Типи взаємодії вірусу та клітини. Продуктивний тип взаємодії вірусу із клітиною

Взаємодія віріона з живою клітиною здійснюється у кілька етапів.

У початковий (підготовчий) період віріон прикріплюється до клітини, проникає всередину її, після чого білкова оболонка віріона руйнується, звільняючи нуклеїнову кислоту.

Настає прихований (латентний) період вірусної інфекції, під час якого присутність у зараженій клітині вірусних частинок не можна виявити жодними методами – батьківський віріон як би зникає. У цей період вірусна нуклеїнова кислота, що проникла в клітину, організує синтез вірусних компонентів потомства, використовуючи для цієї мети ферментативну систему господаря. Цикл розмноження закінчується формуванням дочірніх віріонів та виходом їх із клітини ( кінцевий період ).

Простіше влаштовані бактерії не здатні самі захоплювати частинки з навколишнього середовища. Тому у бактеріофагів є спец. пристрої для подолання щільної бактеріальної стінки. У кінцевій частині хвоста міститься особливий фермент, який розчиняє бактеріальну оболонку. Потім мікроскопічні "м'язи" хвоста скорочуються і нуклеїнова кислота фага "впорскується" всередину клітини, відбувається як би ін'єкція за допомогою шприца.

Внаслідок цього білковий чохол фага залишається на поверхні клітини, а всередину клітини потрапляє лише нуклеїнова кислота.

Нуклеїнові кислоти вірусів здійснюють програму зі створення у клітині нового вірусного потомства. Це було підтверджено оригінальними дослідами. Вдалося розділити віруси на складові їх компоненти - білки та нуклеїнові кислоти. Виявилося, що зараження клітин та розмноження вірусів відбувалося лише після додавання до клітин вірусної нуклеїнової кислоти. Інакше кажучи, нуклеїнові кислоти вірусів власними силами можуть викликати розмноження вірусів, т. е. мають інфекційними властивостями. В іншому досвіді два віруси були розділені на складові компоненти, а потім "переодягнуті": нуклеїнову кислоту одного вірусу "одягли" в оболонку іншого. Отриманими гібридами були заражені чутливі клітини. Було виявлено, що обидва «переодягнені» віруси здатні розмножуватися, а потомство, що утворюється, завжди подібно до того вірусу, нуклеїнову кислоту якого містив гібрид.

Вірусна нуклеїнова кислота, що проникла в клітину, керує всіма процесами розмноження вірусу. Спочатку вона змушує клітину синтезувати звані ранні білки, що пригнічують власний обмін речовин клітини і забезпечують синтез нуклеїнових кислот дочірніх частинок. Утворення їх відбувається внаслідок самокопіювання батьківської нуклеїнової кислоти. Генетична інформація, закладена в нуклеїновій кислоті вірусу, визначає склад білків, у тому числі будуються дочірні частки про пізніх білків. У ДНК-з вірусами реалізація цієї інформації здійснюється звичайним для клітини шляхом: на ДНК синтезується інформаційна РНК (транскрипція), що керує подальшим біосинтезом білків (трансляція). У нуклеїновій кислоті багатьох РНК-містять Ст об'єднані і генетична, і інформаційна функції: РНК бере участь і в реплікації, і в трансляції (у відтворенні нуклеїнових кислот і білка вірусу). У багатьох вірусів побудова білкових оболонок та внутрішнього вмісту йде окремо. Клітина "напрацьовує" окремі деталі, які потім з'єднуються, утворюючи вірусні частки. Коли в зараженій клітині накопичиться достатня кількість “заготівель” для майбутніх вірусних частинок, настає збирання деталей (композиція). Цей процес відбувається зазвичай поблизу клітинної оболонки, яка бере в ньому участь. У складі вірусної частки часто виявляються речовини,

характерні клітини, у якій розмножується вірус. Наприклад, у вірусу грипу заключний етап формування вірусної частки – своєрідне обволікання її шаром клітинної мембрани. Тобто, клітина не тільки «годує» та «напуває» вірус, але на прощання ще й «одягає» їх. Останній етап взаємодії вірусу та клітини, як правило, нетривалий. Повноцінні вірусні частки, що утворилися, швидко виходять у зовнішнє середовище. Дуже своєрідно відбувається вихід потомства у бактеріофагів. Він зазвичай супроводжується розчиненням (лізисом) бактеріальних клітин під дією особливого ферменту, який накопичується в клітині паралельно розмноженню фага і призводить її до руйнування і загибелі. Під мікроскоп добре видно, як це відбувається. Іноді бактерії ніби вибухають, в інших випадках у бактерії (у середині або на одному з кінців) утворюється отвір, через який витікає її вміст. З однієї загиблої бактерії може звільнитися кілька сотень нових частинок фага. Процес розмноження фагів триває доти, доки знищать усі чутливі до цього фагу бактерії. Для вірусу віспи, поліомієліту, енцефалітів також характерний швидкий вихід у довкілля сотень, а часом тисяч дочірніх віріонів. Інші віруси людини і тварин (вірус герпесу, свинки, реовіруси) виходять із клітин у міру дозрівання. Ці віруси до моменту загибелі клітин встигають зробити кілька циклів розмноження, поступово виснажуючи синтетичні ресурси клітин та викликаючи їх руйнування. В окремих випадках Ст можуть накопичуватися всередині клітин, утворюючи кристалоподібні скупчення (В. сказу, аденовіруси та ін), які називають тільцями включень.

При грипі, сказі, псіттакозі, віспі такі тільця виявляють у цитоплазмі клітин, при весняно-літньому енцефаліті, жовтій лихоманці, герпесі та поліомієліті – в ядрі; при деяких інфекціях тільця включень знаходили як у ядрі, так і в цитоплазмі. Дослідження останніх років показали, що в переважній більшості випадків ці включення є колонією вірусу, причому їх утворення закономірно на певній стадії розмноження збудників інфекції. Висока специфічність внутрішньоклітинних включень при вірусних захворюваннях дозволяє використовувати цю ознаку для діагностики. Наприклад, виявлені в нервових клітинах головного мозку цитоплазматичні включення (так звані тільця Негрі) є основним доказом захворювання на сказ, а специфічні утворення круглої або овальної форми (так зв. тільця Гварнієри), виявлені в епітеліальних клітинах, вказують на захворювання віспою. Включення описані також при енцефаліті, дитячому спинномозковому паралічі, ящурі та інших захворюваннях. Дуже своєрідні включення, мають кристалічну форму, утворюють віруси рослин. Тобто розмноження вірусів відбувається особливим, ні з чим незрівнянним способом. Спочатку вірусні частинки проникають всередину клітин та звільняються вірусні нуклеїнові к-ти. Потім заготовляють деталі майбутніх вірусних частинок. Розмноження закінчується збиранням нових вірусних частинок і виходом їх у навколишнє середовище. Випадання будь-якого із зазначених етапів призводить до порушення нормального циклу і спричиняє або повне придушення розмноження Ст, або поява неповноцінного потомства.

Основні етапи взаємодії вірусу із клітиною господаря.

1. Адсорбція - пусковий механізм, пов'язаний із взаємодією специфічних рецепторів вірусу та господаря (у вірусу грипу-гемагглютинін, у вірусу імунодефіциту людини – глікопротеїн gp 120).

2. Проникнення - шляхом злиття суперкапсиду з мембраною клітин або шляхом ендоцитозу (піноцитозу).

3. Звільнення нуклеїнових кислот - ―роздягання нуклеокапсиду та активація нуклеїнової кислоти.

4. Синтез нуклеїнових кислот та вірусних білків , тобто. підпорядкування систем клітини господаря та його робота на відтворення вірусу.

5. Складання віріонів - асоціація реплікованих копій вірусної нуклеїнової кислоти із капсидним білком.

6. Вихід вірусних частинок із клітини , придбання суперкапсиду оболонковими вірусами

Форми вірусної інфекції.

На рівні макроорганізму основні форми вірусних уражень принципово не відрізняються від таких, що спостерігаються при інфікуванні вірусами окремих клітин.

Продуктивна вірусна інфекція з утворенням дочірніх популяцій та характерними клінічними проявами можлива лише за наявності у зараженому організмі чутливих клітин, у яких здійснюється репродуктивний цикл збудника. Наприклад, збудник поліомієліту може реплікувати тільки в клітинах ШКТ та ЦНС приматів та людини.

Абортивна інфекція розвивається при проникненні збудника в нечутливі клітини (наприклад, при попаданні вірусу лейкозу корів в організм людини) або клітини, не здатні забезпечити повний репродуктивний цикл (наприклад, що знаходяться в стадії клітинного циклу G0). Здатність клітин до підтримки вірусспецифічних репродуктивних процесів також пригнічує ІФН, противірусний ефект якого спрямований проти різних вірусів.

Персистуюча вірусна інфекція виникає при такій взаємодії між вірусом та зараженою клітиною, коли в останній продовжується виконання власних клітинних функцій. Якщо клітини заражені діляться, утворюється інфікований клон. Таким чином, збільшення числа заражених клітин сприяє збільшенню загальної популяції збудника в організмі. Проте персистуючі вірусні інфекції зазвичай порушують функції клітин, що зрештою призводить до клінічних проявів. У людини розвиток персистуючих інфекцій певною мірою залежить від віку. Наприклад, внутрішньоутробне зараження вірусом корової краснухи або цитомегаловірусом (ЦМВ) призводить до обмеженого часу персистування збудника. Поява симптоматики пов'язані з можливістю плоду розвивати імунні реакцію інфекційний агент.

Латентна (прихована) вірусна інфекція . У той час, як персистуючі інфекції супроводжуються постійним вивільненням дочірніх вірусних популяцій, при латентних ураженнях вони утворюються спорадично. Репродуктивний цикл подібних збудників різко уповільнюється на пізніх стадіях та активується під впливом різних факторів.

Латентні інфекції характерні для більшості герпесвірусів, що викликають рецидивні та зазвичай не прогресуючі захворювання.

Інаппарантні інфекції * Від лат. in-, заперечення, + арраrео, бути супроводжуються безсимптомною циркуляцією незначних кількостей збудника в окремих органах. При цьому виявити збудника можна лише спеціальними методами. Від безсимптомного носійства подібні поразки відрізняє більша ймовірність виникнення клінічних проявів. Цей термін застосовують за цілого ряду інфекцій, при яких немає явних ознак захворювання. У практиці вірусних інфекцій у людини часто застосовують альтернативний термін субклінічна інфекція. Власне, і латентні інфекції можна розцінювати як інпаратні інфекції, що хронічно протікають, при яких встановлюється баланс між організмом і збудником.

Дрімуча (криптогенна) вірусна інфекція - форма прояву вірусної інфекції, при якій збудник у неактивному стані знаходиться в окремих вогнищах (наприклад, у нервових гангліях). Клінічно інфекція проявляється лише за різкого ослаблення захисних сил організму. Наприклад, вірус герпесу 3 типу, що викликає при первинному зараженні вітряну віспу, довічно зберігається в організмі. Рецидив захворювання у формі оперізувального лишаю можливий лише при порушеннях імунного статусу (найчастіше у похилому віці).

Повільні вірусні інфекції характеризуються тривалим інкубаційним періодом (місяці та роки), протягом якого збудник розмножується, викликаючи все більш явні ушкодження тканин. Спочатку збудник розмножується в обмеженій групі клітин, але поступово інфікує дедалі більше їх число. Захворювання закінчуються розвитком важких поразок та смертю хворого. До повільних вірусних інфекцій відносять підгострий склерозуючий паненцефаліт, ВІЛ-інфекцію та ін.

№ 19 Типи взаємодії вірусу із клітиною. Стадії репродукції вірусів.
Типи взаємодії вірусу із клітиною. Розрізняють три типи взаємодії вірусу з клітиною: продуктивний, абортивний та інтегративний.
Продуктивний тип- завершується утворенням нового покоління віріонів та загибеллю (лізисом) заражених клітин (цитолітична форма). Деякі віруси виходять із клітин, не руйнуючи їх (нецитолітична форма).
Абортивний тип- не завершується утворенням нових віріонів, оскільки інфекційний процес у клітині переривається одному з етапів.
Інтегративний тип,або вирогенія- характеризується вбудовуванням (інтеграцією) вірусної ДНК у вигляді провірусу у хромосому клітини та їх спільним співіснуванням (спільна реплікація).
Репродукція вірусівздійснюється в кілька стадій, що послідовно змінюють один одного: адсорбція вірусу на клітині; проникнення вірусу у клітину; "роздягання" вірусу; біосинтез вірусних компонентів у клітині; формування вірусів; вихід вірусів із клітини.
Адсорбція.Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто прикріплення вірусів до поверхні клітини. Це високоспецифічний процес. Вірус адсорбується на певних ділянках клітинної мембрани – про рецепторах. Клітинні рецептори можуть мати різну хімічну природу, являючи собою білки, вуглеводні компоненти білків та ліпідів, ліпіди. Число специфічних рецепторів на поверхні однієї клітини коливається від 104 до 105. Отже, на клітині можуть адсорбуватись десятки і навіть сотні вірусних частинок.
Проникнення у клітину. Існує два способи проникнення вірусів тварин у клітину: віропексис та злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною. При віропексисі після адсорбції вірусів відбуваються інвагінація (вп'ячування) ділянки клітинної мембрани та утворення внутрішньоклітинної вакуолі, що містить вірусну частинку. Вакуоля з вірусом може транспортуватися в будь-якому напрямку до різних ділянок цитоплазми або ядра клітини. Процес злиття здійснюється одним із поверхневих вірусних білків капсидної або суперкапсидної оболонки. Очевидно, обидва механізми проникнення вірусу клітину не виключають, а доповнюють одне одного.
"Роздягання".Процес «роздягання» полягає у видаленні захисних вірусних оболонок та звільненні внутрішнього компонента вірусу, здатного викликати інфекційний процес. «Роздягання» вірусів відбувається поступово, кілька етапів, у певних ділянках цитоплазми чи ядра клітини, навіщо клітина використовує набір спеціальних ферментів. У разі проникнення вірусу шляхом злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною, процес проникнення вірусу в клітину поєднується з першим етапом його «роздягання». Кінцевими продуктами роздягання є серцевина, нуклеокапсид або нуклеїнова кислота вірусу.
Біосинтез компонентів вірусу. Вірусна нуклеїнова кислота, що проникла в клітину, несе генетичну інформацію, яка успішно конкурує з генетичною інформацією клітини. Вона дезорганізує роботу клітинних систем, пригнічує власний метаболізм клітини та змушує її синтезувати нові вірусні білки та нуклеїнові кислоти, що йдуть на побудову вірусного потомства.
Реалізація генетичної інформації вірусу здійснюється відповідно до процесів транскрипції, трансляції та реплікації.
Формування (складання) вірусів. Синтезовані вірусні нуклеїнові кислоти та білки мають здатність специфічно «пізнавати» один одного і при достатній їх концентрації мимоволі з'єднуються в результаті гідрофобних, сольових і водневих зв'язків.
Існують такі загальні принципи збирання вірусів, що мають різну структуру:
1. Формування вірусів є багатоступеневим процесом із заснуванням проміжних форм;
2. Складання просто влаштованих вірусів полягає у взаємодії молекул вірусних нуклеїнових кислот з капсидними білками та утворенні нуклеокапсидів (наприклад, віруси поліомієліту). У складно влаштованих вірусів спочатку формуються нуклеокапсиди, із якими взаємодіють білки суперкапсидних оболонок (наприклад, віруси грипу);
3. Формування вірусів відбувається у внутрішньоклітинної рідини, але в ядерних чи цитоплазматичних мембранах клітини;
4. Складно організовані віруси в процесі формування включають до складу компоненти клітини-господаря (ліпіди, вуглеводи).
Вихід вірусів із клітини. Розрізняють два основні типи виходу вірусного потомства із клітини. Перший тип – вибуховий – характеризується одночасним виходом великої кількості вірусів. У цьому клітина швидко гине. Такий спосіб виходу характерний для вірусів, які не мають суперкапсидної оболонки. Другий тип – брунькування. Він притаманний вірусам, які мають суперкапсидну оболонку. На заключному етапі складання нуклеокапсиди складно влаштованих вірусів фіксуються на клітинній плазматичній мембрані, модифікованій вірусними білками, і поступово випинають її. В результаті випинання утворюється "нирка", що містить нуклеокапсид. Потім "нирка" відокремлюється від клітини. Таким чином, зовнішня оболонка цих вірусів формується в процесі їхнього виходу з клітини. При такому механізмі клітина може тривалий час продукувати вірус, зберігаючи тією чи іншою мірою свої основні функції.
Час, необхідний реалізації повного циклу репродукції вірусів, варіює від 5-6 год (віруси грипу, натуральної віспи та інших.) до кількох діб (віруси кору, аденовіруси та інших.). Віруси, що утворилися, здатні інфікувати нові клітини і проходити в них зазначений вище цикл репродукції.

Процес репродукції вірусів умовно можна поділити на 2 фази . Перша фаза включає 3 стадії: 1) адсорбцію вірусу на чутливих клітинах; 2) проникнення вірусу у клітину; 3) депротеїнізацію вірусу . Друга фаза включає стадії реалізації вірусного геному: 1) транскрипцію, 2) трансляцію, 3) реплікацію, 4) складання, дозрівання вірусних частинок та 5) вихід вірусу з клітини.

Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто з прикріплення вірусу до поверхні клітини.

Адсорбціяє специфічним зв'язуванням віріонного білка (антирецептора) з комплементарною структурою клітинної поверхні — клітинним рецептором. За хімічною природою рецептори, на яких фіксуються віруси, відносяться до двох груп: мукопротеїдних та ліпопротеїдних. Віруси грипу, парагрипу, аденовіруси фіксуються на мукопротеїдних рецепторах. Ентеровіруси, віруси герпесу, арбовіруси адсорбуються на ліпопротеїдних рецепторах клітини. Адсорбція відбувається лише за наявності певних електролітів, зокрема іонів Са2+, які нейтралізують надлишкові аніонні заряди вірусу та клітинної поверхні та зменшують електростатичне відштовхування. Адсорбція вірусів мало залежить від температури. вірусу та клітини, а потім настає специфічна взаємодія прикріпного білка віріону зі специфічними угрупованнями на плазматичній мембрані клітини. Прості віруси людини та тварин містять прикріплювальні білки у складі капсиду. У складно організованих вірусів прикріплювальні білки входять до складу супер-капсиду. Вони можуть мати форму ниток (фібри у аденовірусів) або шипів, грибоподібних структур у міксо-, ретро-, рабдо- та інших вірусів. Спочатку відбувається одиничний зв'язок віріона з рецептором - таке неміцне прикріплення - адсорбція носить оборотний характер. Щоб настала незворотна адсорбція, повинні з'явитися множинні зв'язки між рецептором вірусу та рецептором клітини, тобто стабільне мультивалентне прикріплення. Кількість специфічних рецепторів лежить на поверхні однієї клітини становить 10 4 -10 5 . Рецептори деяких вірусів, наприклад, для арбовирусов. містяться на клітинах як хребетних, і безхребетних, інших вірусів лише з клітинах однієї чи кількох видів.

Проникнення вірусів людини та тварин у клітину відбувається двома шляхами: 1) віропексисом (піноцитозом); 2) злиттям вірусної суперкапсидної оболонки є клітинною мембраною. Бактеріофаги мають свій механізм проникнення, так званий шприцевий, коли в результаті скорочення білкового відростка фага нуклеїнова кислота ніби впорскується в клітину.

Депротеїнізація вірусу звільнення геіома вірусу від вірусних захисних оболонок відбувається або з допомогою вірусних ферментів, або з допомогою клітинних ферментів. Кінцевими продуктами депротеїнізації є нуклеїнові або нуклеїнові кислоти, пов'язані з внутрішнім вірусним білком. Потім має місце друга фаза вірусної репродукції, що веде до синтезу вірусних компонентів.

Транскрипція - переписування інформації з ДНК або РНК вірусу на іРНК за законами генетичного коду.

Трансляція - процес перекладу генетичної інформації, що міститься в іРНК, на специфічну послідовність амінокислот.

Реплікація - процес синтезу молекул нуклеїнових кислот, гомологічних вірусному геному.

Реалізація генетичної інформації у ДНК-вірусів йде так само, як і в клітинах:

ДНК транскрипція та-РНК трансляція білок

РНК транскрипція та-РНК трансляція білок

У вірусів з позитивним РНК-геномом (тогавіруси, пікорнавіруси) транскрипція відсутня:

РНК трансляція білок

Ретровіруси мають унікальний шлях передачі генетичної інформації:

РНК зворотна транскрипція ДНК транскрипція та-РНК трансляція білок

ДНК інтегрується із геномом клітини-господаря (провірус).

Після напрацювання клітиною вірусних компонентів настає остання стадія вірусної репродукції, збірка вірусних частинок і вихід віріонів з клітини. Вихід віріонів із клітини здійснюється двома шляхами: 1) шляхом «вибуху» клітини, внаслідок чого клітина руйнується. Цей шлях притаманний простим вірусам (пікорна-, рео-, папова-і аденовірусам), 2) вихід із клітин шляхом брунькування. Притаманний вірусам, що містять суперкапсид. При цьому способі клітина відразу не гине, може дати багаторазове вірусне потомство, доки не вичерпаються її ресурси.

Методи культивування вірусів

Для культивування вірусів в лабораторних умовах використовуються такі живі об'єкти: 1) культури клітин (тканин, органів); 2) курячі мбріони; 3) лабораторні тварини.

Культури клітин

Найбільшого поширення мають одношарові культури клітин, які можна розділити на 1) первинні (первинно трипсинізовані), 2) напівперевиваються (диплоїдні) і 3) перевиваються.

За походженнямвони класифікуються на ембріонштні, пухлинні та з дорослих організмів; з морфогенезу- На фібробластні, епітеліальні та ін.

Первинні культури клітин - це клітини будь-якої тканини людини або тварини, які мають здатність рости у вигляді моношару на пластмасовій або скляній поверхні, покритій спеціальним живильним середовищем. Термін життя таких культур обмежений. У кожному конкретному випадку їх одержують із тканини після механічного подрібнення, обробки протеолітичними ферментами та стандартизації кількості клітин. Первинні культури, отримані з бруньок мавп, бруньок ембріона людини, амніону людини, курячих ембріонів, широко використовуються для виділення та накопичення вірусів, а також для виробництва вірусних вакцин.

Напівперевиваються (або диплоїдні ) культури клітин - клітини одного типу, здатні in vitro витримувати до 50-100 пасажів, зберігаючи при цьому свій вихідний диплоїдний набір хромосом. Диплоїдні штами фібробластів ембріона людини використовуються як для діагностики вірусних інфекцій, так і для виробництва вірусних вакцин.

Перевиваються клітинні лінії характеризуються потенційним безсмертям та гетероплоїдним каріотипом.

Джерелом ліній, що перевиваються, можуть бути первинні клітинні культури (наприклад, СОЦ, ПЕМ, ВНК-21 - з нирок одноденних сирійських хом'яків; ПМС - з нирки морської свинки та ін) окремі клітини яких виявляють тенденцію до нескінченного розмноження in vitro. Сукупність змін, що призводять до появи з клітин таких особливостей, називають трансформацією, а клітини тканинних культур, що перевиваються, — трансформованими.

Іншим джерелом клітинних ліній, що перевиваються, є злоякісні новоутворення. І тут трансформація клітин відбувається in vivo. Найчастіше у вірусологічній практиці застосовуються такі лінії клітин, що перевиваються: HeLa - отримана з карциноми шийки матки; Нер-2 - з карциноми гортані; Детройт-6 - з метастазу раку легені у кістковий мозок; RH - із нирки людини.

Для культивування клітин необхідні живильні середовища, які за своїм призначенням поділяються на ростові та підтримуючі. У складі ростових поживних середовищ має бути більше поживних речовин, щоб забезпечити активне розмноження клітин для формування моношару. Підтримуючі середовища повинні забезпечувати лише переживання клітин у сформованому моношарі при розмноженні в клітині вірусів.

Широке застосування знаходять стандартні синтетичні середовища, наприклад, синтетичне середовище 199 та середовище Голка. Незалежно від призначення усі живильні середовища для культур клітин конструюються на основі збалансованого сольового розчину. Найчастіше ним є розчин Хенкса. Невід'ємний компонент більшості ростових середовищ - сироватка крові тварин (теляча, бичача, кінська), без наявності 5-10% якої розмноження клітин та формування моношару не відбувається. До складу підтримуючих середовищ сироватка не входить.

Виділення вірусів у культурах клітин та методи їх індикації.

При виділенні вірусів з різних інфекційних матеріалів від хворого (кров, сеча, фекалії, слизові відокремлювані, змив з органів) застосовують культури клітин, що мають найбільшу чутливість до передбачуваного вірусу. Для зараження використовують культури у пробірках із добре розвиненим моношаром клітин. Перед зараженням клітин живильне середовище видаляють і в кожну пробірку вносять по 0,1-0,2 мл суспензії випробуваного матеріалу, попередньо обробленого антибіотиками для знищення бактерій та грибів. Після 30-60 хв. контакту вірусу з клітинами видаляють надлишок матеріалу, вносять у пробірку підтримуюче середовище та залишають у термостаті до виявлення ознак розмноження вірусу.

Індикатором наявності вірусу в заражених культурах клітин може бути:

1) розвиток специфічної дегенерації клітин - цитопатична дія вірусу (ЦПД), яка має три основні типи: кругло-або дрібноклітинна дегенерація; освіта багатоядерних гігантських клітин - симпластів; розвиток вогнищ клітинної проліферації, які з кількох верств клітин;

2) виявлення внутрішньоклітинних включень, що розташовуються в цитоплазмі та ядрах уражених клітин;

3) позитивна реакція гамагтлютинації (РДА);

4) позитивна реакція гемадсорбції (РДАдс);

5) феномен бляшкоутворення: моношар заражених вірусом клітин покривається тонким шаром агару з додаванням індикатора нейтрального червоного (фон - рожевий). За наявності вірусу у клітинах утворюються безбарвні зони («бляшки») на рожевому фоні агару.

6) за відсутності ЦПД чи ГА можна поставити реакцію інтерференції: досліджувана культура повторно заражається вірусом, що викликає ЦПД. У позитивному випадку ЦПД не буде (реакція інтерференції позитивна). Якщо досліджуваному матеріалі вірусу був, спостерігається ЦПД.

Виділення вірусів у курячих ембріонах.

Для вірусологічних досліджень використовують курячі ембріони 7-12-денного віку.

Перед зараженням визначають життєздатність ембріона. При овоскопіюванні живі ембріони рухливі, добре видно судинний малюнок. Простим олівцем відзначають межі повітряного мішка. Заражають курячі ембріони в асептичних умовах, стерильними інструментами, попередньо обробивши шкаралупу над повітряним простором йодом та спиртом.

Методи зараження курячих ембріонів можуть бути різні: нанесення вірусу на хоріон-алантоїсну оболонку, в амніотичну та алантоїсну порожнини, в жовтковий мішок. Вибір методу зараження залежить від біологічних властивостей вірусу, що вивчається.

Індикація вірусу в курячому ембріоні проводиться по загибелі ембріона, позитивної реакції гемаглютинації на склі з алантоїсною або амніотичною рідиною, за фокусними ураженнями («бляшкам») на хоріон-алантоїсної оболонки.

ІІІ. Виділення вірусів на лабораторних тваринах.

Лабораторні тварини можуть бути використані для виділення вірусів з інфекційного матеріалу, коли неможливо застосувати зручніші системи (культури клітин або курячі ембріони). Беруть переважно новонароджених білих мишей, хом'яків, морських свинок, щур. Заражають тварин за принципом цитотропізму вірусу: пневмотропні віруси вводяться інтраназально, нейротропні – інтрацеребрально, дерматотропні – на шкіру.

Індикація вірусу заснована на появі ознак захворювання у тварин, їх загибелі, патоморфологічних та патогістологічних змін у тканинах та органах, а також за позитивною реакцією гемагглтотинації з екстрактами з органів.

Конспект Віруси

Віруси відіграють велику роль у житті людини. Вони збудники низки небезпечних захворювань – віспи, гепатиту, енцефаліту, краснухи, сказу, грипу та інших.

У 1892 р. російський вчений Д.І. Івановський описав незвичайні властивості збудника хвороби тютюну – тютюнової мозаїки.Цей збудник проходив через бактеріальні фільтри і, крім того, не ріс на штучних живильних середовищах. Таким чином, здорові рослини тютюну можна було заразити безклітинним фільтратом соку хворої рослини.

Через кілька років було виявлено збудник ящуру, який також проходив через бактеріальні фільтри.

У 1898 р. Бейєрінк вигадав нове слово «вірус» (від лат. отрута), щоб позначити інфекційну природу деяких профільтрованих рослинних рідин.

У 1917 р. Ф. д'Еррель відкрив бактеріофаг - вірус вражає бактерії. Однак довгий час структура вірусу залишалася загадкою для вчених. Тому віруси опинилися серед перших об'єктів, досліджених під електронним мікроскопом відразу ж після його відкриття в 30-ті роки.

Відмінності вірусів від інших організмів:

1. Віруси – це дрібні організми (в середньому вони разів у 50 менше бактерій), їх не можна побачити у світловий мікроскоп. 30-300 нм.

2. Віруси немає клітинного будови. Якщо вважати клітинну будову обов'язковою ознакою живого, то віруси живими не є. Однак вони мають генетичний матеріал і здатні до самовідтворення. Існує припущення, що віруси це генетичний матеріал, що колись втік з клітини і зберіг здатність до відтворення при поверненні клітинного оточення.

3. Віруси можуть відтворювати себе лише всередині живої клітини та не є самостійними організмами.

4. Віруси складаються з однієї невеликої молекули нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) та оточені білковою оболонкою

5. На відміну клітинних організмів віруси що неспроможні самостійно синтезувати білки. Вірус вносить у клітину лише свою нуклеїнову кислоту, яка відключає хазяйську ДНК і дає клітині команду синтезувати потрібні йому білки (для збирання та вивільнення нових копій вірусу).

Будова вірусів

Вірусна частка, звана також віріоном, Складається з нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), оточеної білковою оболонкою. Цю оболонку називають капсидом. Капсид складається з субодиниць - капсомірів.Капсид із нуклеїновою кислотою – нуклеокапсид- може бути голим або мати додаткову оболонку ( віруси грипу та герпесу).

Найпростіші віруси, наприклад, вірус тютюнової мозаїки, має лише білковий капсид. Аналогічно влаштований вірус бородавок, аденовіруси.

Вірусні частинки можуть бути паличкоподібної або ниткоподібної форми, мати форму багатогранника.

Взаємодія вірусу із клітиною

1. Упізнання вірусом своєї клітини. Як правило, проникненню вірусу передує його зв'язування з особливим білком-рецептором на поверхні клітини.

2. Адсорбція – прикріплення віріону до клітини. Зв'язування здійснюється за допомогою спеціальних білків на поверхні вірусної частки, які дізнаються про відповідний рецептор на поверхні клітини.. Як ключ до замку.

3. Проникнення через мембрану. Ділянка мембрани, до якої приєднався вірус, занурюється на цитоплазму і перетворюється на вакуоль, яка потім може зливатися з ядром.

4. «Роздягання» – звільнення від капсиду. Відбувається або на поверхні клітини або в результаті руйнування капсиду ферментами клітини в цитоплазмі.

5. Копіювання (редуплікація) вірусної нуклеїнової кислоти.

6. Синтез вірусних білків.

7. Складання віріонів у ядрі або цитоплазмі.

8. Вихід віріонів із клітини. Для деяких вірусів це відбувається шляхом вибуху, внаслідок чого цілісність клітини порушується і вона гине. Інші віруси виділяються способом, що нагадує брунькування. І тут клітини господаря можуть довго зберігати свою життєздатність. Віріони виділяються із клітини з різною швидкістю. При деяких типах інфекції віріони можуть досить довго перебувати усередині клітини, не руйнуючи її.

Віруси бактерій

Віруси, що атакують бактерії , називаються бактеріофагами або просто фагами.

Будова бактеріофагівв основному вивчено на прикладі Т-фагу Eccherichia coli(Коліфаг). Коліфаг складається з поліедричної голівки та хвоста. Головка складається з капсомерів і містить усередині ДНК. Хвіст має складну будову і складається з порожнього стрижня, що оточує його скоротливого чохла і базальної платівки з шипами та нитками, (необхідними для адсорбції на клітці-хазяїні).

Проникнення бактеріофага в клітину

Товсті клітинні стінки бактерій не дозволяють вірусу поринути у цитоплазму, як при зараженні клітин тварин. Тому бактеріофаг вводить порожнистий стрижень у клітину і виштовхує крізь нього нуклеїнову кислоту, що у голівці.

Відкриття вірусів Д. І. Івановським у 1892р. започаткувало розвиток науки вірусології. Швидшому її розвитку сприяли: винахід електронного мікроскопа, розробка методу культивування мікроорганізмів у культурах клітин.

В даний час вірусологія - наука, що бурхливо розвивається, що пов'язано з низкою причин:

Провідною роллю вірусів в інфекційній патології людини (приклади – вірус грипу, ВІЛ – вірус імунодефіциту людини, цитомегаловірус та інші герпесвіруси) на тлі практично повної відсутності засобів специфічної хіміотерапії;

Використання вірусів для вирішення багатьох фундаментальних питань біології та генетики.

Основні властивості вірусів (і плазмід), За якими вони відрізняються від решти живого світу.

1. Ультрамікроскопічні розміри (вимірюються в нанометрах). Великі віруси (вірус віспи) можуть досягати розмірів 300 нм, дрібні – від 20 до 40 нм. 1мм = 1000мкм, 1мкм = 1000нм.

3. Віруси не здатні до зростання та бінарного поділу.

4. Віруси розмножуються шляхом відтворення себе в інфікованій клітині господаря за рахунок власної геномної кислоти нуклеїнової.

6. Середовищем проживання вірусів є живі клітини - бактерії (це віруси бактерій або бактеріофаги), клітини рослин, тварин та людини.

Усі віруси існують у двох якісно різних формах: позаклітинної – віріон та внутрішньоклітинної – вірус. Таксономія цих представників мікросвіту полягає в характеристиці віріонів - кінцевої фази розвитку вірусів.

Будова (морфологія) вірусів

1. Геном вірусівутворюють нуклеїнові кислоти, представлені одноланцюжковими молекулами РНК (у більшості РНК-вірусів) або дволанцюжковими молекулами ДНК (у більшості ДНК-вірусів).

2. Капсид- білкова оболонка, в яку упаковано геномну нуклеїнову кислоту. Капсид складається з ідентичних білкових субодиниць. капсомірів.Існують два способи упаковки капсомерів у капсид – спіральний (спіральні віруси) та кубічний (сферичні віруси).

При спіральній симетріїбілкові субодиниці розташовуються по спіралі, а між ними, також по спіралі, укладена геномна нуклеїнова кислота (ниткоподібні віруси). При кубічному типі симетріївіріони можуть бути у вигляді багатогранників, найчастіше - двадцятигранники. ікосоедри.

3. Просто влаштовані віруси мають лише нуклеокапсид, Т. е. Комплекс геному з капсидом і називаються "голими".

4. В інших вірусів поверх капсида є додаткова мембраноподібна оболонка, що придбавається вірусом у момент виходу з клітини господаря. суперкапсид.Такі віруси називають "одягненими".

Крім вірусів, є ще більш просто влаштовані форми здатних передаватися агентів - плазміди, віроїди та пріони.

Основні етапи взаємодії вірусу із клітиною господаря

1. Адсорбція – пусковий механізм, пов'язаний із взаємодією специфічнихрецепторів вірусу та господаря (у вірусу грипу – гемагглютинін, у вірусу імунодефіциту людини – глікопротеїн gp 120).

2. Проникнення – шляхом злиття суперкапсиду з мембраною клітини або шляхом ендоцитозу (піноцитозу).

3. Звільнення нуклеїнових кислот – “роздягання” нуклеокапсиду та активація нуклеїнової кислоти.

4. Синтез нуклеїнових кислот та вірусних білків, тобто підпорядкування систем клітини господаря та їх робота на відтворення вірусу.

5. Складання віріонів – асоціація реплікованих копій вірусної нуклеїнової кислоти з капсидним білком.

6. Вихід вірусних частинок із клітини, придбання суперкапсиду оболонковими вірусами.

Виходи взаємодії вірусів із клітиною господаря

1. Абортивний процес- коли клітини звільняються від вірусу:

При інфікуванні дефектнимвірусом, для реплікації якого потрібний вірус - помічник, самостійна реплікація цих вірусів неможлива (так звані вірусоїди). Наприклад, вірус дельта (D) гепатиту може реплікуватися лише за наявності вірусу гепатиту B, його Hbs – антигену, аденоасоційований вірус – у присутності аденовірусу);

При інфікуванні вірусом генетично нечутливих щодо нього клітин;

При зараженні чутливих клітин вірусом у умовах, що не дозволяють.

2. Продуктивний процес- реплікація (продукція) вірусів:

- загибель (лізис) клітин(цитопатичний ефект) – результат інтенсивного розмноження та формування великої кількості вірусних частинок – характерний результат продуктивного процесу, викликаного вірусами з високою цитопатогенністю. Цитопатичний ефект на клітинні культури багатьом вірусів носить досить відомий специфічний характер;

- стабільна взаємодія, що не призводить до загибелі клітини (персистуючі та латентні інфекції) - так звана вірусна трансформація клітини.

3. Інтегративний процес- Інтеграція вірусного геному з геномом клітини господаря. Це особливий варіант продуктивного процесу на кшталт стабільного взаємодії. Вірус реплікується разом із геномом клітини господаря і може довго перебувати у латентному стані. Вбудовуватися в ДНК – геном господаря можуть лише ДНК – віруси (принцип “ДНК – у ДНК”). Єдині РНК – віруси, здатні інтегруватися в геном клітини господаря – ретровіруси, мають для цього спеціальний механізм. Особливість їхньої репродукції - синтез ДНК провірусу на основі геномної РНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази з подальшим вбудовуванням ДНК у геном господаря.

Основні методи культивування вірусів

1. В організмі лабораторних тварин.

2. У курячих ембріонах.

3. У клітинних культурах – основний метод.

Типи клітинних культур

1. Первинні (трипсинізовані) культури- фібробласти ембріона курки (ФЕК), людини (ФЕЧ), клітини нирки різних тварин тощо. буд. .

2. Лінії диплоїдних клітинпридатні до повторного диспергування та зростання, як правило, не більше 20 пасажів (втрачають вихідні властивості).

3. Лінії, що перевиваються(гетероплоїдні культури), здатні до багаторазового диспергування та перевивання, тобто до багаторазових пасажів, найбільш зручні у вірусологічній роботі - наприклад, лінії пухлинних клітин Hela, Hep та ін.

Спеціальні живильні середовища для культур клітин

Використовуються різноманітні синтетичні вірусологічні поживні середовища складного складу, що включають великий набір різних факторів зростання - середа 199, Голка, розчин Хенкса, лактальбуміну гідролізат. В середовища додають стабілізатори рН (Hepes), різні у видовому відношенні сироватки крові (найефективнішою вважають ембріональну телячу сироватку), L-цистеїн та L-глютамін.

Залежно від функціонального використання середовища може бути ростові(з великим вмістом сироватки крові) - їх використовують для вирощування клітинних культур до внесення вірусних проб, та підтримуючі(З меншим вмістом сироватки або її відсутністю) - для вмісту інфікованих вірусом клітинних культур.

Виявлені прояви вірусної інфекції клітинних культур

1. Цитопатичний ефект.

2. Виявлення тілець включень.

3. Виявлення вірусів методом флюоресціюючих антитіл (МФА), електронною мікроскопією, авторадіографією.

4. Кольорова проба. Звичайний колір культуральних середовищ, що містять як індикатор рН феноловий червоний, при оптимальних для клітин умовах культивування (рН близько 7,2) - червоний. Розмноження клітин змінює рН і відповідно - колір середовища з червоного на жовтий за рахунок зміщення рН у кислу сторону. При розмноженні клітинних культур вірусів відбувається лізис клітин, зміни рН і кольору середовища не відбувається.

5. Виявлення гемаглютиніну вірусів – гемадсорбція, гемаглютинація.

6. Метод бляшок (бляшкоутворення). Внаслідок цитолітичної дії багатьох вірусів на клітинні культури утворюються зони масової загибелі клітин. Виявляють бляшки - вірусні "клітинно - негативні" колонії.

Номенклатура вірусів

Назва сімейства вірусів закінчується на “viridae”, роду – “virus”, для виду зазвичай використовують спеціальні назви, наприклад – вірус краснухи, вірус імунодефіциту людини – ВІЛ, вірус парагрипу людини типу 1 тощо.

Віруси бактерій (бактеріофаги)

Природним місцем існування фагів є бактеріальна клітина, тому фаги поширені повсюдно (наприклад, у стічних водах). Фагам притаманні біологічні особливості, властиві та іншим вірусам.

Найбільш морфологічно поширений тип фагів характеризується наявністю головки - ікосаедра, відростка (хвоста) зі спіральною симетрією (часто має порожнистий стрижень та скорочувальний чохол), шипів і відростків (ниток), тобто зовні дещо нагадують сперматозоїд.

Взаємодія фагів з клітиною (бактерією) суворо специфічна, тобто бактеріофаги здатні інфікувати лише певні види та фаготипибактерій.

Основні етапи взаємодії фагів та бактерій

1. Адсорбція (взаємодія специфічних рецепторів).

2. Впровадження вірусної ДНК (ін'єкція фага) здійснюється за рахунок лізування речовинами типу лізоциму ділянки клітинної стінки, скорочення чохла, вштовхування стрижня хвоста через цитоплазматичну мембрану в клітину, впорскування ДНК в цитоплазму.

3. Репродукція фага.

4. Вихід дочірніх популяцій.

Основні властивості фагів

Розрізняють вірулентні фаги, здатні викликати продуктивну форму процесу, та помірні фаги, що викликають редуктивну фагову інфекцію (редукцію фага) В останньому випадку геном фага в клітині не реплікується, а впроваджується (інтегрується) в хромосому клітини господаря (ДНК в ДНК), фаг перетворюється на профаг.Цей процес отримав назву лізогенії. Якщо в результаті впровадження фага в хромосому бактеріальної клітини вона набуває нових успадкованих ознак, таку форму мінливості бактерій називають лізогенною (фаговою) конверсією.Бактеріальну клітину, що несе у своєму геномі профаг, називають лізогенною, оскільки профаг при порушенні синтезу особливого білка – репресора може перейти у літичний цикл розвитку, спричинити продуктивну інфекцію з лізисом бактерії.

Помірні фаги мають важливе значення в обміні генетичним матеріалом між бактеріями. у трансдукції(Одна з форм генетичного обміну). Наприклад, здатність виробляти екзотоксин мають тільки збудник дифтерії, в хромосому якого інтегрований помірний профаг, що несе оперон tox, відповідальний синтез дифтерійного экзотоксина. Помірний фаг tox викликає лізогенну конверсію нетоксигенної палички дифтерійної в токсигенну.

За спектром на бактерії фаги поділяють на:

Полівалентні (лізують близькі споріднені бактерії, наприклад сальмонели);

Моновалентні (лізують бактерії одного виду);

Типоспецифічні (лізують лише певні фаговари збудника).

На щільних середовищах фаги виявляють частіше за допомогою спот (spot) – тесту (утворення негативної плями при зростанні колоній) або методом агарових шарів (титрування за Граціа).

Практичне використання бактеріофагів.

1. Для ідентифікації (визначення фаготипу).

2. Для фагопрофілактики (купування спалахів).

3. Для фаготерапії (лікування дисбактеріозів).

4. Для оцінки санітарного стану довкілля та епідеміологічного аналізу.