Процес утворення віріона складається із етапів. Взаємодія вірусу із клітиною
ЗМІСТ
Контрольні питання:
1. Репродукція ДНК-геномних вірусів: основні етапи, особливості репродукції…………………………………………………..……........……...3
2. Ознаки репродукції вірусів у живих системах: лабораторні тварини, курячі ембріони, культури клітин…………………………………………......……………………..… ……16
3. Завдання............................................... .................................................. ...20
Список литературы……………………………...……………………...........25
1.Репродукція ДНК-геномних вірусів: основні етапи, особливості репродукції
Репродукція вірусів
Процес репродукції вірусів можна умовно розділений на дві фази. Перша фаза охоплює події, які ведуть до адсорбції та проникнення вірусу в клітину, звільнення його внутрішнього компонента та модифікації його таким чином, що він здатний викликати інфекцію. Відповідно, перша фаза включає три стадії: 1) адсорбція вірусу на клітинах; 2) проникнення вірусу у клітини; 3) роздягання вірусу у клітині. Ці стадії спрямовані на те, щоб вірус був доставлений у відповідні клітинні структури і його внутрішній компонент був звільнений від захисних оболонок. Як тільки цієї мети досягнуто, починається друга фаза репродукції, протягом якої відбувається експресія вірусного геному. Ця фаза включає стадії: 1) транскрипції, 2) трансляції інформаційних РНК, 3) реплікації геному, 4) складання вірусних компонентів. Заключною стадією репродукції є вихід з клітини.
Перша фаза репродукції.
I. Адсорбція віріонів лежить на поверхні клітини.
Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто прикріплення вірусних частинок до клітинної поверхні. Процес адсорбції можливий за наявності відповідних рецепторів на поверхні клітини і «дізнаються» їх субстанцій на поверхні вірусу. Найпочаткові процеси адсорбції мають неспецифічний характер, і в їх основі може лежати електростатична взаємодія позитивно і негативно заряджених угруповань на поверхні вірусу і клітини. Проте впізнавання клітинних рецепторів вірусними білками, що веде до прикріплення вірусної частки до клітини, є високоспецифічним процесом. Білки на поверхні вірусу, які впізнають специфічні угруповання на плазматичній мембрані клітини та зумовлюють прикріплення до них вірусної частки, називаються білками прикріплення.
Віруси використовують рецептори, призначені для проходження в клітину необхідних для її життєдіяльності речовин: поживних речовин, гормонів, факторів росту і т.д. Рецепторами для вірусів грипу та параміксовірусів є сіалова кислота у складі глікопротеїдів та гліколіпідів (гангліозидів), для рабдовірусів та реовірусів – також вуглеводний компонент у складі білків та ліпідів, для пікорнавірусів та аденовірусів – білки. Специфічні рецептори грають роль у прикріпленні вірусної частинки до клітинної поверхні. Вони визначають подальшу долю вірусної частки, її внутрішньоклітинний транспорт та доставку до певних ділянок цитоплазми та ядра, де вірус здатний ініціювати інфекційний процес. Вірус може прикріпитися до неспецифічних рецепторів і навіть проникнути в клітину, проте тільки прикріплення до специфічного рецептора призведе до виникнення інфекції.
Прикріплення вірусної частинки до клітинної поверхні спочатку відбувається шляхом утворення одиничного зв'язку вірусної частки з рецептором. Однак таке прикріплення неміцне, і вірусна частка може легко відірватися від клітинної поверхні – оборотна адсорбція. Для того, щоб настала незворотна адсорбція, повинні з'явитися множинні зв'язки між вірусною часткою і багатьма молекулами рецепторів, тобто має відбутися стабільне мультивалентне прикріплення. Кількість молекул клітинних рецепторів в ділянках адсорбції може сягати 3000. Стабільне зв'язування вірусної частинки з клітинною поверхнею в результаті мультивалентного прикріплення відбувається завдяки можливості вільного переміщення молекул рецепторів у ліпідному біле плазматичної мембрани, яке визначається рухливістю, «плинністю» білково-ліпідного білка. Збільшення плинності ліпідів є одним з найбільш ранніх подій при взаємодії вірусу з клітиною, наслідком якого є формування рецепторних полів у місці контакту вірусу з клітинною поверхнею та стабільне прикріплення вірусної частки до угруповань, що виникли.
Кількість специфічних рецепторів лежить на поверхні клітини коливається між 104 і 105 однією клітину. Рецептори низки вірусів може бути представлені лише обмеженому наборі клітин-господарів, і це може визначатися чутливість організму до цього вірусу. Наприклад, пікорнавіруси адсорбуються тільки на клітинах приматів. Рецептори для інших вірусів, навпаки, широко представлені на поверхні клітин різних видів, як, наприклад, рецептори для ортоміксовірусів і параміксовірусів, що являють собою сіаліл-з'єднання. Тому ці віруси мають відносно широкий діапазон клітин, у яких може відбуватися адсорбція вірусних частинок. Рецепторами для ряду тогавірусів мають клітини виключно широкого кола господарів: ці віруси можуть адсорбуватися та інфікувати клітини як хребетних, так і безхребетних.
ІІ. Проникнення вірусу у клітину.
Історично склалося уявлення про два альтернативні механізми проникнення в клітину вірусів тварин - шляхом віропексису (ендоцитозу) та шляхом злиття вірусної та клітинної мембран. Однак обидва ці механізми не виключають, а доповнюють один одного
Термін «віропексис» означає, що вірусна частка потрапляє в цитоплазму в результаті інвагінації ділянки плазматичної мембрани та утворення вакуолі, яка містить вірусну частинку.
Рецепторний ендоцитоз. Віропексис є окремим випадком рецепторного або адсорбційного ендоцитозу. Цей процес є звичайним механізмом, завдяки якому в клітину надходять поживні та регуляторні білки, гормони, ліпопротеїни та інші речовини із позаклітинної рідини. Рецепторний ендоцитоз відбувається у спеціалізованих ділянках плазматичної мембрани, де є спеціальні ямки, покриті з боку цитоплазми спеціальним білком з великою молекулярною масою – клатрином. На дні ямки розташовуються специфічні рецептори. Ямки забезпечують швидку інвагінацію та утворення покритих клатрином внутрішньоклітинних вакуолей. Напівперіод проникнення речовини всередину клітини за цим механізмом не перевищує 10 хв з моменту адсорбції. Кількість вакуолей, що утворюються в одну хвилину, досягає більше 2000. Таким чином, рецепторний ендоцитоз є добре злагодженим механізмом, який забезпечує швидке проникнення в клітину чужорідних речовин.
Вкриті вакуолі зливаються з іншими, більшими цитоплазматичними вакуолями, утворюючи рецептосоми, що містять рецептори, але не містять клатрин, а ті в свою чергу зливаються з лізосомами. Таким шляхом білки, що проникли в клітину, зазвичай транспортуються в лізосоми, де відбувається їх розпад на амінокислоти; вони можуть і уникнути лізосоми, і накопичуватися в інших ділянках клітини в недеградованій формі. Альтернативою рецепторного ендоцитозу є рідинний ендоцитоз, коли інвагінація відбувається не в спеціалізованих ділянках мембрани. Більшість оболонкових та безоболонкових вірусів тварин проникає в клітину за механізмом рецепторного ендоцитозу. Ендоцитоз забезпечує внутрішньоклітинний транспорт вірусної частки у складі ендоцитарної вакуолі, оскільки вакуоль може рухатися в будь-якому напрямку та зливатися з клітинними мембранами (включаючи ядерну мембрану), звільняючи вірусну частинку у відповідних внутрішньоклітинних ділянках. Таким шляхом, наприклад, ядерні віруси потрапляють у ядро, а реовіруси – у лізосоми. Однак вірусні частки, що проникли в клітину, знаходяться у складі вакуолі і відокремлені від цитоплазми її стінками. Їм належить пройти низку етапів, перш ніж вони зможуть спричинити інфекційний процес.
Злиття вірусної та клітинної мембран. Для того, щоб внутрішній компонент вірусу міг пройти через клітинну мембрану, вірус використовує механізм злиття мембран. У оболонкових вірусів злиття обумовлено точковою взаємодією вірусного білка злиття з ліпідами клітинної мембрани, в результаті якого вірусна ліпопротеїдна оболонка інтегрує з клітинною мембраною, а внутрішній компонент вірусу виявляється з іншого боку. У безоболонкових вірусів один із поверхневих білків також взаємодіє з ліпідами клітинних мембран, внаслідок чого внутрішній компонент проходить через мембрану. Більшість вірусів тварин виходить у цитозол із рецептосоми.
Якщо при ендоцитозі вірусна частка є пасивним пасажиром, то за злиття вона стає активним учасником процесу. Білком злиття є одним із її поверхневих білків. На даний час цей білок ідентифікований лише у параміксовірусів та ортоміксовірусів. У параміксовірусів цей білок (Р-білок) є одним з двох глікопротеїдів, що знаходяться на поверхні вірусної частинки. Функцію білка злиття у вірусу грипу виконує мала гемаглютинуюча субодиниця.
Параміксовіруси викликають злиття мембран при нейтральному рН і внутрішній компонент цих вірусів може проникати в клітину безпосередньо через плазматичну мембрану. Однак більшість оболонкових та безоболонкових вірусів викликають злиття мембран тільки при низькому значенні рН – від 5,0 до 5,75. Якщо до клітин додати слабкі підстави (хлорид амонію, хлороквін та інших.), які у ендоцитарних вакуолях підвищують рН до 6,0, злиття мембран немає, вірусні частки залишаються у вакуолях , і інфекційний процес немає. Сувора залежність злиття мембран від значень рН обумовлена конформаційними змінами вірусних білків злиття.
У лізосомі є низьке значення рН (4,9). В ендоцитарній вакуолі (рецептосомі) закислення створюється за рахунок АТФ-залежного протонового насоса ще на клітинній поверхні при утворенні покритої вакуолі. Закислення ендоцитарної вакуолі має велике значення для проникають у клітину фізіологічних лігандів, оскільки низьке значення рН сприяє дисоціації ліганду від рецептора та рециркуляції рецепторів.
Той самий механізм, що лежить в основі злиття вірусних і клітинних мембран, обумовлює індукований вірусами гемоліз і злиття плазматичних мембран клітин, що прилягають один до одного, з утворенням багатоядерних клітин, симпластів і синцитіїв. Віруси викликають два типи злиття клітин: 1) «злиття зовні» та 2) «злиття зсередини». «Злиття зовні» відбувається при високій множинності інфекції і виявляється протягом перших годин після зараження. Цей тип злиття, описаний для парамиксовірусів, обумовлений білками вірусу, що заражає і не вимагає внутрішньоклітинного синтезу вірусних компонентів. Навпаки, «злиття зсередини» відбувається при низькій множинності інфекції, виявляється на порівняно пізніх стадіях інфекційного процесу та обумовлено новоствореними синтезованими вірусними білками. "Злиття зсередини" описано для багатьох вірусів: вірусів герпесу, онковірусів, збудників повільних інфекцій та ін. Цей тип злиття викликають ті ж вірусні глікопротеїди, які забезпечують проникнення вірусу в клітину.
ІІІ. Роздягання - депротеїнізація вірусу
Вірусні частинки, що проникли в клітину, повинні роздягнутися для того, щоб викликати інфекційний процес. Сенс роздягання полягає у видаленні вірусних захисних оболонок, які перешкоджають експресії вірусного геному. Внаслідок роздягання звільняється внутрішній компонент вірусу, який здатний викликати інфекційний процес. Роздягання супроводжується рядом характерних особливостей: в результаті розпаду вірусної частки зникає інфекційна активність, у ряді випадків з'являється чутливість до нуклеазів, виникає стійкість до дії антитіл, що нейтралізує, втрачається фоточутливість при використанні ряду препаратів.
Кінцевими продуктами роздягання є серцевини, нуклеокапсиди чи нуклеїнові кислоти. Для ряду вірусів було показано, що продуктом роздягання є голі нуклеїнові кислоти, а нуклеїнові кислоти, пов'язані з внутрішнім вірусним білком. Наприклад, кінцевим продуктом роздягання пікорнавірусів є РНК, ковалентно пов'язана з білком VРg, кінцевим продуктом роздягання аденовірусів є ДНК, ковалентно пов'язана з одним із внутрішніх вірусних білків.
У ряді випадків здатність вірусів викликати інфекційний процес визначається можливістю їх роздягання у клітині даної системи. Тим самим ця стадія є однією із стадій, що лімітують інфекцію.
Роздягання ряду вірусів відбувається у спеціалізованих ділянках усередині клітини (лізосомах, структурах апарату Гольджі, навколоядерному просторі, ядерних порах на ядерній мембрані). При злитті вірусної та клітинної мембран проникнення в клітину поєднується з роздяганням.
Роздягання та внутрішньоклітинний транспорт є взаємопов'язаними процесами: при порушенні правильного внутрішньоклітинного транспорту до місць роздягання вірусна частка потрапляє у лізосому та руйнується лізосомальними ферментами.
Друга фаза репродукції .
I. Транскрипція.
Транскрипція здійснюється за допомогою спеціального ферменту - РНК-полімерази, який пов'язує нуклеотиди шляхом утворення 3-5'фосфодіефірних містків. Таке зв'язування відбувається лише у присутності ДНК-матриці.
Продуктами транскрипції у клітині є іРНК. Сама клітинна ДНК, яка є носієм генетичної інформації, не може безпосередньо програмувати синтез білка. Передачу генетичної інформації від ДНК до рибосом здійснює РНК-посередник. На цьому заснована центральна догма молекулярної біології, яка виражається такою формулою:
ДНК - транскрипція - РНК - трансляція - білок
де стрілки показують напрямок перенесення генетичної інформації.
Реалізація генетичної інформації у вірусів Стратегія вірусного геному щодо синтезу іРНК у різних вірусів різна. У ДНК-вірусів іРНК синтезується на матриці однієї з ниток ДНК. Формула перенесення генетичної інформації у них така сама, як і в клітині:
ДНК – транскрипція – РНК – трансляція – білок.
ДНК-віруси, репродукція яких відбувається в ядрі, використовують для транскрипції клітинну полімеразу. До цих вірусів належать паповавіруси, аденовіруси, віруси герпесу. ДНК-віруси, репродукція яких відбувається в цитоплазмі, не можуть використовувати клітинний фермент, що знаходиться в ядрі. Транскрипція їхнього геному здійснюється вірусспецифічним ферментом - ДНК-полімеразою, яка проникає в клітину у складі вірусу. До цих вірусів відносяться віруси віспи та іридовіруси.
Ферменти, що транскрибують вірусний геном. Транскрипція ряду ДНК-вірусів - паповавірусів, аденовірусів, вірусів герпесу, парвовірусів, гепаднавірусів. Здійснюється в ядрі клітини, і в цьому процесі широко використовуються механізми клітинної транскрипції – ферменти транскрипції та подальшої модифікації транскриптів. Транскрипція цих вірусів здійснюється клітинною РНК-полімеразою II - ферментом, який здійснює транскрипцію клітинного геному. Однак особлива група транскриптів аденовірусу синтезується за допомогою іншого клітинного ферменту – РНК-полімерази III. У двох інших сімейств ДНК-вірусів тварин - вірусів віспи та іридовірусів - транскрипція відбувається в цитоплазмі. Оскільки в цитоплазмі немає клітинних полімераз, транскрипція цих вірусів потребує спеціального вірусного ферменту - вірусної РНК-полімерази. Цей фермент є структурним вірусним білком.
Регулювання транскрипції. Транскрипція вірусного геному суворо регулюється протягом інфекційного циклу. Регуляція здійснюється як клітинними, і вірусспецифічними механізмами. У деяких вірусів, переважно ДНК-содержащих, є три періоду транскрипцій - надрання, рання і пізня. До цих вірусів належать віруси віспи, герпесу, паповавіруси, аденовіруси. В результаті надранньої та ранньої транскрипції вибірково зчитуються надранні та ранні гени з утворенням надранніх або ранніх іРНК. При пізній транскрипції зчитується інша частина вірусного геному - пізні гени з утворенням пізніх іРНК. Кількість пізніх генів зазвичай перевищує кількість ранніх генів. Багато надранніх генів є генами для неструктурних білків - ферментів і регуляторів транскрипції та реплікації вірусного геному. Навпаки, пізні гени зазвичай є генами структурних білків. Зазвичай за пізньої транскрипції зчитується весь геном, але з переважанням транскрипції пізніх генів.
Фактором регулювання транскрипції у ядерних вірусів є транспорт транскриптів з ядра в цитоплазму, до місця функціонування іРНК - полісомів.
Продуктом надранньої транскрипції вірусів герпесу є А-білки. Функція одного або кількох з них потрібна для транскрипції наступної групи генів, що кодують Р-білки. У свою чергу, Р-білки включають транскрипцію останньої групи пізніх генів, що кодують У-білки. Такий тип регуляції отримав назву "каскадної".
ІІ. Трансляція.
Це - процес перекладу генетичної інформації, що міститься в іРНК на специфічну послідовність амінокислот у синтезованих вірус-специфічних білках. Синтез білка в клітині відбувається внаслідок трансляції іРНК на рибосомах. У рибосомах йде злиття потоку інформації (іРНК) з потоком амінокислот, які приносять транспортні РНК (тРНК). У клітці існує велика кількість різноманітних тРНК. Для кожної амінокислоти має бути своя тРНК.
Молекула тРНК є односпіральною РНК зі складною структурою у вигляді кленового листа.
Зв'язування конкретної тРНК та амінокислоти здійснює фермент аміноацилсинтетазу. Один кінець тРНК пов'язується з амінокислотою, а інший – з нуклеотидами іРНК, яким вони є комплементарними. Три нуклеотиди на іРНК кодують одну амінокислоту і називаються «триплет» або «кодон», а комплементарні кодони три нуклеотиди на тРНК називаються «антикодоном».
Процес транскрипції складається із трьох фаз: ініціації елонгації, термінації.
Ініціація трансляції - найбільш відповідальний етап у процесі трансляції, заснований на впізнанні рибосомою іРНК та зв'язуванні з її особливими ділянками. Рибосома дізнається іРНК завдяки «шапочці» (кеп) на 5'-кінці і ковзає до 3'-кінця, поки не досягне ініціаторного кодону, з якого починається трансляція. В еукаріотичній клітині ініціаторними кодонами є кодони АУГ (аденін, урацил, гуанін), що кодують метіонін. З метіоніну починається синтез усіх поліпептидних ланцюгів. Специфічне впізнавання рибосомою вірусної та РНК здійснюється за рахунок вірусспецифічних ініціаторних факторів.
Спочатку з іРНК зв'язується мала рибосомальна субодиниця. До комплексу іРНК з малою рибосомальною субодиницею приєднуються інші компоненти, необхідні початку трансляції. Це кілька молекул білка, які називаються «ініціаторні фактори». Їх принаймні три в прокаріотичній клітині і більше дев'яти в еукаріотичній клітині. Ініціаторні фактори визначають впізнавання рибосомою специфічних іРНК. В результаті формується комплекс, необхідний для ініціації трансляції, який називається ініціаторним комплексом. До ініціаторного комплексу входять: іРНК; мала рибосомальна субодиниця; аміноацил-тРНК, що несе ініціаторну амінокислоту; ініціаторні фактори; кілька молекул ГТФ (гуанозінтріфосфат).
У рибосомі здійснюється злиття потоку інформації з потоком амінокислот. Входження аміноацил-тРНК в А-центр великої рибосомальної субодиниці є наслідком впізнавання, а її антикодон взаємодіє з кодоном іРНК, що знаходиться в малій рибосомальній субодиниці. При просуванні іРНК на один кодон тРНК перекидається в пептидильний центр (П-центр) і її амінокислота приєднується до ініціаторної амінокислоти з утворенням першого пептидного зв'язку. Вільна від амінокислоти тРНК виходить із рибосоми і може знову функціонувати у транспорті специфічних амінокислот. На її місце з A-центру до П-центру перекидається нова тРНК, і утворюється новий пептидний зв'язок. В A-центрі з'являється вакантний кодон іРНК, до якого негайно приєднується відповідна тРНК, і відбувається приєднання нових амінокислот до поліпептидного ланцюга, що росте.
Елонгація трансляції – процес подовження, нарощування поліпептидного ланцюга, заснований на приєднанні нових амінокислот за допомогою пептидного зв'язку. Відбувається постійне протягування нитки іРНК через рибосому і декодування закладеної в ній генетичної інформації. Часто іРНК функціонує одночасно на декількох рибосомах, кожна з яких синтезує ту саму поліпептидну нитку, що кодується даною іРНК.
Термінація трансляції відбувається у той момент, коли рибосома доходить до термінуючого кодону у складі іРНК (УАА, УГА, УАГ). Трансляція припиняється, і поліпептидний ланцюг звільняється з полірибосоми. Після закінчення трансляції полірибосоми розпадаються на субодиниці, які можуть увійти до складу нових полірибосом.
Кожна та PHК функціонує на кількох рибосомах. Групу рибосом, що працюють на одній молекулі іРНК, називають полірибосомою або полісомою. Полісоми можуть складатися від 4-6 до 20 і більше рибосом.
Вірусспецифічні полісоми можуть бути як вільними, так і пов'язаними з мембранами. Внутрішні білки зазвичай синтезуються на вільних полісомах, глікопротеїди завжди синтезуються на полісомах, пов'язаних із мембранами.
Оскільки геном вірусу тварин представлений молекулою, що кодує більш ніж один білок, віруси поставлені перед необхідністю синтезу або довгої іРНК, що кодує один гігантський поліпептид-попередник, який потім повинен бути нарізаний у специфічних точках на функціонально активні білки, або коротких моноцистронних іРНК, кодує один білок. Таким чином, існують два способи формування вірусних білків:
перший - іРНК транслюється в гігантський поліпептид-попередник, який після синтезу нарізається послідовно на зрілі функціонально активні білки;
другий - іРНК транслюється із заснуванням зрілих білків чи білків, які лише трохи модифікуються після синтезу.
Перший спосіб трансляції характерний для РНК-плюс-ниткових вірусів - пікорнавірусів і тогавірусів. Їх іРНК транслюється в гігантський поліпептидний ланцюг, так званий поліпротеїд, який сповзає у вигляді безперервної стрічки з рибосомного конвеєра і нарізається на індивідуальні білки потрібного розміру. Нарізування вірусних білків - багатоступінчастий процес, який здійснюється як вірусспецифічними, так і клітинними протеазами.
Другий спосіб формування білків характерний для ДНК-вірусів і більшості РНК-вірусів. При цьому способі синтезуються короткі моноцистронні іРНК внаслідок вибіркової транскрипції однієї ділянки геному (гену). Однак, ці віруси широко використовують механізм посттрансляційного нарізання білка.
В еукаріотичній клітині багато білків, у тому числі вірусні, піддаються посттрансляційним модифікаціям, зрілі функціонально активні білки часто неідентичні їх знову синтезованим попередникам. Широко поширені такі посттрансляційні ковалентні модифікації, як глікозилювання, ацилювання, метилювання, сульфування (утворення дисульфідних зв'язків), протеолітичне нарізування та, нарешті, фосфорилювання. В результаті замість 20 генетично закодованих амінокислот із різних клітин різних органів еукаріотів виділено близько 140 дериватів амінокислот.
Глікозилювання. У складі складно влаштованих PHК - і ДНК-вірусів є білки, що містять ковалентно приєднані бічні ланцюжки вуглеводів, - глікопротеїди. Глікопротеїди розташовані у складі вірусних оболонок та знаходяться на поверхні вірусних частинок.
Глікозилювання поліпептидів - складний багатоступінчастий процес, перші етапи якого починаються вже в процесі синтезу поліпептидів, і перший вуглеводний залишок приєднується до поліпептидного ланцюга, що ще не зійшов з рибосоми. Наступні етапи глікозилювання відбуваються шляхом послідовного приєднання вуглеводних залишків до вуглеводного ланцюжка у процесі транспортування поліпептиду до плазматичної мембрани. Вуглеводні залишки приєднуються по одному, і тільки при ініціації синтезу олігосахаридного ланцюга переноситься блок. Остаточне формування вуглеводного ланцюжка може завершуватися на плазматичній мембрані перед збиранням вірусної частки.
Глікозилювання впливає на транспорт, більше, транспорт нерозривно пов'язаний для глікопротеїдів зі стадійним глікозилюванням. Переконливим доказом цього є вплив на вірусну репродукцію інгібіторів глікозилювання; вони повністю пригнічують транспорт поліпептидів, не порушуючи та не інгібуючи їх синтезу.
При пригніченні глікозилювання відповідними інгібіторами (аналоги цукрів типу 2-дезоксиглкжози, антибіотик тунікаміцин) блокується складання віріонів міксо-, рабдо-, α-вірусів або утворюються неінфекційні віріони вірусів герпесу та онковірусів.
Сульфування. Деякі білки складно влаштованих РНК- і ДНК-вірусів сульфуються після трансляції. Найчастіше сульфування піддаються глікопротеїди, при цьому сульфатна група зв'язується з вуглеводними залишками глікопротеїду.
Ацилювання. Ряд глікопротеїдів складно влаштованих РНК-вірусів (НА2 вірусу грипу, білок G вірусу везикулярного стоматиту, білок HN вірусу ньюкаслської хвороби та ін) містять ковалентно пов'язані 1-2 молекули жирних кислот.
Нарізування. Багато вірусні білки, і в першу чергу глікопротеїди, набувають функціональної активності лише після того, як відбудеться їхнє нарізування в специфічних точках протеолітичними ферментами. Нарізання відбувається або з утворенням двох функціональних білкових субодиниць (наприклад, велика і мала субодиниці гемаглютиніну вірусу грипу, два глікопротеїди (Е2 і ЕЗ) вірусу лісу Семлики), або з утворенням одного функціонально активного білка та неактивного ферменту, наприклад білки F і H. Нарізування зазвичай здійснюється клітинними ферментами. У багатьох складно влаштованих вірусів тварин, що мають глікопротеїди, нарізування необхідне для формування активних прикріплювальних білків та білків злиття і, отже, для набуття вірусами здатності інфікувати клітину. Лише після нарізування цих білків вірусна частка набуває інфекційної активності. Таким чином, можна говорити про протеолітичну активацію низки вірусів, що здійснюється за допомогою клітинних ферментів.
Фосфорилювання. Фосфопротеїди містяться практично у складі всіх вірусів тварин - РНК - і ДНК-містять, просто і складно влаштованих. У складі більшості вірусів виявлено протеїнкінази, проте фосфорилювання може здійснюватися як вірусними, так і клітинними ферментами. Зазвичай фосфорилируются білки, пов'язані з вірусним геномом і здійснюють регулюючу роль його експресії. З процесом фосфорилування пов'язаний механізм активної дії інтерферону.
ІІІ. Реплікація.
Реплікацією називається синтез молекул нуклеїнової кислоти, гомологічних геномів. У клітині відбувається реплікація ДНК, у результаті якої утворюються дочірні двонитчасті ДНК. Реплікація відбувається на розплетених ділянках ДНК і йде одночасно на обох нитках від 5'-кінця до 3'-кінця.
Оскільки дві нитки ДНК мають протилежну полярність, а ділянка реплікації («вилка») рухається в одному напрямку, один ланцюг будується у зворотному напрямку окремими фрагментами, які називаються фрагментами Оказаки (на ім'я вченого, який уперше запропонував таку модель). Після синтезу фрагменти козаків «зшиваються» лігазою в єдину нитку.
Реплікація ДНК здійснюється ДНК-полімеразами. Для початку реплікації необхідний попередній синтез короткої ділянки РНК на матриці ДНК, яка називається затравкою. З затравки починається синтез нитки ДНК, після чого РНК швидко видаляється з ділянки, що росте.
Реплікація вірусної ДНК. Реплікація геному ДНК-вірусів в основному каталізується клітинними фрагментами і механізм її схожий з механізмом реплікації клітинної ДНК.
Кожна знов синтезована молекула ДНК складається з однієї батьківської та однієї знов синтезованої нитки. Такий механізм реплікації називається напівконсервативним.
У вірусів, що містять кільцеві двонитчасті ДНК (паповавіруси), розрізається одна з ниток ДНК, що веде до розкручування та зняття супервитків на певній ділянці молекули.
Видно нижня суперспіралізована частина молекули, розплетена частина на великій ділянці і реплікаційні петлі, що знову утворюються.
При реплікації однонитчастих ДНК (родина парвовірусів) відбувається утворення двонитчастих форм, які є проміжними реплікативними формами.
Реплікаційні комплекси. Оскільки нитки ДНК і РНК, що утворюються, деякий час залишаються пов'язаними з матрицею, в зараженій клітині формуються реплікативні комплекси, в яких здійснюється весь процес реплікації (а в ряді випадків також і транскрипції) геному. Реплікативний комплекс містить геном, репліказу та пов'язані з матрицею знову синтезовані ланцюги нуклеїнових кислот. Знову синтезовані геномні молекули негайно асоціюються з вірусними білками, у реплікативних комплексах виявляються антигени. У процесі реплікації виникає частково двонитчаста структура з однонитчастими "хвістами", так званий реплікативний попередник.
Реплікативні комплекси асоційовані з клітинними структурами або з передіснуючими або вірусиндукованими. Наприклад, реплікативні комплекси пікорнавірусів асоційовані з мембранами ендоплазматичної мережі, вірусів віспи - з цитоплазматичним матриксом, реплікативні комплекси аденовірусів і вірусів герпесу в ядрах знаходяться в асоціації з новосформованими волокнистими структурами і пов'язані з ядерними. У заражених клітинах може відбуватися посилена проліферація клітинних структур, з якими пов'язані реплікативні комплекси, або формування з передіснуючого матеріалу. Наприклад, у клітинах, заражених пікорнавірусами, відбувається проліферація гладких мембран. У клітинах, заражених реовірусами, спостерігається скупчення мікротрубочок; у клітинах, заражених вірусами віспи, відбувається формування цитоплазматичного матриксу.
У реплікативних комплексах одночасно з синтезом геномних молекул здійснюється транскрипція і відбувається складання нуклеокапсидів та серцевини, а при деяких інфекціях – і вірусних частинок.
Регулювання реплікації. Новостворена молекула геномної РНК може бути використана по-різному. Вона може асоціюватися з капсидними білками та увійти до складу віріону, служити матрицею для синтезу нових геномних молекул, або – для утворення іРНК, нарешті, у «плюс»-ниткових вірусів вона може виконувати функції іРНК і зв'язуватися з рибосомами. У клітині існують механізми, що регулюють використання геномних молекул. Регуляція йде за принципом саморегуляції та реалізується шляхом взаємодії вірусних РНК та білків завдяки можливості білок-нуклеїнового та білок-білкового впізнавання. Наприклад, роль термінального білка пікорнавірусів полягає в забороні трансляції іРНК та відборі молекул для формування віріонів. Білок, що зв'язується з 5'-кінцем геномної РНК, у свою чергу впізнається капсидними білками і служить сигналом для збирання вірусної частки за участю цієї молекули РНК. За тим же принципом відбираються геномні молекули РНК у мінус-ниткових вірусів. Молекула РНК входить до складу віріону або є матрицею для реплікації. Для перемикання її на транскрипцію має виникнути заборона білок-нуклеїнової взаємодії. У реплікації ДНК аденовірусів бере участь молекула білка, яка зв'язується з кінцем вірусної ДНК і необхідна для початку реплікації. Таким чином, для початку реплікації необхідний синтез вірусних білків: у присутності інгібіторів білкового синтезу відсутнє перемикання транскрипції на реплікацію.
IV. Складання вірусних частинок.
Синтез компонентів вірусних частинок у клітині роз'єднаний і може протікати у різних структурах ядра та цитоплазми. Віруси, реплікація яких відбувається у ядрах, умовно називають ядерними. В основному це ДНК-віруси: аденовіруси, паповавіруси, парвовіруси, віруси герпесу.
Віруси, що реплікуються у цитоплазмі, називають цитоплазматичними. До них відносяться з ДНК-вірусів віспи і більшість РНК-вірусів, за винятком ортоміксовірусів і ретровірусів. Однак цей поділ дуже відносний, тому що в репродукції тих та інших вірусів є стадії, що протікають відповідно в цитоплазмі та ядрі.
Всередині ядра та цитоплазми синтез вірусспецифічних молекул також може бути роз'єднаний. Так, наприклад, синтез одних білків здійснюється на вільних полісомах, а інших – на полісомах, пов'язаних із мембранами. Вірусні нуклеїнові кислоти синтезуються в асоціації з клітинними структурами далеко від полісом, які синтезують вірусні білки. При такому дис'юнктивному способі репродукції утворення вірусної частки можливе лише в тому випадку, якщо вірусні нуклеїнові кислоти і білки мають здатність при достатній концентрації впізнавати один одного в різноманітті клітинних білків і нуклеїнових кислот і мимоволі з'єднуватися один з одним, тобто здатні до самозбирання.
В основі самоскладання лежить специфічне білок-нуклеїнове та білок-білкове впізнавання, яке може відбуватися в результаті гідрофобних, сольових та водневих зв'язків, а також стеричної відповідності. Білок-нуклеїнове впізнавання обмежене невеликою ділянкою молекули нуклеїнової кислоти та визначається унікальними послідовностями нуклеотидів у некодуючій частині вірусного геному. З цього впізнавання ділянки геному вірусними капсидними білками починається процес збирання вірусної частки. Приєднання решти білкових молекул здійснюється за рахунок специфічних білок-білкових взаємодій або неспецифічних білок-нуклеїнових взаємодій.
У зв'язку з різноманітністю структури вірусів тварин різноманітні і способи формування віріонів, проте можна сформулювати такі загальні принципи збирання:
У просто влаштованих вірусів формуються провіріони, які потім у результаті модифікацій білків перетворюються на віріони. У складно влаштованих вірусів складання здійснюється багатоступінчасто. Спочатку формуються нуклеокапсиди чи серцевини, із якими взаємодіють білки зовнішніх оболонок.
Складання складно влаштованих вірусів (за винятком складання вірусів віспи та реовірусів) здійснюється на клітинних мембранах. Складання ядерних вірусів відбувається з участю ядерних мембран, складання цитоплазматичних вірусів - з участю мембран ендоплазматичної мережі чи плазматичної мембрани, куди незалежно друг від друга прибувають усі компоненти вірусної частки.
У ряду складно влаштованих вірусів існують спеціальні гідрофобні білки, що виконують функції посередників між сформованими нуклеокапсидами та вірусними оболонками. Такими білками є матриксні білки у ряду «мінус»-ниткових вірусів (ортоміксовірусів, параміксовірусів, рабдовірусів).
Складання нуклеокапсидів, серцевини, провіріонів і віріонів відбувається не у внутрішньоклітинній рідині, а в , що передбачаються в клітині або індукованих вірусом («фабриках»).
Складно влаштовані віруси для побудови своїх частинок використовують ряд елементів клітини-господаря, наприклад, ліпіди, деякі ферменти, у ДНК-геномного 5V40 - гістони, у оболонкових РНК-геномних вірусів - актин, а в складі ареновірусів виявлені навіть рибосоми. Клітинні молекули несуть певні функції у вірусній частинці, проте включення їх у віріон може з'явитися і наслідком випадкової контамінації, як, наприклад, включення ряду ферментів оболонок клітин або клітинних нуклеїнових кислот.
Складання ДНК-вірусів. У складання ДНК-вірусів є деякі відмінності від складання РНК-вірусів. Як і у РНК-вірусів, складання ДНК-вірусів є багатоступеневим процесом з утворенням проміжних форм, що відрізняються від зрілих віріонів за складом поліпептидів. Перший етап складання полягає в асоціації ДНК з внутрішніми білками та формуванні серцевини або нуклеокапсидів. При цьому ДНК з'єднується із попередньо сформованими «порожніми» капсидами.
Внаслідок зв'язування ДНК з капсидами з'являється новий клас проміжних форм, які називаються неповними формами. Крім неповних форм з різним вмістом ДНК, існує інша проміжна форма в морфогенезі - незрілі віріони, що відрізняються від зрілих тим, що містять попередники поліпептидів, що не нарізають. Таким чином, морфогенез вірусів тісно пов'язаний із модифікацією (процесингом) білків.
Складання ядерних вірусів починається в ядрі, зазвичай - з асоціації з ядерною мембраною. Проміжні форми вірусу герпесу, що формуються в ядрі, брунькуються в перинуклеарний простір через внутрішню ядерну мембрану, і вірус набуває таким шляхом оболонку, яка є дериватом ядерної мембрани. Подальша добудова та дозрівання віріонів відбувається у мембранах ендоплазматичної мережі та в апараті Гольджі, звідки вірус у складі цитоплазматичних везикул транспортується на клітинну поверхню.
У ліпідсодержащих вірусів - вірусів віспи, що не забруднюються, складання віріонів відбувається в вже описаних цитоплазматичних вірусних «фабриках». Ліпідна оболонка вірусів у «фабриках» формується з клітинних ліпідів шляхом автономного самоскладання, тому ліпідний склад оболонок значно відрізняється від складу ліпідів у клітинних мембранах.
V. Вихід вірусних частинок із клітини.
Існують два способи виходу вірусного потомства із клітини:
1) шляхом «вибуху»;
2) шляхом брунькування.
Вихід із клітини шляхом вибуху пов'язані з деструкцією клітини, порушенням її цілісності, у результаті зрілі вірусні частки, що знаходяться всередині клітини, виявляються в навколишньому середовищі. Такий спосіб виходу з клітини властивий вірусам, які не містять ліпопротеїдної оболонки (пікорна-, рео-, парво-, папова-, аденовіруси). Однак деякі з цих вірусів можуть транспортуватися на поверхню клітини до загибелі клітини. Вихід із клітин шляхом брунькування властивий вірусам, що містять ліпопротеїдну мембрану, яка є дериватом клітинних мембран. При цьому способі клітина може тривалий час зберігати життєздатність та продукувати вірусне потомство, поки не станеться повне виснаження її ресурсів.
Для вірусів характерний диз'юнктивний (від disjuncus - роз'єднаний) спосіб репродукції-розмноження. Нащадок вірусу виникає в результаті складання нуклеїнових кислот та білкових субодиниць, які синтезуються окремо клітиною господаря.
Проникнення вірусу в клітину та відтворення собі подібних проходить у декілька фаз:
1.проникнення в клітину господаря,
2. синтез ферментів, необхідних для реплікації вірусних нуклеїнових кислот,
3.синтез вірусних елементів,
4.складання та композиція зрілих віріонів,
5. вихід зрілих віріонів з клітини.
Стадії репродукції вірусів.
1 – адсорбція віріону на клітині; 2 - проникнення віріона у клітину шляхом віропексису;
3 - вірус усередині вакуолі клітини; 4 - роздягання віріона вірусу; 5 – реплікація вірусної нуклеїнової кислоти; 6 – синтез вірусних білків на рибосомах клітини; 7 – формування віріону; 8 - вихід віріона із клітини шляхом брунькування.
Фаза I - адсорбція віріону на поверхні клітини.
Протікає у дві стадії: перша – неспецифічнаколи вірус утримується на поверхні клітини за допомогою електростатичних сил, тобто завдяки виникненню протилежних зарядів між окремими ділянками мембрани клітин і вірусу. Ця фаза взаємодії вірусу з клітиною оборотна, на неї впливають такі фактори, як рН та сольовий склад середовища.
Друга стадія – специфічнаколи взаємодіють специфічні рецептори вірусу та рецептори клітини, комплементарні один одному. За хімічною природою рецептори клітини можуть бути мукопротеїдами (або мукополісахаридами) та ліпопротеїдами. Різні віруси фіксуються на різних рецепторах: віруси грипу, парагрипу, аденовіруси – на мукопротеїди, а віруси кліщового енцефаліту, поліомієліту – на ліпопротеїди.
Фаза ІІ - проникнення вірусу у клітину.Електроноскопічні спостереження за процесом проникнення вірусів у чутливі до них клітини показали, що воно здійснюється за допомогою механізму, що нагадує піноцитоз, або, як найчастіше називають, віропексис. У місці адсорбції вірусу клітинна стінка втягується всередину клітини, утворюється вакуоля, в якій виявляється віріон. Паралельно клітинні ферменти (ліпази та протеази) викликають депротеїнізацію віріону – розчинення білкової оболонки та звільнення нуклеїнової кислоти.
Фаза ІІІ - прихований період (період екліпсу – зникнення).У цей час у клітині неможливо визначити наявність інфекційного вірусу ні хімічними, ні електронно-микроскопическими, ні серологічними методами. Про сутність цього явища та його механізмів поки що відомо мало. Передбачається, що у прихованій фазі нуклеїнова кислота вірусу проникає в хромосоми клітини та вступає з ними у складні генетичні взаємини.
Фаза IV - синтез компонентів віріону. У цій фазі вірус і клітина є єдиним цілим, вірусна нуклеїнова кислота виконує генетичну функцію, індукує утворення ранніх білків і змінює функцію рибосом. Ранні білки поділяються на:
а) білки-інгібітори(репресори), що пригнічують метаболізм клітин
б) білки-ферменти(полімерази), що забезпечують синтез вірусних нуклеїнових кислот.
Синтез нуклеїнових кислот та білків протікає неодночасно й у різних структурних частинах клітини. У вірусів, що містять ДНК або РНК, ці процеси мають деякі відмінності та особливості.
Фаза V - формування зрілих віріонів. Процес «складання» вірусу здійснюється в результаті з'єднання компонентів вірусної частки. У складних вірусів у цьому беруть участь клітинні структури і відбувається включення у вірусну частинку ліпідних, вуглеводних, білкових компонентів клітини господаря.
Процес формування віріонів починається через певний час після того, як почав здійснюватися синтез складових компонентів. Тривалість цього періоду досить варіабельна і визначається природою вірусу - для РНК, що містять, зазвичай коротше, ніж для ДНК-вірусів. Наприклад, продукція повних вірусних частинок осповакцини починається приблизно через 5-6 годин після інфікування клітин і продовжується протягом наступних 7-8 годин, тобто після того, як синтез вірусної ДНК вже завершено.
Між нуклеїновою кислотою та відповідним білковими субодиницями утворюються дуже міцні зв'язки, про що свідчать труднощі відокремлення білка від вірусної нуклеїнової кислоти. Велику міцність вірусній частинці надають вуглеводи, що входять до її складу, і особливо ліпіди.
Формування віріонів, як і синтез компонентів вірусу, відбувається у різних місцях клітини, з участю різних клітинних структур. Після завершення процесу формування утворюється зріла дочірня вірусна частка, що має всі властивості батьківського віріона. Але іноді спостерігається утворення так званих неповних вірусів, Що складаються або тільки з нуклеїнової кислоти, або з білка, або з вірусних частинок, формування яких зупинилося в якійсь проміжній стадії.
Фаза VI - вихід зрілих віріонів із клітини. Існують два основні механізми виходу зрілих віріонів із клітини:
1) вихід віріона за допомогою брунькування. У цьому випадку зовнішня оболонка віріона походить з клітинної мембрани, вона містить як клітинний матеріал господаря, так і вірусний матеріал;
2) вихід зрілих віріонів із клітини через проломи в мембрані. Ці віруси немає зовнішньої оболонки. За такого механізму виходу вірусів клітина, зазвичай, гине і серед з'являється дуже багато вірусних частинок.
Причиною загибелі зараженої клітини можуть бути три механізми:
1. робота вірусу, «що виснажує» клітину;
2. захисна реакція клітини, яка запускає генетичну програму її загибелі (апоптоз);
3. імунна система організму, що знищує заражену клітину.
Крім продуктивного типу взаємодії вірусу та клітини можливо інтегративне співіснування чи вирогенія. Вірогенія характеризується інтеграцією (вбудовуванням) нуклеїнової кислоти вірусу в геном клітини, а також реплікацією та функціонуванням вірусного геному як складової частини геному клітини. Для інтеграції з клітинним геномом необхідне виникнення кільцевої форми двониткової ДНК вірусу. Вбудована до складу хромосоми клітини вірусна ДНК називається провірусом. Провірус реплікується у складі хромосоми і перетворюється на геном дочірніх клітин, тобто. стан вірогенії успадковується. Під впливом деяких фізичних чи хімічних факторів провірус може переходити до автономного стану з розвитком продуктивного типу взаємодії з клітиною. Додаткова генетична інформація провірусу при вірогенії повідомляє клітини нові властивості, що може бути причиною розвитку пухлин, аутоімунних та хронічних захворювань. На здатності вірусів до інтеграції з геномом клітини засновані персистенція (від латів. persisto – постійно перебувати, залишатися) вірусів в організмі та розвиток персистентних вірусних інфекцій. Наприклад, вірус гепатиту В здатний викликати персистуючі ураження з розвитком хронічного гепатиту та часто пухлин печінки.
Типи взаємодії вірусу із клітиною. Фази репродукції вірусів
Розрізняють три типи взаємодії вірусу з клітиною:
Продуктивний тип- завершується утворенням нового покоління віріонів та загибеллю (лізисом) заражених клітин (цитолітична форма). Деякі віруси виходять із клітин, не руйнуючи їх (нецитолітична форма).
Абортивний тип- не завершується утворенням нових віріонів, оскільки інфекційний процес у клітині переривається одному з етапів.
Інтегративний тип, або вирогенія- характеризується вбудовуванням (інтеграцією) вірусної ДНК у вигляді провірусу у хромосому клітини та їх спільним співіснуванням (спільна реплікація).
Репродукція вірусів:
1.адсорбція вірусу на клітині-прикріплення вірусів до поверхні клітини Вірус адсорбується на певних ділянках клітинної мембрани – про рецепторах. ;
2. проникнення вірусу у клітину-два способи: віропексис та злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною. При віропексисі після адсорбції вірусів відбуваються інвагінація (вп'ячування) ділянки клітинної мембрани та утворення внутрішньоклітинної вакуолі, що містить вірусну частинку. Вакуоля з вірусом може транспортуватися в будь-якому напрямку до різних ділянок цитоплазми або ядра клітини. Процес злиття здійснюється одним із поверхневих вірусних білків капсидної або суперкапсидної оболонки. ;
3. «роздягання» вірусу- видалення захисних вірусних оболонок та звільнення внутрішнього компонента вірусу, здатного викликати інфекційний процес. Кінцевими продуктами роздягання є серцевина, нуклеокапсид або нуклеїнова кислота вірусу. ;
3.біосинтез вірусних компонентів у клітині- Вірусна нуклеїнова кислота, що проникла в клітину, несе генетичну інформацію, яка успішно конкурує з генетичною інформацією клітини. Вона дезорганізує роботу клітинних систем, пригнічує власний метаболізм клітини та змушує її синтезувати нові вірусні білки та нуклеїнові кислоти, що йдуть на побудову вірусного потомства.
Реалізація генетичної інформації вірусу здійснюється відповідно до процесів транскрипції, трансляції та реплікації. ;
4. формування вірусів-Існують такі загальні принципи збирання вірусів, що мають різну структуру:
1. Формування вірусів є багатоступеневим процесом із заснуванням проміжних форм;
2. Складання просто влаштованих вірусів полягає у взаємодії молекул вірусних нуклеїнових кислот з капсидними білками та утворенні нуклеокапсидів (наприклад, віруси поліомієліту). У складно влаштованих вірусів спочатку формуються нуклеокапсиди, із якими взаємодіють білки суперкапсидних оболонок (наприклад, віруси грипу);
3. Формування вірусів відбувається у внутрішньоклітинної рідини, але в ядерних чи цитоплазматичних мембранах клітини;
4. Складно організовані віруси у процесі формування включають до свого складу компоненти клітини-господаря (ліпіди, вуглеводи) ;
5. вихід вірусів з клітини-Перший тип – вибуховий – характеризується одночасним виходом великої кількості вірусів. У цьому клітина швидко гине. Такий спосіб виходу характерний для вірусів, які не мають суперкапсидної оболонки. Другий тип – брунькування. Він притаманний вірусам, які мають суперкапсидну оболонку. На заключному етапі складання нуклеокапсиди складно влаштованих вірусів фіксуються на клітинній плазматичній мембрані, модифікованій вірусними білками, і поступово випинають її. В результаті випинання утворюється "нирка", що містить нуклеокапсид. Потім "нирка" відокремлюється від клітини. Таким чином, зовнішня оболонка цих вірусів формується в процесі їхнього виходу з клітини .
Життєдіяльність бактерій характеризується зростанням- формуванням структурно-функціональних компонентів клітини та збільшенням самої бактеріальної клітини, а також розмноженням- самовідтворення, що призводить до збільшення кількості бактеріальних клітин у популяції.
Бактерії розмножуютьсяшляхом бінарного поділу навпіл, рідше шляхом брунькування. Актиноміцети, як гриби, можуть розмножуватися спорами. Актиноміцети, будучи розгалуженими бактеріями, розмножуються шляхом фрагментації ниткоподібних клітин. Грампозитивні бактерії діляться шляхом вростання перегородок, що синтезуються, поділу всередину клітини, а грамнегативні - шляхом перетяжки, в результаті утворення гантелеподібних фігур, з яких утворюються дві однакові клітини.
Поділу клітин передуєреплікація бактеріальної хромосоми за напівконсервативним типом (двоспіральний ланцюг ДНК розкривається і кожна нитка добудовується комплементарною ниткою), що призводить до подвоєння молекул ДНК бактеріального ядра - нуклеоїду.
Реплікація ДНК відбувається у три етапи: ініціація, елонгація, або зростання ланцюга, та термінація.
Розмноження бактерій у рідкому живильному середовищі.Бактерії, засіяні в певний обсяг живильного середовища, що не змінюється, розмножуючись, споживають поживні елементи, що призводить в подальшому до виснаження поживного середовища і припинення зростання бактерій. Культивування бактерій у такій системі називають періодичним культивуванням, а культуру – періодичною. Якщо ж умови культивування підтримуються шляхом безперервної подачі свіжого живильного середовища та відтоку такого ж обсягу культуральної рідини, то таке культивування називається безперервним, а культура - безперервною.
При вирощуванні бактерій на рідкому живильному середовищі спостерігається придонне, дифузне або поверхневе (у вигляді плівки) зростання культури. Зростання періодичної культури бактерій, що вирощуються на рідкому поживному середовищі, поділяють на кілька фаз, або періодів:
1. лаг-фаза;
2. фаза логарифмічного зростання;
3. фаза стаціонарного зростання, або максимальної концентрації
бактерій;
4. фаза загибелі бактерій
Лаг-фаза- період між посівом бактерій та початком розмноження. Тривалість лаг-фази в середньому 4-5 год. Бактерії при цьому збільшуються в розмірах та готуються до поділу; наростає кількість нуклеїнових кислот, білка та інших компонентів.
Фаза логарифмічного (експоненційного) зростанняє періодом інтенсивного поділу бактерій. Тривалість її близько 5-6 год. За оптимальних умов зростання бактерії можуть ділитися кожні 20-40 хв. Під час цієї фази бактерії найбільш вразливі, що пояснюється високою чутливістю компонентів метаболізму клітини, що інтенсивно зростає, до інгібіторів синтезу білка, нуклеїнових кислот та ін.
Потім настає фаза стаціонарного зростання, при якій кількість життєздатних клітин залишається без змін, становлячи максимальний рівень (концентрація М). Її тривалість виявляється у годинах і коливається залежно від виду бактерій, їх особливостей та культивування.
Завершує процес зростання бактерій фаза загибелі, Що характеризується відмиранням бактерій в умовах виснаження джерел живильного середовища та накопичення в ній продуктів метаболізму бактерій Тривалість її коливається від 10 год. до кількох тижнів. Інтенсивність росту та розмноження бактерій залежить від багатьох факторів, у тому числі оптимального складу живильного середовища, окисно-відновного потенціалу, рН, температури та ін.
Розмноження бактерій на щільному поживному середовищі.Бактерії, що ростуть на щільних живильних середовищах, утворюють ізольовані колонії округлої форми з рівними або нерівними краями (S- та R-форми), різної консистенції та кольору, що залежить від пігменту бактерій.
Пігменти, розчинні у воді, дифундують у живильне середовище та забарвлюють його. Інша група пігментів нерозчинна у воді, але розчинна в органічних розчинниках. І, нарешті, існують пігменти, які не розчиняються ні у воді, ні в органічних сполуках.
Найбільш поширені серед мікроорганізмів такі пігменти, як каротини, ксантофіли та меланіни. Меланіни є нерозчинними пігментами чорного, коричневого або червоного кольору, що синтезуються з фенольних сполук. Меланіни поряд з каталазою, супероксидцисмутазою та пероксидазами захищають мікроорганізми від впливу токсичних перекисних радикалів кисню. Багато пігментів мають антимікробну, антибіотикоподібну дію.
Не здійснюється бінарним поділом. Ще у 50-х роках минулого століття було встановлено, що розмноження здійснюється методом репродукції (у перекладі з англ. reproduce – робити копію, відтворювати), тобто шляхом відтворення нуклеїнових кислот, а також синтезу білка з подальшим збиранням віріонів. Дані процеси відбуваються у різних частинах клітини так званого господаря (наприклад, в ядрі або цитоплазмі). Цей роз'єднаний метод репродукції вірусів називається диз'юнктивним. Саме на цьому ми зупинимося докладніше в нашій статті.
Процес репродукції
Цей процес має особливості репродукції вірусів і відрізняється послідовною зміною деяких стадій. Розглянемо їх окремо.
Фази
Вірусна репродукція в клітині здійснюється в декілька фаз, описаних нижче:
- Перша фаза є адсорбцією вірусу, про яку йшлося вище, на поверхні клітини, яка є чутливою до цього вірусу.
- Друга є проникнення вірусу в клітини господаря методом віропексису.
- Третя – це якесь «роздягання» віріонів, вивільнення нуклеїнової кислоти від капсиду та суперкапсиду. У ряду вірусів попадання нуклеїнової кислоти у клітини відбувається методом злиття віріонної оболонки та клітини-хазяїна. В даному випадку третя та друга фази об'єднуються в єдину.
Адсорбція
Під цією стадією репродукції вірусів мається на увазі проникнення вірусної частки клітини. Адсорбція починається на клітинній поверхні за допомогою взаємодії клітинних та вірусних рецепторів. У перекладі з латинської слово "рецептори" означає "приймає". Вони є спеціальні чутливі освіти, які сприймають роздратування. Рецептори - це молекули чи молекулярні комплекси, розташовані лежить на поверхні клітин, і навіть здатні розпізнавати хімічні специфічні угруповання, молекули чи інші клітини, пов'язувати їх. У найбільш складних віріонів такі рецептори розташовуються із зовнішньої оболонки у вигляді шиповидного виросту або ворсинки, у простих віріонів вони знаходяться, як правило, на поверхні капсиду.
Механізм адсорбції на поверхні сприйнятливої клітини ґрунтується на взаємодії рецепторів із так званими комплементарними рецепторами "господарської" клітини. Рецептори віріона та клітини є деякими специфічними структурами, які розташовані на поверхні.
Аденовіруси та міксовіруси адсорбуються безпосередньо на мукопротеїнових рецепторах, а арбовіруси та пікорнавіруси – на ліпопротеїнових рецепторах.
У віріону міксовірусів нейрамінідаза руйнує мукогфотеїновий рецептор і відщеплює N-ацетилнейрамінові кислоти від олігосахариду, який містить галактозу і галактозамін. Їхні взаємодії на даному етапі оборотні, адже на них значно впливає температура, реакція середовища та сольові компоненти. Адсорбції віріону перешкоджають гепарин і сульфатовані полісахариди, що при цьому несуть негативний заряд, проте їх інгібуюча дія знімається деякими полікаріонами (екмолін, ДЕАЕ-декстран, протамінсулъфат), що нейтралізують негативний заряд від сульфат.
Попадання віріона в "господарську" клітину
Шлях впровадження вірусу в чутливу до нього клітину не завжди буде одним і тим самим. Багато віріонів здатні проникати в клітини методом піноцитозу, що в перекладі з грецької означає "пити", "випивати". При цьому методі піноцитозная вакуоль ніби втягує віріон безпосередньо всередину клітини. Інші віріони можуть проникати у клітину безпосередньо крізь її оболонку.
Контакт ферменту нейрамінідазу з клітинними мукопротеїдами сприяє потраплянню віріонів у клітину серед міксовірусів. Результати досліджень останніх років доводять, що ДНК та РНК віріонів від зовнішньої оболонки не відокремлюються, тобто віріони проникають цілком у чутливі клітини шляхом піноцитозу або віропексису. На даний момент це підтверджено щодо вірусу віспи, осповакцини, а також інших вірусів, що вибирають місцем існування організм тварин. Якщо говорити про фаги, вони заражають нуклеїновою кислотою клітини. Механізм зараження ґрунтується на тому, що ті віріони, які містяться у вакуолях клітин, гідролізуються ферментами (ліпаз, протеаз), у процесі чого від оболонки фага звільняється ДНК та потрапляє до клітини.
Для проведення експерименту виконувалося зараження клітини за допомогою нуклеїнової кислоти, яка була виділена від деяких вірусів, і викликається повний цикл репродукції віріонів. Однак у природних умовах інфікування за допомогою такої кислоти не відбувається.
Дезінтеграція
Наступний етап репродукції вірусів - дезінтеграція, яка є звільненням НК від капсиду і зовнішньої оболонки. Після потрапляння віріону в клітини, капсид переживає деякі зміни, набуваючи чутливості до клітинного протеазу, потім він руйнується, паралельно звільняючи ПК. В окремих бактеріофагів у клітини потрапляє вільна ПК. Фітопатогенний вірус проникає через пошкодження клітинної стінки, а потім він адсорбується на внутрішньому клітинному рецепторі з одночасним вивільненням НК.
Реплікація РНК та синтез вірусного білка
Наступним етапом репродукції вірусів є синтез вірусоспецифічного білка, який відбувається за участю так званих інформаційних РНК (у окремих вірусів вони перебувають у складі віріонів, а в деяких синтезуються лише у заражених клітинах безпосередньо на матриці віріонної ДНК або РНК). Відбувається реплікація вірусної ПК.
Процес репродукції РНК-вірусів починається після попадання нуклеопротеїдів у клітину, де формуються вірусні полісоми методом комплексування РНК з рибосомами. Після цього синтезуються і ранні білки, куди слід віднести репресори з клітинного метаболізму, і навіть РНК-полимеразы, які транслюються з батьківської молекулою РНК. У цитоплазмі найбільш дрібних вірусів, або в ядрі, утворюється вірусна двонитчаста РНК методом комплексування батьківського плюс-ланцюга («+» - РНК-ланцюг) із знову синтезованим, а також комплементарним з ним мінус-ланцюга («-» - РНК-ланцюга) . З'єднання даних ниток з нуклеїнової кислоти провокує утворення лише однонитчастої структури РНК, яка називається реплікативною формою. Синтези вірусної РНК здійснюються реплікативними комплексами, у яких беруть участь реплікативна форма РНК, фермент РНК-полімерази, полісоми.
Існує 2 види РНК-полімераз. До таких відносяться: РНК-полімераза I, яка каталізує формування реплікативної форми безпосередньо на матриці плюс-ланцюга, а також РНК-полімераза II, яка бере участь у синтезі вірусної РНК однониткової на матриці реплікативного типу. Синтез нуклеїнових кислот у дрібних вірусів відбувається у цитоплазмі. Що стосується вірусу грипу, то в ядрі синтезується внутрішній білок та РНК. РНК виділяється потім з ядра і проникає в цитоплазму, де разом із рибосомами починає синтезувати вірусний білок.
Після потрапляння віріонів у клітини, у них пригнічується синтез нуклеїнової кислоти, а також клітинних білків. При репродукції на матриці в ядрі синтезується ще РНК, яка несе в собі інформацію для синтезу білка. Механізм синтезу вірусного білка складає рівні клітинної рибосоми, а джерелом побудови буде амінокислотний фонд. Активізація амінокислот здійснюється ферментами, за допомогою і-РНК переносяться безпосередньо в рибосоми (полісоми), в яких вони знаходяться вже в синтезованій молекулі білків.
Таким чином, у заражених клітинах синтез нуклеїнових кислот та білків віріону здійснюється у складі реплікативно-транскриптивного складного комплексу, що регулюється якоюсь системою механізму.
Морфогенез віріону
Утворення віріонів може статися лише у разі строго впорядкованого з'єднання структурних вірусних поліпептидів, а також їх ПК. А це забезпечується так званим самоскладанням молекул білка біля НК.
Формування віріону
Формування віріона відбувається за участю деяких структурних компонентів, що входять до складу клітини. Віруси герпесу, поліомієліту та осповакцини утворюються в цитоплазмі, а аденовіруси – в ядрі. Синтез вірусної РНК, і навіть формування нуклеокапсида відбувається у ядрі, а гемагглютинин формується в цитоплазмі. Після цього нуклеокапсид перебирається з ядра в цитоплазму, де здійснюється утворення оболонки віріона. Нуклеокапсид покривається зовні вірусними білками, а до складу віріону при цьому включаються гемаглютиніни та нейрамінідази. Саме таким чином відбувається утворення нащадків, наприклад, вірусу грипу.
Вивільнення віріона з "господарської" клітини
З "господарської" клітини частки вірусу виділяються одночасно (під час руйнування клітин) або поступово (без будь-яких руйнувань клітин).
Саме в такому вигляді відбувається репродукція вірусів. Віріони вивільняються з клітин, як правило, двома способами.
Перший метод
Перший спосіб має на увазі наступне: після абсолютного дозрівання віріонів безпосередньо всередині клітини вони округляються, там утворюються вакуолі, а потім руйнується клітинна оболонка. По завершенню цих процесів віріони виходять усі одночасно і повністю з клітин (пікорнавіруси). Цей спосіб прийнято називати літичним.
Другий метод
Другий спосіб має на увазі процес звільнення віріонів у міру їх дозрівання протягом 2-6 годин на цитоплазматичній мембрані (міксовіруси та арбовіруси). Виділення із клітини міксовірусів сприяє нейрамінідази, що руйнують клітинну оболонку. Під час цього способу 75-90% віріонів виходять спонтанно у культуральне середовище, а клітини поступово гинуть.
Репродукціявірусів здійснюється в кілька стадій, що послідовно змінюють один одного: адсорбція вірусу на клітині; проникнення вірусу у клітину; "роздягання" вірусу; біосинтез вірусних компонентів у клітині; формування вірусів; вихід вірусів із клітини.
Адсорбція . Взаємодія вірусу із клітиною починається з процесу адсорбції, тобто прикріплення вірусів до поверхні клітини. Це високоспецифічний процес. Вірус адсорбується на певних ділянках клітинної мембрани - так званих рецепторах. Клітинні рецептори можуть мати різну хімічну природу, являючи собою білки, вуглеводні компоненти білків та ліпідів, ліпіди. Число специфічних рецепторів на поверхні однієї клітини коливається від 104 до 105. Отже, на клітині можуть адсорбуватися десятки і навіть сотні вірусних частинок. Проникнення в клітину. Існує два способи проникнення вірусів тварин у клітину: віропексис та злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною. При віропексисі після адсорбції вірусів відбуваються інвагінація (вп'ячування) ділянки клітинної мембрани та утворення внутрішньоклітинної вакуолі, що містить вірусну частинку. Вакуоля з вірусом може транспортуватися в будь-якому напрямку до різних ділянок цитоплазми або ядра клітини. Процес злиття здійснюється одним із поверхневих вірусних білків капсидної або суперкапсидної оболонки. Мабуть, обидва механізми проникнення вірусу в клітину не виключають, а доповнюють один одного. «Роздягання». Процес «роздягання» полягає у видаленні захисних вірусних оболонок та звільненні внутрішнього компонента вірусу, здатного викликати інфекційний процес. «Роздягання» вірусів відбувається поступово, кілька етапів, у певних ділянках цитоплазми чи ядра клітини, навіщо клітина використовує набір спеціальних ферментів. У разі проникнення вірусу шляхом злиття вірусної оболонки з клітинною мембраною, процес проникнення вірусу в клітину поєднується з першим етапом його «роздягання». Кінцевими продуктами роздягання є серцевина, нуклеокапсид або нуклеїнова кислота вірусу. Біосинтез компонентів вірусу. Вірусна нуклеїнова кислота, що проникла в клітину, несе генетичну інформацію, яка успішно конкурує з генетичною інформацією клітини. Вона дезорганізує роботу клітинних систем, пригнічує власний метаболізм клітини та змушує її синтезувати нові вірусні білки та нуклеїнові кислоти, що йдуть на побудову вірусного потомства. Реалізація генетичної інформації вірусу здійснюється відповідно до процесів транскрипції, трансляції та реплікації. Формування (складання) вірусів. Синтезовані вірусні нуклеїнові кислоти та білки мають здатність специфічно «пізнавати» один одного і при достатній їх концентрації мимоволі з'єднуються в результаті гідрофобних, сольових і водневих зв'язків. Існують такі загальні принципи збирання вірусів, що мають різну структуру:
1. Формування вірусів є багатоступеневим процесом із заснуванням проміжних форм;
2. Складання просто влаштованих вірусів полягає у взаємодії молекул вірусних нуклеїнових кислот з капсидними білками та утворенні нуклеокапсидів (наприклад, віруси поліомієліту). У складно влаштованих вірусів спочатку формуються нуклеокапсиди, з якими взаємодіють білки суперкапсидних оболонок (наприклад, віруси грипу);
3. Формування вірусів відбувається у внутрішньоклітинної рідини, але в ядерних чи цитоплазматичних мембранах клітини;
4. Складно організовані віруси в процесі формування включають до складу компоненти клітини-господаря (ліпіди, вуглеводи).
Вихід вірусів із клітини.Розрізняють два основні типи виходу вірусного потомства із клітини. Перший тип – вибуховий – характеризується одночасним виходом великої кількості вірусів. У цьому клітина швидко гине. Такий спосіб виходу характерний для вірусів, які не мають суперкапсидної оболонки. Другий тип – брунькування. Він притаманний вірусам, які мають суперкапсидну оболонку. На заключному етапі складання нуклеокапсиди складно влаштованих вірусів фіксуються на клітинній плазматичній мембрані, модифікованій вірусними білками, і поступово випинають її. В результаті випинання утворюється "нирка", що містить нуклеокапсид. Потім "нирка" відокремлюється від клітини. Таким чином, зовнішня оболонка цих вірусів формується в процесі їхнього виходу з клітини. При такому механізмі клітина може тривалий час продукувати вірус, зберігаючи тією чи іншою мірою свої основні функції.