Luminesans mikroskopiyasi. elektron mikroskop

Ushbu bobda konfokal lazerli skanerlash mikroskopining (CLSM) asosiy tamoyillari, qurilmasi, qo'llanilishi Leica qurilmalari misolida ko'rib chiqiladi. CLSM printsipi fokuslar bir-biriga to'g'ri kelganda linzaning fokus tekisligidan chiqadigan yorug'lik oqimini ro'yxatga olishdir, ya'ni detektor diafragmasi uning tasviri ob'ektni yorituvchi yorug'lik markaziga to'liq mos keladigan tarzda joylashtirilishi kerak. Lazerlar va sezgir detektorlar tasvirni olish uchun yorug'lik manbai sifatida ishlatiladi.

CLSM ning asosiy xususiyati yuqori aniqlik va past shovqin darajasi bilan o'rganilayotgan ob'ektning (masalan, hujayraning) qatlamli tasvirini olish imkoniyatidir. Bunga ob'ektni kogerent manbadan yoki jadvaldan yo'naltirilgan yorug'lik nurlari bilan bosqichma-bosqich skanerlash, maxsus lyuminestsent zondlar va yorug'lik oqimlarini cheklashning maxsus usullari yordamida erishiladi.

CLSMda skanerlash tizimlarini quyidagicha tasniflash mumkin.

1. Nurni skanerlash.

A) Oynali sistemalar: bir oynali, ikki oynali, rezonansli magnitoelektrik.

B) Yengil tolali tizimlar: bir tolali, ko'p tolali.

C) Ob'ektiv yordamida skanerlash:

· X, Y o'qlari bo'ylab linzalarning piezoelektrik harakati;

Z o'qi bo'ylab linzalarning piezoelektrik harakati.

D) Akusto-optik nur deflektorlari: X va Y o'qlari bo'ylab skanerlash uchun ikkita akusto-optik deflektor.

E) Disk tizimlari:

bitta spiral bir tomonlama va ikki tomonlama;

Ko'p spiral bir tomonlama va ikki tomonlama.

E) Kombinatsiyalangan tizimlar: Y o'qi bo'ylab akusto-optik deflektor va X o'qi bo'ylab oynani skanerlash.

2. Skanerlash jadvali.

A) Step haydovchi: X, Y, Z o'qlari bo'ylab qadam motorlari bilan skanerlash bosqichi.

B) Kombinatsiyalangan qo'zg'alish: X, Y o'qlarida pog'onali dvigatel va Z o'qida piezoelektrik qo'zg'alish bilan skanerlash bosqichi.

Guruch. 5. KLSM ishining sxematik diagrammasi.

1 - skanerlash jadvali; 2 - sinov namunasi; 3, 7 - linzalar; 4 - skanerlash moslamasi; 5 - nurni ajratuvchi plastinka; 6 - lazerdan yorug'lik nuri; 8, 12 - B va C nuqtalarining tasviri; 9 - igna diafragma; 10 - igna diafragmasining markazidagi A nuqtasining tasviri; 11 - radiatsiya qabul qiluvchi; 13, 15 - linzalar 3 fokusidan tashqarida bo'lgan B va C nuqtalarining porlashi; 14 - linzaning 3 fokusida joylashgan A nuqtasining porlashi.

Lazer manbasidan qo'zg'atuvchi yorug'lik oqimi 6 nurni ajratuvchi plastinka 5 orqali, skanerlash tizimi 4 linzaga 3 kiradi va diqqat markazida bo'lgan sinov preparati tekisligining A nuqtasiga (masalan, hujayra) qaratilgan. . Hujayra ichidagi tuzilmalar lyuminestsent zondlar bilan bog'langanligiga ishonamiz va nurning fokuslanish nuqtasi A yorug'likning nuqta manbai sifatida qaralishi mumkin, flüoresan oqimi undan ob'ektiv 3, nurni ajratuvchi 5, ob'ektiv 7 orqali igna diafragma tekisligiga qaratilgan. 9 ("pin teshigi") va fotodetektor tomonidan qayd etilgan 11. Optik o'q bo'ylab (B va C nuqtalari) optik o'q bo'ylab linzalar markazidan tashqarida yotgan preparat bo'laklarining qo'zg'alish oqimi bilan yoritilishi A nuqtaga qaraganda pastroqdir. B va C nuqtalaridan detektor nishonining yoritish komponenti sezilarli darajada kamayishi mumkin. Fokusdan tashqarida bo'lgan B va C nuqtalaridan keladigan floresan oqimlari pin teshigi bilan chegaralanadi va detektorga tushmaydi yoki ularning kichik bir qismi tushadi. Shunday qilib, samolyotda tayyorgarlikni skanerlashda XY detektor darajasi Z koordinatasi bo'yicha skanerlash tekisligidan masofa bilan belgilanadigan signalni qayd etadi.3-ob'ektiv fokusini skanerlash tekisligi bilan va 7-ob'ektiv fokusini igna diafragma bilan birlashtirish "konfokallik" atamasida aks etadi. Skanerlash tekisligining Z o'qi bo'ylab bosqichma-bosqich harakatlanishi bir qator kontrastli qatlamli tasvirlarni olish va o'rganilayotgan ob'ektning ichki uch o'lchovli tuzilishini (3-D) qayta qurish imkonini beradi. Tasvir sifati, tekislikdagi ruxsat XY va Z o'qi bo'ylab optikaning sifati, skanerlash tizimlarining sifati, teshik diafragmasining o'lchamlari va ishlab chiqarish aniqligi, strukturaning qattiqligi, ishlatiladigan signalni qayta ishlash algoritmlarining samaradorligi va o'ziga xosligi bilan bog'liq. lyuminestsent problar.

Mikroskopning fazoviy o'lchamlarini aniqlash uchun nuqta yorug'lik manbasining tasviri tahlil qilinadi. An'anaviy linzalar tomonidan yaratilgan nuqta manbasining tasviri yorqin markaziy yadro va zaifroq tashqi halqalardan tashkil topgan diffraktsiyali Airy nuqtadir.

Guruch. 6. Havoli difraksion nuqta.

Bir xil yorqinlikdagi ikkita nuqta manbalari, ularning orasidagi masofa d ga teng , Agar Airy doiralarining markazlari orasidagi masofa quyidagi qiymatdan oshsa, ular ikkita alohida nuqta sifatida ko'rinadi:

r A \u003d XY \u003d 0,6 l / NA,

qaerda r A - Airy doiradagi birinchi qorong'u halqaning radiusi, l - yorug'lik manbasining to'lqin uzunligi nm, NA - raqamli diafragma.

Bu ifoda Rayleigh kriteriyasi deb ataladi. Namuna tekisligida (XY) mikroskopning ruxsatini aniqlaydi. Bunday holda, ruxsat chegarasi birinchi navbatda yorug'likning to'lqinli tabiati bilan belgilanadi va shuning uchun u ko'pincha NA=1 ni hisobga olgan holda soddalashtiriladi. CLSM tasviri havodor nuqta hajmining biroz pasayishiga olib keladi. Standart mikroskop uchun Airy dog'ining intensivligi n -2 qonuniga muvofiq kamayadi, bu erda n - ko'ndalang siljish va CLSM uchun intensivlik n -4 ga kamayadi. Bu CLSM rezolyutsiyasining 1,5 barobar oshishiga olib keladi. Konfokal mikroskop uchun Rayleigh mezoni quyidagi shaklga ega:

XY c r \u003d 0,4 l / NA,

Bu erda XY c r - CLSM ning o'lchamlari.

CLSM ning afzalligini baholash uchun instrumental funktsiyani (Eri nuqta tuzilishi) ko'rib chiqing va mikroskopning eksenel yo'nalishda (Z) ajralish kuchini tahlil qiling. 3D Airy nuqtasi (intensivlikni taqsimlash) ob'ekt tasvirini belgilaydigan 3D apparat funktsiyasi (TAF). An'anaviy mikroskop uchun TAF konussimon bo'lib, markazdan yuqoriga va pastga yonadi, konfokal mikroskop uchun esa elliptik va kamroq eksenel cho'zilgan.

Guruch. 7-rasm. An'anaviy mikroskopning nuqta manbaining uch o'lchovli instrumental funktsiyasining ko'rinishi - (a) va CLSM - (b).

Rayleigh mezoni mikroskopning optik o'q yo'nalishi bo'yicha aniqligini aniqlash uchun ham qo'llaniladi. An'anaviy mikroskop uchun optik o'q bo'ylab ma'lum masofada joylashgan ikkita nuqta manbalari, agar ularning havo nuqtalarining maksimallari masofada bo'lsa, hal qilinishi mumkin:

Z r =2 l/NA 2,

bu yerda Z r mikroskopning eksenel ruxsati.

CLSM uchun Airy nuqtasida energiya taqsimoti torroq va eksenel yo'nalishdagi o'lchamlari 1,4 baravar yuqori. Konfokal mikroskop uchun Rayleigh mezoni quyidagi shaklga ega:

Z r c \u003d 1,4 l / NA 2,

Bu erda Z r c - CLSM ning eksenel o'lchamlari.

Zamonaviy CLSMlar bitta asosiy afzalliklarga ega - nozik optik qismlarni olish qobiliyati. Yupqa optik qismlarni olishda tasvir sifatiga quyidagi parametrlar ta'sir qiladi:

konfokal diafragmaning o'lchami;

NA ob'ektivining raqamli diafragma;

sindirish ko'rsatkichi;

namunadagi yorug'likning yutilishi.

Namuna qalinligi oshgani sayin yorug'lik intensivligining kamayishi optik z o'qi bo'ylab mikroskopning aniqligiga ta'sir qiladi.Yo'nalish mikroskop va namunaning optikasiga bog'liq. Konfokal mikroskopdagi optik qismning qalinligi odatda intensivlik cho'qqisi ∆z 1/2 = 0,65 mkm ning yarim balandligidagi taqsimlash kengligi bilan tavsiflanadi. Namuna va detektor ideal bo'lsa, bu parametr ob'ektivning raqamli diafragmasiga, to'lqin uzunligi l va immersion muhitning sinishi indeksiga bog'liq n i .

Guruch. 8-rasm. Mikroskopning ∆z 1/2 eksenel aniqligining ob'ektivning sonli teshikka bog'liqligi.

KLSMda detektor oldiga yorug'lik miqdorini o'zgartiradigan sozlanishi diafragma qo'yilgan. Igna diafragmalari fokus tekisligiga to'g'ri kelmaydigan yoki fokus tekisligida tahlil qilinadigan ob'ekt elementi yaqinida joylashgan nuqtalardan tasvir tekisligiga kiradigan yorug'likni maksimal yoki to'liq filtrlash uchun sharoit yaratish uchun mo'ljallangan. Igna diafragmasining o'lchami cheklangan bo'lib, qurilmaning ko'ndalang o'lchamlari, preparatning yoritilgan elementlarining yorqinligi Z o'qi bo'ylab fokus tekisligiga nisbatan siljiydi va maydon chuqurligi unga bog'liq. Diafragmaning kattaligi hosil bo'lgan qismning qalinligiga ta'sir qiladi. Diafragma qanchalik kichik bo'lsa, kesma qalinligi nazariy chegaraga qanchalik yaqin bo'lsa (intensivlik cho'qqisi maksimal yarmida taqsimlanish kengligi) va juda katta teshiklarda ingichka qismni olish imkonsiz bo'ladi.

Yuqorida aytib o'tilganidek, CLSM namuna yuzasidan sezilarli chuqurlikdagi optik qismni olish imkonini beradi, muhim nuqta esa sinishi indeksi va chuqurlik muammosidir. Hodisa va aks ettirilgan nurning namuna orqali o'tishi tasvir sifatiga ta'sir qiladi. Agar suvga cho'mdiruvchi muhit va namunaning sindirish ko'rsatkichlari yaqin bo'lsa (cho'ktiruvchi suyuqlik va ob'ektning sindirish ko'rsatkichlari farqining tarqoq yorug'likning paydo bo'lishiga ta'siri, tasvir kontrastini kamaytiradi va sferik aberatsiya effekti sifatida ishlaydi), yorug'lik konusi birlashadi. Sinishi ko'rsatkichlari boshqacha bo'lsa, sferik aberatsiya paydo bo'ladi.

Guruch. 9. Immersion muhit va namunaning sindirish ko'rsatkichlari.

a – aberratsiyasiz immersion linzalar yordamida tasvirni shakllantirish; b - indikatorlarning mos kelmasligi sababli sferik aberatsiya.

Turli xil sinishi ko'rsatkichlari bilan optik o'qdan turli masofalarda harakatlanadigan yorug'lik nurlari bir nuqtaga yo'naltirilmaydi, bu esa tasvir sifatining yo'qolishiga olib keladi. Iloji bo'lsa, namuna va ob'ektivning sinishi ko'rsatkichlari mos kelishi kerak. Namuna va immersion muhitning sindirish ko'rsatkichlari farq qiladigan bo'lsa, ob'ektning chuqurlikdagi tasviri optik o'q bo'ylab xiralashadi va fokus tekisligi siljiydi. Kirish chuqurligini oshirish uchun ob'ektiv katta raqamli diafragmaga ega bo'lishi kerak, masalan, suvga cho'mish ob'ektivi. Biroq, bunday linzalar ob'ektiv linzalardan fokus tekisligiga kichik maksimal masofaga ega. Penetratsiya chuqurligi namunaning bir xilligidan ta'sirlanadi, bu katta chuqurlikdagi yorug'lik intensivligining pasayishiga va soyaning paydo bo'lishiga olib keladi. Ideal holda, penetratsiyaning maksimal chuqurligiga va maksimal ruxsatga erishadigan namuna linzaga teng sinishi indeksiga ega bo'lishi kerak, ammo bu bir hil namunadir va bunday biologik namunalar mavjud emas.

Skanerlash vaqtida KLSM namuna yuzasidan muntazam oshib boruvchi chuqurlikdagi bir qator optik qismlarni oladi. Aksariyat CLSMlar uchun yuzlab 2D tasvirlarni olish bir necha daqiqa davom etadi. Optik tasvirni ikki yo'l bilan olish mumkin:

1) XY tekisligida bir-biridan ∆z masofada joylashgan optik kesmalar ketma-ketligini olish. Ob'ektlar markazlarining koordinatalarini turli kesmalarda solishtirish ularning yo'nalishini va uzunligi bo'ylab taqsimlanishini aniqlash imkonini beradi.

Guruch. 10. XY tekisligida uch o'lchamli strukturani o'rganish.

2) XZ tekisligida ∆y masofada joylashgan bir qancha optik kesmalarni olish. Agar namuna kesma tekisligiga parallel bo'lsa, uning XZ tekisligidagi kesimi deyarli yumaloq bo'ladi, turli XZ kesmalardagi tasvirlarni solishtirganda, o'rganilayotgan ob'ektning egriligini aniqlash mumkin.

Guruch. 11. XZ tekisligida uch o'lchamli strukturani o'rganish.

CLSM usullaridan foydalangan holda o'rganilayotgan ob'ektlarni uch o'lchovli rekonstruksiya qilish ikkita muammoni hal qilishga qaratilgan:

ob'ektning optik qismlarini "yig'ish" natijasida olingan uch o'lchamli tasvirni vizualizatsiya qilish;

· ob'ektning ichki tuzilmalarini miqdoriy tahlil qilish.

Bugungi kunga kelib, CLSM ning bir nechta ishlab chiqaruvchilari mavjud. CLSM ishlab chiqaruvchilarining innovatsiyalari:

· 2002 yilda Leica qo'zg'atuvchi lazer nurlari va luminesansni samarali ajratish imkonini beruvchi akusto-optik nurlarni ajratuvchi (AOBS) ni e'lon qildi;

· 2002 yil Carl Zeiss LSM 510 META konfokal mikroskopini bir vaqtning o'zida 32 ta spektral kanalda signalni qayd etuvchi original fotodetektor bilan ishlab chiqara boshladi;

· 2004 yil Zeiss yuqori tezlikdagi LSM 5 Live ni yaratdi, u an'anaviy CLSMdan 20 marta tezroq skanerlash tezligiga ega;

· Olympus kompaniyasi ikkita skanerli qurilmani ishlab chiqdi, bu, masalan, FRAP texnikasidan samaraliroq foydalanish imkonini beradi;

· Nikon - ixcham va arzon KLSM soddalashtirilgan dizayni yaratadi;

· 2007 yil Leica eksenel piksellar sonini 4 dan 7 baravar yaxshilaydigan 4Pi-konfokal mikroskopning chiqarilishini e'lon qildi.

KLSM qurilmasini yangi, ilg'or avlod qurilmalari - Leica'dan TCS SP5 bilan bog'liq deb hisoblang.

Guruch. 12. Multifoton/konfokal keng polosali tizim TCS SP5 (teskari mikroskop).

CLSM TCS SP5 ning asosiy elementlari: AOTF – akustik-optik sozlanishi filtr, AOBS – akustik-optik nur ajratuvchi, SP-Detector – spektral fotometr sensori.

AOTF - Akustik optik sozlanishi filtr - optik ta'sirni minimallashtirishga xizmat qiladi, namuna va ftoroxromga qarab lazer quvvatini sozlaydi. Kerakli to'lqin uzunligini tanlash va qo'zg'atuvchi nurning qizg'inligini nazorat qilish imkonini beradi. AOTF - bu yorug'lik nurlarining sinishi indeksining bir xilligi bilan hajmli diffraktsiyasi printsipi asosida ishlaydigan elektr sozlanishi filtr. Bunday notekisliklar ultratovushli akustik to'lqin qo'sh sindiruvchi kristallarda qo'zg'alganda paydo bo'ladi. Bir o'qli kristallarda anizotropik diffraktsiyada minimal ultratovush chastotasi mavjud bo'lib, unda tushish va diffraktsiya burchaklari mos keladi va kollinear akusto-optik o'zaro ta'sir sodir bo'ladi.

Guruch. 13. Akustik-optik sozlanishi filtr.

AOBS - akusto-optik nurni ajratuvchi, akusto-optik kristall - teskari rejimda ishlaydigan sozlanishi mumkin bo'lgan sinishi qurilmasi. AOBS dan foydalanishga nima yordam beradi:

1. Aniq, past shovqinli tasvirni olish uchun yorug'likning yuqori o'tkazuvchanligi talab qilinadi. Ko'p ketma-ket skanerlashda tasvirni o'rtacha hisoblab, shovqinni kamaytirish, albatta, o'rganilayotgan ob'ektning fotooqartilishiga olib keladi. AOBS ning yorug'lik o'tkazish tezligi butun ko'rinadigan spektrdagi ko'pchilik dikroik nometalllardan ustundir. Shuning uchun kamroq miqdordagi skanerlashning o'rtacha qiymati talab qilinadi. Natijada, preparat ancha uzoq davom etadi;

2. Yorqin va aniq tasvirlar ob'ektdan detektorga imkon qadar ko'proq fotonlarning o'tishini talab qiladi, bu tasvir sifatini yaxshilaydi. AOBS eng keng floresan diapazonlarini, ya'ni fotonlarning maksimal sonini ro'yxatga olishni ta'minlaydi;

3. Tasvirlash paytida past oqartirish namunani xiralashishdan va tirik ob'ektlarni zaharli floroxrom fotoliz mahsulotlaridan himoya qilish uchun muhimdir. AOBS ning yorug'lik o'tkazuvchanlik egri chizig'i juda tik qiyaliklarga ega, bu ftoroxromning floresansini uning qo'zg'alish zonasiga iloji boricha yaqinroq yozish imkonini beradi;

4. Ko'rinadigan diapazondagi har qanday bo'yoq hayajonlanishi mumkin, chunki aks ettirish alohida sozlanishi mumkin;

5. Ko'p parametrli floresans masalasi hal qilindi: sakkiztagacha lazer emissiya chizig'ini dasturlash mumkin, flüoresansni ro'yxatga olish uchun etarli joy qoldirib, chastotalar o'rnatiladi;

6. Bo'yoqlarning nisbati, metabolitning qo'zg'alish nisbati sifatida - namunalar, masalan, Ca 2+ uchun, membrana salohiyati, pH ketma-ket skanerlashda tez o'zgarishi kerak. AOBS bir necha mikrosekundlarda o'tadi;

7. Yoritilgan nurda tasvirni ro'yxatdan o'tkazish foydalanishning yana bir imkoniyatidir. AOBS sizga aks ettirilgan qo'zg'atuvchi nurning o'tishini individual ravishda sozlash imkonini beradi;

8. ROI skanerlash (ketma-ket skanerlash va muayyan hududni skanerlash) ham takomillashtirildi: bitta skanerlash vaqtida turli xil qo'zg'alish rejimlari turli hududlarga qo'llanilishi mumkin;

9. Katta hajmdagi 3D yozuvlar, ketma-ket rejimda, tezkor almashtirish qurilmalaridan foyda ko'radi, chunki tezlik tizimning samaradorligini oshiradi;

10. Floresan korrelyatsiya spektroskopiyasi (FCS) past fon va kam yorug'lik tarqalishini talab qiladi Faqat AOBS, masalan, Ar lazerlaridan yaqin atrofdagi emissiya liniyalarini samarali ravishda bloklaydi;

11. Spektral qayd etish (Lambda skanerlash) aniq spektrni ta'minlaydi, chunki AOBS ning yorug'lik o'tkazuvchanligi "oq" bo'lib, u emissiya spektrida o'zgarishlarni keltirib chiqarmaydi - bu dikroikli tizimda spektral skanerlashni amalga oshirishda keng tarqalgan muammo hisoblanadi. nometall;

12. Haqiqiy konfokal optik kesma nuqtali yoritishni va spot floresansini qayd qilishni talab qiladi. AOBS konfokal nuqta skanerlari bilan foydalanish uchun javob beradi;

13. Multifoton yoki ultrabinafsha tasvirlash xatolar va cheklovlarsiz parallel ravishda amalga oshirilishi mumkin. AOBS ko'rinmas lazerlarning qo'zg'alishini o'zgartirmaydi va floresans spektrini o'zgartirmaydi;

14. Noto'g'ri operatsiyani bajarish mumkin emas, chunki AOBS haydovchi boshqaruvi bilan birgalikda AOTF (Akustik optik sozlanishi filtr) tomonidan boshqariladi. Agar qo'zg'alish chizig'i tanlangan bo'lsa, AOBS mos ravishda dasturlashtiriladi. Operator qaror qabul qilishi shart emas - ish to'g'ri va avtomatik tarzda amalga oshiriladi;

15. Hech qanday noto'g'ri chiziq yo'q, chunki filtr barabanlari va slayderlarga xos bo'lgan harakatlanuvchi elementlar yo'q. Kristal mustahkam o'rnatilgan, dasturlash elektron tarzda amalga oshiriladi;

16. Filtr kublari, dikroik oynali slayderlar va boshqalar kabi qimmatbaho qo'shimcha uskunalarga ehtiyoj yo'q. Shu sababli, yangi optik elementlarni o'rnatish uchun texnik yordam narxi ancha past.

Guruch. 14. AOBS - akusto-optik nurlarni ajratuvchi.

SP-Detector - bu spektral fotometr sensori. Induktsiyalangan floresan spektrlarining yig'indisi bo'lgan namunadagi yorug'lik konfokal optik qismni tashkil etuvchi teshik diafragmasidan o'tadi. Bundan tashqari, prizma yordamida bu yorug'lik spektrga parchalanadi. Birinchi detektordan o'tayotganda yorug'lik qo'zg'aluvchan ikkita panjurdan iborat tirqishli fotometr qurilmasidan o'tadi. Ushbu panjurlar diapazonning har ikki tomonidagi spektrning chekkalarini kesib, ularni 2 va 3-darajali datchiklarga yo'naltiradi. Natijada, spektr bir vaqtning o'zida beshta kanalga bo'linadi. Natijada, SP detektoridan foydalanganda, namunadagi turli bo'yoqlardan nurlanish qayd etiladi.

Guruch. 15. Spektral detektor SP.

SP detektori lambda skanerlash imkonini beradi: eksperimentga jalb qilingan bo'yoqlarning xususiyatlarini darhol tahlil qilish uchun spektral tasvirlar to'planadi.

2013 yil 4 iyun

Moskva davlat universitetining biologiya fakultetida olib borilayotgan ilmiy tadqiqotlarning muhim qismini, ular bilan chambarchas bog'liq bo'lgan o'quv dasturlarini muvaffaqiyatli amalga oshirishni eng zamonaviy mikroskopik texnologiyadan foydalanmasdan tasavvur qilib bo'lmaydi. Moskva universitetining Taraqqiyot dasturi doirasida biologiya fakultetida konfokal mikroskopiya bo‘yicha kafedralararo laboratoriya tashkil etilib, zarur jihozlar bilan to‘liq ta’minlangan va samarali faoliyat ko‘rsatmoqda.

Matritsa makroporasi devorlarida 3T3 fibroblastlar

Matn: Tretyakov Artemi

Nima qila oladi?

Yordamida konfokal mikroskop siz hujayraning virtual bo'limlarining bir nechta tasvirlarini yoki ulardan yig'ilgan uch o'lchamli modelni olishingiz mumkin. Bunday imkoniyatlar lazer tomonidan ta'minlanadi, uning nurlari hujayraning istalgan nuqtasiga yo'naltirilishi mumkin. Tasvirni olish uchun ob'ekt lyuminestsent faol bo'lishi kerak, ya'ni lazer nuri unga (aniqrog'i, uning tarkibidagi ma'lum molekulalarga) urilganda, u unga tushganidan ko'ra ko'proq to'lqin uzunligiga ega bo'lgan yorug'lik chiqarishi kerak. mikroskop. Tasvir aynan shu floresans asosida qurilgan.

Surat

Bu qanday ishlaydi?

“Fundamental va amaliy fanlararo ilmiy tadqiqotlarning hozirgi rivojlanish darajasi, shuningdek, fanlararo kompetensiyalarga ega bo‘lgan mutaxassislarni tayyorlash vazifalari moddiy-texnika bazasini jadal rivojlantirish va modernizatsiya qilishni talab qiladi” (Moskva universitetining rivojlanish dasturi, 5-bet;). .

Lazerdan tashqari, elektromexanik qurilma lazer nurini uzatuvchi optik filtrni ham o'z ichiga oladi, lekin "pinhole" deb ataladigan diafragmaga uzunroq to'lqinli yorug'likni aks ettiradi (inglizchadan. Pinhole - pin bilan qilingan teshik, so'zma-so'z tarjima barcha keraksiz fon yorug'ligini o'chiradigan va shu bilan hujayraning skanerlangan maydoni tasvirining ravshanligiga pastki optik qatlamlarning ta'sirini kamaytiradigan yoki butunlay inkor etadigan pinhole qurilmasini mukammal tavsiflaydi. Agar fon yorug'ligi pin teshigi bilan o'chirilmagan bo'lsa, u holda optik qatlamlar bir-biriga yopishib, kuzatuvchiga to'sqinlik qiladi - go'yo u barglar orqali uzoqqa qaragandek. Diafragma orqasida olingan ma'lumotni raqamlashtiradigan fotodetektor mavjud.

Bunday "nuqta" skanerlash vaqt talab qilishi aniq. Konfokal tizimda ushbu jarayonni tezlashtirish uchun aylanadigan disk deb ataladigan boshqa modul ishlatiladi, bu lazer operatsiyasining bir aktida bir nuqta emas, balki butun chiziq tasvirini olish imkonini beradi.

Bunday tizim uchun patent 1961 yilda MIT professori Marvin Minski tomonidan olingan. Uning faol qo'llanilishi 80-yillarda boshlangan va hozirda konfokal mikroskopiya o'zining gullash davrini boshdan kechirmoqda. Rossiyada birinchi mikroskop 2003 yilda paydo bo'lgan, bu Axiovert 200M LSM510 Meta edi. Boshqalar ham ergashdilar va hozir mamlakatimizda bir nechta yirik laboratoriyalar, jumladan, Moskva davlat universitetining biologiya fakultetida kafedralararo laboratoriya mavjud. Laboratoriya ixtiyorida beshta mikroskop mavjud, jumladan: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

Konfokal mikroskopiya nafaqat eng yuqori kontrast va uch o'lchovlilikka erishdi, balki to'rtinchi o'lchovni - vaqtni ham o'zlashtirdi, bu hujayralardagi o'zgarishlarni o'rganish imkonini berdi. Ushbu maqsadlar uchun har bir o'rnatish hayotni qo'llab-quvvatlash tizimlari bilan jihozlangan. Bularning barchasi ushbu imkoniyatlardan muvaffaqiyatli foydalanayotgan tadqiqotchilarga keng imkoniyatlar yaratadi.

Va biz Moskva davlat universitetining biologiya fakulteti laboratoriyasi haqida gapirayotganimiz sababli, ushbu laboratoriyada olib borilgan tadqiqotlarni misol sifatida keltirish kerak.

Ipak va to'r

Konfokal mikroskopiya nafaqat eng yuqori kontrast va uch o'lchovlilikka erishdi, balki to'rtinchi o'lchovni - vaqtni ham o'zlashtirdi, bu hujayralardagi o'zgarishlarni o'rganish imkonini berdi.

Qiziqarli ishlardan biri qon tomirlari va boshqa ichi bo'sh organlarni tiklash uchun biologik parchalanadigan protezlarni yaratishdir. Bunday to'qimali muhandislik inshootlari tashqi tomondan, eng oddiy hollarda, shikastlangan joyga qo'yiladigan quvurlar yoki plyonkalarni ifodalaydi va shu bilan "yamoq" rolini bajaradi. Ular turli xil materiallardan, jumladan, ipak qurti pilla ipak fibroinidan tayyorlanishi mumkin. Ushbu materialning afzalligi shundaki, u barqaror va moslashuvchan va bardoshli protez tuzilishini hosil qiladi. Protezning o'zi faqat yalang'och ko'z bilan ko'rilganda plyonkaga o'xshaydi, aslida bu matritsa - ko'p qatlamli asos, tirik to'qimalarning tuzilishiga taqlid qiluvchi ramka. Bu iskala yangi hujayralarning to'g'ri joylashishiga yordam beradi va ularning bir tekis taqsimlanishini ta'minlaydi. Natijada organning shikastlangan devori tiklanadi va keraksiz bo'lib qolgan ramka biodegradatsiyaga uchraydi. Ammo hujayralar iskala bo'ylab qanchalik teng taqsimlanganligini, shuningdek, ular matritsaning chuqur qatlamlarida yaxshi yashaydimi yoki yo'qligini (agar gaz almashinuvi va metabolik mahsulotlar almashinuvida qiyinchiliklar mavjud bo'lsa) tekshirish oson emas. ular ichiga kirganlarida morfologiyani o'zgartiradilar, unchalik oson emas. Aynan shu bosqichda mikroskopdan foydalanish (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) vazifani ancha soddalashtirdi. Asosan, ob'ektni buzilmasdan tekshirish qobiliyati, shuningdek, mikroskopning matritsa ichiga 600 mikrongacha bo'lgan chuqurlikka qarash qobiliyati tufayli.

Surat

Xuddi shunday ish suyak to'qimasi bilan ham amalga oshirildi, uning matritsasi ham xuddi shu fibroindan, ham o'rgimchak tanasida topilgan va u tomonidan to'rlarni to'qish uchun ishlatiladigan oqsil bo'lgan spidroindan qilingan. Laboratoriya sharoitida oqsil umuman o'rgimchaklar tomonidan emas, balki xamirturush tomonidan ishlab chiqariladi, uning genomiga ushbu oqsilning sintezi uchun javob beradigan biroz o'zgartirilgan o'rgimchak geni kiritilgan.

Juda oddiy emas

Ammo, agar to'qimalarda shikastlanishning paydo bo'lishi oddiy va tushunarli jarayon bo'lsa, boshqa patologiyalar har doim ham aniq emas. Va samarali davolanishni boshlashdan oldin va bundan tashqari, ularning rivojlanishining oldini olish uchun ularning paydo bo'lish mexanizmini aniqlash kerak. Bularga ateroskleroz kiradi - arteriyalar kasalligi, buning natijasida lipidlar tomir devorida, to'g'rirog'i, intimada - uning ichki qatlamida to'planib, devorni qalinroq qiladi, bu esa oxir-oqibatda tomirlarning to'liq bloklanishiga olib kelishi mumkin. kema. Ushbu kasallik nima sodir bo'lganligi sababli, immunokompetent hujayralar qanday rol o'ynashi aniq emasligi kabi, to'planish joylarida tez orada aterogenez boshlanadi. Bu savollarga to'liq javoblar hali topilmadi, ammo aterogenezni o'rganish davom etmoqda, garchi bu mavzu bo'yicha to'qima protezlari mavzusiga qaraganda ancha kam nashrlar mavjud.

Surat

Molekulalarning taqdiri

Konfokal mikroskopiya kafedralararo laboratoriyasidan 10 ga yaqin kafedraning 20 dan ortiq bakalavriat va magistratura talabalari muntazam foydalanmoqda.

Yuqorida tavsiflangan tadqiqotlarda asosan hujayralar holati kuzatiladi. Ammo konfokal mikroskopning imkoniyatlari bu bilan cheklanmaydi, u lyuminestsent faollikka ega bo'lsa, u hatto hujayradagi bitta molekulaning taqdirini ham kuzatishga qodir. Buning uchun molekulalar odatda ftoroxromlar bilan belgilanadi - bu faollikka ega bo'lgan maxsus bo'yoqlar. Ftoroxromlar alohida molekulalar sifatida mavjud bo'lib, ularning yorlig'i tadqiqotchini qiziqtirgan molekulaga ftoroxromning kimyoviy bog'lanishidan iborat. Shundan so'ng, bunday etiketli molekulalar hujayra ichiga kiradi va ularning keyingi taqdiri mikroskop yordamida nazorat qilinadi. Shu tarzda, masalan, ritsin va viskumin hujayrasidagi faollik va harakatlar solishtirildi. Ikkala modda ham oqsil toksinlari bo'lib, ikkalasi ham o'simlikdan kelib chiqadi va ikkita qismdan iborat - subbirliklardan iborat bo'lib, ulardan biri hujayra bilan bog'lanish va ichkariga kirish uchun javobgardir, ikkinchisi esa ribosomani inaktivatsiya qilish uchun, natijada hujayra o'limiga olib keladi. Amaliy foyda yana bir xavfli kasallik - saraton kasalligini davolash bilan bog'liq. Subbirliklar orasidagi bunday aniq "vazifalarni ajratish" birinchi bo'linmani, masalan, antikor bilan almashtirishga imkon beradi. Siz faqat ushbu antikor mos keladigan ba'zi hujayralarga ta'sir qiluvchi "immunotoksin" olasiz. Ikkita asosiy muammo bor. Birinchisi: saraton hujayralariga yaqinlashadigan va toksinning sog'lom hujayralarga kirishiga to'sqinlik qiladigan antikorni tanlash. Ikkinchisi: immunotoksinga aylantirilganda yuqori samarali bo'lib qoladigan toksinni tanlash.

Surat: Yangi tug'ilgan kalamushlarning yurak hujayralarining birlamchi madaniyati: A - nazorat, B - kun davomida 20 mkM izoproterenol bilan davolash. 1 - mitoxondriyalarni TMRE bilan bo'yash; 2 - fazali kontrast. Masshtab 10 mkm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. "Izoproterenol ta'sirida yangi tug'ilgan kalamushlarning madaniyatli kardiyomiyositlari mitoxondriyalarida adaptiv o'zgarishlar". "Retseptorlar va hujayra ichidagi signalizatsiya" xalqaro konferentsiyasi 24-26 MAY 2011 yil, Pushchino).

Ta'lim

Konfokal mikroskopiya yordamida amalga oshirilgan ishlar ro'yxatini uzoq vaqt davomida davom ettirish mumkin. Tirik hujayralar bilan ishlashga imkon beruvchi samarali usul deyarli har qanday ilmiy tadqiqotlarda talabga ega. Shuning uchun talabalarni ushbu laboratoriyada ishlashga tayyorlash katta rol o'ynaydi. Unga kurs, kurs oldi va diplom ishlariga jalb qilingan 20 dan ortiq bakalavriat va magistratura talabalari muntazam tashrif buyurishadi.

Muassasalarda embriologlar, molekulyar biologlar, sitologlar, bioinjenerlar, immunologlar, zoologlar ishlaydi.

Konfokal mikroskopiya laboratoriyasi 2004 yilda tashkil etilgan.

Laboratoriya mudiri – dotsent M.M.Moysenovich

Laboratoriyada yosh mutaxassislar A.A.Ramonova, A.Yu.Arxipovalar faoliyat yuritmoqda

Hozirgi vaqtda laboratoriyada 2 ta konfokal tizim o'rnatilgan:

• LSM510 META konfokal biriktirgichli Axiovert 200M (Karl Zeiss, Germaniya)
• "NIKON CORPORATION" (Yaponiya) tomonidan ishlab chiqarilgan konfokal lazerli skanerlash tizimi - laboratoriya tadqiqotlari uchun teskari biomedikal mikroskop Eclipse aksessuarlari bilan: Ti-E stendli, TIRF yoritgichli, A1 konfokal modulli va aylanadigan diskga asoslangan konfokal modulli .

Barcha yangiliklar "

Margolin 389s.

Optik mikroskopiya texnika va texnologiyaning barcha yutuqlaridan, shuningdek, axborot va kompyuter texnologiyalaridan foydalangan. Bu mavjud asbob-uskunalar va ulardan foydalanish usullarining sezilarli darajada yaxshilanishiga olib keldi, bu esa, o'z navbatida, yangi usullarning, xususan, konfokal mikroskopiyaning paydo bo'lishiga olib keldi. Konfokal mikroskopning klassik optik mikroskopdan farqi shundaki, ob'ektning bir nuqtasi tasviri vaqtning har bir momentida qayd etiladi va skanerlash (namunani siljitish yoki optik tizimni qayta qurish) orqali to'liq huquqli tasvir yaratiladi. Shunday qilib, elektron mikroskopni skanerlash printsipi o'ziga xos shaklda amalga oshiriladi, bu har bir alohida nuqtadan signalni o'zboshimchalik bilan uzoq vaqt davomida yozib olish va qayta ishlash imkonini beradi.

Klassik mikroskopda namunaning turli nuqtalaridan yorug'lik fotodetektorga kiradi. Konfokal mikroskopda yorug'likni faqat bir nuqtadan ro'yxatga olish uchun ob'ektiv linzadan keyin kichik diafragma qo'yiladi, shunda tahlil qilinayotgan nuqtadan chiqadigan yorug'lik diafragma orqali o'tadi va yoziladi, yorug'lik esa diafragma orqali yoziladi. Qolgan nuqtalar asosan diafragma tomonidan saqlanadi, rasmda ko'rsatilgandek. 7.28.

Guruch. 7.28. Konfokal optik mikroskopda nurlarning o'tish sxemasi

Yana bir xususiyat shundaki, yoritgich ko'rish maydonining bir xil yoritilishini yaratmaydi, balki yorug'likni tahlil qilinadigan nuqtaga qaratadi. Bunga namunaning orqasida ikkinchi fokuslash tizimini joylashtirish orqali erishish mumkin, ammo buning uchun namuna shaffof bo'lishi kerak. Bundan tashqari, ob'ektiv linzalar odatda qimmatga tushadi, shuning uchun yorug'lik uchun ikkinchi fokuslash tizimidan foydalanish qiyin. Shu bilan bir qatorda, tushayotgan va aks ettirilgan yorug'lik bir xil ob'ektiv tomonidan yo'naltirilishi uchun nur ajratgichdan foydalanish mumkin. Bunday sxema ham sozlashni osonlashtiradi.

Keling, konfokal mikroskopdan foydalanganda kontrast qanday va qanday miqdorda o'zgarishini ko'rib chiqaylik. Konfokal mikroskopda yorug'lik linzalardan ikki marta o'tganligi sababli, nuqta loyqalash funktsiyasi (bundan buyon matnda PSF deb yuritiladi) foton o'z koordinatalari bilan nuqtaga tegishi yoki foton shu nuqtadan ro'yxatga olinishining mustaqil ehtimollarining mahsuloti bo'ladi.

Agar siz rezolyutsiya uchun Rayleigh mezonidan foydalansangiz, konfokal mikroskopda aniqlik oshadi, lekin sezilarli darajada emas. Konfokal mikroskop uchun bizda r o'lchamlari uchun ifoda mavjud:

An'anaviy mikroskop uchun esa:

Biroq, konfokal mikroskopning asosiy afzalligi Rayleigh mezoni ma'nosida piksellar sonini oshirish emas, balki kontrastni sezilarli darajada oshirishdir. Xususan, fokus tekisligidagi an'anaviy PSF uchun birinchi lateral maksimaldagi amplitudaning markazdagi amplitudaga nisbati 2%, konfokal mikroskop uchun esa bu nisbat 0,04% bo'ladi. Bundan kelib chiqadiki, intensivligi, masalan, yorqin ob'ektnikidan 200 baravar kam bo'lgan xira ob'ektni an'anaviy mikroskopda aniqlab bo'lmaydi, garchi ob'ektlar orasidagi masofa Rayleigh mezonida belgilangan masofadan sezilarli darajada katta bo'lishi mumkin. . Shu bilan birga, bunday ob'ektni konfokal mikroskopda yaxshi qayd etish kerak.

Muhim parametr - nurlantiruvchi va konvergent linzalarning fokus tekisligidagi diafragma o'lchami. Ob'ekt tekisligidagi diafragma tasviri fotodetektor tomonidan yorug'lik qaysi sohalardan qayd etilganligini aniqlaydi. Ko'rinib turibdiki, diafragma o'lchamini kamaytirish uzatiladigan yorug'lik miqdorining pasayishiga olib keladi, shovqin darajasini oshiradi va natijada erishilgan kontrastning barcha afzalliklarini inkor etishi mumkin. Shunday qilib, diafragma o'lchamini optimal tanlash va oqilona kelishuv haqida savol tug'iladi.

Havo nuqtasidan kichikroq diafragma shunchaki intensivlikning yo'qolishiga olib keladi va hech qanday tarzda rezolyutsiyaga ta'sir qilmaydi. Bir teshik o'lchamiga ega bo'lgan diafragma ob'ektiv linzalarning o'lchamlarini maksimal darajada oshiradi. Biroq, teshik o'lchami Havo joyidan 3-5 baravar katta bo'lgan diafragma eng mos keladigan murosaga o'xshaydi. Shuni tushunish kerakki, bu erda muhokama qilinadigan o'lcham ob'ekt tekisligidagi tasvirning o'lchamining ma'nosiga ega va shuning uchun diafragmadagi teshikning haqiqiy hajmi linzalarning kattalashishiga bog'liq. Xususan, 100x ob'ektivdan foydalanganda, 1 mm diafragma bilan diafragma ob'ekt tekisligiga radiusi 10 mkm bo'lgan doira ichiga proyeksiyalanadi.

Konfokal mikroskopiya g'oyasining rivojlanishi kuzatilayotgan ob'ektlarning shakli va fazoviy tuzilishini tahlil qilish uchun yanada sezgir va metrologik jihatdan qat'iy usullarga ehtiyoj tufayli yuzaga kelgan konfokal lazerli skanerlash mikroskopining (KJICM) rivojlanishi edi. Asosiy funktsional ulanishlar bilan KLSM ning sxematik diagrammasi rasmda ko'rsatilgan. 7.29.

CLSM ning asosiy xususiyati o'rganilayotgan ob'ektni yuqori aniqlik va past shovqin darajasi bilan qatlam-qatlam tasvirlash imkoniyatidir. Bunga ob'ektni izchil manbadan yo'naltirilgan yorug'lik nuri bilan bosqichma-bosqich skanerlash yoki maxsus lyuminestsent zondlar va yorug'lik oqimlarini cheklashning maxsus usullari yordamida sahnani siljitish orqali erishiladi.

Guruch. 7.29. KJICM ning strukturaviy diagrammasi:

1 - skanerlash jadvali; 2 - sinov namunasi; 3, 6 - linzalar; 4 - skanerlash qurilmasi; 5 - nurni ajratuvchi plastinka; 7, 9 - igna diafragmalari; 8 - radiatsiya qabul qiluvchi; 10 - lazer; 11 - boshqaruv bloki; 12 - kompyuter; 13 - eksa skanerlash drayveri z.

CLSMda o'lchamlari mikroskopning kattalashishi va to'lqin uzunligiga mos keladigan teshik diafragmasidan foydalanish ruxsatni 10% dan ortiq oshirish imkonini beradi. Shubhasiz, CLSM ning o'lchamlari va shunga mos ravishda nozik tuzilmalarni tahlil qilish imkoniyatlari preparatni ingichka nur bilan skanerlash sharoitida an'anaviy mikroskopning o'xshash imkoniyatlaridan 40% dan ko'p bo'lmagan miqdorda oshib ketishi mumkin. KLCMning o'lchamlari mikroskopiya va yoritish usuliga bog'liq. KLCM o'lchamlari aniqlanadi ham optik tizim, ham elektron yo'l axborotni qayta ishlash. Shuning uchun KLCMni loyihalashda uning sxemalari, optik tizimning ruxsati, skanerlash bosqichi, detektor xarakteristikalari kabi parametrlarni muvofiqlashtirish va optimal ishlov berish algoritmlari va tegishli dasturiy ta'minotni tanlash kerak.

Umumiy holda, KLCM maydonining chuqurligi diafragma, to'lqin uzunligi, yorug'lik manbalarining kogerentligi va igna diafragmasining o'lchamiga bog'liq. Ignali diafragma KLCM ni boshqa turdagi mikroskoplardan ajratib turadigan asosiy dizayn elementidir. Igna diafragmalari fokus tekisligiga to'g'ri kelmaydigan yoki fokus tekisligida tahlil qilinadigan ob'ekt elementi yaqinida joylashgan nuqtalardan tasvir tekisligiga kiradigan yorug'likni maksimal yoki to'liq filtrlash uchun sharoit yaratish uchun mo'ljallangan.

Qurilmaning kerakli xususiyatlarini olish uchun igna diafragmasining optimal diametrini tanlash muhimdir. KJICM lateral o'lchamlari va maydon chuqurligini baholash uchun aloqalar igna diafragmasi yorug'lik nuqtasi bo'lgan kichik diafragmaga ega degan faraz ostida olinadi. Haqiqatda, igna diafragmasining o'lchami cheklangan va qurilmaning ko'ndalang o'lchamlari, o'q bo'ylab fokus tekisligiga nisbatan siljigan preparatning yoritilgan elementlarining yorqinligi unga bog'liq. z, va maydon chuqurligi. Igna diafragmasining kichik diametrlari bilan yorug'lik oqimi kichik bo'ladi, bu signal-to-shovqin nisbatini pasaytiradi va kontrastni pasaytiradi. Katta diametrlarda diafragma diafragmasining samaradorligi diafragmani qisqartirish orqali kamayadi.

Asosiy tushuncha

Minskow patentidan konfokal nuqta sensori printsipi

Konfokal mikroskopiya printsipi 1957 yilda Marvin Minski tomonidan patentlangan va an'anaviy keng burchakli floresan mikroskoplarning ba'zi cheklovlarini bartaraf etishga qaratilgan. An'anaviy (ya'ni keng maydon) floresan mikroskopda butun namuna yorug'lik manbasidan yorug'lik bilan teng ravishda to'ldiriladi. Optik yo'ldagi namunaning barcha qismlari bir vaqtning o'zida qo'zg'atiladi va hosil bo'lgan floresans fotodetektor mikroskop yoki kameralar, shu jumladan katta fokuslanmagan fon qismi yordamida aniqlanadi. Bundan farqli o'laroq, konfokal mikroskop fokusdan tashqari signallarni istisno qilish uchun yorug'lik nuqtasini (nuqtani yoyish funktsiyasiga qarang) va detektor oldidagi optik konjugatsiyalangan tekislikdagi kichik teshikdan foydalanadi - "konfokal" nomi ushbu konfiguratsiyadan kelib chiqadi. Fokus tekisligiga juda yaqin joylashgan lyuminestsent tomonidan chiqarilgan yorug'lik aniqlangandan so'ng, optik o'lchamdagi tasvir, xususan, namuna chuqurligi yo'nalishida, keng maydonli mikroskoplarga qaraganda ancha yaxshi bo'ladi. Biroq, lyuminestsent namunadagi yorug'likning ko'p qismi ponksiyon bilan bloklanganligi sababli, bu yuqori o'lcham signalning intensivligining pasayishi hisobiga keladi - shuning uchun ko'pincha uzoq ta'sir qilish talab etiladi. Keyinchalik signalning bu pasayishini qoplash uchun teshik, yorug'lik qizg'inligi sezgir detektor yordamida aniqlanadi, odatda fotoko'paytiruvchi naycha (PMT) yoki ko'chki fotodiodi, yorug'lik signalini kompyuter tomonidan qayd qilinadigan elektr signaliga aylantiradi.

Namunaning bir nuqtasi bir vaqtning o'zida yoritilgandan so'ng, 2D yoki 3D tasvirlarni namunadagi oddiy rastr (ya'ni, parallel skanerlash chiziqlarining to'rtburchaklar namunasi) orqali skanerlash talab qilinadi. Nur namuna bo'ylab gorizontal tekislikda bir yoki bir nechta (servo boshqariladigan) tebranuvchi nometall yordamida skanerlanadi. Ushbu skanerlash usuli odatda past reaktsiya kechikishiga ega va skanerlash tezligi o'zgarishi mumkin. Sekin skanerlash signal-shovqin nisbatini yaxshilaydi, natijada kontrast yaxshilanadi va piksellar sonini oshiradi.

Fokus tekisligining erishish mumkin bo'lgan qalinligi asosan ishlatiladigan yorug'likning to'lqin uzunligini ushbu ob'ektivning raqamli diafragmasiga bo'lingan holda, shuningdek, namunaning optik xususiyatlari bilan belgilanadi. Nozik optik kesish, ehtimol, bu turdagi mikroskoplarni 3D vizualizatsiya va namunalarning sirt profilini yaratishda ayniqsa yaxshi qiladi.

Ketma-ket bo'laklar "Z-stack" ni tashkil qiladi, uni maxsus 3D tasvirlash dasturi tomonidan qayta ishlanishi mumkin yoki u 2D stekga birlashtiriladi (asosan maksimal piksel intensivligi olinadi, boshqa keng tarqalgan usullar standart og'ish yoki piksellarni yig'ishdan foydalanishni o'z ichiga oladi).

Konfokal mikroskopiya buzilmagan, yog 'va jonli namunalarni to'g'ridan-to'g'ri, invaziv bo'lmagan, ketma-ket optik qismlarga bo'lish qobiliyatini minimal namuna tayyorlash bilan, shuningdek, lateral piksellar sonini yaxshilash imkonini beradi. Tanlangan ob'ektlarni ko'rinadigan qilish uchun biologik namunalar ko'pincha floresan bo'yoqlar bilan ishlanadi. Biroq, biologik tizimlarning buzilishini minimallashtirish uchun haqiqiy bo'yoq kontsentratsiyasi past darajada saqlanishi mumkin: ba'zi asboblar individual floresan molekulalarni kuzatishi mumkin. Bundan tashqari, transgenik usullar o'zlarining kimerik lyuminestsent molekulalarini ishlab chiqaradigan organizmlarni yaratishi mumkin (masalan, GFP, qiziqish oqsili bilan yashil floresan oqsilning sintezi). Konfokal mikroskoplar namunadagi nuqta qo'zg'alishi (nuqta bilan chegaralangan diffraktsiya) va hosil bo'lgan floresan signalni nuqta aniqlash printsipi asosida ishlaydi. Detektordagi teshik fokusdan tashqari floresansni bloklaydigan jismoniy to'siqni ta'minlaydi. Faqat fokus yoki Airy diskining markaziy nuqtasi yozib olinadi. Namunani bir vaqtning o'zida rastrli skanerlash Z-fokusni oddiygina o'zgartirish orqali nozik optik qismlarni yig'ish imkonini beradi. Olingan tasvirlar namunaning 3D tasvirini yaratish uchun yig'ilishi mumkin.

Gorizontal skanerlash uchun ishlatiladigan usullar

Savdoda to'rt turdagi konfokal mikroskoplar mavjud:

Konfokal lazerli skanerlash mikroskoplari lazerni namunaga skanerlash va qo'zg'almas teshik va detektor orqali tasvirni "deskanerlash" uchun bir nechta nometalldan (odatda x va y o'qi bo'ylab 2 yoki 3 ta skanerdan) foydalanadi.

Foyda

CLSM hujayra biologiyasi va genetikasidan mikrobiologiya va rivojlanish biologiyasigacha bo'lgan ko'plab biologik fan fanlarida keng qo'llaniladi. U kvant optikasi va nano-kristal tasvirlash va spektroskopiyada ham qo'llaniladi.

Biologiya va tibbiyot

Hujayra bo'ylab aktin filamentlarining tarqalishini ko'rsatadigan konfokal mikroskop tasvirlari to'plamiga misol.

Klinik jihatdan, CLSM turli ko'z kasalliklarini baholashda qo'llaniladi va ayniqsa shox pardaning endotelial hujayralarini tasvirlash, sifatli tahlil qilish va miqdorini aniqlash uchun foydalidir. U keratomikoz holatlarida shox parda stromasida filamentli qo'ziqorin elementlarining mavjudligini aniqlash va aniqlash uchun ishlatiladi, bu tezda tashxis qo'yish va shu tariqa aniq terapiyani erta belgilash imkonini beradi. Endoskopik muolajalar (endomikroskopiya) uchun CLSM texnikasini o'rganish ham umid baxsh etadi. Farmatsevtika sanoatida dori vositalarini taqsimlash sifati va bir xilligini nazorat qilish maqsadida yupqa plyonkali farmatsevtik shakllarni ishlab chiqarish jarayonini kuzatish tavsiya etilgan.

Optika va kristallografiya

CLSM ba'zi 3D optik ma'lumotlarni saqlash tizimlarida ma'lumot olish mexanizmi sifatida ishlatiladi va Magdalen papirusining yoshini aniqlashga yordam berdi.

Variantlar va takomillashtirish

Eksenel piksellar sonini yaxshilash

Nuqtalarni yoyish funksiyasi nuqta ellipsoididir, uning uzunligi bir necha marta keng. Bu mikroskopning eksenel o'lchamlarini cheklaydi. Buni bartaraf etishning usullaridan biri 4p mikroskopidir, bu erda tushgan va chiqarilgan yorug'lik yoki ellipsoid hajmini kamaytirish uchun namunaning yuqori va pastki qismiga xalaqit berishi mumkin. Alternativ usul konfokal mikroskop teta. Ushbu texnikada yorug'lik nuri konusi va aniqlanishi kerak bo'lgan yorug'lik bir-biriga burchak ostida joylashgan (ular perpendikulyar bo'lganda eng yaxshi natijalar). Ikki nogironlik funktsiyasining kesishishi ancha kichikroq samarali namuna hajmini beradi. Shundan bitta mikroskop yorituvchi samolyot paydo bo'ldi. Bundan tashqari, dekonvolyutsiyadan eksperimental ravishda olingan nuqta tarqalish funksiyasi yordamida fokusdan tashqaridagi yorug'likni olib tashlash va eksenel va lateral tekisliklarda kontrastni yaxshilash uchun foydalanish mumkin.

super rezolyutsiya

Rag'batlantirilgan emissiya (STED) mikroskoplari kabi diffraktsiya chegarasidan pastroq ruxsatga erishadigan konfokal variantlar mavjud. Ushbu texnikadan tashqari, palma, (e) STORM, SIM va boshqalar kabi boshqa (konfokal bo'lmagan) o'ta aniqlik usullari mavjud. Ularning barchasi o'ziga xos afzalliklarga ega, masalan, foydalanish qulayligi, o'lchamlari va maxsus jihozlarga, buferga yoki floroforga bo'lgan ehtiyoj.

Past harorat

Past haroratlarda namunalarni tasvirlash uchun ikkita asosiy yondashuv qo'llanilgan, ikkalasi ham lazerli skanerlash konfokal mikroskopiya arxitekturasiga asoslangan. Yondashuvlardan biri uzluksiz oqim kriostatidan foydalanishdir: faqat namuna past haroratda va uning optik manzili shaffof oyna orqali amalga oshiriladi. Yana bir mumkin bo'lgan yondashuv - optikani (ayniqsa, ob'ektiv mikroskopni) kriogen saqlash Devarda ajratish. Ushbu ikkinchi yondashuv, garchi og'irroq bo'lsa-da, yaxshi mexanik barqarorlikni kafolatlaydi va deraza tufayli yo'qotishlarni oldini oladi.

tasvirlar

Nipkow diskli konfokal mikroskop bilan o'lchangan 1 evrolik tanganing qisman sirt profili.

1 evrolik tanga uchun aks ettirish ma'lumotlari.

hikoya

Boshlanishi: 1940-1957

Birinchi konfokal skanerlash Mikroskop 1955 yilda Marvin Minskov tomonidan qurilgan va patent 1957 yilda topshirilgan. Fokus tekisligidagi yorug'lik nuqtasini skanerlash sahnani siljitish orqali erishilgan. Hech qanday ilmiy nashr taqdim etilmagan va u bilan yaratilgan rasmlar saqlanib qolmagan.

Tandem skanerlash mikroskop

Petran tandem-skanerlash mikroskopining diagrammasi. Nipkow diskini ko'rsatish uchun qizil chiziq qo'shiladi.

1960 yilda Pilsendagi Charlz universitetining tibbiyot fakulteti chexoslovakiyalik Mojmir Petran birinchi tijoratlashtirilgan konfokal mikroskop bo'lgan Tandem skanerlash mikroskopini ishlab chiqdi. U Chexoslovakiya va Qo'shma Shtatlardagi kichik kompaniyaga Tracor-Northern (keyinchalik NORAN) tomonidan sotilgan va bir nechta qo'zg'alish va teshik emissiyasini yaratish uchun aylanadigan Nipkow diskidan foydalangan.

Chexoslovakiya patenti 1966 yilda chexoslovakiyalik hamkasbi Petran va Milan Hadravskiy tomonidan topshirilgan. Ushbu mikroskop yordamida olingan ma'lumotlar va tasvirlar bilan birinchi ilmiy nashr 1967 yilda Yel universitetidan M. Devid Egger va Petran tomonidan Science jurnalida nashr etilgan. Ushbu maqolaning izohida Petran mikroskopni loyihalashtirgani va uning qurilishini nazorat qilgani va u qisman Yeldagi "do'st" bo'lganligi aytiladi. 1968 yildagi ikkinchi nashrda asbobning nazariyasi va texnik tafsilotlari tasvirlangan va qo'shimcha mualliflar sifatida Yeldagi guruh rahbari Hadravskiy va Robert Galambos bor edi. 1970 yilda AQSh patenti berildi. U 1967 yilda topshirilgan.

1969 yil: Birinchi konfokal lazerli skanerlash mikroskopi

1969 va 1971 yillarda Yel universitetidan M. Devid Egger va Pol Davidovits birinchi konfokalni tavsiflovchi ikkita maqola chop etishdi. lazer skanerlovchi mikroskop. Bu nuqta skaneri edi, ya'ni faqat bitta yorug'lik nuqtasi yaratilgan. U asab to'qimasini kuzatish uchun epi-yorug'lik-aks ettirish mikroskopidan foydalanadi. To'lqin uzunligi 633 nm bo'lgan 5 mVt geliy-neon lazer shaffof oynadan nishon yo'nalishi bo'yicha yorug'likni aks ettirdi. Maqsad fokus uzunligi 8,5 mm bo'lgan oddiy linza edi. Barcha oldingi va eng so'nggi tizimlardan farqli o'laroq, namuna ushbu linzaning (skanerlash maqsadi) harakati bilan skanerdan o'tkazildi, bu esa fokus nuqtasining harakatiga olib keladi. Yoritilgan yorug'lik shaffof oynaga qaytdi, uzatilgan qism nuqtani aniqlash uchun boshqa linzaga yo'naltirildi, uning orqasida fotomultiplikator trubkasi joylashtirildi. Signal CRT osiloskop yordamida tasvirlangan, katod-nur nishon bilan bir vaqtda uzatilgan. Maxsus qurilma Polaroid fotosuratlarini olish imkonini berdi, ulardan uchtasi 1971 yilgi nashrda namoyish etilgan.

Mualliflar in vivo tadqiqotlar uchun floresan bo'yoqlar haqida fikr yuritadilar. Ular Minskining patentidan iqtibos keltiradilar, o'sha paytda Nyu-Yorkdagi Albert Eynshteyn tibbiyot maktabining doktoranti bo'lgan Stiv Baer, ​​u erda konfokal chiziqli skanerlash mikroskopini ishlab chiqdi, "Minskiy mikroskopi" bilan lazerdan foydalanishni taklif qildi va Galambos, Hadravskiyga rahmat. va Petranni muhokama qilish uchun uning mikroskopini ishlab chiqishga olib keldi. Ularning rivojlanishiga turtki shundaki, Tandem skanerlash mikroskopida yorug'lik nurining faqat 10-7 qismi ko'zning bir qismida tasvirni yaratishda ishtirok etadi. Shunday qilib, tasvir sifati ko'pchilik biologik tadqiqotlar uchun etarli emas edi.

1977-1985 yillar: lazerli spotli skanerlar va sahnani skanerlash

1977 yilda Kolin JR Sheppard va Toni Uilson epi-lazerli yoritish, skanerlash bosqichi va fotoko'paytiruvchi naychalar bilan konfokalni detektor sifatida tasvirladilar. Bosqich optik o'q (Z o'qi) bo'ylab harakatlanishi mumkin, bu esa optik ketma-ket bo'limlarga imkon beradi.

1979 yilda Fred Brakenhoff va uning hamkasblari optik kesma va ruxsatni yaxshilashning nazariy afzalliklari amalda haqiqatan ham erishish mumkinligini ko'rsatdi. 1985 yilda ushbu guruh birinchi bo'lib biologik savollarga javob berishga qodir bo'lgan ishonchli konfokal mikroskop tasvirlarini nashr etdi. Ko'p o'tmay, yana ko'plab guruhlar texnologik cheklovlar tufayli haligacha sir bo'lib qolayotgan ilmiy savollarga javob berish uchun konfokal mikroskopiyadan foydalanishni boshladilar.

1983 yilda Oksfordlik IJ Koks va S. Sheppard kompyuter tomonidan boshqariladigan konfokal mikroskopning birinchi ishini nashr etdi. Birinchi tijoriy lazerli skanerlash mikroskopi, SOM-25 bosqichli skaner Oxford Optoelektronika (BioRad tomonidan sotib olingan bir nechta TAKE-ramkalardan keyin) tomonidan 1982 yildan boshlab taklif qilingan. U Oksford guruhi dizayniga asoslangan edi.

1985 yildan beri: nurli skanerlash bilan lazer nuqtali skanerlar

1980-yillarning o'rtalarida Uilyam Bredshou Amos va Jon Grem Uayt va Kembrijdagi molekulyar biologiya laboratoriyasida ishlaydigan hamkasblari birinchi konfokal nurli skanerlash mikroskopini qurdilar. Namuna bilan sahna harakatlanmaydi, aksincha, yorug'lik nuqtali bo'lib, bu tasvirni tezroq olish imkonini beradi: har biri 512 chiziqli soniyada to'rtta tasvir. Oraliq tasvirlar juda bo'rttirilgan, 1-2 metr uzunlikdagi nurning yo'li tufayli, diametri ~ 1 mm bo'lgan an'anaviy iris diafragmasini "teshik" sifatida ishlatishga ruxsat beriladi. Raqamli kamera qo'shilishidan oldin birinchi mikrografiyalar filmga uzoq vaqt ta'sir qilishda olingan. Keyingi takomillashtirish birinchi marta mashg'ulotlarni kengaytirishga imkon berdi. Zeiss bir vaqtning o'zida tijorat CLSM ning Shvetsiyaning Sarastro kompaniyasi tomonidan tarqatilishiga olib keldi. Biznes 1990 yilda Molecular Dynamics tomonidan sotib olingan, ammo oxir-oqibat CLSM to'xtatilgan. Germaniyada 1984 yilda tashkil etilgan Heidelberg Instruments CLSM ni ishlab chiqdi, u dastlab biologiya emas, balki sanoat dasturlari uchun mo'ljallangan edi. Ushbu qog'oz 1990 yilda Leica Lasertechnik kompaniyasiga topshirilgan. Zeiss allaqachon bozorda konfokal bo'lmagan uchuvchi nuqta lazerli skanerlash mikroskopi bo'lib, u konfokalga yangilangan. 1990 yil hisobotida konfokallarning "ba'zi" ishlab chiqaruvchilari ro'yxati: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-North va Zeiss.

1989 yilda Fritz Karl Preikschat o'g'li Ekhard Preikschat bilan zarrachalar hajmini tahlil qilish uchun skanerlash diodli lazer mikroskopini ixtiro qildi. U Ekhard Preikschat bilan birgalikda Lasentec kompaniyasini tijoratlashtirish uchun asos solgan. 2001 yilda Lasentec Mettler Toledo tomonidan sotib olindi (NYSE: MPD). Katta tozalash tizimlarida kristallanish jarayonini in situ nazoratini ta'minlash uchun butun dunyo bo'ylab, asosan, farmatsevtika sanoatida o'n mingga yaqin tizimlar o'rnatildi.

• Ikki fotonli qo'zg'atuvchi mikroskop: Tegishli texnologiyadan foydalansa ham (ikkalasi ham lazerli skanerlash mikroskoplari), multifotonli floresan mikroskoplar qat'iy konfokal mikroskoplar emas. Muddati konfokal mavjudligidan kelib chiqadi diafragma V konjugatsiyalangan fokus tekisligi(konfokal). Ko'p fotonli mikroskoplarda bu diafragma odatda yo'q.
• Jami ichki aks ettirish floresan mikroskop (TIRF) haqida
  konfokal mikroskopiya
  • Virtual CLSM (Java asosidagi)
  • Har xil turdagi mikroskoplar, jumladan, flüoresan va konfokal mikroskoplarda animatsiya va tushuntirish. (Parij Sud universiteti)

  

Konfokal mikroskopiya an'anaviy optik mikroskopiyaga nisbatan bir qator afzalliklarga ega, jumladan, sozlanishi maydon chuqurligi, tasvirni yomonlashtiruvchi fokusdan tashqari ma'lumotlarni yo'q qilish va qalin namunalarning optik qismlarini ketma-ket tahlil qilish qobiliyati. Konfokal usulning mohiyati namunaning qalinligi fokus tekisligidan kattaroq bo'lganda, namunaning bir qismidan yorug'likni o'chirish uchun fazoviy filtrlashdan foydalanishdir (fon yoritilishi). So'nggi yillarda konfokal mikroskopiya mashhurligida portlash sodir bo'ldi, bu qisman an'anaviy optik mikroskopiya uchun tayyorlangan namunalarning juda yuqori sifatli tasvirlarini olish qulayligi va qisman bugungi kunda ko'plab tadqiqot sohalarida qo'llanilishining ko'pligi tufayli. .

Asosiy tushunchalar

Bugungi asboblar eng qadimgi versiyalardan sezilarli darajada farq qilsa-da, Marvin Minski tomonidan kashshof bo'lgan va 1957 yilda patentlangan konfokal tasvirlash printsipi barcha zamonaviy konfokal mikroskoplarda qo'llaniladi. An'anaviy keng maydonli mikroskoplarda butun namuna simob yoki ksenon yorug'lik manbai bilan yoritiladi va tasvir vizual tarzda kuzatiladi yoki tasvirni qabul qilish moslamasi yoki fotografik plyonkaga proyeksiya qilinadi. Konfokal mikroskop bilan tasvirni shakllantirish usuli tubdan farq qiladi. Yoritish bir yoki bir nechta fokuslangan yorug'lik nurlari bilan butun namuna yuzasini skanerlash orqali amalga oshiriladi, odatda lazer yoyi manbasidan. Namunaning yoritilgan maydoni ob'ektiv tomonidan fokuslanadi va keyin kompyuter tomonidan boshqariladigan skaner yordamida skanerlanadi. Namunadagi yorug'lik nurlarining ketma-ketligi pin teshigi (yoki ba'zi hollarda tirqish) orqali fotoko'paytiruvchi trubka (PMT) orqali aniqlanadi, uning chiqishi kompyuterda ko'rsatilgan tasvirga aylanadi. Bo'yalmagan namunalarni ulardan aks ettirilgan yorug'lik bilan kuzatish mumkin bo'lsa-da, ular odatda bir yoki bir nechta floresan bo'yoqlar bilan belgilanadi.

Rasmni olish usullari

Konfokal mikroskop juda ko'p sonli har xil turdagi namunalarni tekshirish uchun turli tasvirlash usullaridan foydalanadi. Ularning barchasi nisbatan qalin bo'laklar yoki butun namuna (umumiy tayyorgarlik) ketma-ketligida optik qismlar deb ataladigan yuqori aniqlikdagi tasvirlarni olishning texnik imkoniyatiga asoslanadi. Optik qism tasvirning asosiy elementidir. Tasvirlarning o'zi bir-biriga bog'langan va bo'yalgan namunalarni bir, ikki, uch va ko'p to'lqin uzunlikdagi yoritish rejimlarida kuzatish orqali olinadi, shu bilan birga turli xil yoritish va bo'yash texnikasi yordamida yaratilgan tasvirlar bir-biri bilan aniq korrelyatsiya qilinadi. Tirik hujayraning tasvirlarini va vaqtincha ochilgan tasvirlar ketma-ketligini (ma'lum vaqt oralig'ida tasvirlarni ro'yxatga olish) olish mumkin va tasvir ketma-ketligiga qo'llaniladigan raqamli ishlov berish usullari tasvirlar seriyasidan birlashtirilgan butun tasvirni yaratishga imkon beradi. z o'qi bo'ylab va namunalarning uch o'lchovli tasvirlari., shuningdek, vaqt ketma-ketligidagi uch o'lchovli ma'lumotlar, ya'ni to'rt o'lchovli tasvir. Dastlabki konfokal mikroskoplarda tasvirlar aks ettirilgan yorug'lik yordamida olingan, ammo, aslida, lazerli skanerlash konfokal mikroskopda mikroskopiyada keng tarqalgan bo'lib foydalaniladigan har qanday uzatiladigan yorug'lik manbasidan foydalangan holda tasvirlash usuli qo'llanilishi mumkin.

Tasvir yaratish

Konfokal mikroskoplar yordamida namuna tayyorlash va tasvirlash jarayonlari, asosan, an'anaviy keng maydon mikroskopida yillar davomida ishlab chiqilgan. Biotibbiyotda konfokal mikroskopning asosiy qo'llanilishi odatda bir yoki bir nechta floresan yorliqlar bilan bo'yalgan tirik hujayralar va to'qimalarning tasvirini olishdir. Nisbatan oddiy protokollarga kiritilishi mumkin bo'lgan va o'ziga xos hujayra organellalari va tuzilmalarini bo'yash uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan juda ko'p turli xil floresan dog'lar mavjud. Mavjud bo'lgan juda ko'p turli xil dog'lar orasida, masalan, yadro, Golji apparati, endoplazmatik to'r, mitoxondriya, shuningdek, hujayralardagi polimerlangan aktinni ko'rsatadigan floresan phalloidin kabi bo'yoqlar mavjud. Qo'llaniladigan namunani tayyorlash usulidan qat'i nazar, konfokal mikroskopiyaning asosiy afzalligi bir vaqtning o'zida bir nechta tasvirlarni yig'ish va ularni kompyuterda raqamli taqdim etish natijasida yuzaga keladigan tasvirni taqdim etish va tahlil qilishning moslashuvchanligidadir.

Konfokal mikroskopiyaning muhim jihatlari

Floresan mikroskopida miqdoriy 3D tasvirlash ko'pincha nazorat qilinadigan va nazoratsiz eksperimental qiymatlar yoki mikroskopning joylashuvi va joylashuvi muammolari tufayli namuna tayyorlash artefaktlari bilan murakkablashadi. Doktor Jeyms B. Pauly tomonidan yozilgan ushbu maqolada keng maydonli floresans va konfokal mikroskopiya natijalarini ko'pincha xiralashtiradigan eng keng tarqalgan ekologik omillar ro'yxati keltirilgan. Muhokama qilingan mavzular orasida lazer tizimi, optik komponentlarning hizalanishi, ob'ektiv kattalashtirish, oqartirish artefaktlari, aberatsiyalar, immersion moy, qoplamaning qalinligi, kvant rentabelligi (kvant samaradorligi) va namuna muhiti kiradi.

Ko'p rangli konfokal mikroskopiyadagi aberatsiyalar

Dizaynning takomillashtirilishi konfokal mikroskopiyani hujayra biologiyasida keng tarqalgan tadqiqot vositasiga aylantiradigan darajada soddalashtirdi. Ammo konfokal mikroskoplar kuchayib borishi bilan ularning optikasiga ko'proq talablar qo'yildi. Haqiqatan ham, keng maydonli mikroskopiyada kichik tasvir nuqsonlarini keltirib chiqaradigan optik aberatsiyalar konfokal mikroskopiyada halokatli bo'lishi mumkin. Afsuski, konfokal mikroskopiyadagi qat'iy optik talablar ko'pincha zaif mikroskopda ham aniq tasvirni kafolatlaydigan optik tizimlar tomonidan qoplanadi. Optika ishlab chiqaruvchilari muayyan ilovalar uchun mo'ljallangan turli xil mikroskop maqsadlarini ishlab chiqaradilar. Ushbu maqola ob'ektiv dizayndagi kelishuvlar konfokal mikroskopiyaga qanday ta'sir qilishini ko'rsatadi.

Konfokal mikroskopda uch rangli tasvir

Lazerli skanerlash konfokal mikroskopi (LSCM) odatda bitta, ikkita va uchta yorliqli lyuminestsent namunalarni raqamli tasvirlash uchun ishlatiladi. Qizil, yashil va ko'k (RGB) ranglardan foydalanish uchta lyuminestsent xujayra belgilarining yorug'lik taqsimotini ifodalashda, har bir nisbiy pozitsiya uchun qo'shimcha rang ishlatilganda va turli rangdagi tasvirlar bitta uchta rangni tashkil qilganda eng informatsiondir. - rangli naqsh. Ushbu bo'limda biz Adobe Photoshop mashhur tasvirni qayta ishlash dasturi yordamida uch rangli konfokal tasvirlarni olish uchun yaqinda nashr etilgan usulning soddalashtirilgan versiyasini ko'rib chiqamiz. Bundan tashqari, konfokal tasvirlarni ifodalash uchun uch rangli tasvirlash protokolini yaratish uchun bir nechta ilovalar muhokama qilinadi. Shuni yodda tutish kerakki, ushbu raqamli usullar LSCM tasvirlari bilan cheklanmaydi va boshqa manbalardan Photoshop-ga import qilingan raqamli tasvirlarga qo'llanilishi mumkin.

Konfokal aks ettiruvchi mikroskopiya asoslari

Konfokal aks ettiruvchi mikroskopiyadan namuna haqida qo'shimcha ma'lumot olish uchun nisbatan kam qo'shimcha kuch sarflanishi mumkin, chunki texnikalar namunani minimal tayyorlash va uskunani qayta sozlashni talab qiladi. Bundan tashqari, konfokal aks ettiruvchi mikroskopiyada, bo'yalmagan to'qimalar haqidagi ma'lumotlar, bo'yalgan, aks ettiruvchi namunalardan olingan ma'lumotlar kabi oson mavjud. Bu usul ham keng tarqalgan floresan tasvirlash usullari bilan birlashtirilishi mumkin. Yaqinda qo'llanilgan ilovalarga misollar floresan bo'yalgan hujayralar populyatsiyasida bo'yalmagan hujayralarni ro'yxatga olish va shaffof bo'lmagan strukturali substratda o'sadigan floresan bo'yalgan hujayralar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlarni kuzatish.

Konfokal tasvirlar galereyasi

Nikon MicroscopyU konfokal tasvirlar galereyasi Nikon PCM-2000 konfokal mikroskop yordamida Eclipse E-600 tik mikroskop bilan birlashtirilgan raqamli tasvirlar seriyasidir. Namunaning turli tekisliklarida optik kesmalarning tasvirlari ketma-ketligi mikroskopning optik o'qi bo'ylab skanerlash orqali olingan. Bu ketma-ketlik interaktiv Java ilovasi bilan ifodalanadi, bu sizga bir qator tilimlarni avtomatik ravishda "o'ynash" yoki ularni slaydlar kabi oldinga va orqaga aylantirish imkonini beradi.

Lazerli skanerlash konfokal mikroskop

Odatda mikroskoplar tomonidan ishlab chiqarilgan qalin namunalarni ko'rishga xos bo'lgan yomon kontrast fenomenini bartaraf etish uchun bir nechta usullar ishlab chiqilgan. Konfokal va dekonvolyutsiya usullari o'rtacha qalinlikdagi namunalarning (5 dan 15 mikrongacha) sezilarli darajada yaxshi tasvirlarini ishlab chiqaradi. Eng qalin namunalar (20 mikron yoki undan ko'p) fokuslanmagan hududlardan yuqori yorug'lik ta'sirida buziladi va ehtimol konfokal mikroskopiya usullari bilan eng yaxshi olinadi. Ushbu qo'llanmada namunalar virtual konfokal mikroskop yordamida Z o'qi bo'ylab bir qator optik qismlar sifatida taqdim etiladi.

Ko'zgu konfokal mikroskopiyasi

Ushbu qo'llanma yordamida siz integral mikrosxemalar yuzasining alohida qatlamlarini tekshirishingiz mumkin. Yo'l-yo'riq uchun raqamli tasvirlar Nikon Optiphot C200 aks ettiruvchi konfokal mikroskop yordamida olingan. Har bir seriya uchun z-o'qi bo'ylab optik bo'limlar ketma-ketligi mikroskopning kremniy kristalining yuzasida zanjirlar mozaikasiga chuqur kirib (1 mikrometrlik qadam bilan) fokuslanganida qayd etilgan.

Asosiy fikrlar

An'anaviy mikroskopiya bilan solishtirganda, konfokal mikroskopiya bir qator afzalliklarga ega, jumladan o'rganilayotgan namunaga sayoz chuqurlik, fon yoritilishining yo'qligi va qalin namunalarning bir qator optik qismlarini olish qobiliyati. Biotibbiyotda konfokal mikroskopiyaning asosiy qo'llanilishi odatda bir yoki bir nechta floresan yorliqlar bilan belgilanadigan tirik hujayralar va to'qimalarni tasvirlashdir.

Guruch. 1. Konfokal mikroskopda nurlar yo`lining sxemasi

An'anaviy keng maydon mikroskopida lyuminestsent namunalarni tasvirlashda namuna tomonidan o'rganilmagan joylardan chiqadigan ikkilamchi nur ko'pincha diqqat markazidagi tafsilotlarning aniqligiga xalaqit beradi. Bu, ayniqsa, qalinligi 2 mikrometrdan ortiq bo'lgan namunalar uchun muammoli. Konfokal mikroskopiya o'q bo'ylab ham, tekislikda ham aniqlikni biroz yaxshilaydi; Ammo aynan qalin floresan bo'yalgan namunalarda yuzaga keladigan fon yorug'ligini istisno qilish qobiliyati ushbu tadqiqot usulining so'nggi paytlarda mashhurligining oshishiga olib keldi. Ko'pgina zamonaviy konfokal mikroskoplarning ishlashi nisbatan oson bo'lganligi sababli, ko'p foydalanuvchili ko'rish tizimlarining asosiy jihozlarining bir qismiga aylandi. Lazerli skanerlovchi konfokal mikroskop (LSCM) tomonidan erishilgan rezolyutsiya an'anaviy keng maydonli optik mikroskopdan bir oz yaxshiroq bo'lganligi sababli, lekin baribir transmissiya (uzatuvchi) elektron mikroskopning ruxsatidan sezilarli darajada past bo'lganligi sababli, u ma'lum ma'noda ikkita eng keng tarqalgan tadqiqot usullari o'rtasidagi ko'prik. 1-rasmda asosiy konfokal mikroskopda yorug'lik o'tishining sxematik diagrammasi ko'rsatilgan.

An'anaviy keng maydonli mikroskoplarda butun namuna simob yoki ksenon yorug'lik manbai bilan yoritiladi va tasvir vizual tarzda kuzatiladi yoki tasvirlash moslamasi yoki fotografik plyonkaga proyeksiya qilinadi. Konfokal mikroskop bilan tasvirni olish usuli tubdan farq qiladi. Namuna bir yoki bir nechta fokuslangan nur, odatda lazer bilan skanerlash orqali yoritiladi (2-rasm). Namunani skanerlash natijasida olingan tasvirlar optik qismlar deb ataladi. Ushbu terminologiya tadqiqotning invaziv bo'lmagan usuliga ishora qiladi, bunda tasvirlar namunani fizik jihatdan ajratish yo'li bilan emas, balki yo'naltirilgan yorug'lik yordamida olinadi.

Guruch. 2. Namunalarni keng maydon va spotli skanerlash

Konfokal mikroskopiya tirik namunalarni tekshirishni sezilarli darajada soddalashtirdi, ma'lumotlarni uch o'lchovli (z-seriya) olish imkonini berdi va ko'p bo'yalgan namunalar tasvirini olish jarayonini yaxshiladi. 3-rasmda an'anaviy lyuminestsent tasvirni episkopik konfokal ko'rish yoritgichi bilan propidiy yodid bilan bo'yalgan epiteliy bilan kapalak xrizalisining umumiy tayyorlanishining bir xil joylari solishtiriladi. Shubhasiz, piksellar sonining ta'sirchan o'sishi va natijada LSCM tasviridagi yadrolar tasvirining aniqligi, fokusdan tashqari lyuminestsent nurlanishni istisno qilish tufayli.

Lazerli skanerlash konfokal mikroskop (LSCM)

LSCM endi biotibbiyotda ishlatiladigan konfokal mikroskoplarning eng keng tarqalgan versiyasidir. Kirish qismida LSCM ga alohida e'tibor beriladi, chunki ushbu mikroskoplarning dizayni va konstruktsiyasi hatto tajribasiz foydalanuvchilarga ham ular bilan ishlashga imkon beradi. Boshqa konstruktiv echimlar biologiyada o'zining maxsus joylarini egalladi. Konfokal mikroskopning har qanday modeli yoki modifikatsiyasi uchun namuna tayyorlash qoidalarining ko'pchiligi kichik o'zgartirishlar bilan, shuningdek, dekonvolyutsiya va multifoton texnikasi kabi boshqa optik kesish usullari qo'llaniladi.

Konfokal mikroskopiyaning rivojlanishi

Konfokal mikroskop ixtirosi 1955 yilda ishlaydigan mikroskopni yaratgan Marvin Minskiga tegishli deb ishoniladi. Konfokal mikroskopiyaning rivojlanishi asosan tirik to'qimalarda (in vivo) (tanada) biologik jarayonlarni kuzatish istagi bilan bog'liq edi va Minskiy o'z oldiga tirik miyaning bo'yalmagan preparatida neyron tarmoq tasvirini olishni maqsad qilib qo'ydi. . Minskiy tomonidan ilgari surilgan va 1957 yilda patentlangan konfokal mikroskopiya tamoyillari barcha zamonaviy konfokal mikroskoplarda qo'llaniladi. 1-rasmda lyuminestsent tasvirlashda qo'llaniladigan barcha zamonaviy konfokal tizimlar asosidagi epifloresan mikroskopiyaga nisbatan qo'llaniladigan konfokal printsipi tushuntirilgan. Asl konfiguratsiyada Minsky nuqta yorug'lik manbai sifatida ishlatiladigan zirkonli yoy yorug'lik manbai oldida joylashtirilgan pinhole (diafragma) dan foydalangan.

Guruch. 3. Kapalak qanotlari epiteliysi

Nuqtali manbadan keladigan yorug'lik namunadagi ma'lum bir fokus tekisligidagi linzalar tomonidan nuqta shaklida yo'naltirilgan va u orqali o'tib, ikkinchi linza tomonidan fokusda bo'lgan ikkinchi teshik diafragmaga (pin teshigi) qaratilgan. birinchisi (ular konfokal, ya'ni konfokal edi). Ikkinchi pin teshigidan o'tuvchi nurlar past shovqinli fotoko'paytiruvchi trubkaga tegib, namunadan keladigan yorug'likning yorqinligiga qarab signal hosil qildi. Ikkinchi pin teshigi namunadagi fokus tekisligidan yuqori yoki pastroq hududlardan keladigan fotoko'paytirgichdan yorug'likni kesadi. Fokus tekisligidan qalinroq namunalar bilan ishlashda fokusdan tashqari yorug'lik va chaqnashlarni yo'q qilish uchun fazoviy filtrlashdan foydalanish konfokal mikroskopiyaning asosiy tamoyilidir. Minskiy o'z asarlarida yagona ob'ektiv va dikromatik oynaga ega aks ettiruvchi mikroskopni ham tasvirlab berdi, uning dizayni bugungi kunda qo'llaniladigan tizimlarning asosiga aylandi.

Konfokal usul bilan tasvirni olish uchun namunani bir nuqtaga qaratilgan yorug'lik bilan skanerlash kerak. Minskiy tomonidan yig'ilgan asl apparatda yorug'lik nurlari to'xtamas edi va namunaning o'zi tebranish bosqichida harakat qildi. Mikroskopning optik o'qiga nisbatan skanerlash nurining harakatsizligi ushbu o'rnatishning afzalligi edi, chunki bu tasvirni buzishi mumkin bo'lgan ko'pgina optik nuqsonlarni bartaraf etishga imkon berdi. Biroq, biologik namunalarni tekshirishda bu tebranish va buzilishlarga olib kelishi mumkin, natijada tasvir aniqligi va ravshanligini yo'qotishiga olib keladi. Bundan tashqari, sahna va namuna ko'chirilganda, masalan, floresan bo'yalgan hujayralarni mikroin'ektsiya qilish kabi har qanday manipulyatsiyani amalga oshirish mumkin emas.

Ammo, namuna qanday skanerlanganidan qat'i nazar, uning tasvirini olish kerak. Va Minskining asl sxemasi haqiqiy tasvirni yaratmadi, chunki fotoko'paytirgichning chiqish signali magnitafonga ega bo'lmagan harbiylarda ishlatiladigan uzoq muddatli yonish osiloskopiga berilgan. Keyinchalik Minsky, uning tasvirining ta'sirchan sifati mikroskopning o'zining past aniqligi bilan emas, balki osiloskop displeyi bilan bog'liqligini yozgan. Hozir aniq bo'ldiki, texnologiya yo'qligi sababli Minsky konfokal usulning to'liq imkoniyatlarini, ayniqsa biologik tuzilmalarni tasvirlashda to'liq namoyish eta olmadi. Uning ta'kidlashicha, konfokal mikroskopiyaning o'ta talabchan biologlar jamoasi tomonidan darhol qabul qilinmaganligining sababi bo'lgan, ular uchun olingan tasvirlarning sifati har doim ustuvor bo'lgan. O'sha paytda ularning ixtiyorida ajoyib optikaga ega yorug'lik mikroskoplari mavjud edi, bu esa juda sezgir rangli plyonkada yorqin rangli gistologik qismlarni kuzatish va suratga olish imkonini berdi. Zamonaviy konfokal mikroskoplarda tasvirlar fotoko'paytiruvchi trubadan olingan signallardan hosil bo'ladi yoki o'rnatilgan CCD o'rnatilgan raqamli kamera tomonidan olinadi, to'g'ridan-to'g'ri kompyuter tasvirlash tizimi tomonidan qayta ishlanadi, yuqori aniqlikdagi ekranda va mukammal tasvir hujjatlash qurilmasida namoyish etiladi. . Zamonaviy lazerli skanerlovchi konfokal mikroskopning diagrammasi 4-rasmda keltirilgan.

Guruch. 4. Zamonaviy lazerli skanerlovchi konfokal mikroskopning sxemasi

Optik mikroskopning asosiy optikasi o'nlab yillar davomida tubdan o'zgarmadi, chunki asbobning yakuniy ruxsati to'lqin uzunligi, ob'ektiv va namunaning o'ziga xos xususiyatlari bilan belgilanadi. Namuna kontrastini va boshqa optik mikroskopiya usullarini yaxshilash uchun ishlatiladigan bo'yoqlar so'nggi 20 yil ichida sezilarli darajada yaxshilandi. Konfokal usulning ko'tarilishi va takomillashtirilishi ko'p jihatdan zamonaviy texnologiyalarning yutuqlari bilan bog'liq bo'lgan optik mikroskopiyaning tiklanishi natijasidir. Minskiy dizaynida foydali bo'lishi mumkin bo'lgan ko'plab texnologik yutuqlar asta-sekin biologlar va boshqa mikroskopistlar uchun (shu jumladan narxda) mavjud bo'lib bormoqda. Ular orasida ilg'or nuqtali yorug'lik manbalari sifatida ishlatiladigan barqaror ko'p chastotali lazerlar, ilg'or dikromatik oynalar, sezgir past shovqinli fotodetektorlar, kengaytirilgan imkoniyatlarga ega yuqori tezlikdagi mikrokompyuterlar (yuqori sig'imli xotira mavjudligi sababli), murakkab tasvirlash dasturlari, yuqori rezolyutsiya monitorlari va raqamli printerlar.

Ushbu texnologiyalar mustaqil ravishda ishlab chiqilgan va 1955 yildan boshlab asta-sekin konfokal tasvirlash tizimlariga kiritilgan. Misol uchun, raqamli tasvirni qayta ishlash texnikasi birinchi marta 1980-yillarning boshlarida Vuds Hole Okeanografiya instituti tadqiqotchilari tomonidan muvaffaqiyatli qo'llanilgan. O'zlarining terminologiyasida "video mikroskoplar" dan foydalanib, ular optik mikroskopning nazariy aniqlik chegarasidan pastroq bo'lgan mikronaychalarning hujayra tuzilishini tasvirlashga muvaffaq bo'lishdi. Raqamli tasvir protsessoriga ulangan yuqori sezuvchanlikdagi super kremniyli (SIT) videokamera tomonidan olingan tasvirlarni raqamli optimallashtirish orqali piksellar sonini sezilarli darajada oshirish mumkin. Uyali tuzilmalar differentsial shovqin kontrasti (DIC) optikasi va keyingi raqamli tasvirni qayta ishlash yordamida vizualizatsiya qilindi.

Konfokal mikroskop dizaynlarining tasnifi odatda namunani skanerlash usuliga asoslanadi. Ikkita asosiy skanerlash usuli mavjud: Sahnani skanerlash va Yoritish nurlarini skanerlash; va nurni skanerlashning kamida ikkita usuli. Minskining asl asbobi ibtidoiy tyuning generatori tomonidan boshqariladigan sahnani skanerlash tizimiga asoslangan bo'lib, u tasvirni juda sekin ishlab chiqaradi. O'zlarining prototiplaridan ancha oldinda bo'lgan zamonaviy bosqichli skanerlash konfokal o'rnatishlari asosan materialshunoslikda, masalan, mikrokristallarni ishlab chiqarishda qo'llaniladi. Ushbu tamoyilga asoslangan tizimlar yaqinda mikrokristallarda DNK tahlili olib boriladigan biotibbiyot sohalarida mashhur bo'ldi.

Biologik tizimlarni tasvirlashning yanada amaliy alternativi statsionar namunani nurli skanerlashdir. Ushbu tamoyil ko'plab o'lchash tizimlarining asosi bo'lib, ularning takomillashtirilishi bugungi kunda mashhur tadqiqot mikroskoplarining paydo bo'lishiga olib keldi. Ushbu muqaddimada biz konfokal mikroskopiyaning texnik tafsilotlariga to'xtalmaymiz, lekin mohiyatiga ko'ra u ikkita tubdan farq qiluvchi nurli skanerlash usulidan foydalanadi: ko'p nurli skanerlash va bitta nurli skanerlash. Bir nurli skanerlash hozirgacha eng keng tarqalgan va LSCMda aynan shu usul qo'llaniladi. Bu erda nur galvanometrlar tomonidan sekundiga bir kadr tezlikda boshqariladigan kompyuter tomonidan boshqariladigan nometalllar tomonidan skanerdan o'tkaziladi. Taxminan video kadr tezligida tezroq skanerlashga erishish uchun ba'zi tizimlar akusto-optik qurilma yoki tebranuvchi nometalllardan foydalanadi. Muqobil usul deyarli real vaqtda skanerlash uchun ikkita nurni ishlatadi, odatda aylanadigan Nipkow disk shaklidan foydalanadi. Ushbu tizimlar floresan bo'yalgan namunalarni tasvirlash uchun yanada samarali modellarni yaratish maqsadida juftlashtirilgan (tandem) skanerlash mikroskoplarini (TSM) o'zgartirish va takomillashtirish natijasidir. 5-rasmda real vaqtda tasvirlashda past lyuminestsent nurga sezgirlikni oshirish uchun egizak Nipkow disklari va mikrolinzalari bilan bunday ilg'or tizim ko'rsatilgan.

Guruch. 5. Nipkow disklari asosidagi optik dizayn

Bugungi kunga kelib, konfokal mikroskopiyada optik kesmalarni olishning ikkita muqobil usuli mavjud: dekonvolyutsiya usuli va multifoton. Ular texnik jihatdan farq qiladi, ammo konfokal usullar kabi an'anaviy optik mikroskopga asoslangan. Dekonvolyutsiya fokusdan tashqari joylardan tasvir yaratishda keladigan ma'lumotlarni hisoblash va olib tashlash uchun hisoblash algoritmlariga asoslanadi. Samarali algoritmlar va yuqori unumdor mini-kompyuterlar tufayli bu texnika juda qulay bo'ldi. Multifotonli mikroskop LSCM bilan bir xil skanerlash tizimidan foydalanadi, lekin qabul qilgichda teshik bo'lishini talab qilmaydi. Bu shart emas, chunki lazer ftorxrom yorlig'ini faqat fokus nuqtasida qo'zg'atadi va shu bilan fokusdan tashqari nurlanishni istisno qiladi. Tirik to'qimalarni kuzatishda bu usulning qo'shimcha afzalligi fotooqartirishni kamaytiradi, chunki lazer nurlari tomonidan uzatiladigan va namuna to'qimalari tomonidan so'rilgan energiya miqdori kamayadi.

An'anaviy optik mikroskop LSCM qurilgan asosdir. Volfram yoki simob chiroq o'rniga sezgir fotoko'paytiruvchi trubkaga (PMT) va skanerlash oynalari va boshqa skanerlash moslamalarini boshqaruvchi kompyuterga ulangan, shuningdek, tasvirlarni yig'ish va taqdim etishni osonlashtiradigan lazer ishlatiladi. Qabul qilingan ma'lumotlar raqamli tashuvchilarda saqlanadi va tizimning o'zida yoki boshqa bir nechta dasturiy ta'minot paketlari yordamida qayta ishlanishi mumkin.

LSCM dizayniga ko'ra, signalning yoritilishi va qabul qilinishi (ro'yxatga olinishi) diffraktsiya chegarasi bo'lgan namunadagi nuqta bilan cheklangan. Mikroskopning maqsadlari yorug'lik nuqtasini diqqat markaziga keltiradi va skanerlash moslamasi namunani kompyuter nazorati ostida ushbu nuqta bilan skanerlaydi. Namunaning porlab turgan nuqtalaridan kelgan signallar fotoko'paytirgichga pin teshigi (yoki ba'zi hollarda tirqish) diafragma orqali kiradi va PMT chiqish signallari tasvirga shakllanadi va kompyuter tomonidan vizual tarzda takrorlanadi. Namunadan aks ettirilgan nurda bo'yalmagan namunalar kuzatilishi mumkin bo'lsa-da, ular odatda bir yoki bir nechta floresan bo'yoqlar bilan bo'yalgan. 1990-yilda adabiyotda tasvirlangan keng tarqalgan LSCMlardan biri tadqiqot biologiyasi duch keladigan fundamental muammoga javoban ishlab chiqilgan. Ikki hujayrali bosqichdan keyin immunofluoresan bo'yalgan embrionlar ichidagi ko'plab tuzilmalar va individual makromolekulalar an'anaviy epiflüoresan mikroskop bilan ko'rish mumkin emas, chunki embrion hajmi hujayralar soni ortishi bilan taxminan bir xil bo'lib qoladi. Bu shuni anglatadiki, hujayralarning zichroq joylashishi bilan fokus tekisligidan tashqaridagi hujayralardan luminesans kuchayadi, bu esa tasvir o'lchamlari yomonlashishiga olib keladi.

Guruch. 6. Nikon lazerli skanerlash konfokal mikroskop konfiguratsiyasi

Ushbu muammo ustida ishlayotgan tadqiqotchilar guruhi o'sha paytda mavjud bo'lgan konfokal tizimlarning hech biri ularning talablariga javob bermasligini aniqladilar. O'sha paytda sahnani skanerlaydigan mikroskoplar juda sekin edi. Bitta tasvirni yaratish uchun taxminan 10 soniya kerak bo'ldi va ko'p nurli asboblar floresan tasvirlash uchun hali amaliy emas edi. LSCM an'anaviy epifloresan mikroskopiya talablariga javob berish uchun ishlab chiqilgan va bir vaqtning o'zida ishlab chiqilayotgan boshqalar bilan bir qatorda turli kompaniyalar tomonidan biotibbiyot hamjamiyatiga taqdim etilayotgan murakkab tizimlarning prototipiga aylandi. Bugungi kunda ishlatilayotgan tizimning namunasi (Nikon E1000) 6-rasmda ko'rsatilgan.

Maxsus ishlab chiqilgan qurilmalarda optik qismlarning qalinligi fotodetektor oldidagi pin teshigi diametrining o'zgarishi bilan o'zgarishi mumkin. Boshqa sobit pinhole dizaynlari bilan solishtirganda, bu qo'shimcha xususiyat biologik tuzilmalarni tasvirlashda juda moslashuvchan. Namunaning skanerlangan maydonini qisqartirish va skanerlangan ma'lumotni saqlash va vizualizatsiya qilish uchun bir xil o'lchamdagi ma'lumotlar qatoriga joylashtirish orqali tasvirni ruxsatni yo'qotmasdan kattalashtirish mumkin (xuddi shunday, skanerlash elektron mikroskopida kattalashtirish o'zgaradi). Bu bitta linzaga kattalashtirish oralig'ini beradi, bu linzalarni almashtirishda o'tkazib yuborilishi yoki yo'qolishi mumkin bo'lgan kamdan-kam yoki tez sodir bo'ladigan hodisalarni ko'rsatishda juda foydali bo'lishi mumkin.

LSCM ning zamonaviy va moslashuvchan imkoniyatlari bilan endi arzon narxlarda sotuvda sotiladigan konfokal mikroskopiya so'nggi yillarda portlab ketdi, ko'plab ko'p foydalanuvchili laboratoriyalar ushbu uskunani elektron mikroskoplardan afzal ko'radi. Konfokal mikroskopning afzalligi - an'anaviy optik mikroskopiya uchun tayyorlangan namunalarning yuqori sifatli tasvirlarini olishning nisbatan qulayligi va tadqiqotning turli sohalarida ko'p sonli ilovalar.

LSCM ning birinchi avlodi qattiq namunalar bilan yaxshi ishladi, ammo ular lazerlarning yorug'lik energiyasini nazorat qila olmadilar, bu esa jiddiy ehtiyot choralari ko'rilmasa, ko'pincha tirik namunaning halokatli yo'q qilinishiga olib keldi. Ushbu cheklovlarga qaramay, sobit namunalarning tasvirlari shu qadar yuqori sifatga ega ediki, konfokal yondashuv mutaxassislar tomonidan so'zsiz qabul qilindi. Asboblarning keyingi avlodlari tasvirlash jarayonining barcha jihatlarini takomillashtirdi. Bunga qo'shimcha ravishda, yangi qurilmalar ancha ergonomik va foydalanish uchun qulay bo'ldi, shuning uchun tekislash, filtrlar kombinatsiyasini o'zgartirish, kompyuter yordamida amalga oshirilgan lazer quvvatini sozlash ancha oson va tezlashdi. Endi uchta ftoroxrom bilan bir vaqtning o'zida va undan ham ko'proq bilan ketma-ket suratga olish mumkin. Yaxshilangan va ishonchli dasturiy ta'minot, tezroq kompyuterlar, katta disk sig'imlari va RAM narxining pasayishi tufayli tasvirni qayta ishlash ham sezilarli darajada rivojlandi.

Tasvirlash rejimlari

Konfokal mikroskopning asosiy qo'llanilishi har xil turdagi qalin namunalarni tasvirlashdir. Konfokal usulning afzalligi yuqori aniqlik va o'lchamdagi alohida optik qismlar ketma-ketligi sifatida namunaning tasvirlarini yaratish qobiliyatidan kelib chiqadi. U bir nechta tasvirlash rejimlaridan foydalanadi; ularning har biri tasvirning asosiy birligi sifatida optik qismga asoslanadi.

Guruch. 1. Uchta belgi bilan belgilangan optik qismlar

Alohida optik bo'limlar

Optik qism konfokal mikroskopiya texnikasida tasvirning asosiy birligi hisoblanadi. Bog'langan va bo'yalgan namunalar bir, ikki, uch va ko'p to'lqin uzunlikdagi yoritish ostida, ko'p rangli namunalar bir-birining ustiga qo'yilgan holda tasvirlanishi mumkin (agar tegishli rang aberatsiyasini to'g'irlagan linzalar ishlatilsa). Qo'shimcha tekislash odatda raqamli tasvirni qayta ishlash texnikasi bilan amalga oshiriladi. Ko'pgina lazerli skanerlovchi konfokal mikroskoplar (LSCM) optik bo'lakni olish uchun taxminan 1 soniya vaqt oladi, garchi odatda bir nechta optik bo'laklar signal-shovqin nisbatini yaxshilash uchun o'rtacha hisoblanadi. Rasmni olish vaqti, albatta, tasvirning piksel o'lchamlariga va tizim kompyuterining tezligiga bog'liq. Oddiy 8 bitli 768x512 pikselli tasvirni saqlash uchun taxminan 0,3 Mb xotira kerak bo'ladi.

1-rasmda ko'rsatilgan optik bo'limlar radiatsiya manbai sifatida bitta kripton/argon lazer yordamida uch xil to'lqin uzunlikdagi (488, 568 va 647 nanometr) qo'zg'atuvchi yorug'lik bilan bir vaqtning o'zida olingan. Uchinchi yosh bosqichida Drosophila qanotining tasavvur diski namuna sifatida taqdim etiladi, unda qanotning shakllanishida ishtirok etadigan uchta gen belgilanadi. Ko'rsatilgan uchta gen va mos keladigan ftoroxrom belgilari: (a) vestigial (fluoresan - 496 nanometr); (b) qanotsiz (lissamin rodamin - 572 nanometr); va © CiD (siyanin 5 - 649 nanometr). Qanotni tashkil etuvchi genlarning uchta fazoviy ifodalangan domenlarining birlashtirilgan tasviri pastki o'ngda joylashgan (rasm (d)).

Berilgan vaqt oralig'ida suratga olish va tirik hujayraning vizualizatsiyasi

Tirik hujayralarni ma'lum vaqt oralig'ida o'rganish LSCM rezolyutsiyasining oshishi tufayli yangi turtki oldi. Ilgari uyali tuzilmalarning harakatlarini o'rganish 16 mm fotografik plyonka va kameraga ulangan soat mexanizmi oralig'i, keyinroq vaqt oralig'idagi video yozuvchisi, optik disk yozuvchisi yoki video tasvirni raqamlash taxtasi yordamida amalga oshirildi. Endi LSCM yordamida real vaqtda ma'lum, oldindan o'rnatilgan intervallarda optik kesmalarni olish mumkin.

LSCM yordamida tirik to'qimalarni vizualizatsiya qilish tegishli namunalarni tasvirlashdan ko'ra ancha qiyin va amalda har doim ham mumkin emas, chunki namuna kuzatish shartlariga bardosh bera olmaydi. 1-jadvalda LSCM bilan tirik va bog'langan hujayralarni kuzatishda e'tiborga olinishi kerak bo'lgan ba'zi omillar keltirilgan. Ba'zi namunalarni mikroskop sahnasiga qo'yish jismoniy jihatdan imkonsizdir yoki ular butun kuzatish davrida tirik qololmaydilar. Tekshirilayotgan hodisa yoki struktura linzalarning ko'rish maydoniga kirmasligi mumkin. Masalan, drozofilaning xayoliy qanot disklari lichinkada juda chuqur rivojlanadi; va bir marta parchalanib, ular madaniyatda rivojlana olmaydi. Shu sababli, bugungi kunda ushbu turdagi to'qimalarda gen ekspressiyasini kuzatishning yagona mavjud usuli - bu lichinkalarni ajratish, rivojlanishning turli bosqichlarida namunalardan olingan xayoliy disklarni bog'lash va bo'yashdir.

Tab. 1. LSCM yordamida bog'langan va tirik hujayralarni kuzatish

Tirik hujayralarni muvaffaqiyatli kuzatish va tasvirlash butun jarayon davomida juda ehtiyotkorlikni talab qiladi.Mikroskop bosqichida maqbul sharoitlarni saqlash juda zarur. Lazer nurlari bilan nurlanganda hujayraga etkazilgan zarar takroriy skanerlashda to'planishi mumkin, shuning uchun bu ta'sirni minimallashtirish, tasvirni olish uchun zarur va etarli bo'lishi kerak. Askorbin kislotasi kabi antioksidantlar odatda floresan molekulalarni qo'zg'atuvchi nurga ta'sir qilganda chiqariladigan kislorodni kamaytirish va hujayralarni o'ldiradigan erkin radikallarni ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun madaniyat muhitiga qo'shiladi. Odatda, nurlanishning floresan bo'yalgan hujayralarga ta'sirini baholash uchun keng qamrovli dastlabki nazorat tajribalarini o'tkazish, barcha tasvir parametrlarining kuzatuvga muvofiqligini diqqat bilan kuzatib borish kerak. Sinov tasvirlaridan keyin jonli namunalarning hayotiyligini baholash kerak. Masalan, embrionlar butun kuzatish jarayonida o'zlarining normal rivojlanishini davom ettirishlari kerak, shuning uchun radiatsiya yoki ftorxromlar ta'siridan kelib chiqqan har qanday anomaliyalarni aniqlash kerak. 2-rasmda yashil kaltsiy bilan floresan bo'yalgan Drosophila embrionining ma'lum vaqt oralig'ida o'qqa tutilishi ko'rsatilgan. Bir qator tasvirlar vaqt o'tishi bilan lyuminestsent yorug'likning tarqalishidagi o'zgarishlarni ko'rsatadi.

Har bir hujayra turi kuzatish jarayonida o'z hayotiyligini saqlab qolish uchun o'ziga xos choralarni talab qiladi. Ba'zi hasharotlar hujayralari uchun xona haroratini saqlab turish va etarli darajada katta hajmdagi mos muhitga ega bo'lish etarli. Biroq, aksariyat hujayra turlari sahnada qolish vaqtida karbonat angidridning to'g'ri muvozanatini saqlash uchun sahnani va ba'zan perfuzion kamerani isitishni talab qiladi. LSCM yordamida kuzatish shartlari eng kam "dushman" bo'lgan hujayra turini tanlash ko'plab eksperimental muammolarni oldini olishga yordam beradi. Zamonaviy konfokal asboblarni takomillashtirish potentsial muammolarni sezilarli darajada kamaytirishga olib keldi. Kvant samaradorligining oshishi, ob'ektivlarning katta raqamli diafragma (yorqinligi) va kamroq zaharli hujayra bo'yoqlaridan foydalanish konfokal mikroskopiyani tirik hujayralarni tahlil qilishning amaliy usuliga aylantirdi. Bir vaqtning o'zida ro'yxatga olish va tasvirni qayta ishlashni imkon qadar tezroq amalga oshirishga imkon beradigan past quvvatli lazerlardan foydalanishga intilish kerak. Agar tasvirlarni olish va ro'yxatdan o'tkazishni tezlashtirish uchun teshik teshigi kengaytirilsa (jonli bo'lmagan namunalarni kuzatish bilan solishtirganda), keyinchalik dekonvolyutsiya ba'zan yo'qolgan tasvir sifatini tiklashi mumkin.

Guruch. 2. Belgilangan vaqt oralig'ida tortishish

Ko'pgina fiziologik jarayonlar va hodisalar juda tez sodir bo'ladi va shuning uchun tasvirlash tezligi o'rtacha soniyada bir tasvirni tashkil etadigan ko'pchilik LSCMlar tomonidan suratga olinmaydi. Akusto-optik qurilmalar va yoriqli diafragmalardan foydalanadigan LSCMlar galvanometr tomonidan qo'zg'atilgan nuqtali skanerlash tizimlariga qaraganda tezroq va fiziologik tadqiqotlar uchun amaliyroqdir. Ushbu tezroq sozlamalar yaxshi fazoviy va vaqtinchalik piksellar sonini birlashtiradi, bu to'liq ekran piksellar sonida sekundiga 30 kvadratgacha yoki video tasvir tezligiga yaqin bo'lishi mumkin. Sekinroq, teshikli skanerlovchi mikroskoplarda vaqtinchalik aniqlikni faqat namunani ko'rish maydonini kamaytirish orqali oshirish mumkin. To'liq fazoviy o'lchamlari kerak bo'lsa, kadr tezligini kamaytirish kerak, natijada vaqtinchalik piksellar sonini yo'qotadi. Disk yoki tebranish oynasini skanerlashdan foydalanadigan konfokal tizimlar tez fiziologik jarayonlarni yoki boshqa vaqtinchalik hodisalarni tasvirlash imkoniyatiga ega.

Z-seriyasi va 3D ko'rinishlari

Z-seriya - optik o'qga (z-o'qi) perpendikulyar tekislikda turli darajalarda qilingan namunaning optik kesimlari ketma-ketligi. Z-seriyali tasvirlar mikroskopning nozik fokusidagi bosqichma-bosqich o'zgarishlarni moslashtirish, so'ngra har bir bosqichda tasvirlash orqali olinadi. Fokusli qadam odatda kompyuter tomonidan boshqariladigan qadam motori tomonidan amalga oshiriladi, bu fokusni ma'lum miqdorda o'zgartiradi. Kompyuterning makro dasturidan foydalanib, tasvirni olish va saqlash, mikroskopni namunadagi ma'lum bir chuqurlikka qayta yo'naltirish, ikkinchi tasvirni olish va saqlash, yangi tekislikda qayta fokuslash va hokazolar dasturlashtirilgan tasvirlar soni bo'lmaguncha davom etishi mumkin. qo‘lga kiritildi.

Kerakli tasvirlar namunaning tanlangan maydonidan olingan z-seriyadan olinishi va qiziqishning aniq hujayralarini batafsil tekshirish uchun maxsus dastur tomonidan qayta ishlanishi mumkin. Z-seriyani 3-rasmda ko'rsatilganidek, tasvirlarning fotomontaji sifatida ko'rsatish mumkin. Tasvirlarni birlashtirish va ko'rsatishning bunday turi, shuningdek, boshqa ko'plab tasvirlarni manipulyatsiya qilish zamonaviy tasvirlash dasturlari paketlarining standart xususiyatlari to'plamidir. 3-rasmdagi tasvirlar yanada tez-tez z-pog'onaga ega bo'lgan kattaroq seriyalardan tanlab olingan. Yashil nur 22C10 antikori bilan bo'yalgan Drosophila embrionining periferik asab tizimini aniqlaydi.

Guruch. 3. Optik kesimlarning Z-seriyasi

LSCM tomonidan ishlab chiqarilgan namunaning bir necha yuzlab optik qismlariga asoslanib, bir-biriga bog'langan tuzilmalarning butun majmuasi haqida tasavvurga ega bo'lish qiyin bo'lishi mumkin. Biroq, ro'yxatga olingandan so'ng, z-seriya hajmli tasvirlash usullaridan foydalangan holda namunani keyingi 3D ko'rsatish uchun ideal materialdir. Bu yondashuv hozir tibbiyot va biologiyada to‘qimalarning tuzilishi va funksiyasi o‘rtasidagi bog‘liqlikni aniqlash uchun keng qo‘llaniladi. Fokusni o'zgartiruvchi vosita qadami bilan aniqlangan namuna uchun to'g'ri z-skanerlash bosqichini o'rnatish muhimdir; bu holda tasvir namunaning haqiqiy chuqurligini aks ettiradi.

Namuna ko'rilayotganda harakatsiz qolar ekan, LSCM z-seriyali tasvirlar ajoyib tarzda yozib olinadi va raqamli ravishda saqlanadi, ularni namunaning 3D ko'rinishiga aylantirish nisbatan oson bo'ladi. 4-rasmda bitta optik qism (a) z-seriyali proyeksiya (b) bilan taqqoslanadi va 22C10 antikori bilan belgilangan Drosophila embrionining periferik asab tizimini vizualizatsiya qilishda ushbu texnikaning ahamiyati ko'rsatilgan.

Mikroskop operatori tomonidan o'rnatilgan step vosita qadami optik qismning qalinligi bilan bog'liq, ammo boshqa qiymatga ega bo'lishi mumkin. Optik qismning qalinligi mikroskopda kuzatilgan namunaning kesimining qalinligi bilan bog'liq va ob'ektiv va pin teshigi diametriga bog'liq. Biroq, ba'zi hollarda, fokus balandligi optik qism qalinligiga mos kelishi mumkin va bu chalkashlikka olib kelishi mumkin.

Z-seriyali fayl qabul qilingandan so'ng, u konfokal tasvirni qayta ishlash uchun maxsus mo'ljallangan 3D rekonstruksiya dasturiga yuboriladi. Bunday dasturlar grafik stantsiyalarda qo'llanilganda juda tezdir, lekin ayni paytda shaxsiy kompyuterda yoki konfokal mikroskopning grafik stantsiyasida, etarlicha tez protsessor va katta operativ xotira bilan muvaffaqiyatli ishlatilishi mumkin. Ushbu dasturlar yordamida namunaning alohida 3D tasvirlarini ham, aylanish yoki boshqa fazoviy o'zgarishlar effektini keltirib chiqaradigan namunaning har xil turlaridan tashkil topgan bir-birini almashtiruvchi tasvirlar ketma-ketligini yaratish mumkin. namunaning uch o'lchovli xususiyatlarini yaxshiroq idrok etish. Dastur sizga uzunlikni, chuqurlikni o'zgartirishga, hajmli o'lchovlarni amalga oshirishga, shuningdek namunaning turli darajalarida turli tuzilmalarni ajratib ko'rsatish uchun namuna shaffofligi kabi maxsus tasvir parametrlarini interaktiv ravishda o'zgartirishga imkon beradi.

Guruch. 4. Optik tilim va z-seriya proyeksiyasi

Muayyan vaqt oralig'ida olingan tasvirlar ketma-ketligidan olingan bir qator optik bo'laklarni ko'rsatishning yana bir usuli uch o'lchovli tasvirdir, unda z o'qi vaqt o'qi vazifasini bajaradi. Ushbu yondashuv organizmning rivojlanishidagi fiziologik o'zgarishlarni tasavvur qilishda foydalidir. Dengiz kirpi embrionlarining rivojlanishi davrida kaltsiy kontsentratsiyasining o'zgarishlar dinamikasini aniqlashtirish bu usulni qo'llashga misol bo'ldi. Turli xil chuqurliklarda olingan optik qismlarning rang kodlari 3D ma'lumotlarni taqdim etishning oddiy usuli hisoblanadi. Amalda, turli xil chuqurliklarda olingan har bir optik qismga rang (odatda qizil, yashil yoki ko'k) belgilanadi, so'ngra rangli tasvirlar birlashtiriladi va tasvirni qayta ishlash dasturi yordamida ranglarni o'zgartirish orqali kerakli effektga erishiladi.

4D tasvirlash

LKSM yordamida tirik to'qimalarda yoki tirik to'qimalar madaniyatini tayyorlash jarayonida o'zini namoyon qiladigan va ma'lum vaqt oralig'ida olingan tasvirlar ketma-ketligida aks ettirilgan dinamik hodisalar to'rt o'lchovli shaklda, vaqt to'rtinchisi sifatida ifodalanishi mumkin. o'lcham. Muntazam vaqt oralig'ida olingan Z-seriyalari to'rt o'lchovli ma'lumotlar to'plamidir: uchta fazoviy o'lchov (x, y va z) va to'rtinchisi bo'lgan vaqt, ularni 4D tomoshabin yordamida kuzatish mumkin. Bunday dasturlar, masalan, film kabi, vaqtning turli nuqtalarida olingan stereo juftlarni yaratish va ijro etish yoki, muqobil ravishda, kesilgan plyonka kabi, vaqtning turli nuqtalarida olingan qayta yaratilgan uch o'lchamli tasvirlarni qayta ishlash va taqdim etish imkonini beradi.

X-Z rasmlari

Agar namunaning yon ko'rinishini olish kerak bo'lsa, masalan, epiteliya qatlamining vertikal qismi, x-z bo'limi ikkita usuldan birida amalga oshirilishi mumkin. Yon ko'rinish namunaning bir chizig'ini (x o'qi) turli xil chuqurliklarda (z o'qi) skanerlash, qadamli vosita yordamida fokusni nazorat qilish va keyin butun bo'laklar seriyasini bitta tasvirga birlashtirish orqali olinishi mumkin. Yana bir usul - yon ko'rinish mavjud z-seriyali optik qismlardan olinganda 3D renderlash dasturida kesish tekisligi opsiyasidan foydalanishdir. 5-rasmda kapalak qanoti epiteliysini tasvirlashda lazer turli z-koordinatalarda yoki chuqurliklarda namunaga kirib boradigan bitta chiziq (chapdagi rasmdagi gorizontal qora chiziq) bo'ylab skanerdan o'tkazildi. 5-rasmda ko'rsatilgan X-z tasviri konfokal tasvirlash tizimi bilan qurilgan va taqdim etilgan. Qanot epiteliysi ikkita epiteliya qatlamidan iborat, ammo lazer nurining namunaga kirib borish chuqurligi ortishi bilan floresan nurlanishning intensivligi pasayganligi sababli, faqat yuqori qatlam aniq ko'rinadi.

Guruch. 5. X-Z tekisligidagi tasvir

Yoritilgan nurda tasvirni yaratish

Barcha erta konfokal mikroskoplar aks ettirilgan yoki orqaga tarqaladigan nurda ishlagan. Yoritilgan yorug'likdan foydalanib, ko'plab namunalarni konfokal mikroskopda bo'yalmagan holda kuzatish mumkin yoki ular immunogold yoki kumush halid mikrokristallari kabi yuqori darajada aks ettiruvchi bo'yoqlar bilan etiketlanishi mumkin. Aks ettirilgan yorug'lik kuzatuvlarining, ayniqsa tirik to'qimalar uchun afzalligi, namunaning fotooqartilishidan o'tmasligidir. Ammo bo'yoqlarning ayrim turlari lazer nurini zaiflashtirishi mumkin. Yana bir potentsial muammo shundaki, ba'zi mikroskoplar nurning optik yo'lidagi optik elementlardan ichki ko'zgularni boshdan kechirishi mumkin. Ko'p nurli LSCM va tirqishli diafragma LSCM versiyalarida aks ettirilgan yorug'lik muammosi mavjud emas va u mavjud bo'lgan mikroskoplarda polarizatorlardan foydalanish, artefaktlarsiz maydonlarni vizualizatsiya qilish va optik o'qdan siljish muammoni kamaytirishga yordam beradi.

O'tkazilgan yorug'lik tasviri

Mikroskopiyada keng tarqalgan bo'lib qo'llaniladigan uzatiladigan yorug'lik tasvirlash usullarining har biri LSCMda, jumladan, faza kontrasti, differentsial parazit kontrasti (DIC), qorong'u maydon yoki polarizatsiyalangan yorug'likdan foydalanish mumkin. Namuna orqali o'tadigan yorug'lik uzatiladigan yorug'lik qabul qiluvchiga kiradi, uning signali optik tolali yorug'lik yo'riqnomasi orqali mikroskopning skanerlash boshidagi fotoko'paytirgichlardan biriga yo'naltiriladi. O'tkazilgan yorug'lik tasvirlari va konfokal epifloresan tasvirlari bir vaqtning o'zida yoritgichning bir xil nurlari yordamida olinishi mumkin, bu ularning aniq ro'yxatga olinishini ta'minlaydi. Tegishli dasturiy ta'minot yordamida tasvirlarni birlashtirish yoki sintez qilish orqali to'qimalarda etiketlangan hujayralarning aniq holatini aks ettirish mumkin. Ba'zi tadqiqotlar quyidagi mazmunli yondashuvni taklif qiladi: konfokal bo'lmagan uzatilgan yorug'lik tasvirini bir xil namunadagi etiketli hujayralarning bir yoki bir nechta konfokal floresan tasvirlari bilan birlashtiring. Bunday yondashuv, masalan, etiketlanmagan hujayralar populyatsiyasi ichida bir necha soat yoki hatto yillar davomida belgilangan hujayralar subpopulyatsiyasi migratsiyasining fazoviy va vaqtinchalik jihatlarini aniqlash imkonini beradi.

Bugungi kunda uzatiladigan ochiq rangli qabul qiluvchi allaqachon keng qo'llanilmoqda, u qizil, yashil va ko'k (RGB) ranglarda uzatilgan signallarni qabul qilib, ba'zi raqamli rangli kameralarda amalga oshirilganiga o'xshash haqiqiy ranglarda rangli tasvirni ishlab chiqaradi. Bunday qabul qiluvchi, ayniqsa, o'tkazilayotgan yorug'likdagi to'qimalarning haqiqiy ranglarini muntazam ravishda kuzatadigan va bu tasvirlarni tahlil qilish uchun floresan ma'lumotlarga qo'shadigan patologlar uchun foydalidir.