппортунистические» инфекции – заболевания, вызванные микроорганизмом, способным поражать только индивидуумы с ослабленным иммунитетом.

Как устроен ВИЧ?

ВИЧ входит в состав ретровирусов. Характерно : уникальное строение генома и наличие обратной транскриптазы. Обратная транскриптаза обеспечивает обратную направленность потока генетической информации – от РНК к ДНК (отсюда название).

Геном : 2 идентичные молекулы 1-нитевой несегментированной +РНК.

При репродукции образуются промежуточные продукты ДНК – особенности размножения ретровирусов . Выделяют ВИЧ-I и ВИЧ-II.

Зрелые вирионы : сферическая форма, d = 120 нм, в геноме 2 нити +РНК, капсид, суперкапсид из двойного липидного слоя, кот-й пронизывают гликопротеиновые шипы. Эти шипы взаимодействуют с молекулами CD4 на мембранах клетки.