Репродукцію вірусів у клітинних системах. Етапи репродукції

Відносини вірусу із клітиною господаря можуть складатися по-різному. Умовно ці стосунки можна звести до трьох типів.

Продуктивна інфекція:цикл репродукції вірусу у клітині господаря завершується утворенням нового, численного покоління вірусів, що зазвичай супроводжується загибеллю клітини господаря.

Абортивна інфекціямає місце, якщо цикл репродукції вірусу у клітині господаря раптово переривається. Клітина господаря зберігає свою життєдіяльність.

Вірогеніяхарактеризується інтеграцією (вбудовуванням) вірусної нуклеїнової кислоти в геном клітини господаря, що призводить надалі до синхронної реплікації ДНК клітини та нуклеїнової кислоти вірусу. Клітина господаря продовжує жити.

Розмноження вірусів здійснюється шляхом репродукції в клітині господаря. Цикл репродукції є процесом підпорядкування клітинних механізмів чужорідної вірусної інформації.

Функціонально ферменти вірусів можна поділити на 2 групи: ферменти, що сприяють проникненню вірусної нуклеїнової кислоти в клітину і виходу віріонів, що утворилися в середу, і ферменти, що беруть участь у процесах транскрипції та реплікації вірусної нуклеїнової кислоти.

Цикл репродукціїможна поділити на окремі стадії.

1 стадія - хемосорбція вірусів на поверхні клітини господаря

Хемосорбція можлива лише за умови, якщо клітина несе на поверхні чутливі рецептори, комплементарні рецепторам даного вірусу. У клітинах тварин та людини функцію рецепторів для пікорно- та арбовірусів виконують ліпопротеїди, для міксо- та параміксовірусів та аденовірусів – мукопротеїди.

У простоорганізованих вірусів рецепторами є унікальні поєднання білкових субодиниць, що знаходяться на поверхні капсиду. У складноорганізованіших вірусів функцію рецепторів виконують вирости суперкапсиду у вигляді шипів або ворсинок.

2 стадія – проникнення вірусу у клітину господаря.

Шляхи проникнення вірусів у клітину можуть бути різними. Передбачається, що багато вірусів проникають у клітину шляхом піноцитоз, або віропексису. При піноцитозі в районі хемосорбції вірусу клітинна мембрана утворює інвагінацію та заковтує вірус. У складі піноцитарної вакуолі вірус потрапляє до цитоплазми.

Деякі віруси проникають у клітину з допомогою злиття клітинних і вірусних мембран.

Проникнення фагової ДНК у бактеріальну клітину відбувається рахунок часткового руйнування оболонки клітини фаговим лизоцимом і скоротливої ​​реакції залишку фага.

3 стадія – депротеїнізація вірусу.

Процес депротеїнізації вірусу передбачає звільнення нуклеїнової кислоти від білків капсиду. Як тільки вірусна нуклеїнова кислота звільняється від білків капсиду, настає так званий прихований період – період екліпса. Передбачається, що в період екліпсу вірусна нуклеїнова кислота проходить цитоплазмою клітини в район ядра.

4 стадія - синтез компонентів вірусу.

Сукупність процесів цієї стадії можна поділити на три етапи:

Перший етап – підготовчий. Він передбачає дві цілі: придушити функціонування генетичного апарату клітини, припинити синтез клітинних білків та нуклеїнових кислот, перевести білок-синтезуючий апарат клітини під контроль геному вірусу; підготувати умови для реплікації нуклеїнової кислоти та синтезу білків капсиду вірусу.

Другий етап – реплікація нуклеїнової кислоти вірусу. Для дволанцюгових ДНК – геномних вірусів характерний такий шлях реалізації генетичної інформації, як і інших живих організмів. Процесу реплікації ДНК передує транскрипція іРНК. Інформаційна РНК вірусу транслюється рибосомами клітини і вірус – полісомі по матриці иРНК йде синтез ранніх вірусспецифічних білків.

Щойно синтезувалися ранні вірусспецифічні білки, починається процес реплікації ДНК вірусу. Реплікація двох – ланцюжкової ДНК вірусу йде за принципом реплікації ДНК клітинних організмів напівконсервативним шляхом.

Процес реплікації одноланцюгової ДНК починається із синтезу її комплементарної пари. В результаті утворюється дволанцюжкова кільцева батьківська ДНК.

Вивчення механізму реплікації РНК – геномних вірусів розпочалося з 1961 р., коли було відкрито РНК-геномні фаги.

У РНК-геномних вірусів молекула РНК одночасно є генетичним матеріалом та виконує функцію іРНК та ДНК.

У 1970 р. у складі одноклітинних РНК-вірусів виявили фермент РНК-залежна ДНК-полімераза, що свідчить про наявність процесу зворотної транскрипції. Пізніше було доведено, що у онкогенних РНК-вірусів за матрицею їхньої РНК за участю РНК-залежної
ДНК-полімерази, що міститься у віріоні, траскрибується ДНК-копія. ДНК-копія з одноланцюгової переходить у реплікативну дволанцюжкову форму, яка забезпечує реплікацію РНК вірусу та синтез необхідних ферментів.

Третій етап – синтез білків капсид.

Цей процес відстає в часі від процесу реплікації вірусу нуклеїнової кислоти і починається, коли реплікація в повному розпалі. Синтез білків капсиду відбувається як і ядрі, і у цитоплазмі клітини. Вірусспецифічна іРНК транслюється рибосомами клітини і на вірус-полісомі йде синтез білків-попередників. З цього "фонду" білків-попередників і формуються білки капсиду вірусу.

5 стадія - складання віріонів, або морфогенез вірусу.

У простоорганізованих вірусів білкові субодиниці капсиду в строго впорядкованому з'єднанні розташовуються навколо нуклеїнової кислоти. У складноорганізованих вірусів у процесі збирання віріонів беруть участь і клітинні структури – ядерна та цитоплазматична мембрани.

6 стадія – вихід вірусу із клітини.

Цей процес у різних вірусів здійснюється по-різному. Вихід ДНК-геномних фагів відбувається за повного лізису клітини фаговим лізоцимом. Складноорганізовані віруси людини та тварин виходять із клітини з ділянкою цитоплазми шляхом брунькування через цитоплазматичну мембрану та оболонку, одночасно набуваючи суперкапсид. Нерідко виходу вірусів із клітини сприяє перетравленню її фагоцитами крові. Віруси рослин із клітини в клітину можуть переходити через міжклітинні сполуки – плазмодесми.

Найчастіше цикл репродукції вірусу завершується продуктивною інфекцією – утворенням численної популяції (100–200) повноцінних віріонів, що зазвичай супроводжується смертю господаря.

Таксономія, класифікація

ПАРАМІКСОВІРУСИ

Параміксовіруси (родина Paramyxoviridae від лат. para - навколо, myxa - слиз) - сімейство РНК-вірусів. Сімейство містить респіраторно-синтиціальний вірус, віруси кору, паротиту, парагрипу, що передаються респіраторним механізмом. У сімейство Paramyxoviridae відповідно до загальноприйнятої класифікації вірусів до останнього часу входили три роди: Paramyxovirus, Morbillivirus, Pneumovirus. Але нещодавно до класифікації внесено зміни.

Сімейство Paramyxoviridaeрозділено на дві підродини, збільшено кількість пологів:

1. Підродина Paramyxovirinae включає пологи Respirovirus(колишня назва - Paramyxovirus), Morbillivirusі Rubulavirus(Новий рід);

2. Підродина Pneumovirinae містить пологи Pneumovirusі Metapneumovirus.

2. Морфологія, розміри, особливості геному

Будова віріону.Усі представники сімейства Paramyxoviridae мають схожу будову. Це складний РНК-геномний вірус великих розмірів. Типовим представником є ​​вірус Сендай (він патогенний для мишей) і ультраструктура параміксовірусів розглядається на цьому прикладі (рис.5). Віріон має округлу форму, діаметр 150-300 нм. Зовні знаходиться ліпопротеїновий суперкапсид із безліччю шипиків двох типів на поверхні (рис.4). Зсередини до суперкапсид прилягає шар матриксного М-білка. У центральній частині віріона знаходиться тяж нуклеокапсиду (РНП) зі спіральним типом симетрії, згорнутий у пухкий клубок.

Мал. 4 Схема параміксовірусу Мал. 5 Електоронограма вірусу Сендай

Геномпредставлений великою молекулою лінійної однонитчастої мінус-РНК, що кодує 7 білків. Серед них основний капсидний білок NP, білки полімеразного комплексу L і Р, неструктурний білок С (усі вони входять до складу нуклеокапсиду), а також М-білок і поверхневі глікопротеїни. Це прикріплювальні білки та білок злиття (F-білок). Прикріплювальні білки утворюють шипики одного типу, а F-білок - шипики іншого типу. У різних параміксовірусів прикріплювальні білки представлені: HN (гемагглютінін-нейрамінідаза), Н (гемагглютинін) або G-білком.

Парагрип.За антигенами вірусних білків HN, NP, F розрізняють 4 основні серотипи вірусів парагрипу. Типи 1, 2, 3 перехресно реагують антитілами до вірусу паротиту. Вірус 4 типу відрізняється і має 2 підтипи (в такий спосіб передбачається наявність 5 типів вірусів парагрипу). Всі віруси парагрипу мають HN - білок і тому виявляють гемагглютинуючу та нейрамінідазну активність. Вірус парагрипу 1, 2 типу аглютинує еритроцити курей, вірус парагрипу 3 аглютинує тільки еритроцити морських свинок.

Параміксовірус (рис. 5) зв'язується глікопротеїнами (HN, H або G) оболонки з поверхнею клітини (1). F-білок забезпечує злиття оболонки вірусу з плазматичною мембраною клітини без утворення ендосом. Реплікація геному подібна до реплікації мінус РНК-геномних вірусів: РНК-полімераза вноситься в клітину з нуклеокапсидом вірусу. Геном транскрибується в окремі іРНК (2) для кожного білка та повноцінну плюс-матрицю (3) для геномної РНК. Нові геноми взаємодіють з L-, P- та NP-білками, утворюючи нуклеокапсиди. Синтезований матриксний білок переміщається до внутрішнього шару клітинної мембрани. Попередники глікопротеїнових шпильок оболонки синтезуються на рибосомах, пов'язаних з мембранами ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). Вони глікозилуються, переміщаючись через ЕР та апарат Гольджі (АГ), вбудовуючись у мембрану клітини. Нуклеокапсид зв'язується з матриксним білком та глікопротеїнмодифікованою мембраною (суперкапсидом). Віріони виходять із клітини (4)брунькуванням.

Мал. 5 Репродукція параміксовірусів

Параміксовіруси мають здатність за допомогою F-білка переходити в сусідні клітини, викликаючи їх злиття. При цьому утворюються багатоядерні гігантські клітини – синцитії (симпласти). Такий механізм дозволяє вірусам поширюватися безпосередньо з клітини у клітину, уникаючи дії віруснейтралізуючих антитіл. Здатність до симпластоутворення - характерна ознака параміксовірусів.

Підбірка по базі: Відповіді на питання по тесту з БЖД.docx, ІІСіТ - питання 2018 відповіді.docx, Контрольні питання для самостійної підготовки.docx, менеджмент теорія питання.docx, ДКБ питання до екзамену.docx, 30 відповідей на питання про біг. pdf , Тестові питання.docx , тести, питання 8РЯ.doc , Контрольні питання та завдання з відповідями для допуску до комп'ютер , Ділові та наукові теми. Питання до заліку.doc.
ЗМІСТ

Контрольні питання:

1. Репродукція ДНК-геномних вірусів: основні етапи, особливості репродукції…………………………………………………..……........……...3

2. Ознаки репродукції вірусів у живих системах: лабораторні тварини, курячі ембріони, культури клітин…………………………………………......……………………..… ……16

3. Завдання............................................... .................................................. ...20

Список литературы……………………………...……………………...........25

1.Репродукція ДНК-геномних вірусів: основні етапи, особливості репродукції

Репродукція вірусів

Процес репродукції вірусів можна умовно розділений на дві фази. Перша фаза охоплює події, які ведуть до адсорбції та проникнення вірусу в клітину, звільнення його внутрішнього компонента та модифікації його таким чином, що він здатний викликати інфекцію. Відповідно, перша фаза включає три стадії: 1) адсорбція вірусу на клітинах; 2) проникнення вірусу у клітини; 3) роздягання вірусу у клітині. Ці стадії спрямовані на те, щоб вірус був доставлений у відповідні клітинні структури і його внутрішній компонент був звільнений від захисних оболонок. Як тільки цієї мети досягнуто, починається друга фаза репродукції, протягом якої відбувається експресія вірусного геному. Ця фаза включає стадії: 1) транскрипції, 2) трансляції інформаційних РНК, 3) реплікації геному, 4) складання вірусних компонентів. Заключною стадією репродукції є вихід з клітини.

Перша фаза репродукції.

I. Адсорбція віріонів лежить на поверхні клітини.

Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто прикріплення вірусних частинок до клітинної поверхні. Процес адсорбції можливий за наявності відповідних рецепторів на поверхні клітини і «дізнаються» їх субстанцій на поверхні вірусу. Найпочаткові процеси адсорбції мають неспецифічний характер, і в їх основі може лежати електростатична взаємодія позитивно і негативно заряджених угруповань на поверхні вірусу і клітини. Проте впізнавання клітинних рецепторів вірусними білками, що веде до прикріплення вірусної частки до клітини, є високоспецифічним процесом. Білки на поверхні вірусу, які впізнають специфічні угруповання на плазматичній мембрані клітини та зумовлюють прикріплення до них вірусної частки, називаються білками прикріплення.

Віруси використовують рецептори, призначені для проходження в клітину необхідних для її життєдіяльності речовин: поживних речовин, гормонів, факторів росту і т.д. Рецепторами для вірусів грипу та параміксовірусів є сіалова кислота у складі глікопротеїдів та гліколіпідів (гангліозидів), для рабдовірусів та реовірусів – також вуглеводний компонент у складі білків та ліпідів, для пікорнавірусів та аденовірусів – білки. Специфічні рецептори грають роль у прикріпленні вірусної частинки до клітинної поверхні. Вони визначають подальшу долю вірусної частки, її внутрішньоклітинний транспорт та доставку до певних ділянок цитоплазми та ядра, де вірус здатний ініціювати інфекційний процес. Вірус може прикріпитися до неспецифічних рецепторів і навіть проникнути в клітину, проте тільки прикріплення до специфічного рецептора призведе до виникнення інфекції.

Прикріплення вірусної частинки до клітинної поверхні спочатку відбувається шляхом утворення одиничного зв'язку вірусної частки з рецептором. Однак таке прикріплення неміцне, і вірусна частка може легко відірватися від клітинної поверхні – оборотна адсорбція. Для того, щоб настала незворотна адсорбція, повинні з'явитися множинні зв'язки між вірусною часткою і багатьма молекулами рецепторів, тобто має відбутися стабільне мультивалентне прикріплення. Кількість молекул клітинних рецепторів в ділянках адсорбції може сягати 3000. Стабільне зв'язування вірусної частинки з клітинною поверхнею в результаті мультивалентного прикріплення відбувається завдяки можливості вільного переміщення молекул рецепторів у ліпідному біле плазматичної мембрани, яке визначається рухливістю, «плинністю» білково-ліпідного білка. Збільшення плинності ліпідів є одним з найбільш ранніх подій при взаємодії вірусу з клітиною, наслідком якого є формування рецепторних полів у місці контакту вірусу з клітинною поверхнею та стабільне прикріплення вірусної частки до угруповань, що виникли.

Кількість специфічних рецепторів лежить на поверхні клітини коливається між 104 і 105 однією клітину. Рецептори низки вірусів може бути представлені лише обмеженому наборі клітин-господарів, і це може визначатися чутливість організму до цього вірусу. Наприклад, пікорнавіруси адсорбуються тільки на клітинах приматів. Рецептори для інших вірусів, навпаки, широко представлені на поверхні клітин різних видів, як, наприклад, рецептори для ортоміксовірусів і параміксовірусів, що являють собою сіаліл-з'єднання. Тому ці віруси мають відносно широкий діапазон клітин, у яких може відбуватися адсорбція вірусних частинок. Рецепторами для ряду тогавірусів мають клітини виключно широкого кола господарів: ці віруси можуть адсорбуватися та інфікувати клітини як хребетних, так і безхребетних.

ІІ. Проникнення вірусу у клітину.

Історично склалося уявлення про два альтернативні механізми проникнення в клітину вірусів тварин - шляхом віропексису (ендоцитозу) та шляхом злиття вірусної та клітинної мембран. Однак обидва ці механізми не виключають, а доповнюють один одного

Термін «віропексис» означає, що вірусна частка потрапляє в цитоплазму в результаті інвагінації ділянки плазматичної мембрани та утворення вакуолі, яка містить вірусну частинку.

Рецепторний ендоцитоз. Віропексис є окремим випадком рецепторного або адсорбційного ендоцитозу. Цей процес є звичайним механізмом, завдяки якому в клітину надходять поживні та регуляторні білки, гормони, ліпопротеїни та інші речовини із позаклітинної рідини. Рецепторний ендоцитоз відбувається у спеціалізованих ділянках плазматичної мембрани, де є спеціальні ямки, покриті з боку цитоплазми спеціальним білком з великою молекулярною масою – клатрином. На дні ямки розташовуються специфічні рецептори. Ямки забезпечують швидку інвагінацію та утворення покритих клатрином внутрішньоклітинних вакуолей. Напівперіод проникнення речовини всередину клітини за цим механізмом не перевищує 10 хв з моменту адсорбції. Кількість вакуолей, що утворюються в одну хвилину, досягає більше 2000. Таким чином, рецепторний ендоцитоз є добре злагодженим механізмом, який забезпечує швидке проникнення в клітину чужорідних речовин.

Вкриті вакуолі зливаються з іншими, більшими цитоплазматичними вакуолями, утворюючи рецептосоми, що містять рецептори, але не містять клатрин, а ті в свою чергу зливаються з лізосомами. Таким шляхом білки, що проникли в клітину, зазвичай транспортуються в лізосоми, де відбувається їх розпад на амінокислоти; вони можуть і уникнути лізосоми, і накопичуватися в інших ділянках клітини в недеградованій формі. Альтернативою рецепторного ендоцитозу є рідинний ендоцитоз, коли інвагінація відбувається не в спеціалізованих ділянках мембрани. Більшість оболонкових та безоболонкових вірусів тварин проникає в клітину за механізмом рецепторного ендоцитозу. Ендоцитоз забезпечує внутрішньоклітинний транспорт вірусної частки у складі ендоцитарної вакуолі, оскільки вакуоль може рухатися в будь-якому напрямку та зливатися з клітинними мембранами (включаючи ядерну мембрану), звільняючи вірусну частинку у відповідних внутрішньоклітинних ділянках. Таким шляхом, наприклад, ядерні віруси потрапляють у ядро, а реовіруси – у лізосоми. Однак вірусні частки, що проникли в клітину, знаходяться у складі вакуолі і відокремлені від цитоплазми її стінками. Їм належить пройти низку етапів, перш ніж вони зможуть спричинити інфекційний процес.

Злиття вірусної та клітинної мембран. Для того, щоб внутрішній компонент вірусу міг пройти через клітинну мембрану, вірус використовує механізм злиття мембран. У оболонкових вірусів злиття обумовлено точковою взаємодією вірусного білка злиття з ліпідами клітинної мембрани, в результаті якого вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а внутрішній компонент вірусу виявляється з іншого боку. У безоболонкових вірусів один із поверхневих білків також взаємодіє з ліпідами клітинних мембран, внаслідок чого внутрішній компонент проходить через мембрану. Більшість вірусів тварин виходить у цитозол із рецептосоми.

Якщо при ендоцитозі вірусна частка є пасивним пасажиром, то за злиття вона стає активним учасником процесу. Білком злиття є одним із її поверхневих білків. На даний час цей білок ідентифікований лише у параміксовірусів та ортоміксовірусів. У параміксовірусів цей білок (Р-білок) є одним з двох глікопротеїдів, що знаходяться на поверхні вірусної частинки. Функцію білка злиття у вірусу грипу виконує мала гемаглютинуюча субодиниця.

Параміксовіруси викликають злиття мембран при нейтральному рН і внутрішній компонент цих вірусів може проникати в клітину безпосередньо через плазматичну мембрану. Однак більшість оболонкових та безоболонкових вірусів викликають злиття мембран тільки при низькому значенні рН – від 5,0 до 5,75. Якщо до клітин додати слабкі підстави (хлорид амонію, хлороквін та інших.), які у ендоцитарних вакуолях підвищують рН до 6,0, злиття мембран немає, вірусні частки залишаються у вакуолях , і інфекційний процес немає. Сувора залежність злиття мембран від значень рН обумовлена ​​конформаційними змінами вірусних білків злиття.

У лізосомі є низьке значення рН (4,9). В ендоцитарній вакуолі (рецептосомі) закислення створюється за рахунок АТФ-залежного протонового насоса ще на клітинній поверхні при утворенні покритої вакуолі. Закислення ендоцитарної вакуолі має велике значення для проникають у клітину фізіологічних лігандів, оскільки низьке значення рН сприяє дисоціації ліганду від рецептора та рециркуляції рецепторів.

Той самий механізм, що лежить в основі злиття вірусних і клітинних мембран, обумовлює індукований вірусами гемоліз і злиття плазматичних мембран клітин, що прилягають один до одного, з утворенням багатоядерних клітин, симпластів і синцитіїв. Віруси викликають два типи злиття клітин: 1) «злиття зовні» та 2) «злиття зсередини». «Злиття зовні» відбувається при високій множинності інфекції і виявляється протягом перших годин після зараження. Цей тип злиття, описаний для парамиксовірусів, обумовлений білками вірусу, що заражає і не вимагає внутрішньоклітинного синтезу вірусних компонентів. Навпаки, «злиття зсередини» відбувається при низькій множинності інфекції, виявляється на порівняно пізніх стадіях інфекційного процесу та обумовлено новоствореними синтезованими вірусними білками. "Злиття зсередини" описано для багатьох вірусів: вірусів герпесу, онковірусів, збудників повільних інфекцій та ін. Цей тип злиття викликають ті ж вірусні глікопротеїди, які забезпечують проникнення вірусу в клітину.

ІІІ. Роздягання - депротеїнізація вірусу

Вірусні частинки, що проникли в клітину, повинні роздягнутися для того, щоб викликати інфекційний процес. Сенс роздягання полягає у видаленні вірусних захисних оболонок, які перешкоджають експресії вірусного геному. Внаслідок роздягання звільняється внутрішній компонент вірусу, який здатний викликати інфекційний процес. Роздягання супроводжується рядом характерних особливостей: в результаті розпаду вірусної частки зникає інфекційна активність, у ряді випадків з'являється чутливість до нуклеазів, виникає стійкість до дії антитіл, що нейтралізує, втрачається фоточутливість при використанні ряду препаратів.

Кінцевими продуктами роздягання є серцевини, нуклеокапсиди чи нуклеїнові кислоти. Для ряду вірусів було показано, що продуктом роздягання є голі нуклеїнові кислоти, а нуклеїнові кислоти, пов'язані з внутрішнім вірусним білком. Наприклад, кінцевим продуктом роздягання пікорнавірусів є РНК, ковалентно пов'язана з білком VРg, кінцевим продуктом роздягання аденовірусів є ДНК, ковалентно пов'язана з одним із внутрішніх вірусних білків.

У ряді випадків здатність вірусів викликати інфекційний процес визначається можливістю їх роздягання у клітині даної системи. Тим самим ця стадія є однією із стадій, що лімітують інфекцію.

Роздягання ряду вірусів відбувається у спеціалізованих ділянках усередині клітини (лізосомах, структурах апарату Гольджі, навколоядерному просторі, ядерних порах на ядерній мембрані). При злитті вірусної та клітинної мембран проникнення в клітину поєднується з роздяганням.

Роздягання та внутрішньоклітинний транспорт є взаємопов'язаними процесами: при порушенні правильного внутрішньоклітинного транспорту до місць роздягання вірусна частка потрапляє у лізосому та руйнується лізосомальними ферментами.

Друга фаза репродукції .

I. Транскрипція.

Транскрипція здійснюється за допомогою спеціального ферменту - РНК-полімерази, який пов'язує нуклеотиди шляхом утворення 3-5'фосфодіефірних містків. Таке зв'язування відбувається лише у присутності ДНК-матриці.

Продуктами транскрипції у клітині є іРНК. Сама клітинна ДНК, яка є носієм генетичної інформації, не може безпосередньо програмувати синтез білка. Передачу генетичної інформації від ДНК до рибосом здійснює РНК-посередник. На цьому заснована центральна догма молекулярної біології, яка виражається такою формулою:

ДНК - транскрипція - РНК - трансляція - білок

де стрілки показують напрямок перенесення генетичної інформації.

Реалізація генетичної інформації у вірусів Стратегія вірусного геному щодо синтезу іРНК у різних вірусів різна. У ДНК-вірусів іРНК синтезується на матриці однієї з ниток ДНК. Формула перенесення генетичної інформації у них така сама, як і в клітині:

ДНК – транскрипція – РНК – трансляція – білок.

ДНК-віруси, репродукція яких відбувається в ядрі, використовують для транскрипції клітинну полімеразу. До цих вірусів належать паповавіруси, аденовіруси, віруси герпесу. ДНК-віруси, репродукція яких відбувається в цитоплазмі, не можуть використовувати клітинний фермент, що знаходиться в ядрі. Транскрипція їхнього геному здійснюється вірусспецифічним ферментом - ДНК-полімеразою, яка проникає в клітину у складі вірусу. До цих вірусів відносяться віруси віспи та іридовіруси.

Ферменти, що транскрибують вірусний геном. Транскрипція ряду ДНК-вірусів - паповавірусів, аденовірусів, вірусів герпесу, парвовірусів, гепаднавірусів. Здійснюється в ядрі клітини, і в цьому процесі широко використовуються механізми клітинної транскрипції – ферменти транскрипції та подальшої модифікації транскриптів. Транскрипція цих вірусів здійснюється клітинною РНК-полімеразою II - ферментом, який здійснює транскрипцію клітинного геному. Однак особлива група транскриптів аденовірусу синтезується за допомогою іншого клітинного ферменту – РНК-полімерази III. У двох інших сімейств ДНК-вірусів тварин - вірусів віспи та іридовірусів - транскрипція відбувається в цитоплазмі. Оскільки в цитоплазмі немає клітинних полімераз, транскрипція цих вірусів потребує спеціального вірусного ферменту - вірусної РНК-полімерази. Цей фермент є структурним вірусним білком.

Регулювання транскрипції. Транскрипція вірусного геному суворо регулюється протягом інфекційного циклу. Регуляція здійснюється як клітинними, і вірусспецифічними механізмами. У деяких вірусів, переважно ДНК-содержащих, є три періоду транскрипцій - надрання, рання і пізня. До цих вірусів належать віруси віспи, герпесу, паповавіруси, аденовіруси. В результаті надранньої та ранньої транскрипції вибірково зчитуються надранні та ранні гени з утворенням надранніх або ранніх іРНК. При пізній транскрипції зчитується інша частина вірусного геному - пізні гени з утворенням пізніх іРНК. Кількість пізніх генів зазвичай перевищує кількість ранніх генів. Багато надранніх генів є генами для неструктурних білків - ферментів і регуляторів транскрипції та реплікації вірусного геному. Навпаки, пізні гени зазвичай є генами структурних білків. Зазвичай за пізньої транскрипції зчитується весь геном, але з переважанням транскрипції пізніх генів.

Фактором регулювання транскрипції у ядерних вірусів є транспорт транскриптів з ядра в цитоплазму, до місця функціонування іРНК - полісомів.

Продуктом надранньої транскрипції вірусів герпесу є А-білки. Функція одного або кількох з них потрібна для транскрипції наступної групи генів, що кодують Р-білки. У свою чергу, Р-білки включають транскрипцію останньої групи пізніх генів, що кодують У-білки. Такий тип регуляції отримав назву "каскадної".

ІІ. Трансляція.

Це - процес перекладу генетичної інформації, що міститься в іРНК на специфічну послідовність амінокислот у синтезованих вірус-специфічних білках. Синтез білка в клітині відбувається внаслідок трансляції іРНК на рибосомах. У рибосомах йде злиття потоку інформації (іРНК) з потоком амінокислот, які приносять транспортні РНК (тРНК). У клітці існує велика кількість різноманітних тРНК. Для кожної амінокислоти має бути своя тРНК.

Молекула тРНК є односпіральною РНК зі складною структурою у вигляді кленового листа.

Зв'язування конкретної тРНК та амінокислоти здійснює фермент аміноацилсинтетазу. Один кінець тРНК пов'язується з амінокислотою, а інший – з нуклеотидами іРНК, яким вони є комплементарними. Три нуклеотиди на іРНК кодують одну амінокислоту і називаються «триплет» або «кодон», а комплементарні кодони три нуклеотиди на тРНК називаються «антикодоном».

Процес транскрипції складається із трьох фаз: ініціації елонгації, термінації.

Ініціація трансляції - найбільш відповідальний етап у процесі трансляції, заснований на впізнанні рибосомою іРНК та зв'язуванні з її особливими ділянками. Рибосома дізнається іРНК завдяки «шапочці» (кеп) на 5'-кінці і ковзає до 3'-кінця, поки не досягне ініціаторного кодону, з якого починається трансляція. В еукаріотичній клітині ініціаторними кодонами є кодони АУГ (аденін, урацил, гуанін), що кодують метіонін. З метіоніну починається синтез усіх поліпептидних ланцюгів. Специфічне впізнавання рибосомою вірусної та РНК здійснюється за рахунок вірусспецифічних ініціаторних факторів.

Спочатку з іРНК зв'язується мала рибосомальна субодиниця. До комплексу іРНК з малою рибосомальною субодиницею приєднуються інші компоненти, необхідні початку трансляції. Це кілька молекул білка, які називаються «ініціаторні фактори». Їх принаймні три в прокаріотичній клітині і більше дев'яти в еукаріотичній клітині. Ініціаторні фактори визначають впізнавання рибосомою специфічних іРНК. В результаті формується комплекс, необхідний для ініціації трансляції, який називається ініціаторним комплексом. До ініціаторного комплексу входять: іРНК; мала рибосомальна субодиниця; аміноацил-тРНК, що несе ініціаторну амінокислоту; ініціаторні фактори; кілька молекул ГТФ (гуанозінтріфосфат).

У рибосомі здійснюється злиття потоку інформації з потоком амінокислот. Входження аміноацил-тРНК в А-центр великої рибосомальної субодиниці є наслідком впізнавання, а її антикодон взаємодіє з кодоном іРНК, що знаходиться в малій рибосомальній субодиниці. При просуванні іРНК на один кодон тРНК перекидається в пептидильний центр (П-центр) і її амінокислота приєднується до ініціаторної амінокислоти з утворенням першого пептидного зв'язку. Вільна від амінокислоти тРНК виходить із рибосоми і може знову функціонувати у транспорті специфічних амінокислот. На її місце з A-центру до П-центру перекидається нова тРНК, і утворюється новий пептидний зв'язок. В A-центрі з'являється вакантний кодон іРНК, до якого негайно приєднується відповідна тРНК, і відбувається приєднання нових амінокислот до поліпептидного ланцюга, що росте.

Елонгація трансляції – процес подовження, нарощування поліпептидного ланцюга, заснований на приєднанні нових амінокислот за допомогою пептидного зв'язку. Відбувається постійне протягування нитки іРНК через рибосому і декодування закладеної в ній генетичної інформації. Часто іРНК функціонує одночасно на декількох рибосомах, кожна з яких синтезує ту саму поліпептидну нитку, що кодується даною іРНК.

Термінація трансляції відбувається у той момент, коли рибосома доходить до термінуючого кодону у складі іРНК (УАА, УГА, УАГ). Трансляція припиняється, і поліпептидний ланцюг звільняється з полірибосоми. Після закінчення трансляції полірибосоми розпадаються на субодиниці, які можуть увійти до складу нових полірибосом.

Кожна та PHК функціонує на кількох рибосомах. Групу рибосом, що працюють на одній молекулі іРНК, називають полірибосомою або полісомою. Полісоми можуть складатися від 4-6 до 20 і більше рибосом.

Вірусспецифічні полісоми можуть бути як вільними, так і пов'язаними з мембранами. Внутрішні білки зазвичай синтезуються на вільних полісомах, глікопротеїди завжди синтезуються на полісомах, пов'язаних із мембранами.

Оскільки геном вірусу тварин представлений молекулою, що кодує більш ніж один білок, віруси поставлені перед необхідністю синтезу або довгої іРНК, що кодує один гігантський поліпептид-попередник, який потім повинен бути нарізаний у специфічних точках на функціонально активні білки, або коротких моноцистронних іРНК, кодує один білок. Таким чином, існують два способи формування вірусних білків:

перший - іРНК транслюється в гігантський поліпептид-попередник, який після синтезу нарізається послідовно на зрілі функціонально активні білки;

другий - іРНК транслюється із заснуванням зрілих білків чи білків, які лише трохи модифікуються після синтезу.

Перший спосіб трансляції характерний для РНК-плюс-ниткових вірусів - пікорнавірусів і тогавірусів. Їх іРНК транслюється в гігантський поліпептидний ланцюг, так званий поліпротеїд, який сповзає у вигляді безперервної стрічки з рибосомного конвеєра і нарізається на індивідуальні білки потрібного розміру. Нарізування вірусних білків - багатоступінчастий процес, який здійснюється як вірусспецифічними, так і клітинними протеазами.

Другий спосіб формування білків характерний для ДНК-вірусів і більшості РНК-вірусів. При цьому способі синтезуються короткі моноцистронні іРНК внаслідок вибіркової транскрипції однієї ділянки геному (гену). Однак, ці віруси широко використовують механізм посттрансляційного нарізання білка.

В еукаріотичній клітині багато білків, у тому числі вірусні, піддаються посттрансляційним модифікаціям, зрілі функціонально активні білки часто неідентичні їх знову синтезованим попередникам. Широко поширені такі посттрансляційні ковалентні модифікації, як глікозилювання, ацилювання, метилювання, сульфування (утворення дисульфідних зв'язків), протеолітичне нарізування та, нарешті, фосфорилювання. В результаті замість 20 генетично закодованих амінокислот із різних клітин різних органів еукаріотів виділено близько 140 дериватів амінокислот.

Глікозилювання. У складі складно влаштованих PHК - і ДНК-вірусів є білки, що містять ковалентно приєднані бічні ланцюжки вуглеводів, - глікопротеїди. Глікопротеїди розташовані у складі вірусних оболонок та знаходяться на поверхні вірусних частинок.

Глікозилювання поліпептидів - складний багатоступінчастий процес, перші етапи якого починаються вже в процесі синтезу поліпептидів, і перший вуглеводний залишок приєднується до поліпептидного ланцюга, що ще не зійшов з рибосоми. Наступні етапи глікозилювання відбуваються шляхом послідовного приєднання вуглеводних залишків до вуглеводного ланцюжка у процесі транспортування поліпептиду до плазматичної мембрани. Вуглеводні залишки приєднуються по одному, і тільки при ініціації синтезу олігосахаридного ланцюга переноситься блок. Остаточне формування вуглеводного ланцюжка може завершуватися на плазматичній мембрані перед збиранням вірусної частки.

Глікозилювання впливає на транспорт, більше, транспорт нерозривно пов'язаний для глікопротеїдів зі стадійним глікозилюванням. Переконливим доказом цього є вплив на вірусну репродукцію інгібіторів глікозилювання; вони повністю пригнічують транспорт поліпептидів, не порушуючи та не інгібуючи їх синтезу.

При пригніченні глікозилювання відповідними інгібіторами (аналоги цукрів типу 2-дезоксиглкжози, антибіотик тунікаміцин) блокується складання віріонів міксо-, рабдо-, α-вірусів або утворюються неінфекційні віріони вірусів герпесу та онковірусів.

Сульфування. Деякі білки складно влаштованих РНК- і ДНК-вірусів сульфуються після трансляції. Найчастіше сульфування піддаються глікопротеїди, при цьому сульфатна група зв'язується з вуглеводними залишками глікопротеїду.

Ацилювання. Ряд глікопротеїдів складно влаштованих РНК-вірусів (НА2 вірусу грипу, білок G вірусу везикулярного стоматиту, білок HN вірусу ньюкаслської хвороби та ін) містять ковалентно пов'язані 1-2 молекули жирних кислот.

Нарізування. Багато вірусні білки, і в першу чергу глікопротеїди, набувають функціональної активності лише після того, як відбудеться їхнє нарізування в специфічних точках протеолітичними ферментами. Нарізання відбувається або з утворенням двох функціональних білкових субодиниць (наприклад, велика і мала субодиниці гемаглютиніну вірусу грипу, два глікопротеїди (Е2 і ЕЗ) вірусу лісу Семлики), або з утворенням одного функціонально активного білка та неактивного ферменту, наприклад білки F і H. Нарізування зазвичай здійснюється клітинними ферментами. У багатьох складно влаштованих вірусів тварин, що мають глікопротеїди, нарізування необхідне для формування активних прикріплювальних білків та білків злиття і, отже, для набуття вірусами здатності інфікувати клітину. Лише після нарізування цих білків вірусна частка набуває інфекційної активності. Таким чином, можна говорити про протеолітичну активацію низки вірусів, що здійснюється за допомогою клітинних ферментів.

Фосфорилювання. Фосфопротеїди містяться практично у складі всіх вірусів тварин - РНК - і ДНК-містять, просто і складно влаштованих. У складі більшості вірусів виявлено протеїнкінази, проте фосфорилювання може здійснюватися як вірусними, так і клітинними ферментами. Зазвичай фосфорилируются білки, пов'язані з вірусним геномом і здійснюють регулюючу роль його експресії. З процесом фосфорилування пов'язаний механізм активної дії інтерферону.

ІІІ. Реплікація.

Реплікацією називається синтез молекул нуклеїнової кислоти, гомологічних геномів. У клітині відбувається реплікація ДНК, у результаті якої утворюються дочірні двонитчасті ДНК. Реплікація відбувається на розплетених ділянках ДНК і йде одночасно на обох нитках від 5'-кінця до 3'-кінця.

Оскільки дві нитки ДНК мають протилежну полярність, а ділянка реплікації («вилка») рухається в одному напрямку, один ланцюг будується у зворотному напрямку окремими фрагментами, які називаються фрагментами Оказаки (на ім'я вченого, який уперше запропонував таку модель). Після синтезу фрагменти козаків «зшиваються» лігазою в єдину нитку.

Реплікація ДНК здійснюється ДНК-полімеразами. Для початку реплікації необхідний попередній синтез короткої ділянки РНК на матриці ДНК, яка називається затравкою. З затравки починається синтез нитки ДНК, після чого РНК швидко видаляється з ділянки, що росте.

Реплікація вірусної ДНК. Реплікація геному ДНК-вірусів в основному каталізується клітинними фрагментами і механізм її схожий з механізмом реплікації клітинної ДНК.

Кожна знов синтезована молекула ДНК складається з однієї батьківської та однієї знов синтезованої нитки. Такий механізм реплікації називається напівконсервативним.

У вірусів, що містять кільцеві двонитчасті ДНК (паповавіруси), розрізається одна з ниток ДНК, що веде до розкручування та зняття супервитків на певній ділянці молекули.

Видно нижня суперспіралізована частина молекули, розплетена частина на великій ділянці і реплікаційні петлі, що знову утворюються.

При реплікації однонитчастих ДНК (родина парвовірусів) відбувається утворення двонитчастих форм, які є проміжними реплікативними формами.

Реплікаційні комплекси. Оскільки нитки ДНК і РНК, що утворюються, деякий час залишаються пов'язаними з матрицею, в зараженій клітині формуються реплікативні комплекси, в яких здійснюється весь процес реплікації (а в ряді випадків також і транскрипції) геному. Реплікативний комплекс містить геном, репліказу та пов'язані з матрицею знову синтезовані ланцюги нуклеїнових кислот. Знову синтезовані геномні молекули негайно асоціюються з вірусними білками, у реплікативних комплексах виявляються антигени. У процесі реплікації виникає частково двонитчаста структура з однонитчастими "хвістами", так званий реплікативний попередник.

Реплікативні комплекси асоційовані з клітинними структурами або з передіснуючими або вірусиндукованими. Наприклад, реплікативні комплекси пікорнавірусів асоційовані з мембранами ендоплазматичної мережі, вірусів віспи - з цитоплазматичним матриксом, реплікативні комплекси аденовірусів і вірусів герпесу в ядрах знаходяться в асоціації з новосформованими волокнистими структурами і пов'язані з ядерними. У заражених клітинах може відбуватися посилена проліферація клітинних структур, з якими пов'язані реплікативні комплекси, або формування з передіснуючого матеріалу. Наприклад, у клітинах, заражених пікорнавірусами, відбувається проліферація гладких мембран. У клітинах, заражених реовірусами, спостерігається скупчення мікротрубочок; у клітинах, заражених вірусами віспи, відбувається формування цитоплазматичного матриксу.

У реплікативних комплексах одночасно з синтезом геномних молекул здійснюється транскрипція і відбувається складання нуклеокапсидів та серцевини, а при деяких інфекціях – і вірусних частинок.

Регулювання реплікації. Новостворена молекула геномної РНК може бути використана по-різному. Вона може асоціюватися з капсидними білками та увійти до складу віріону, служити матрицею для синтезу нових геномних молекул, або – для утворення іРНК, нарешті, у «плюс»-ниткових вірусів вона може виконувати функції іРНК і зв'язуватися з рибосомами. У клітині існують механізми, що регулюють використання геномних молекул. Регуляція йде за принципом саморегуляції та реалізується шляхом взаємодії вірусних РНК та білків завдяки можливості білок-нуклеїнового та білок-білкового впізнавання. Наприклад, роль термінального білка пікорнавірусів полягає в забороні трансляції іРНК та відборі молекул для формування віріонів. Білок, що зв'язується з 5'-кінцем геномної РНК, у свою чергу впізнається капсидними білками і служить сигналом для збирання вірусної частки за участю цієї молекули РНК. За тим же принципом відбираються геномні молекули РНК у мінус-ниткових вірусів. Молекула РНК входить до складу віріону або є матрицею для реплікації. Для перемикання її на транскрипцію має виникнути заборона білок-нуклеїнової взаємодії. У реплікації ДНК аденовірусів бере участь молекула білка, яка зв'язується з кінцем вірусної ДНК і необхідна для початку реплікації. Таким чином, для початку реплікації необхідний синтез вірусних білків: у присутності інгібіторів білкового синтезу відсутнє перемикання транскрипції на реплікацію.

IV. Складання вірусних частинок.

Синтез компонентів вірусних частинок у клітині роз'єднаний і може протікати у різних структурах ядра та цитоплазми. Віруси, реплікація яких відбувається у ядрах, умовно називають ядерними. В основному це ДНК-віруси: аденовіруси, паповавіруси, парвовіруси, віруси герпесу.

Віруси, що реплікуються у цитоплазмі, називають цитоплазматичними. До них відносяться з ДНК-вірусів віспи і більшість РНК-вірусів, за винятком ортоміксовірусів і ретровірусів. Однак цей поділ дуже відносний, тому що в репродукції тих та інших вірусів є стадії, що протікають відповідно в цитоплазмі та ядрі.

Всередині ядра та цитоплазми синтез вірусспецифічних молекул також може бути роз'єднаний. Так, наприклад, синтез одних білків здійснюється на вільних полісомах, а інших – на полісомах, пов'язаних із мембранами. Вірусні нуклеїнові кислоти синтезуються в асоціації з клітинними структурами далеко від полісом, які синтезують вірусні білки. При такому дис'юнктивному способі репродукції утворення вірусної частки можливе лише в тому випадку, якщо вірусні нуклеїнові кислоти і білки мають здатність при достатній концентрації впізнавати один одного в різноманітті клітинних білків і нуклеїнових кислот і мимоволі з'єднуватися один з одним, тобто здатні до самозбирання.

В основі самоскладання лежить специфічне білок-нуклеїнове та білок-білкове впізнавання, яке може відбуватися в результаті гідрофобних, сольових та водневих зв'язків, а також стеричної відповідності. Білок-нуклеїнове впізнавання обмежене невеликою ділянкою молекули нуклеїнової кислоти та визначається унікальними послідовностями нуклеотидів у некодуючій частині вірусного геному. З цього впізнавання ділянки геному вірусними капсидними білками починається процес збирання вірусної частки. Приєднання решти білкових молекул здійснюється за рахунок специфічних білок-білкових взаємодій або неспецифічних білок-нуклеїнових взаємодій.

У зв'язку з різноманітністю структури вірусів тварин різноманітні і способи формування віріонів, проте можна сформулювати такі загальні принципи збирання:

У просто влаштованих вірусів формуються провіріони, які потім у результаті модифікацій білків перетворюються на віріони. У складно влаштованих вірусів складання здійснюється багатоступінчасто. Спочатку формуються нуклеокапсиди чи серцевини, із якими взаємодіють білки зовнішніх оболонок.

Складання складно влаштованих вірусів (за винятком складання вірусів віспи та реовірусів) здійснюється на клітинних мембранах. Складання ядерних вірусів відбувається з участю ядерних мембран, складання цитоплазматичних вірусів - з участю мембран ендоплазматичної мережі чи плазматичної мембрани, куди незалежно друг від друга прибувають усі компоненти вірусної частки.

У ряду складно влаштованих вірусів існують спеціальні гідрофобні білки, що виконують функції посередників між сформованими нуклеокапсидами та вірусними оболонками. Такими білками є матриксні білки у ряду «мінус»-ниткових вірусів (ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів).

Складання нуклеокапсидів, серцевини, провіріонів і віріонів відбувається не у внутрішньоклітинній рідині, а в , що передбачаються в клітині або індукованих вірусом («фабриках»).

Складно влаштовані віруси для побудови своїх частинок використовують ряд елементів клітини-господаря, наприклад, ліпіди, деякі ферменти, у ДНК-геномного 5V40 - гістони, у оболонкових РНК-геномних вірусів - актин, а в складі ареновірусів виявлені навіть рибосоми. Клітинні молекули несуть певні функції у вірусній частинці, проте включення їх у віріон може з'явитися і наслідком випадкової контамінації, як, наприклад, включення ряду ферментів оболонок клітин або клітинних нуклеїнових кислот.

Складання ДНК-вірусів. У складання ДНК-вірусів є деякі відмінності від складання РНК-вірусів. Як і у РНК-вірусів, складання ДНК-вірусів є багатоступеневим процесом з утворенням проміжних форм, що відрізняються від зрілих віріонів за складом поліпептидів. Перший етап складання полягає в асоціації ДНК з внутрішніми білками та формуванні серцевини або нуклеокапсидів. При цьому ДНК з'єднується із попередньо сформованими «порожніми» капсидами.

Внаслідок зв'язування ДНК з капсидами з'являється новий клас проміжних форм, які називаються неповними формами. Крім неповних форм з різним вмістом ДНК, існує інша проміжна форма в морфогенезі - незрілі віріони, що відрізняються від зрілих тим, що містять попередники поліпептидів, що не нарізають. Таким чином, морфогенез вірусів тісно пов'язаний із модифікацією (процесингом) білків.

Складання ядерних вірусів починається в ядрі, зазвичай - з асоціації з ядерною мембраною. Проміжні форми вірусу герпесу, що формуються в ядрі, брунькуються в перинуклеарний простір через внутрішню ядерну мембрану, і вірус набуває таким шляхом оболонку, яка є дериватом ядерної мембрани. Подальша добудова та дозрівання віріонів відбувається у мембранах ендоплазматичної мережі та в апараті Гольджі, звідки вірус у складі цитоплазматичних везикул транспортується на клітинну поверхню.

У ліпідсодержащих вірусів - вірусів віспи, що не забруднюються, складання віріонів відбувається в вже описаних цитоплазматичних вірусних «фабриках». Ліпідна оболонка вірусів у «фабриках» формується з клітинних ліпідів шляхом автономного самоскладання, тому ліпідний склад оболонок значно відрізняється від складу ліпідів у клітинних мембранах.

V. Вихід вірусних частинок із клітини.

Існують два способи виходу вірусного потомства із клітини:

1) шляхом «вибуху»;

2) шляхом брунькування.

Вихід із клітини шляхом вибуху пов'язані з деструкцією клітини, порушенням її цілісності, у результаті зрілі вірусні частки, що знаходяться всередині клітини, виявляються в навколишньому середовищі. Такий спосіб виходу з клітини властивий вірусам, які не містять ліпопротеїдної оболонки (пікорна-, рео-, парво-, папова-, аденовіруси). Однак деякі з цих вірусів можуть транспортуватися на поверхню клітини до загибелі клітини. Вихід із клітин шляхом брунькування властивий вірусам, що містять ліпопротеїдну мембрану, яка є дериватом клітинних мембран. При цьому способі клітина може тривалий час зберігати життєздатність та продукувати вірусне потомство, поки не станеться повне виснаження її ресурсів.

Процес репродукції вірусів умовно можна поділити на 2 фази . Перша фаза включає 3 стадії: 1) адсорбцію вірусу на чутливих клітинах; 2) проникнення вірусу у клітину; 3) депротеїнізацію вірусу . Друга фаза включає стадії реалізації вірусного геному: 1) транскрипцію, 2) трансляцію, 3) реплікацію, 4) складання, дозрівання вірусних частинок та 5) вихід вірусу з клітини.

Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто з прикріплення вірусу до поверхні клітини.

Адсорбціяє специфічним зв'язуванням віріонного білка (антирецептора) з комплементарною структурою клітинної поверхні — клітинним рецептором. За хімічною природою рецептори, на яких фіксуються віруси, відносяться до двох груп: мукопротеїдних та ліпопротеїдних. Віруси грипу, парагрипу, аденовіруси фіксуються на мукопротеїдних рецепторах. Ентеровіруси, віруси герпесу, арбовіруси адсорбуються на ліпопротеїдних рецепторах клітини. Адсорбція відбувається лише за наявності певних електролітів, зокрема іонів Са2+, які нейтралізують надлишкові аніонні заряди вірусу та клітинної поверхні та зменшують електростатичне відштовхування. Адсорбція вірусів мало залежить від температури. вірусу та клітини, а потім настає специфічна взаємодія прикріпного білка віріону зі специфічними угрупованнями на плазматичній мембрані клітини. Прості віруси людини та тварин містять прикріплювальні білки у складі капсиду. У складно організованих вірусів прикріплювальні білки входять до складу супер-капсиду. Вони можуть мати форму ниток (фібри у аденовірусів) або шипів, грибоподібних структур у міксо-, ретро-, рабдо- та інших вірусів. Спочатку відбувається одиничний зв'язок віріона з рецептором - таке неміцне прикріплення - адсорбція носить оборотний характер. Щоб настала незворотна адсорбція, повинні з'явитися множинні зв'язки між рецептором вірусу та рецептором клітини, тобто стабільне мультивалентне прикріплення. Кількість специфічних рецепторів лежить на поверхні однієї клітини становить 10 4 -10 5 . Рецептори деяких вірусів, наприклад, для арбовирусов. містяться на клітинах як хребетних, і безхребетних, інших вірусів лише з клітинах однієї чи кількох видів.

Проникнення вірусів людини та тварин у клітину відбувається двома шляхами: 1) віропексисом (піноцитозом); 2) злиттям вірусної суперкапсидної оболонки є клітинною мембраною. Бактеріофаги мають свій механізм проникнення, так званий шприцевий, коли в результаті скорочення білкового відростка фага нуклеїнова кислота ніби впорскується в клітину.

Депротеїнізація вірусу звільнення геіома вірусу від вірусних захисних оболонок відбувається або з допомогою вірусних ферментів, або з допомогою клітинних ферментів. Кінцевими продуктами депротеїнізації є нуклеїнові або нуклеїнові кислоти, пов'язані з внутрішнім вірусним білком. Потім має місце друга фаза вірусної репродукції, що веде до синтезу вірусних компонентів.

Транскрипція - переписування інформації з ДНК або РНК вірусу на іРНК за законами генетичного коду.

Трансляція - процес перекладу генетичної інформації, що міститься в іРНК, на специфічну послідовність амінокислот.

Реплікація - процес синтезу молекул нуклеїнових кислот, гомологічних вірусному геному.

Реалізація генетичної інформації у ДНК-вірусів йде так само, як і в клітинах:

ДНК транскрипція та-РНК трансляція білок

РНК транскрипція та-РНК трансляція білок

У вірусів з позитивним РНК-геномом (тогавіруси, пікорнавіруси) транскрипція відсутня:

РНК трансляція білок

Ретровіруси мають унікальний шлях передачі генетичної інформації:

РНК зворотна транскрипція ДНК транскрипція та-РНК трансляція білок

ДНК інтегрується із геномом клітини-господаря (провірус).

Після напрацювання клітиною вірусних компонентів настає остання стадія вірусної репродукції, збірка вірусних частинок і вихід віріонів з клітини. Вихід віріонів із клітини здійснюється двома шляхами: 1) шляхом «вибуху» клітини, внаслідок чого клітина руйнується. Цей шлях притаманний простим вірусам (пікорна-, рео-, папова-і аденовірусам), 2) вихід із клітин шляхом брунькування. Притаманний вірусам, що містять суперкапсид. При цьому способі клітина відразу не гине, може дати багаторазове вірусне потомство, доки не вичерпаються її ресурси.

Методи культивування вірусів

Для культивування вірусів в лабораторних умовах використовуються такі живі об'єкти: 1) культури клітин (тканин, органів); 2) курячі мбріони; 3) лабораторні тварини.

Культури клітин

Найбільшого поширення мають одношарові культури клітин, які можна розділити на 1) первинні (первинно трипсинізовані), 2) напівперевиваються (диплоїдні) і 3) перевиваються.

За походженнямвони класифікуються на ембріонштні, пухлинні та з дорослих організмів; з морфогенезу- На фібробластні, епітеліальні та ін.

Первинні культури клітин - це клітини будь-якої тканини людини або тварини, які мають здатність рости у вигляді моношару на пластмасовій або скляній поверхні, покритій спеціальним живильним середовищем. Термін життя таких культур обмежений. У кожному конкретному випадку їх одержують із тканини після механічного подрібнення, обробки протеолітичними ферментами та стандартизації кількості клітин. Первинні культури, отримані з бруньок мавп, бруньок ембріона людини, амніону людини, курячих ембріонів, широко використовуються для виділення та накопичення вірусів, а також для виробництва вірусних вакцин.

Напівперевиваються (або диплоїдні ) культури клітин - клітини одного типу, здатні in vitro витримувати до 50-100 пасажів, зберігаючи при цьому свій вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів ембріона людини використовуються як для діагностики вірусних інфекцій, так і для виробництва вірусних вакцин.

Перевиваються клітинні лінії характеризуються потенційним безсмертям та гетероплоїдним каріотипом.

Джерелом ліній, що перевиваються, можуть бути первинні клітинні культури (наприклад, СОЦ, ПЕМ, ВНК-21 - з нирок одноденних сирійських хом'яків; ПМС - з нирки морської свинки та ін) окремі клітини яких виявляють тенденцію до нескінченного розмноження in vitro. Сукупність змін, що призводять до появи з клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини тканинних культур, що перевиваються, — трансформованими.

Іншим джерелом клітинних ліній, що перевиваються, є злоякісні новоутворення. І тут трансформація клітин відбувається in vivo. Найчастіше у вірусологічній практиці застосовуються такі лінії клітин, що перевиваються: HeLa - отримана з карциноми шийки матки; Нер-2 - з карциноми гортані; Детройт-6 - з метастазу раку легені у кістковий мозок; RH - із нирки людини.

Для культивування клітин необхідні живильні середовища, які за своїм призначенням поділяються на ростові та підтримуючі. У складі ростових поживних середовищ має бути більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару. Підтримуючі середовища повинні забезпечувати лише переживання клітин у сформованому моношарі при розмноженні в клітині вірусів.

Широке застосування знаходять стандартні синтетичні середовища, наприклад, синтетичне середовище 199 та середовище Голка. Незалежно від призначення усі живильні середовища для культур клітин конструюються на основі збалансованого сольового розчину. Найчастіше ним є розчин Хенкса. Невід'ємний компонент більшості ростових середовищ - сироватка крові тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин та формування моношару не відбувається. До складу підтримуючих середовищ сироватка не входить.

Виділення вірусів у культурах клітин та методи їх індикації.

При виділенні вірусів з різних інфекційних матеріалів від хворого (кров, сеча, фекалії, слизові відокремлювані, змив з органів) застосовують культури клітин, що мають найбільшу чутливість до передбачуваного вірусу. Для зараження використовують культури у пробірках із добре розвиненим моношаром клітин. Перед зараженням клітин живильне середовище видаляють і в кожну пробірку вносять по 0,1-0,2 мл суспензії випробуваного матеріалу, попередньо обробленого антибіотиками для знищення бактерій та грибів. Після 30-60 хв. контакту вірусу з клітинами видаляють надлишок матеріалу, вносять у пробірку підтримуюче середовище та залишають у термостаті до виявлення ознак розмноження вірусу.

Індикатором наявності вірусу в заражених культурах клітин може бути:

1) розвиток специфічної дегенерації клітин - цитопатична дія вірусу (ЦПД), яка має три основні типи: кругло-або дрібноклітинна дегенерація; освіта багатоядерних гігантських клітин - симпластів; розвиток вогнищ клітинної проліферації, які з кількох верств клітин;

2) виявлення внутрішньоклітинних включень, що розташовуються в цитоплазмі та ядрах уражених клітин;

3) позитивна реакція гамагтлютинації (РДА);

4) позитивна реакція гемадсорбції (РДАдс);

5) феномен бляшкоутворення: моношар заражених вірусом клітин покривається тонким шаром агару з додаванням індикатора нейтрального червоного (фон - рожевий). За наявності вірусу у клітинах утворюються безбарвні зони («бляшки») на рожевому фоні агару.

6) за відсутності ЦПД чи ГА можна поставити реакцію інтерференції: досліджувана культура повторно заражається вірусом, що викликає ЦПД. У позитивному випадку ЦПД не буде (реакція інтерференції позитивна). Якщо досліджуваному матеріалі вірусу був, спостерігається ЦПД.

Виділення вірусів у курячих ембріонах.

Для вірусологічних досліджень використовують курячі ембріони 7-12-денного віку.

Перед зараженням визначають життєздатність ембріона. При овоскопіюванні живі ембріони рухливі, добре видно судинний малюнок. Простим олівцем відзначають межі повітряного мішка. Заражають курячі ембріони в асептичних умовах, стерильними інструментами, попередньо обробивши шкаралупу над повітряним простором йодом та спиртом.

Методи зараження курячих ембріонів можуть бути різні: нанесення вірусу на хоріон-алантоїсну оболонку, в амніотичну та алантоїсну порожнини, в жовтковий мішок. Вибір методу зараження залежить від біологічних властивостей вірусу, що вивчається.

Індикація вірусу в курячому ембріоні проводиться по загибелі ембріона, позитивної реакції гемаглютинації на склі з алантоїсною або амніотичною рідиною, за фокусними ураженнями («бляшкам») на хоріон-алантоїсної оболонки.

ІІІ. Виділення вірусів на лабораторних тваринах.

Лабораторні тварини можуть бути використані для виділення вірусів з інфекційного матеріалу, коли неможливо застосувати зручніші системи (культури клітин або курячі ембріони). Беруть переважно новонароджених білих мишей, хом'яків, морських свинок, щур. Заражають тварин за принципом цитотропізму вірусу: пневмотропні віруси вводяться інтраназально, нейротропні – інтрацеребрально, дерматотропні – на шкіру.

Індикація вірусу заснована на появі ознак захворювання у тварин, їх загибелі, патоморфологічних та патогістологічних змін у тканинах та органах, а також за позитивною реакцією гемагглтотинації з екстрактами з органів.

Не здійснюється бінарним поділом. Ще у 50-х роках минулого століття було встановлено, що розмноження здійснюється методом репродукції (у перекладі з англ. reproduce – робити копію, відтворювати), тобто шляхом відтворення нуклеїнових кислот, а також синтезу білка з подальшим збиранням віріонів. Дані процеси відбуваються у різних частинах клітини так званого господаря (наприклад, в ядрі або цитоплазмі). Цей роз'єднаний метод репродукції вірусів називається диз'юнктивним. Саме на цьому ми зупинимося докладніше в нашій статті.

Процес репродукції

Цей процес має особливості репродукції вірусів і відрізняється послідовною зміною деяких стадій. Розглянемо їх окремо.

Фази

Вірусна репродукція в клітині здійснюється в декілька фаз, описаних нижче:

1. Перша фаза є адсорбцією вірусу, про яку йшлося вище, на поверхні клітини, яка є чутливою до цього вірусу.
2. Друга є проникнення вірусу в клітини господаря методом віропексису.
3. Третя – це якесь «роздягання» віріонів, вивільнення нуклеїнової кислоти від капсиду та суперкапсиду. У ряду вірусів попадання нуклеїнової кислоти у клітини відбувається методом злиття віріонної оболонки та клітини-хазяїна. В даному випадку третя та друга фази об'єднуються в єдину.

Адсорбція

Під цією стадією репродукції вірусів мається на увазі проникнення вірусної частки клітини. Адсорбція починається на клітинній поверхні за допомогою взаємодії клітинних та вірусних рецепторів. У перекладі з латинської слово "рецептори" означає "приймає". Вони є спеціальні чутливі освіти, які сприймають роздратування. Рецептори - це молекули чи молекулярні комплекси, розташовані лежить на поверхні клітин, і навіть здатні розпізнавати хімічні специфічні угруповання, молекули чи інші клітини, пов'язувати їх. У найбільш складних віріонів такі рецептори розташовуються із зовнішньої оболонки у вигляді шиповидного виросту або ворсинки, у простих віріонів вони знаходяться, як правило, на поверхні капсиду.

Механізм адсорбції на поверхні сприйнятливої ​​клітини ґрунтується на взаємодії рецепторів із так званими комплементарними рецепторами "господарської" клітини. Рецептори віріона та клітини є деякими специфічними структурами, які розташовані на поверхні.

Аденовіруси та міксовіруси адсорбуються безпосередньо на мукопротеїнових рецепторах, а арбовіруси та пікорнавіруси – на ліпопротеїнових рецепторах.

У віріону міксовірусів нейрамінідаза руйнує мукогфотеїновий рецептор і відщеплює N-ацетилнейрамінові кислоти від олігосахариду, який містить галактозу і галактозамін. Їхні взаємодії на даному етапі оборотні, адже на них значно впливає температура, реакція середовища та сольові компоненти. Адсорбції віріону перешкоджають гепарин і сульфатовані полісахариди, що при цьому несуть негативний заряд, проте їх інгібуюча дія знімається деякими полікаріонами (екмолін, ДЕАЕ-декстран, протамінсулъфат), що нейтралізують негативний заряд від сульфат.

Попадання віріона в "господарську" клітину

Шлях впровадження вірусу в чутливу до нього клітину не завжди буде одним і тим самим. Багато віріонів здатні проникати в клітини методом піноцитозу, що в перекладі з грецької означає "пити", "випивати". При цьому методі піноцитозная вакуоль ніби втягує віріон безпосередньо всередину клітини. Інші віріони можуть проникати у клітину безпосередньо крізь її оболонку.

Контакт ферменту нейрамінідазу з клітинними мукопротеїдами сприяє потраплянню віріонів у клітину серед міксовірусів. Результати досліджень останніх років доводять, що ДНК та РНК віріонів від зовнішньої оболонки не відокремлюються, тобто віріони проникають цілком у чутливі клітини шляхом піноцитозу або віропексису. На даний момент це підтверджено щодо вірусу віспи, осповакцини, а також інших вірусів, що вибирають місцем існування організм тварин. Якщо говорити про фаги, вони заражають нуклеїновою кислотою клітини. Механізм зараження ґрунтується на тому, що ті віріони, які містяться у вакуолях клітин, гідролізуються ферментами (ліпаз, протеаз), у процесі чого від оболонки фага звільняється ДНК та потрапляє до клітини.

Для проведення експерименту виконувалося зараження клітини за допомогою нуклеїнової кислоти, яка була виділена від деяких вірусів, і викликається повний цикл репродукції віріонів. Однак у природних умовах інфікування за допомогою такої кислоти не відбувається.

Дезінтеграція

Наступний етап репродукції вірусів - дезінтеграція, яка є звільненням НК від капсиду і зовнішньої оболонки. Після потрапляння віріону в клітини, капсид переживає деякі зміни, набуваючи чутливості до клітинного протеазу, потім він руйнується, паралельно звільняючи ПК. В окремих бактеріофагів у клітини потрапляє вільна ПК. Фітопатогенний вірус проникає через пошкодження клітинної стінки, а потім він адсорбується на внутрішньому клітинному рецепторі з одночасним вивільненням НК.

Реплікація РНК та синтез вірусного білка

Наступним етапом репродукції вірусів є синтез вірусоспецифічного білка, який відбувається за участю так званих інформаційних РНК (у окремих вірусів вони перебувають у складі віріонів, а в деяких синтезуються лише у заражених клітинах безпосередньо на матриці віріонної ДНК або РНК). Відбувається реплікація вірусної ПК.

Процес репродукції РНК-вірусів починається після попадання нуклеопротеїдів у клітину, де формуються вірусні полісоми методом комплексування РНК з рибосомами. Після цього синтезуються і ранні білки, куди слід віднести репресори з клітинного метаболізму, і навіть РНК-полимеразы, які транслюються з батьківської молекулою РНК. У цитоплазмі найбільш дрібних вірусів, або в ядрі, утворюється вірусна двонитчаста РНК методом комплексування батьківського плюс-ланцюга («+» - РНК-ланцюг) із знову синтезованим, а також комплементарним з ним мінус-ланцюга («-» - РНК-ланцюга) . З'єднання даних ниток з нуклеїнової кислоти провокує утворення лише однонитчастої структури РНК, яка називається реплікативною формою. Синтези вірусної РНК здійснюються реплікативними комплексами, у яких беруть участь реплікативна форма РНК, фермент РНК-полімерази, полісоми.

Існує 2 види РНК-полімераз. До таких відносяться: РНК-полімераза I, яка каталізує формування реплікативної форми безпосередньо на матриці плюс-ланцюга, а також РНК-полімераза II, яка бере участь у синтезі вірусної РНК однониткової на матриці реплікативного типу. Синтез нуклеїнових кислот у дрібних вірусів відбувається у цитоплазмі. Що стосується вірусу грипу, то в ядрі синтезується внутрішній білок та РНК. РНК виділяється потім з ядра і проникає в цитоплазму, де разом із рибосомами починає синтезувати вірусний білок.

Після потрапляння віріонів у клітини, у них пригнічується синтез нуклеїнової кислоти, а також клітинних білків. При репродукції на матриці в ядрі синтезується ще РНК, яка несе в собі інформацію для синтезу білка. Механізм синтезу вірусного білка складає рівні клітинної рибосоми, а джерелом побудови буде амінокислотний фонд. Активізація амінокислот здійснюється ферментами, за допомогою і-РНК переносяться безпосередньо в рибосоми (полісоми), в яких вони знаходяться вже в синтезованій молекулі білків.

Таким чином, у заражених клітинах синтез нуклеїнових кислот та білків віріону здійснюється у складі реплікативно-транскриптивного складного комплексу, що регулюється якоюсь системою механізму.

Морфогенез віріону

Утворення віріонів може статися лише у разі строго впорядкованого з'єднання структурних вірусних поліпептидів, а також їх ПК. А це забезпечується так званим самоскладанням молекул білка біля НК.

Формування віріону

Формування віріона відбувається за участю деяких структурних компонентів, що входять до складу клітини. Віруси герпесу, поліомієліту та осповакцини утворюються в цитоплазмі, а аденовіруси – в ядрі. Синтез вірусної РНК, і навіть формування нуклеокапсида відбувається у ядрі, а гемагглютинин формується в цитоплазмі. Після цього нуклеокапсид перебирається з ядра в цитоплазму, де здійснюється утворення оболонки віріона. Нуклеокапсид покривається зовні вірусними білками, а до складу віріону при цьому включаються гемаглютиніни та нейрамінідази. Саме таким чином відбувається утворення нащадків, наприклад, вірусу грипу.

Вивільнення віріона з "господарської" клітини

З "господарської" клітини частки вірусу виділяються одночасно (під час руйнування клітин) або поступово (без будь-яких руйнувань клітин).

Саме в такому вигляді відбувається репродукція вірусів. Віріони вивільняються з клітин, як правило, двома способами.

Перший метод

Перший спосіб має на увазі наступне: після абсолютного дозрівання віріонів безпосередньо всередині клітини вони округляються, там утворюються вакуолі, а потім руйнується клітинна оболонка. По завершенню цих процесів віріони виходять усі одночасно і повністю з клітин (пікорнавіруси). Цей спосіб прийнято називати літичним.

Другий метод

Другий спосіб має на увазі процес звільнення віріонів у міру їх дозрівання протягом 2-6 годин на цитоплазматичній мембрані (міксовіруси та арбовіруси). Виділення із клітини міксовірусів сприяє нейрамінідази, що руйнують клітинну оболонку. Під час цього способу 75-90% віріонів виходять спонтанно у культуральне середовище, а клітини поступово гинуть.