Люмінесцентна мікроскопія Електронна мікроскопія
У цьому розділі будуть розглянуті основні принци, пристрій, застосування конфокального лазерного мікроскопа, що сканує (КЛСМ) на прикладі приладів фірми Leica. Принцип КЛСМ – реєстрація світлового потоку, що виходить з фокальної площини об'єктива при збігу фокусів, тобто діафрагма детектора повинна бути позиціонована так, щоб її зображення точно збіглося з фокусом світла, що освітлює об'єкт. Як джерело освітлення застосовуються лазери та чутливі детектори для отримання зображення.
Основна особливість КЛСМ полягає в можливості отримання пошарового зображення об'єкта, що досліджується (наприклад, клітини) з високою роздільною здатністю і з низьким рівнем шумів. Досягається це шляхом покрокового сканування об'єкта сфокусованим пучком світла від джерела когерентного або столиком, використанням специфічних флуоресцентних зондів і спеціальних методів обмеження світлових потоків.
Системи сканування в КЛСМ можна класифікувати в такий спосіб.
1. Сканування променем.
А) Дзеркальні системи: однодзеркальні, дводзеркальні, резонансні магнітоелектричні.
Б) Світловолоконні системи: одноволоконні, багатоволоконні.
В) Сканування об'єктивом:
· П'єзоелектричне переміщення об'єктива по осях Х, Y;
· П'єзоелектричне переміщення об'єктива по осі Z.
Г) Акустооптичні дефлектори променя: два акустооптичні дефлектори для сканування по осях Х та Y.
Д) Дискові системи:
· Односпіральні односторонні та двосторонні;
· Багатоспіральні односторонні та двосторонні.
Е) Комбіновані системи: акустооптичний дефлектор осі Yі сканування дзеркалом по осі Х.
2. Сканування столиком.
А) Кроковий привід: скануючий столик з кроковими двигунами по осях Х, Y, Z.
Б) Комбінований привід: скануючий столик з кроковим двигуном по осях X, Y п'єзоелектричний привід по осі Z.
Мал. 5. Принципова схема роботи КЛСМ.
1 - скануючий столик; 2 - досліджуваний зразок; 3, 7 – об'єктиви; 4 - скануючий пристрій; 5 - світлодільна пластина; 6 – промінь світла від лазера; 8, 12 - зображення точок В та С; 9 - голчаста діафрагма; 10 - зображення точки А у центрі голчастої діафрагми; 11 - приймач випромінювання; 13, 15 - світіння точок В і С, що знаходяться поза фокусом об'єктива 3; 14 - світіння точки А, що знаходиться у фокусі об'єктива 3.
Світловий потік збудження 6 від лазерного джерела надходить через світлоділильну пластину 5, скануючу систему 4 на об'єктив 3 і фокусується в точку А площині досліджуваного препарату (наприклад, клітини), що знаходиться у фокусі. Вважаємо, що внутрішньоклітинні структури пов'язані з флуоресцентними зондами і точку А фокусування пучка можна розглядати як точкове джерело світла, потік флуоресценції від якого через об'єктив 3, світлодільна пластина 5, об'єктив 7 фокусується в площині голчастої діафрагми 9 ("pinhole" .Освітленість потоком збудження фрагментів препарату, що лежать поза фокусом об'єктива вздовж оптичної осі (точки В і С), нижче, ніж у точці А. Отже, складова освітленості мішені детектора від точок В і С може бути суттєво зменшена. Потоки флуоресценції, що виходять від точок В і С, що лежать поза фокусом, обмежуються точковою діафрагмою і на детектор не потрапляють або потрапляє їх мала частина. Таким чином, при скануванні препарату у площині XYдетектором реєструється сигнал, рівень якого визначається відстанню від площини сканування вздовж координати Z. Поєднання фокусу об'єктиву 3 з площиною сканування і фокусу об'єктива 7 з голчастою діафрагмою відображено в терміні "конфокальність". Покрокове переміщення площини сканування вздовж осі Z дозволяє отримати серію контрастних пошарових зображень та реконструювати внутрішню тривимірну структуру (3-D) об'єкта, що досліджується. Якість зображення, роздільна здатність у площині XYі вздовж осі Z залежить від якості оптики, якості скануючих систем, розмірів і точності виготовлення точкової діафрагми, жорсткості конструкції, ефективності алгоритмів обробки сигналів, що використовуються, специфічності флуоресцентних зондів.
Для визначення просторової роздільної здатності мікроскопа проводять аналіз зображення точкового джерела світла. Зображення точкового джерела, що формується звичайною лінзою, є дифракційною плямою Ері, що складається з яскравого центрального ядра і більш слабких зовнішніх кілець.
Мал. 6. Дифракційна пляма Ері.
Два точкові джерела однакової яскравості, відстань між якими дорівнює d , видно як дві різні точки, якщо відстань між центрами гуртків Ері перевищує таке значення:
r A = XY =0,6 λ/NA,
де r A - радіус першого темного кільця в гуртку Ері, λ-довжина хвилі джерела світла в нм, NA - числова апертура.
Цей вислів називають критерієм Релея. Воно визначає роздільну здатність мікроскопа в площині зразка (XY). У цьому межа дозволу визначається передусім хвильової природою світла, і його часто спрощують, вважаючи NA=1. У КЛСМ формування зображення призводить до невеликого зменшення розміру плями Ері. Інтенсивність плями Ері для стандартного мікроскопа зменшується за законом n-2 де n - поперечне зміщення, а для КЛСМ інтенсивність зменшується як n-4. Це призводить до збільшення роздільної здатності КЛСМ в 1,5 рази. Для конфокального мікроскопа критерій Релея має вигляд:
XY c r =0,4 λ/NA,
де XY c r - роздільна здатність КЛСМ.
Для оцінки переваги КЛСМ, розглянемо апаратну функцію (структуру плями Ері) і проаналізуємо роздільну здатність мікроскопа в осьовому напрямку (Z). Тривимірна пляма Ері (розподіл інтенсивності) є тривимірною апаратною функцією (ТАФ) яка визначає зображення об'єкта. ТАФ для звичайного мікроскопа має конічну форму, що розширюється вгору і вниз від центру, тоді як конфокального мікроскопа вона має еліптичну форму і менш витягнута в осьовому напрямку.
Мал. 7. Вид тривимірної апаратної функції точкового джерела звичайного мікроскопа – (а) та КЛСМ – (б).
Критерій Релея може бути застосований і для визначення роздільної здатності мікроскопа в напрямку оптичної осі. Для звичайного мікроскопа два точкових джерела, розташовані на певній відстані вздовж оптичної осі, можна дозволити, якщо максимуми їх плям Ері знаходяться на відстані:
Z r =2 λ/NA 2 ,
де Z r - осьова роздільна здатність мікроскопа.
Розподіл енергії в плямі Ері для КЛСМ вужче, і роздільна здатність в осьовому напрямку в 1,4 рази вище. Для конфокального мікроскопа критерій Релея має вигляд:
Z r c =1,4 λ/NA 2 ,
де Z r c - осьова роздільна здатність КЛСМ.
Сучасні КЛСМ мають одну головну перевагу – можливість отримання тонких оптичних зрізів. На якість зображення під час отримання тонких оптичних зрізів впливають такі параметры:
· Розмір конфокальної діафрагми;
· Чисельна апертура об'єктива NA;
· показник заломлення;
· Поглинання світла у зразку.
Зменшення інтенсивності світла зі збільшенням товщини зразка впливає дозвіл мікроскопа по оптичної осі Z. Дозвіл залежить від оптики мікроскопа і зразка. Товщину оптичного перерізу в конфокальному мікроскопі зазвичай характеризують шириною розподілу на піввисоті піку інтенсивності Δz 1/2 = 0,65 мкм. Якщо зразок і детектор ідеальні, цей параметр залежить від числової апертури об'єктива, довжини хвилі і показника заломлення імерсійного середовища n i .
Мал. 8. Залежність осьової роздільної здатності мікроскопа ∆z 1/2 від числової апертури об'єктива.
У КЛСМ перед детектором ставиться регульована діафрагма, що змінює кількість світла. Голчасті діафрагми призначені для створення умов максимальної або повної фільтрації світла, що потрапляє в площину формування зображення від точок, що не збігаються з фокальною площиною або знаходяться поряд з аналізованим елементом об'єкта у фокальній площині. Розмір голчастої діафрагми кінцевий, і від нього залежать поперечна роздільна здатність приладу, яскравість освітлених елементів препарату, зміщених щодо фокальної площини по осі Z, і глибина різкості. Розмір діафрагми впливає на товщину перетину. Чим менше діафрагма, тим ближче товщина перерізу до теоретичної межі (шириною розподілу на піввисоті піку інтенсивності), а за дуже великих апертур здатність отримувати тонкий переріз стає неможливим.
Як говорилося раніше, КЛСМ дає можливість отримувати оптичний переріз на значній глибині від поверхні зразка, при цьому важливим моментом є показник заломлення та проблема глибини. Проходження падаючого та відбитого променя через зразок впливає на якість зображення. Якщо показники заломлення імерсійного середовища та зразка близькі (вплив різниці показників заломлення імерсійної рідини та об'єкта на появу розсіяного світла, що знижує контраст зображення та діє як ефект сферичної аберації), світловий конус буде збігатися. Якщо ж показники заломлення різняться, утворюється сферична аберація.
Мал. 9. Показники заломлення імерсійного середовища та зразка.
а – формування зображення іммерсійним об'єктивом без аберації; б – сферична аберація, обумовлена невідповідністю показників.
При різних показниках заломлення світлові промені, що йдуть на відстані від оптичної осі, в одну точку не фокусується, що призводить до втрати якості зображення. По можливості показники заломлення зразка та об'єктива мають бути узгоджені. Якщо показники заломлення зразка та імерсійного середовища розрізняються, зображення об'єкта на глибині розмите уздовж оптичної осі, а площину фокусу зсунуто. Для збільшення глибини проникнення об'єктив повинен мати більшу числову апертуру, наприклад, імерсійний об'єктив. Однак такі об'єктиви мають малу максимальну відстань від об'єктивної лінзи до фокальної площини. На глибину проникнення впливає неоднорідність зразка, що призводить до зниження інтенсивності світла на великій глибині та появі тіні. В ідеалі зразок, що дозволяє досягти максимальної глибини проникнення та максимального дозволу, повинен мати показник заломлення, що дорівнює показнику заломлення об'єктива, але це однорідний зразок, а таких біологічних зразків не існує.
Під час сканування КЛСМ отримує ряд оптичних перерізів з глибиною, що регулярно зростає, від поверхні зразка. Для більшості КЛСМ отримання сотні 2D-зображень займає лише кілька хвилин. Оптичне зображення можна отримати двома способами:
1) отримання послідовності оптичних перерізів у площині XY, розташованих на відстані ∆z один від одного. Зіставлення координат центрів об'єктів у різних перерізах дає можливість визначити їхню орієнтацію та розподіл за довжиною.
Мал. 10. Вивчення тривимірної структури у площині XY.
2) одержання ряду оптичних перерізів у площині XZ, розташованих на відстані ∆y. Якщо зразок паралельний площині перерізу, його перетин у площині XZ буде майже круглим, при зіставленні зображень у різних XZ перерізах, можна визначити вигнутість досліджуваного об'єкта.
Мал. 11. Вивчення тривимірної структури у площині XZ.
Тривимірна реконструкція об'єктів, що досліджуються, методами КЛСМ спрямована на вирішення двох завдань:
· Візуалізації об'ємного зображення об'єкта, отриманого шляхом "складання" його оптичних зрізів;
· Кількісного аналізу внутрішніх структур об'єкта.
На сьогоднішній день існує досить багато фірм виробників КЛСМ. Інновації фірм-виробників КЛСМ:
· 2002 р. фірма Leica анонсувала акустооптичний світлодільник (AOBS), що дозволяє ефективно розділяти лазерний промінь збудження та люмінесценцію;
· 2002 р. фірма Carl Zeiss почала випускати конфокальний мікроскоп LSM 510 META з оригінальним фотоприймачем, що реєструє сигнал одночасно в 32 спектральних каналах;
· 2004 р. Zeiss створює високошвидкісний LSM 5 Live, що має швидкість сканування в 20 разів вище звичайного КЛСМ;
· Фірма Olympus розробила прилад із двома сканерами, що дозволяє більш ефективно застосовувати, наприклад, методику FRAP;
· Nikon - створює компактний та недорогий КЛСМ спрощеної конструкції;
· 2007 рік фірма Leica оголосила про випуск 4Pi-конфокального мікроскопа, що покращує аксіальний дозвіл у 4 - 7 разів.
Розглянемо пристрій КЛСМ, що відноситься до нового більш досконалого покоління приладів – TCS SP5 фірми Leica.
Мал. 12. Багатофотонна/конфокальна широкосмугова система TCS SP5 (інвертований мікроскоп).
Ключові елементи КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптичний фільтр, що настроюється, AOBS – акусто-оптичний світлодільник, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.
AOTF - акустико-оптичний фільтр, що настроюється - служить для мінімізації оптичного експонування, налаштовує потужність лазера в залежності від зразка і флуорохрому. Дозволяє вибрати необхідну довжину хвилі та керувати інтенсивністю світла збудження. AOTF - являє собою фільтр, що електрично перебудовується, що працює на принципі об'ємної дифракції світлового пучка на неоднорідностях показника заломлення. Такі неоднорідності виникають при збудженні в двопроменезаломлюючих кристалах ультразвукової акустичної хвилі. При анізотропній дифракції в одновісних кристалах існує мінімальна частота ультразвуку, при якій кути падіння і дифракції збігаються, і відбувається так звана акустооптична колінеарна взаємодія.
Мал. 13. Акустико-оптичний фільтр, що настроюється.
AOBS – акусто - оптичний світлодільник, це акусто-оптичний кристал – налаштований заломлюючий пристрій, що працює в реверсивному режимі. Що дає використання AOBS:
1. Для отримання чіткого, з низьким рівнем шуму, зображення необхідне високий рівень світлопропускання. Зменшення шуму за рахунок усереднення зображення за багатьма послідовними скануваннями з необхідністю призводить до фотознебарвлення об'єкта, що вивчається. Ступінь світлопропускання AOBS перевершує більшість дихроїчних дзеркал у всьому видимому діапазоні спектра. Отже, потрібне усереднення за меншою кількістю сканування. В результаті препарат проіснує набагато довше;
2. Яскраві та чіткі зображення вимагають проходження якомога більшої кількості фотонів від об'єкта до детектора, що покращує якість зображення. AOBS забезпечує реєстрацію максимально широких смуг флуоресценції, тобто максимальної кількості фотонів;
3. Низьке знебарвлення під час отримання зображення є важливим для захисту зразка від вицвітання, а живих об'єктів від токсичних продуктів фотолізу флуорохромів. Криві світлопропускання AOBS мають дуже круті нахили, що дозволяє реєструвати флуоресценцію флуорохрому максимально близько до смуги його збудження;
4. Може бути збуджений будь-який барвник видимого діапазону, оскільки відображення може налаштовуватись індивідуально;
5. Вирішено питання багатопараметричної флуоресценції: можна запрограмувати до восьми ліній випромінювання лазера, залишаючи достатньо місця для реєстрації флуоресценції, при цьому частоти налаштовуються;
6. Співвідношення барвників, як співвідношення збудження метаболіт - проб, наприклад, для Са 2+ мембранного потенціалу, водневого показника повинно швидко перемикатися при послідовному скануванні. AOBS перемикається за кілька мікросекунд;
7. Реєстрація зображення у відбитому світлі – ще одна можливість використання. AOBS дозволяє налаштовувати проходження відбитого збуджуючого світла індивідуально;
8. Сканування ROI (послідовне сканування та сканування певної зони) також покращено: різні режими збудження застосовуються для різних областей під час окремого сканування;
9. Великий обсяг 3D записів, у послідовному режимі виграє від пристроїв із швидким перемиканням, оскільки швидкість збільшує ефективність системи;
10. Флуоресцентна кореляційна спектроскопія (FCS) вимагає низького фону та малого світлорозсіювання Тільки AOBS ефективно блокує близькі лінії випромінювання, наприклад, від Ar лазерів;
11. Спектральний запис (Лямбда сканування) забезпечує точний спектр, так як світлопропускання AOBS «біле», а це означає, що він не вносить змін до спектру випромінювання - що є звичайною проблемою при виконанні спектрального сканування в системі з дзеркальними дзеркалами;
12. Для справжнього конфокального отримання оптичних зрізів необхідне точкове висвітлення та точкова реєстрація флуоресценції. AOBS підходить для роботи з конфокальними пристроями точкового сканування;
13. Отримання зображення в мультифотонному режимі або ультрафіолетовому збудженні може бути виконано паралельно без помилок або обмежень. AOBS не змінює збудження лазерів невидимого діапазону та не змінює спектр флуоресценції;
14. Неможливо виконати помилкову операцію, оскільки AOBS контролюється спільно з управлінням збудження за допомогою AOTF (акустико-оптичний фільтр, що настроюється). Якщо вибрано лінію збудження, то і AOBS запрограмований відповідно до неї. Оператору не треба приймати рішення - робота виконується правильно та автоматично;
15. Відсутнє розюстування, оскільки немає рухливих елементів властивих фільтровим барабанам та слайдерам. Кристал міцно встановлений, програмування виконується електронним способом;
16. Немає необхідності в дорогому додатковому устаткуванні, наприклад, фільтрових кубиків, слайдерів діхроїчних дзеркал тощо. Тому набагато менші витрати на технічну допомогу для встановлення нових оптичних елементів.
Мал. 14. AOBS - акусто - оптичний світлодільник.
SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Світло від зразка є сумою спектрів викликаної флуоресценції проходить pinhole діафрагму, яка формує конфокальний оптичний зріз. Далі за допомогою призми це світло розкладається у спектр. При проходженні першого детектора світло проходить пристрій щілинного фотометра, що складається з двох шторок з приводом. Ці шторки обрізають краї спектру з обох боків діапазону і направляють до сенсорів 2 та 3 порядку. Через війну спектр розкладається одночасно п'ять каналів. У результаті під час використання SP – детектора реєструється випромінювання від різних барвників у зразку.
Мал. 15. Спектральний детектор SP.
SP – детектор дозволяє проводити лямбда-сканування: спектральні зображення накопичуються для аналізу характеристик барвників, які задіяні в експерименті, відразу.
4 червня 2013Значна частина наукових досліджень, що проводяться на біологічному факультеті МДУ, успішна реалізація тісно пов'язаних з ними освітніх програм, немислимі без застосування найсучаснішої мікроскопічної техніки. У рамках Програми розвитку Московського університету на біологічному факультеті було створено, повністю оснащено необхідним обладнанням та ефективно працює міжкафедральна лабораторія конфокальної мікроскопії.
Фібробласти 3Т3 на стінках макропори матриксу
Текст: Третьяков Артемій
Що робити?
За допомогою конфокального мікроскопаможна отримати кілька зображень віртуальних зрізів клітини, або зібрану з них тривимірну модель. Такі можливості дає лазер, промінь якого можна фокусувати у будь-якій точці клітини. Для отримання зображення об'єкт повинен бути флуоресцентно активний, тобто при попаданні променя лазера він (а точніше, певні молекули в його складі) повинен випромінювати світло з більшою довжиною хвилі, ніж на нього, який і вловлюється мікроскопом. Зображення будується на основі цієї флуоресценції.
Фото
Як працює?
«Сучасний рівень розвитку фундаментальних та прикладних міждисциплінарних наукових досліджень, а також завдання підготовки фахівців, які володіють міждисциплінарними компетенціями, потребують інтенсивного розвитку та модернізації матеріально-технічної бази» (Програма розвитку Московського університету, с. 5;).
Крім лазера до складу електронномеханічного пристрою входить також оптичний фільтр, що пропускає промінь лазера, але відбиває більш довгохвильове світло на діафрагму, звану «пінхолом» (від англ. Pinhole – шпилькою дірка, дослівний переклад відмінно характеризує пристрій пінхолу), яка відсікає весь непотрібний фон світло і тим самим знижує або зовсім зводить нанівець вплив оптичних шарів, що лежать нижче, на чіткість відображення сканованої ділянки клітини. Якби фонове світло не відсікалося пінхолом, то оптичні шари накладалися б один на одного і заважали спостерігачеві – ніби він дивиться крізь листя в далечінь. За діафрагмою розташовується фотоприймач, що оцифровує інформацію, що отримується.
Зрозуміло, що таке «точкове» сканування потребує часу. Щоб прискорити цей процес у конфокальній системі використовується ще один модуль, званий спінінг-диском, що дозволяє за один акт роботи лазера отримати зображення не однієї точки, а цілої лінії.
Патент на таку систему було отримано 1961 року професором Массачусетського технологічного інституту Марвіном Мінським. Активне її використання розпочалося у 80-х роках, а зараз конфокальна мікроскопія переживає свій розквіт. У Росії її перший мікроскоп з'явився 2003 року, це був Axiovert 200M LSM510 Meta. За ним були інші, і тепер у нашій країні існує кілька великих лабораторій, серед яких і міжкафедральна лабораторія на біологічному факультеті МДУ. У розпорядженні лабораторії п'ять мікроскопів, зокрема: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
Конфокальна мікроскопія досягла як високого розмаїття і тривимірності, вона освоїла і четвертий вимір – час, дозволивши вивчати зміни, що у клітинах. Для цього кожна установка забезпечена системами підтримки їх життя. Все це дає широкі можливості для дослідників, які цими можливостями успішно користуються.
І, коли йдеться про лабораторію біологічного факультету МДУ, як приклади слід згадати проведені в цій лабораторії дослідження.
Шовк та павутиння
Конфокальна мікроскопія досягла як високого розмаїття і тривимірності, вона освоїла і четвертий вимір – час, дозволивши вивчати зміни, що у клітинах.
Однією з цікавих робіт є створення протезів, що біодеградуються, для відновлення судин та інших порожніх органів. Такі тканинно-інженерні конструкції зовні являють собою, у найпростіших випадках, трубки або плівки, що одягаються на місце пошкодження і виконують, таким чином, роль «латки». Їх можна виготовити з різних матеріалів, у тому числі з фіброїну шовку коконів шовкопряда. Достоїнство цього матеріалу в тому, що він стабільний та формує гнучку та міцну структуру протеза. Сам протез виглядає як плівка тільки при розгляді неозброєним оком, насправді він є матриксом - сітчастою багатошаровою основою, каркасом, що імітує будову живої тканини. Цей каркас допомагає новим клітинам зайняти правильне положення, забезпечуючи їхній рівномірний розподіл. В результаті пошкоджена стінка органу відновлюється, а каркас, що став непотрібним, піддається біодеградації. Але перевірити, наскільки рівномірно розподіляються по каркасу клітини, а також чи добре їм живеться в глибоких шарах матриксу (чи немає труднощів у газообміні та обміні продуктами метаболізму), і чи не змінюють вони при проникненні всередину нього морфології, не так просто. Саме цьому етапі застосування мікроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) сильно спростило завдання. В основному за рахунок можливості досліджувати об'єкт без руйнування, а також за рахунок здатності мікроскопа дивитися всередину матриксу на глибину до 600 мкм.
Фото
Подібні роботи були проведені і з кістковою тканиною, матрикс для якої виготовляли як з того ж фіброїну, так і з спіддроїну - білка, що спочатку виявлено в організмі павука і використовується для плетіння павутиння. У лабораторних умовах білок виробляють зовсім не павуки, а дріжджі, в чий геном впроваджено трохи змінений ген павука, відповідальний синтез цього білка.
Не все так просто
Але якщо виникнення пошкоджень у тканинах – процес простий і зрозумілий, інші патології зрозумілі далеко не завжди. І перш ніж розпочати ефективне лікування і, тим більше, запобігання їх розвитку, потрібно з'ясувати механізм виникнення. До таких відноситься атеросклероз - хвороба артерій, в результаті якої в стінці судини, а точніше, в інтимі - її внутрішньому шарі, накопичуються ліпіди, що роблять стінку товщі, що в кінцевому підсумку може призвести навіть до повної закупорки судини. Через що виникає це захворювання, не зовсім зрозуміло, як і незрозуміло те, яку роль грають імунокомпетентні клітини, у місцях скупчення яких незабаром починається атерогенез. Повноцінні відповіді на ці питання ще не знайдені, але вивчення атерогенезу продовжується, хоч і публікацій на цю тему значно менше, ніж на тему тканеінженерних протезів.
Фото
Долі молекул
Міжкафедральну лабораторію конфокальної мікроскопії регулярно використовують у своїй роботі понад 20 студентів та аспірантів із майже 10 кафедр.
В описаних вище дослідженнях переважно відстежується стан клітин. Але цим можливості конфокального мікроскопа не обмежені, він цілком здатний відстежити навіть долю окремої молекули в клітині – аби вона мала флуоресцентну активність. І тому молекули зазвичай мітять флуорохромами – спеціальними барвниками, мають цю активність. Флуорохроми існують у вигляді окремих молекул, і переміщення ними полягає в хімічному зв'язуванні флуорохрому з молекулою, що цікавить дослідника. Після цього такі мічені молекули потрапляють у клітину та його подальшу долю відстежують з допомогою мікроскопа. Таким способом порівнювали, наприклад, активність та переміщення в клітині рицину та віскуміну. Обидві речовини – білкові токсини, обидві мають рослинне походження і складаються з двох частин – субодиниць, одна з яких відповідальна за зв'язування з клітиною та проникнення всередину, а інша – за інактивацію рибосоми, що зрештою веде до загибелі клітини. Практична користь знову ж таки пов'язана з лікуванням ще одного небезпечного захворювання – раку. Такий чіткий «розподіл обов'язків» між субодиницями дозволяє замінити першу субодиницю, наприклад, на антитіло. Вийде «імунотоксин», що діє лише на певні клітини, до яких це антитіло підійде. Основних проблем дві. Перша: вибір антитіла, яке буде підходити до ракових клітин та не допускати проникнення токсину у здорові. І друга: вибір токсину, який при перетворенні на імунотоксин буде зберігати високу ефективність.
Фото: Первинна культура клітин серця новонароджених щурів: А - контроль, Б - оброблених 20мкМ ізопротеренолу протягом доби. 1 - забарвлення мітохондрій TMRE; 2 – фазовий контраст. Шкала 10мкм. (Смирнова Т.А., Сапрунова В.Б. "Адаптаційні зміни мітохондрій культивованих кардіоміоцитів новонароджених щурів під впливом ізопротеренолу". Міжнародна конференція "Рецептори та внутрішньоклітинна сигналізація" 24-26 ТРАВНЯ 2011р.)
Навчання
Список проведених із використанням конфокальної мікроскопії робіт можна продовжувати довго. Ефективний метод, який дозволяє працювати з живими клітинами, затребуваний практично в будь-якому науковому дослідженні. І тому величезну роль грає підготовка студентів до роботи у цій лабораторії. Регулярно її відвідують понад 20 студентів та аспірантів, які займаються курсовими, передкурсовими та дипломними роботами.
Працюють на установках ембріологи, молекулярні біологи, цитології, біоінженери, імунологи, зоологи.
Лабораторія конфокальної мікроскопії заснована у 2004 році.
Завідувач лабораторії – доцент М.М.Мойсенович
У лабораторії працюють молоді фахівці А.А.Рамонова та А.Ю.Архіпова
В даний час в лабораторії встановлено 2 конфокальні системи:
- Axiovert 200M з конфокальною приставкою LSM510 META (Carl Zeiss, Німеччина)
- Конфокальна лазерна система сканування, виробництва "НІКОН КОРПОРЕЙШН" (Японія) - мікроскоп медико-біологічний інвертований для лабораторних досліджень Eclipse з приладдям: зі штативом Ti-E, з TIRF-освітлювачем, з конфокальним модулем А1 і конфокальним модулем.
Всі новини "
Марголін 389с.
Оптична мікроскопія використовувала всі досягнення як техніки та технології, так і інформаційних та комп'ютерних технологій. Це призвело до значного вдосконалення наявної апаратури та методик її використання, що, у свою чергу, призвело до появи нових методів, зокрема конфокальної мікроскопії. Конфокальний мікроскоп відрізняється від класичного оптичного мікроскопа тим, що у кожний момент часу реєструється зображення однієї точки об'єкта, а повноцінне зображення будується шляхом сканування (руху зразка або перебудови оптичної системи). Таким чином, у своєрідній формі реалізується принцип растрової електронної мікроскопії, що дозволяє як завгодно довго реєструвати і обробляти сигнал з кожної окремо взятої точки.
У класичному мікроскопі фотоприймальний пристрій потрапляє світло з різних точок зразка. У конфокальному мікроскопі для того, щоб реєструвати світло тільки від однієї точки, після об'єктивної лінзи розташовується діафрагма малого розміру таким чином, що світло, що випускається аналізованою точкою, проходить через діафрагму і буде зареєстровано, а світло від інших точок в основному затримується діафрагмою, як це показано на рис. 7.28.
Мал. 7.28. Схема проходження променів у конфокальному оптичному мікроскопі
Ще одна особливість полягає в тому, що освітлювач створює не рівномірну освітленість поля зору, а фокусує світло аналізовану точку. Це може досягатися розташуванням другої фокусуючої системи за зразком, але при цьому потрібно, щоб зразок був прозорим. Крім того, об'єктивні лінзи зазвичай мають високу вартість, тому використання другої системи фокусування для підсвічування мало переважно. Альтернативою є використання світлоділильної пластинки, так щоб і падаюче і відбите світло фокусувалися одним об'єктивом. Така схема ще й полегшує юстування.
Розглянемо тепер, як і наскільки кількісно змінюється контрастність при застосуванні конфокальної мікроскопії. Так як у конфокальному мікроскопі світло двічі проходить через об'єктив, функція розмиття точки (далі позначається PSF) буде твір незалежних ймовірностей того, що фотон потрапить в точку з її координатами або фотон буде зареєстрований з цієї точки.
Якщо використовувати критерій Релея для вирішення, то вийде, що роздільна здатність у конфокальному мікроскопі збільшується, але не суттєво. Для конфокального мікроскопа маємо вираз дозволу r:
У той час як для звичайного мікроскопа:
Проте основною перевагою конфокального мікроскопа є збільшення дозволу у сенсі критерію Релея, а істотне збільшення контрастності. Зокрема, для звичайної PSF у фокальній площині відношення амплітуди в першому бічному максимумі до амплітуди в центрі становить 2%, а для конфокального мікроскопа це відношення становитиме 0,04%. З цього випливає, що тьмяний об'єкт з інтенсивністю, наприклад, у 200 разів меншою, ніж у яскравого об'єкта, у звичайному мікроскопі виявити неможливо, хоча відстань між об'єктами може бути істотно більшою за ту відстань, яку наказано критерієм Релея. У той самий час у конфокальном мікроскопі такий об'єкт повинен добре реєструватися.
Важливим параметром є розмір діафрагм у фокальній площині опромінює і збирає лінз. Зображення діафрагми у площині об'єкта визначає, з яких областей світло реєструється фотодетектором. Очевидно, що зменшення розміру діафрагми призводить до зменшення кількості світла, що зникає, збільшує рівень шуму і в кінцевому підсумку може звести на «ні» всі досягнуті переваги по контрастності. Таким чином, постає питання про оптимальний вибір розміру діафрагми і розумний компроміс.
Діафрагма з розміром отвору менша за пляму Ейрі просто призводить до втрати інтенсивності і ніяк не впливає на дозвіл. Діафрагма з розміром отвору в одну пляму Ейрі дозволяє максимально використовувати роздільну здатність об'єктивної лінзи. Однак діафрагма з розміром отвору приблизно в 3 - 5 разів більше плям Ейрі представляється найбільш підходящим компромісом. Слід розуміти, що розмір, що обговорюється тут, має сенс розміру зображення в площині об'єкта, а тому реальний розмір отвору в діафрагмі залежить від збільшення лінзи. Зокрема, при використанні 100-кратної лінзи діафрагма з отвором 1 мм буде спроектована в площину об'єкта в коло радіусом 10 мкм.
Розвитком ідеї конфокальної мікроскопії стала розробка конфокального лазерного скануючого мікроскопа (KJICM), що було викликано потребою у більш чутливих та метрологічно строгих методах аналізу форми та просторової структури об'єктів, що спостерігаються. Принципова схема КЛСМ із основними функціональними зв'язками показано на рис. 7.29.
Основною особливістю КЛСМ є можливість пошарового зображення об'єкта, що досліджується, з високою роздільною здатністю і низьким рівнем шумів. Досягається це шляхом покрокового сканування об'єкта сфокусованим пучком світла від джерела когерентного або пересуванням столика з використанням спеціальних флуоресцентних зондів і спеціальних методів обмеження світлових потоків.
Мал. 7.29. Структурна схема KJICM:
1 - скануючий столик; 2 - досліджуваний зразок; 3, 6 - об'єктиви; 4 - скануючий пристрій; 5 - світлодільна пластина; 7, 9 - голчасті діафрагми; 8 - приймач випромінювання; 10 - лазер; 11 - блок керування; 12 - комп'ютер; 13 - привід для сканування по осі z.
Використання КЛСМ точкової діафрагми, розміри якої узгоджені зі збільшенням мікроскопа і довжиною хвилі, дає можливість підвищити роздільну здатність більш ніж на 10%. Очевидно, що дозвіл КЛСМ і, відповідно, можливості аналізу тонких структур можуть перевищувати аналогічні можливості звичайного мікроскопа не більше ніж на 40% в умовах сканування препарату тонким променем. Роздільна здатність KЛCM залежить від способу мікроскопування та освітлення. Дозвіл KЛCM визначається як оптичною системою, так і електронним трактомобробки інформації Тому в конструкції KЛCM, його схемах повинні бути узгоджені такі параметри, як роздільна здатність оптичної системи, крок сканування, характеристики детектора, а також повинні бути обрані оптимальні алгоритми обробки та відповідне програмне забезпечення.
Загалом глибина різкості KЛCM залежить від апертури, довжини хвилі, когерентності джерел світла та розмірів голчастої діафрагми. Голкова діафрагма є основним елементом конструкції, що відрізняє KLCM від інших типів мікроскопів. Голчасті діафрагми призначені для створення умов максимальної або повної фільтрації світла, що потрапляє в площину формування зображення від точок, що не збігаються з фокальною площиною або знаходяться поряд з аналізованим елементом об'єкта у фокальній площині.
Вибір оптимального діаметра голчастої діафрагми є важливим для отримання необхідних характеристик приладу. Співвідношення для оцінки латерального дозволу і глибини різкості KJICM виходять у припущенні, що голчаста діафрагма має мале отвір, будучи точкою, що світиться. Реально розмір голчастої діафрагми кінцевий і від нього залежать поперечна роздільна здатність приладу, яскравість освітлених елементів препарату, зміщених щодо фокальної площини по осі z,та глибина різкості. При малих діаметрах голчастої діафрагми світловий потік стає малим, що зменшує відношення сигнал/шум та знижує контрастність. При великих діаметрах ефективність голчастої діафрагми знижується рахунок зменшення апертури.
Основна концепція
Конфокальний принцип точка датчика з патенту Мінськ
Принцип конфокальної мікроскопії був запатентований у 1957 році Марвін Мінськ і прагне подолати деякі обмеження традиційних ширококутних мікроскопів флуоресценції. У звичайному (тобто широкого поля) флуоресцентний мікроскоп весь зразок затоплюються рівномірно світло від джерела світла. Всі частини зразка в оптичному шляху збуджуються в той же час і в результаті флуоресценції детектують за допомогою мікроскопа фотодетектора або камер, включаючи велику несфокусовану частину фону. На противагу цьому, конфокальний мікроскоп використовує точку підсвічування (див. функція розсіювання точки) і крихітний отвір в оптично сполученій площині передньої частини детектора, щоб виключити з фокусу сигналу - назва «конфокальної» походить від цієї конфігурації. Як тільки світло, що випромінюється за допомогою флуоресценції дуже близько до фокальної площини можна виявити, зображення в оптичній роздільній здатності , зокрема, у напрямку глибини зразка, набагато краще, ніж у широкого полі мікроскопів. Тим не менш, так як більша частина світла від зразка флуоресценції блокується на прокол, це підвищена роздільна здатність за рахунок зменшеної інтенсивності сигналу - так довго впливу часто потрібні. Щоб компенсувати це падіння сигналу після того, як прокол, інтенсивність світла виявляється за допомогою чутливого детектора, як правило, фотоелектронний помножувач (ФЕУ) або лавинним фотодіодом, перетворюючи світловий сигнал на електричний, який записується за допомогою комп'ютера.
Як тільки одна точка у зразку освітлена в той час, 2D або 3D зображень потрібно сканування над регулярною растра (тобто прямокутний шаблон паралельних ліній сканування) у зразку. Промінь сканують поперек зразка в горизонтальній площині за допомогою одного або більше (серво контролюється) дзеркала, що осцилюють. Цей метод сканування зазвичай має низьку реакційну затримку і швидкість сканування може змінюватися. Повільне сканування забезпечують краще відношення сигнал-шум, що призводить до кращої контрастності та більш високою роздільною здатністю.
Досяжна товщина фокальної площини визначається головним чином від довжини хвилі використовуваного світла, поділеної на числової апертури цього об'єктива, але і оптичних властивостей зразка. Тонкі оптичні секціонування можливо роблять ці типи мікроскопів особливо хороші у 3D візуалізації та профілюванні поверхні зразків.
Послідовні зрізи становлять «Z-стек», який може бути оброблений певним програмним забезпеченням для створення 3D-зображення, або він об'єднується в 2D стеку (переважно максимальна інтенсивність пікселя беруться, інші загальні методи включають використання стандартного відхилення або підсумовування пікселів).
Конфокальна мікроскопія забезпечує ємність для прямого, неінвазивного, серійного оптичного секціонування інтактних, товстих та живих особин з мінімумом підготовки проб, а також незначним покращенням у бічному дозволі. Біологічні зразки часто обробляють флуоресцентні барвники, щоб зробити вибрані об'єкти видимими. Однак фактична концентрація барвника може бути низькою, щоб звести до мінімуму порушення біологічних систем: деякі інструменти можуть відстежувати окремі флуоресцентні молекули. Крім того, трансгенні методи можуть створювати організми, які виробляють свої власні флуоресцентні молекули химерних (такі як сплав GFP, зеленого флуоресцентного білка з білком, що представляє інтерес). Конфокальні мікроскопи працюють за принципом точкового збудження у зразку (дифракції обмежено точкові) та виявлення точки флуоресцентного результуючого сигналу. Обскури на детекторі забезпечує фізичний бар'єр, який блокує поза фокусом флуоресценції. Тільки у фокусі, або центральної плями диска Ейрі, записується. Растрове сканування зразка в одній точці, в той час допускає тонкі оптичні ділянки повинні бути зібрані шляхом простої зміни Z-фокус. Отримані зображення можуть бути складені, щоб зробити 3D зображення зразка.
Методи, що використовуються для горизонтального сканування
Чотири типи конфокальних мікроскопів є комерційно доступними:
Конфокальні лазерні скануючі мікроскопи використовують декілька дзеркала (зазвичай 2 або 3 сканувань лінійно вздовж осей х і у-вісь) для сканування лазера на зразок та «descan» зображення через фіксовану обскуру та детектор.
Користь
CLSM широко використовується в багатьох біологічних наукових дисциплін, від клітинної біології та генетики в галузі мікробіології та біології розвитку. Він також використовується в квантової оптики та нано-кристалічної візуалізації та спектроскопії.
Біології та медицини
Приклад стоси конфокальної мікроскопії зображень, що показують розподіл актинових філаментів по всій клітині.
Клінічний, КЛСМ використовується при оцінці різних очних захворювань, і особливо корисно для отримання зображень, якісного аналізу та кількісної оцінки ендотеліальних клітин у рогівці. Він використовується для локалізації та ідентифікації присутності ниткоподібних елементів грибів у рогівковій стромі у випадках кератомійкози, що дозволяє швидко поставити діагноз і тим самим раннє заснування остаточної терапії. Дослідження CLSM методів для ендоскопічних процедур (ендомікроскопія) також показує обіцянку. У фармацевтичній промисловості було рекомендовано стежити за процесом виготовлення тонких фармацевтичних форм плівки, щоб контролювати якість та однорідність розподілу лікарського засобу.
Оптика та кристалографія
CLSM використовується як механізм пошуку даних у деяких оптичному зберіганні даних 3D-системах і допоміг визначити вік папірусу Магдалини.
Варіанти та удосконалення
Поліпшення осьового дозволу
Точка поширення функція точкового еліпсоїд, кілька разів до тих пір, як це широко. Це обмежує осьову роздільну здатність мікроскопа. Один з методів подолання цього 4 π мікроскопії , де світло, що падає і випромінюється або можуть заважати як зверху, так і знизу зразка, щоб зменшити обсяг еліпсоїда. Альтернативна методика конфокальної мікроскопії тета. У цій техніці конус освітлювального світла і світло, що детектується, розташоване під кутом один до одного (найкращим результатам, коли вони перпендикулярні). Перетин двох фор функцій дає набагато менший ефективний обсяг зразка. З цього еволюціонували одного літака підсвічування мікроскопа. Додатково деконволюції можуть бути використані з використанням експериментально отриманої функції розсіювання точки для видалення з фокусу світла, покращуючи контраст в обох осьових і бічних площинах.
Супер дозвіл
Є конфокальні варіанти, які досягають роздільної здатності нижче дифракційної межі, такі як стимульованої емісії збідненої мікроскопії (STED). Крім цієї техніки широке розмаїття інших методів (не конфокальної основі) супер-дозвіл доступні як пальмова, (д) ШТОРМОВА, SIM - карти, і так далі. Всі вони мають свої переваги, такі як простота використання, дозвіл та необхідність спеціального обладнання, буфера або флуорофору.
Низькотемпературний Працездатність
Для зразків зображень при низьких температурах, два основних підходи були використані як на основі лазерної скануючої конфокальної мікроскопії архітектури. Один з підходів полягає у використанні безперервного потоку кріостату: тільки зразок знаходиться при низькій температурі та її оптичною адресацією через прозоре вікно. Інший можливий підхід полягає в частині оптики (особливо об'єктивного мікроскопа) у кріогенній судині Дьюара для зберігання. Цей другий підхід, хоч і більш громіздким, гарантує кращу механічну стабільність і дозволяє уникнути втрат через вікно.
зображень
Частковий профіль поверхні монети 1-Євро, виміряний за допомогою диска Нипкова конфокальної мікроскопії.
Відображення даних для 1-монети євро.
історія
Початок: 1940-1957
Перший конфокальний скануючиймікроскоп був побудований Marvin Мінськ в 1955 і патент був подано в 1957 році сканування точки освітлення у фокальній площині було досягнуто шляхом переміщення стадії. Жодне наукове видання не було представлено, і жодні зображення, зроблені з ним не були збережені.
Тандем-скануючий мікроскоп
Схема Тандем-скануючої мікроскопії Petran в. Червоний бар додано, щоб вказати Нипкова диск.
У 1960 році чехословацький Моймір Петран медичний факультет Карлового університету в Пльзені розробила Тандем скануючий мікроскоп, перший Комерціалізований конфокальної мікроскопії. Він був проданий невеликий компанії в Чехословаччині і в Сполучених Штатах Tracor-Північної (пізніше NORAN) і використовується обертовий диск Нипкова, щоб генерувати численні збудження та емісії мікроотворів.
Патент чехословацький був поданий у 1966 році за Петраном і Міланом Hadravský, чехословацьким колегою. Перша наукова публікація з даними та зображеннями, отриманими з цим мікроскопом, була опублікована в журналі Science у 1967 році, автором якого є М. Девід Еггер з Єльського університету та Petran. У примітці до цієї статті згадується, що Petran розроблений мікроскоп і керував його будівництвом, і що він був частково «науковим співробітником» в Єльському університеті. Друге видання з 1968 року описав теорію та технічні деталі приладу і мав Hadravský і Роберт Галамбос, керівник групи в Єльському університеті, як додаткові автори. У 1970 році було видано патент США. Він був поданий у 1967 році.
1969: Перший конфокальної лазерної скануючої мікроскопії
У 1969 і 1971 роках, М. Девід Egger і Пол Davidovits з Єльського університету, опублікував дві статті, що описують перший конфокальний лазерноїскануючої мікроскопії. Це була точка сканера, тобто тільки один освітлення плями було згенеровано. Він використовується епі-освітлення-відображення мікроскопії для спостереження нервової тканини. У 5 мВт гелій-неоновий лазер з довжиною хвилі 633 нм світло відбивалося від напівпрозорого дзеркала у напрямку мети. Ціль була простий об'єктив з фокусною відстанню 8,5 мм. На відміну від усіх попередніх і пізніших систем, зразок сканували рухом цієї лінзи (мета сканування), що призводить до переміщення фокальної точки. Відбите світло повернулося до напівпрозорого дзеркала, передана частина була орієнтована іншою лінзою на точкове виявлення, за якою фотоелектронний помножувач був поміщений. Сигнал візуалізували за допомогою ЕПТ осцилографа, електронно-променевий був перенесений одночасно з метою. Спеціальний пристрій дозволив зробити Polaroid фотографії, три з яких були показані в 1971 році публікації.
Автори розмірковують про флуоресцентні барвники для досліджень у природних умовах. Вони посилаються на патент Мінського, дякую Стів Бера, в той час докторант в Альберта Ейнштейна школи медицини в Нью - Йорку , де він розробив конфокальної лінії скануючого мікроскопа, що запропонував використовувати лазер з «мікроскопом Мінська» і подякувати Галамбос, Hadravsky і Petran для дискусій, які ведуть розвитку свого мікроскопа. Мотивація їх розвитку було те, що у Tandem-сканирующей мікроскопії лише фракція 10 -7 освітлювального світла бере участь у генерації зображення у частині ока. Таким чином, якість зображення не була достатньою для більшості біологічних досліджень.
1977-1985: Точкові сканери з лазерами та сканування сцени
У 1977 році Колін JR Sheppard і Tony Wilson описав конфокальної з епі-лазера-підсвічуванням, сканування стадії та фотоелектронних помножувачів як детектори. Етап міг переміщатися вздовж оптичної осі (Z-вісь), що дозволяє оптичні серійні зрізи.
У 1979 році Фред Brakenhoff та його колеги показали, що теоретичні переваги оптичного секціонування та покращення дозволу дійсно досяжно на практиці. У 1985 році ця група стала першою публікувати переконливі знімки, зроблені на конфокальній мікроскопії, які могли відповісти на біологічні питання. Незабаром після того, як багато більше груп почали використовувати конфокальні мікроскопії, щоб відповісти на наукові питання, які досі залишилося загадкою через технологічні обмеження.
У 1983 році IJ Cox унд С. Шеппард з Оксфорда опублікував першу роботу відповідно до якого конфокальний мікроскоп, керований комп'ютером. Перший комерційний лазерний мікроскоп, що сканує, етап-сканер SOM-25 був запропонований Oxford оптоелектроніки (після декількох TAKE-кадром, придбаних BioRad), починаючи з 1982 р. Вона була заснована на конструкції групи Oxford.
Починаючи з 1985 року: Лазерна точка сканери з скануванням променя
У середині 1980-х років, Вільям Бредшоу Амоса і Джона Грема Уайта та його колег, що працюють в лабораторії молекулярної біології в Кембриджі була побудована перша конфокальної променя скануючого мікроскопа. Стадії зі зразком не рухається, замість того, щоб освітленість пляма, що дозволяє швидше отримання зображень: чотири зображення за секунду з 512 рядків кожна. Сильно перебільшені проміжні зображення, - за шляхом променя довжиною 1-2 метрів, допускається використання звичайної ірисової діафрагми як «обскура», з діаметром ~ 1 мм. Перші мікрофотографії були прийняті при тривалому впливі на плівку, перш ніж було додано цифровий фотоапарат. Подальше вдосконалення дозволило масштабування на підготовку вперше. Цейсс приблизно в той же час привели до комерційного CLSM шведської компанії Зарастро~d. Підприємство було придбано 1990 року молекулярної динаміки, але зрештою CLSM припинено. У Німеччині, Heidelberg Instruments , заснована в 1984 році, розробив КЛСМ, який спочатку означало для промислового застосування, а не біології. Цей документ було передано у 1990 році Leica Lasertechnik. Цейсс вже не-конфокальної літаючої плями лазерного скануючого мікроскопа на ринку, який був підвищений до конфокальної. У доповіді 1990 року, зазначивши, «деякі» виробник confocals списків: Sarastro, технічний інструмент, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-північного та Цейс.
У 1989 році Фріц Карл Preikschat, із сином Ekhard Preikschat, винайшов скануючий лазерний діод мікроскоп для аналізу розміру частинок. Він і Ekhard Preikschat співзасновником Lasentec комерціалізувати. У 2001 році Lasentec було придбано Mettler Toledo (NYSE: МПД). Близько десяти тисяч систем були встановлені по всьому світу, в основному у фармацевтичній промисловості для забезпечення контролю у місці процесу кристалізації у великих системах очищення.
- Двофотонне збудження мікроскопія : Незважаючи на те, що вони використовують відповідну технологію (обидва лазерні мікроскопи, що сканують), багатофотонні флуоресцентні мікроскопи не є строго конфокальними мікроскопами. Термін конфокальноївиникає з-за наявності діафрагмив кон'югованої фокальної площини(Конфокального). Ця діафрагма зазвичай відсутня у багатофотонних мікроскопах.
- Повне внутрішнє відображення флуоресцентний мікроскоп (TIRF)
конфокальної мікроскопії- Віртуальний CLSM (Java-основа)
- анімація та роз'яснення з різних типів мікроскопів, включаючи флуоресцентні та конфокальні мікроскопи . (Université Paris Sud)
Основні поняття
Хоча сучасні прилади значно відрізняються від ранніх версій, принцип конфокального отримання зображень, висунутий Марвіном Мінськ і запатентований в 1957 році, застосовується у всіх сучасних конфокальних мікроскопах. У традиційних широкопольних мікроскопах весь зразок повністю висвітлюється ртутним або ксеноновим джерелом світла, а зображення спостерігається візуально, або проектується на пристрій реєстрації зображення або фотоплівку. Метод формування зображення конфокальним мікроскопом принципово інший. Освітлення здійснюється скануванням усієї поверхні зразка одним або більше сфокусованим променем світла, зазвичай від лазерного дугового джерела. Висвітлена область зразка фокусується об'єктивом і потім сканується за допомогою скануючого пристрою з керуванням через комп'ютер. Послідовність світлових променів від зразка розпізнається через точкову діафрагму (або, в деяких випадках, щілинну діафрагму) фотоелектронним помножувачем (ФЕУ), вихідні сигнали якого перетворюються на зображення, що відображається на комп'ютері. Хоча незабарвлені зразки можна спостерігати за допомогою відбитого від них світла, їх зазвичай відзначають однією або більше флуоресцентними барвниками.
Способи отримання зображення
При конфокальної мікроскопії на дослідження величезної кількості зразків різного типу застосовуються різні способи отримання зображення. Всі вони ґрунтуються на технічній можливості отримання зображень високої чіткості, званих оптичними зрізами, у послідовності щодо товстих зрізів або всього зразка цілком (тотального препарату). Оптичний зріз є основним елементом зображення. Самі зображення виходять при спостереженні пов'язаних і забарвлених зразків в режимах одно-, дво-, три- та багатохвильового освітлення, при цьому зображення, що формуються за допомогою різних методик освітлення та фарбування, точно співвіднесені між собою. Можливе отримання зображень живої клітини та розгорнутої у часі послідовності зображень (реєстрація зображень у заданий часовий інтервал), а чисельні методи обробки, що застосовуються до послідовностей зображень, дозволяють створити інтегроване ціле зображення із серії зображень по осі z та тривимірні зображення зразків. тривимірних даних у часовій послідовності, тобто чотиривимірне зображення. У перших конфокальних мікроскопах зображення виходили за допомогою відбитого світла, але, насправді, в лазерному конфокальному сканувальному мікроскопі може бути застосований спосіб отримання зображення за допомогою будь-якого джерела проходить світла, зазвичай використовується в мікроскопії.
Створення зображення
Процедури підготовки зразка та отримання його зображення за допомогою конфокальних мікроскопів - це, в основному, ті, які були розроблені протягом багатьох років у традиційній широкопольній мікроскопії. У біомедицини головним додатком конфокальної мікроскопії є отримання зображення пов'язаних або живих клітин та тканин, які зазвичай забарвлюються однією або більше флуоресцентними мітками. Існує велика кількість різних флуоресцентних барвників, які можуть бути занесені у відносно прості протоколи та використовуватися для фарбування певних клітинних органел та структур. Серед величезної кількості доступних барвників є, наприклад, барвники ядра, апарату Гольджі, ендоплазматичного ретикулуму, мітохондрій, а також такі барвники, як флуоресцентний фалоїдин, що вказує на полімеризований актин у клітинах. Незалежно від застосовуваного способу підготовки зразка, головна перевага конфокальної мікроскопії полягає в гнучкості способів подання та аналізу зображення, що є наслідком одночасного збирання множинних зображень та їх подання в комп'ютері у цифровій формі.
Критичні аспекти конфокальної мікроскопії
Отримання кількісних тривимірних зображень у флуоресцентній мікроскопії часто ускладнене артефактами, що виникають при підготовці зразка, завдяки контрольованим та неконтрольованим експериментальним величинам або проблемам розташування та компонування мікроскопа. Ця стаття, написана доктором Джеймсом Б. Полі, систематизує найбільш загальні зовнішні чинники, які часто «затуляють» результати, отримані у широкопольній флуоресцентній та конфокальній мікроскопії. Серед обговорюваних тем - лазерна система, юстування оптичних компонентів, збільшення об'єктивів, артефакти, пов'язані з знебарвленням, аберації, імерсійне масло, товщина покривного скла, квантовий вихід (квантова ефективність) та середовище зразка.
Аберації в багатобарвній конфокальній мікроскопії
Удосконалення конструкції спростили конфокальну мікроскопію настільки, що вона стала звичайним інструментом проведення досліджень у клітинній біології. Але оскільки конфокальні мікроскопи стали потужнішими, стали пред'являтися вищі вимоги до їх оптики. Насправді оптичні аберації, що викликають незначні дефекти зображення в широкопольній мікроскопії, можуть призвести до руйнівних наслідків у конфокальній мікроскопії. На жаль, суворі оптичні вимоги в конфокальній мікроскопії часто приховані через оптичні системи, що гарантують чітке зображення навіть у разі слабкого мікроскопа. Виробники оптики випускають багато різних об'єктивів для мікроскопів, призначених для певних додатків. У цій статті показується, який компромісні рішення при створенні об'єктивів впливають на конфокальну мікроскопію.
Триколірна візуалізація у конфокальній мікроскопії
Лазерний скануючий конфокальний мікроскоп (ЛСКМ) зазвичай використовується для отримання цифрових зображень флуоресцентних зразків, позначених однією, двома та трьома мітками. Використання червоного, зеленого і синього (RGB) кольорів найбільш інформативно для представлення розподілу світла до трьох флуоресціюючих міток клітини, коли для кожного взаємного розташування використовується додатковий колір і коли різного кольору зображення утворюють єдину триколірну картину. У цьому розділі ми розглянемо спрощену версію нещодавно опублікованого методу отримання кольорових конфокальних зображень за допомогою популярної програми обробки зображень, Adobe Photoshop. На додаток, обговорюються кілька програм зі створення протоколу триколірного зображення для представлення конфокальних знімків. Варто мати на увазі, що ці чисельні методи не обмежуються зображеннями, отриманими ЛСКМ, і можуть застосовуватись до цифрових зображень, імпортованих у Photoshop з інших джерел.
Основи конфокальної відбивної мікроскопії
Конфокальна відбивна мікроскопія може застосовуватися для отримання додаткової інформації про зразок з відносно незначними додатковими зусиллями, оскільки методики вимагають мінімальної підготовки зразка та переналаштування обладнання. До того ж, у конфокальній відбивній мікроскопії інформація про незабарвлені тканини також легко доступна, як і дані, що отримуються при роботі з пофарбованими зразками, що відображають світло. Цей метод можна комбінувати з більш поширеними методами досліджень у світлі флуоресценції. Прикладами недавніх додатків є реєстрація незабарвлених клітин у популяції флуоресцентно забарвлених клітин та спостереження взаємодій між флуоресцентно забарвленими клітинами, що ростуть на непрозорому структурованому субстраті.
Галерея конфокальних зображень
Галерея конфокальних знімків Nikon MicroscopyU є послідовністю цифрових зображень, отриманих з використанням конфокального мікроскопа Nikon PCM-2000, об'єднаного з прямим мікроскопом Eclipse E-600. Послідовність зображень оптичних зрізів різних площинах зразка була отримана при скануванні вздовж оптичної осі мікроскопа. Послідовність представлена інтерактивним Java - додатком, що дозволяє або програвати серію зрізів автоматично, або прокручувати їх вперед і назад, як слайди.
Лазерна скануюча конфокальна мікроскопія
Було розроблено кілька методів для подолання явища поганого розмаїття, властивого зображенням зразків з великою товщиною, що зазвичай створюється мікроскопами. Конфокальна і деконволюційна методики створюють значно кращі зображення зразків середньої товщини (від 5 до 15 мікрон). Зображення зразків із найбільшою товщиною (від 20 мікрон і більше) погіршуються через вплив великого потоку зовнішнього світла від позафокусних областей і, можливо, найкраще виходять методами конфокальної мікроскопії. За допомогою цього навчального посібника зразки представлені серіями оптичних зрізів уздовж осі z за допомогою віртуального конфокального мікроскопа.
Відбивна конфокальна мікроскопія
За допомогою цього навчального посібника можна дослідити окремі шари поверхні інтегральних мікросхем. Цифрові зображення для посібника були отримані за допомогою відбивного конфокального мікроскопа Nikon Optiphot C200. Для кожної серії була записана послідовність оптичних зрізів по осі z, у міру проникнення та фокусування мікроскопа вглиб (з кроком 1 мікрометр) мозаїки схем на поверхні кремнієвого кристала.
Основні положення
Порівняно з традиційною, конфокальна мікроскопія має кілька переваг, включаючи малу глибину проникнення досліджуваний зразок, відсутність фонових засвіток та можливість отримувати серії оптичних зрізів зразків великої товщини. У біомедицини головним додатком конфокальної мікроскопії є отримання зображення пов'язаних або живих клітин та тканин, які зазвичай відзначені однією або більше флуоресцентними мітками.
Мал. 1. Схема перебігу променів у конфокальній мікроскопії
При отриманні зображень флуоресціюючих зразків за допомогою традиційного мікроскопа вторинне свічення, що випускається зразком з областей поза дослідженням, часто впливає на чіткість зображення деталей, що знаходяться у фокусі. Це особливо проблематично при товщині зразків понад 2 мікрометри. Конфокальна мікроскопія дає незначне покращення роздільної здатності як уздовж осі, так і по площині; Однак саме можливість виключити фонові засвічення, що виникають у флуоресцентно-забарвлених зразках великої товщини, викликала нещодавній сплеск популярності цього способу дослідження. Будучи відносно простими в управлінні, більшість сучасних конфокальних мікроскопів, стали частиною базового обладнання в багатьох розрахованих на багато користувачів системах по роботі з зображеннями. Оскільки дозвіл, що досягається лазерним скануючим конфокальним мікроскопом (ЛСКМ) трохи краще традиційного широкопольного оптичного мікроскопа, але все ж значно нижче дозволу електронного мікроскопа, що просвічує (трансмісійного), він, у певному сенсі, з'явився мостом між двома найбільш поширеними методами досліджень. На малюнку 1 представлена принципова схема проходження світла конфокальном мікроскопі базової компоновки.
У традиційних широкопольних мікроскопах весь зразок повністю висвітлюється ртутним або ксеноновим джерелом світла, а зображення або візуально спостерігається, або проектується на пристрій візуалізації зображення або фотоплівку. Метод отримання зображення конфокальним мікроскопом принципово інший. Висвітлення зразка здійснюється скануванням його одним або більше сфокусованим променем, зазвичай лазерним (рисунок 2). Таким чином, зображення, що отримуються скануванням зразка, називаються оптичними зрізами. Ця термінологія відноситься до неінвазивного методу досліджень, коли зображення виходять за допомогою сфокусованого світла, а не фізичним розсіченням зразка.
Мал. 2. Широкопільне та точкове сканування зразків
Конфокальна мікроскопія значно спростила дослідження живих зразків, уможливила отримання даних у трьох вимірах (z-серія) і більш досконалим процес отримання зображень мультизабарвлених зразків. На малюнку 3 порівнюється традиційне зображення, отримане при дослідженні у світлі флуоресценції з епіскопічним освітлювачем з конфокальним зображенням, тих самих ділянок тотального препарату лялечки метелика з епітелієм, забарвленим іодидом пропідію. Очевидно вражаюче підвищення роздільної здатності і, як наслідок, різкості зображення ядер на знімку ЛСКМ завдяки виключенню позафокусного флуоресцентного світіння.
Лазерний скануючий конфокальний мікроскоп (ЛСКМ)
ЛСКМ - нині найпоширеніша версія конфокальних мікроскопів, що застосовуються в біомедичні. У введенні особлива увага приділяється саме ЛСКМ, оскільки конструкція і пристрій цих мікроскопів дозволяє працювати з ними навіть користувачам-початківцям. Інші конструктивні рішення зайняли свої спеціальні ніші у біології. Для будь-якої моделі Або модифікації конфокального мікроскопа застосовується, з незначними змінами, більшість правил підготовки зразків, також як і для інших методик, заснованих на оптичних зрізах, таких як деконволюційна та багатофотонна методика.
Розвиток конфокальної мікроскопії
Вважається, що винахід конфокального мікроскопа належить Марвіну Мінську, який створив робочий мікроскоп у 1955 році. Розвиток конфокальної мікроскопії було багато в чому викликане бажанням спостерігати біологічні процеси в живій тканині (in vivo) (в організмі), і Мінськ ставив за мету отримати зображення нейронної мережі в незабарвленому препараті живого мозку. Принципи конфокальної мікроскопії, висунуті Мінськ і запатентовані 1957 року, застосовуються у всіх сучасних конфокальних мікроскопах. На малюнку 1 пояснюється конфокальний принцип у застосуванні до епіфлуоресцентної мікроскопії, покладений в основу всіх сучасних конфокальних систем, що використовуються при отриманні флуоресцентних зображень. У початковій конфігурації Мінськ використовував точковий отвір (діафрагму), поміщену навпроти цирконієвого дугового джерела світла, що використовується як точкове джерело світла.
Мал. 3. Епітелій крила метелика
Світло від точкового джерела фокусувався у вигляді точки об'єктивом на заданій фокальній площині у зразку і, проходячи через нього, фокусувався другим об'єктивом на другій точковій діафрагмі (точковому отворі), що знаходиться у фокусі з першою (вони були софокусними). Промені, що проходять через другий точковий отвір, потрапляли на фотоумножитель з низьким рівнем шуму, що генерує сигнал залежно від яскравості світла, що походить від зразка. Другий точковий отвір відсікав від фотопомножувача світло, що йде з областей вище або нижче фокальної площини у зразку. Використання просторової фільтрації для виключення позафокусного світла та засвіток під час роботи зі зразками товщі фокальної площини є ключовим принципом конфокальної мікроскопії. У своїх роботах Мінськ також описував відбивний мікроскоп з одним об'єктивом і дихроматичним дзеркалом, конструкція якого стала основою систем, що використовуються зараз.
Щоб отримати зображення конфокальним методом, необхідно виконати сканування зразка сфокусованим на точку світлом. В оригінальному приладі, зібраному Мінська, промінь світла був нерухомий, а сам зразок рухався на предметному столику, що вібрує. Нерухомість скануючого променя щодо оптичної осі мікроскопа була перевагою цієї установки, оскільки це дозволяла виключити більшість дефектів оптики, які б спотворити зображення. Однак, при дослідженні біологічних зразків це могло викликати коливання та дисторсію, зрештою, призводило до втрати роздільної здатності та чіткості зображення. Більше того, при переміщенні предметного столика та зразка, неможливо виконати жодних маніпуляцій, таких як, наприклад, мікроін'єкції флуоресцентно забарвлених клітин.
Але незалежно від способу сканування зразка необхідно отримати його зображення. А початкова схема Мінська не створювала дійсного зображення, тому що вихідний сигнал фотопомножувача подавався на осцилограф, який використовувався в збройних силах з тривалим післясвіченням, що не має записуючого пристрою. Пізніше Мінськ писав, що не надто вражаюча якість його зображення було наслідком не низької роздільної здатності самого мікроскопа, але дисплея осцилографа. Зараз зрозуміло, що через відсутність технологій Мінська не могла повною мірою продемонструвати весь потенціал конфокального методу, особливо при візуалізації біологічних структур. Він вказував, що можливо саме це стало причиною того, що конфокальна мікроскопія не відразу була сприйнята дуже вимогливим співтовариством біологів, для яких завжди була пріоритетна якість одержуваних зображень. У той час у їхньому розпорядженні були світлові мікроскопи з чудовою оптикою, що дозволяють спостерігати та фотографувати кольорові яскраво-фарбовані гістологічні зрізи на високочутливу кольорову плівку. У сучасних конфокальних мікроскопах зображення формується з сигналів, що надходять з фотопомножувача або вловлюваних цифровою камерою з вбудованим приладом із зарядовим зв'язком, безпосередньо обробляється комп'ютерною системою роботи із зображеннями, виводиться на екран з високою роздільною здатністю та пристрій документування зображень чудової якості. Схема сучасного лазерного скануючого конфокального мікроскопа наведено малюнку 4.
Мал. 4. Схема сучасного лазерного скануючого конфокального мікроскопа
Базова оптика оптичного мікроскопа принципово не змінювалася протягом десятиліть, оскільки кінцева роздільна здатність приладу визначається довжиною хвилі, об'єктивом і властивостями самого зразка. Барвники, що використовуються для посилення розмаїття зразків, та інші методи оптичної мікроскопії значно покращилися за останні 20 років. Підйом та вдосконалення конфокального методу з'явилися наслідком відродження оптичної мікроскопії, викликаного, багато в чому, успіхами сучасних технологій. Багато технологічних досягнень, які могли б бути корисними в конструкції Мінська, поступово стають доступними (у тому числі й за ціною) для біологів та інших мікроскопістів. Серед них, стабільні багаточастотні лазери, що використовуються як покращені точкові джерела світла, удосконалені дихроматичні дзеркала, чутливі малошумливі фотоприймачі, швидкодіючі мікрокомп'ютери з посиленими можливостями (завдяки доступності пам'яті з великою ємністю), складне програмне забезпечення для роботи із зображеннями, монітори з високим цифрові принтери.Ці технології розвивалися незалежно, і з 1955 року поступово вбудовувалися у конфокальні системи візуалізації. Наприклад, методи обробки цифрового зображення вперше були успішно використані на початку 80-х дослідниками океанографічного інституту Вудз Хоул (Woods Hole Oceanographic Institute). Використовуючи, в їх термінології, «відео-мікроскопи», вони змогли отримати зображення клітинної структури мікротрубок, розміром менше теоретичної межі роздільної здатності оптичного мікроскопа. Очевидне зростання роздільної здатності стало можливим завдяки цифровій оптимізації зображень, що захоплюються високочутливою суперкремніконовою (SIT) відеокамерою, з'єднаною з цифровим процесором зображень. Клітинні структури були візуалізовані за допомогою оптики, що працює на диференціальному інтерференційному контрасті (ДІК), та подальшої обробки зображень цифровими методами.
Класифікація конструкцій конфокальних мікроскопів зазвичай ґрунтується на методі сканування зразка. Існує два основні способи сканування: сканування предметного столика та сканування освітлювального променя; і принаймні два способи сканування променя. В основу початкового приладу Мінська була покладена система сканування предметного столика, що рухається примітивним камертонним генератором, яка створювала зображення досить повільно. Сучасні конфокальні установки зі скануванням предметного столика, що пішли далеко вперед від своїх прототипів, використовуються в основному в матеріалознавстві, наприклад, у виробництві мікрокристалів. Системи, засновані на цьому принципі, стали останнім часом популярними в областях біомедицини, де проводиться аналіз ДНК на мікрокристалах.
Більш практичною альтернативою формування зображень біологічних систем є сканування стаціонарного зразка променем. Цей принцип є основою багатьох вимірювальних систем, удосконалення яких призвело до появи популярних сьогодні дослідницьких мікроскопів. У цьому введенні ми не торкаємося технічних деталей конфокальної мікроскопії, але, по суті, в ній використовуються два принципово відмінні методи сканування променя: багатопроменеве сканування та однопроменеве сканування. Однопроменеве сканування на сьогодні найбільш поширене, і саме цей метод застосовується у ЛСКМ. Тут сканування променя проводиться за допомогою керованих комп'ютером дзеркал, які рухаються гальванометрами зі швидкістю один кадр в секунду. Для досягнення більш швидкого сканування, приблизно з частотою відео кадрів, в деяких системах застосовується акустооптичний пристрій або дзеркала, що коливаються. В альтернативному методі використовують два промені для сканування майже в реальному часі, при цьому зазвичай застосовується різновид обертового диска Нипкова. Ці системи стали результатом модифікації та доведення спарених (тандемних) скануючих мікроскопів (TSM), з метою створення ефективніших моделей для створення зображень флуоресцентно-забарвлених зразків. На малюнку 5 показана така вдосконалена система зі спареними дисками Нипкова та мікролінзами для підвищення чутливості до слабкого флуоресцентного світіння при створенні зображення в реальному часі.
Мал. 5. Оптична схема на основі дисків Нипкова
На сьогоднішній день у конфокальній мікроскопії існують два альтернативні методи отримання оптичних зрізів: метод деконволюції та багатофотонний. Вони різняться технічно, але, як і конфокальні способи, ґрунтуються на традиційній оптичній мікроскопії. Деконволюція заснована на обчислювальних алгоритмах розрахунку та видалення тієї інформації, яка надходить під час створення зображення з позафокусних областей. Ця методика стала дуже зручною завдяки ефективним алгоритмам та високопродуктивним мінікомп'ютерам. Багатофотонна мікроскопія використовує ту ж скануючу систему, що і ЛСКМ, але не вимагає наявності точкової діафрагми в приймачі. У ній немає необхідності, оскільки лазер збуджує флуорохромну мітку тільки в точці фокусу, виключаючи тим самим позафокусне випромінювання. При спостереженні живих тканин цього способу з'являються додаткові переваги, а саме: зниження фотознебарвлення, оскільки зменшується кількість енергії, що передається лазерним променем і поглинається тканинами зразка.
Традиційний оптичний мікроскоп є основою, де будується ЛСКМ. Замість вольфрамової або ртутної лампи застосовується лазер, який пов'язаний з чутливим фотопомножувачем (ФЕУ) та комп'ютером, що управляє скануючими дзеркалами та іншими скануючими пристроями, а також полегшує збирання та представлення зображень. Отримані дані зберігаються на цифрових носіях і можуть бути оброблені за допомогою численних пакетів програм, або комп'ютера самої системи, або на якомусь іншому.
За конструкцією ЛСКМ, освітлення та прийом (реєстрація) сигналу обмежуються точкою на зразку з дифракційною межею. Об'єктиви мікроскопа зводять пляму освітлення у фокус, і скануючий пристрій виконує сканування зразка цією плямою під керуванням комп'ютера. Сигнали від точок зразка, що світяться, потрапляють у фотопомножувач через точкову (або, в деяких випадках, щілинну) діафрагму, а вихідні сигнали ФЕУ формуються в зображення і візуально відтворюються комп'ютером. Хоча незабарвлені зразки можна спостерігати у відбитому від зразка світлі, зазвичай вони фарбуються однією або більше флуоресцентними барвниками. Один з найпоширеніших ЛСКМ, описаний у літературі приблизно 1990 року, було розроблено у відповідь фундаментальну проблему, з якою зіткнулися біології-дослідники. Багато структур та окремі макромолекули всередині імунофлуоресцентно забарвлених зародків неможливо візуалізувати традиційним епіфлуоресцентним мікроскопом після двоклітинної стадії, оскільки при зростанні числа клітин обсяг ембріона залишається приблизно таким же. Це означає, що при більш щільному розташуванні клітин посилюється свічення від клітин поза фокальною площиною, що призводить до погіршення роздільної здатності зображення.
Мал. 6. Конфігурація лазерного скануючого конфокального мікроскопа Nikon
Група дослідників, які працюють над цією проблемою, виявила, що жодна з доступних на той час конфокальних систем не відповідає їхнім вимогам. На той час мікроскопи зі скануванням предметного столика працювали надто повільно. На створення одного зображення витрачалося приблизно 10 секунд, а прилади з багатопроменевим скануванням ще не підходили для флуоресцентної візуалізації з практичної точки зору. ЛСКМ був розроблений таким чином, щоб задовольняти вимоги традиційної епіфлуоресцентної мікроскопії і, поряд з іншими, що розробляються в той же час, став прообразом складних систем, які зараз пропонують біомедичному співтовариству різними фірмами. Приклад застосовуваної сьогодні системи (Nikon E1000) наведено малюнку 6.
У спеціально розроблених приладах товщина оптичних зрізів може змінюватись із зміною діаметра точкового отвору перед фотоприймачем. У порівнянні з іншими конструкціями з фіксованим розміром точкового отвору, ця додаткова функція виявляється надзвичайно гнучкою при візуалізації біологічних структур. Зображення може бути збільшено без втрати дозволу за рахунок скорочення сканованої площі зразка і приміщення відсканованої інформації в масив даних того ж розміру для зберігання та візуального подання (подібним чином змінюється збільшення і в електронному електронному мікроскопі). Завдяки цьому в одного об'єктива з'являється інтервал зміни масштабу, що може бути надзвичайно корисним під час візуалізації рідкісних або швидкоплинних подій, які можуть бути пропущені або втрачені при зміні об'єктива.
Завдяки детально опрацьованим і гнучким можливостям ЛСКМ, пропонованих зараз комерційними фірмами за прийнятними цінами, в останні роки стався вибух популярності конфокальної мікроскопії, коли багато розрахованих на багато користувачів лабораторії воліють це обладнання електронним мікроскопам. Перевагою конфокальної мікроскопії є відносна легкість, з якою можуть бути отримані високоякісні зображення зразків, приготованих для традиційної оптичної мікроскопії, і велика кількість додатків у різних галузях досліджень.
Перше покоління ЛСКМ добре працювало із зафіксованими зразками, але їм не вдавалося контролювати світлову енергію лазерів, що надто часто призводило до фатального руйнування живого зразка, якщо не вживали серйозних запобіжних заходів. Незважаючи на ці обмеження зображення зафіксованих зразків були настільки якісними, що конфокальний підхід був беззастережно прийнятий фахівцями. У приладах наступних поколінь було вдосконалено кожен аспект процесу візуалізації. На додаток до цього, нові прилади стали значно ергономічнішими та зручнішими в роботі, так що юстирування, зміна комбінації фільтрів, регулювання потужності лазера, що виробляються за допомогою комп'ютера, стали набагато легшими та швидшими. Тепер можна знімати зображення з трьома флуорохромами одночасно, а послідовно - з ще більшим числом. Завдяки вдосконаленому і більш надійному програмному забезпеченню, підвищенню швидкодії комп'ютерів, збільшенню ємності дисків і падінню цін на оперативні пристрої, процес обробки зображення теж значно просунувся вперед.
Режими формування зображення
Основним застосуванням конфокального мікроскопа є отримання зображень зразків товстих різного типу. Перевага конфокального методу випливає з можливості створювати зображення зразка як послідовність окремих оптичних зрізів високої чіткості та роздільної здатності. У цьому використовується кілька режимів візуалізації; основу кожного лежить оптичний зріз, як базова одиниця зображення.
Мал. 1. Оптичні зрізи, мічені трьома мітками
Окремі оптичні зрізи
Оптичний зріз є базовою одиницею зображення методах конфокальної мікроскопії. Можуть бути отримані зображення пов'язаних і забарвлених зразків у режимі одно-, дво-, три- та багатохвильового освітлення, при цьому зображення мультизабарвлених зразків будуть поєднані один з одним (якщо використовуються об'єктиви з адекватною корекцією хроматичної аберації). Додаткове суміщення зазвичай здійснюється методами цифрової обробки зображення. Більшості лазерних скануючих конфокальних мікроскопів (ЛСКМ) потрібно приблизно 1 секунда отримання оптичного зрізу, хоча, зазвичай, зображення кількох оптичних зрізів усереднюються поліпшення відношення сигнал - шум. Час отримання зображення, звичайно, залежить від розмірів зображення в пікселях та швидкодії комп'ютера системи. Для зберігання типового 8-бітного зображення розміром 768×512 пікселів потрібно близько 0.3 Мбіт пам'яті.
Оптичні зрізи, представлені на малюнку 1, отримані одночасно при опроміненні збуджуючим світлом трьох різних довжин хвиль (488, 568 і 647 нанометрів) при використанні одного криптонового / аргонового лазера в якості джерела випромінювання. Як зразок представлений імагінальний диск крила дрозофіли на третій віковій стадії, в якому позначені три гени, що беруть участь у формуванні крила. Три представлені гени та відповідні флуорохромні мітки такі: (a) рудиментарний (флюоресцеїн - 496 нанометрів); (b) безкрилий (лісамін родамін - 572 нанометрів); і © CiD (ціанін 5 - 649 нанометрів). Комбіноване зображення трьох просторово представлених доменів генів, що формують крило, розташовується внизу праворуч (зображення (d)).
Зйомка в заданий часовий інтервал та візуалізація живої клітини
Дослідження живих клітин у заданий часовий інтервал набуло нового імпульсу завдяки підвищенню роздільної здатності ЛСКМ. Раніше дослідження рухів клітинних структур проводилися з використанням 16-міліметрової фотоплівки та інтервалометром з годинниковим механізмом, з'єднаним з фотокамерою, пізніше за допомогою відеомагнітофона з функцією цейтраферної зйомки, оптичного пристрою запису на диск або оцифровування платою відеозображень. Зараз за допомогою ЛСКМ можна одержувати оптичні зрізи через певні, попередньо задані інтервали в режимі реального часу.
Візуалізація живих тканин за допомогою ЛСКМ набагато складніша, ніж отримання зображення пов'язаних зразків, і не завжди можлива практично, оскільки зразок може не витримати умов спостереження. У таблиці 1 наведено деякі фактори, які необхідно враховувати при спостереженні живих та пов'язаних клітин за допомогою ЛСКМ. Деякі зразки просто фізично неможливо помістити на предметний столик мікроскопа, або вони не зможуть залишатися живими на ньому протягом усього періоду спостереження. Досліджуване явище чи структура можуть потрапляти у зору об'єктива. Наприклад, імагінальні диски крила дрозофіли розвиваються надто глибоко в личинці, тому їх неможливо спостерігати; а після препарування вони не можуть розвиватися в культурі. Тому сьогодні єдиний доступний метод спостерігати експресію генів у тканинах такого типу – розсікти личинку, зв'язати та пофарбувати імагінальні диски, взяті зі зразків на різних стадіях розвитку.
Табл. 1. Спостереження пов'язаних та живих клітин за допомогою ЛСКМ
Успішне спостереження та створення зображень живих клітин потребує надзвичайної обережності протягом усього процесу. Обов'язковою умовою є підтримка прийнятних умов на предметному столику мікроскопа. Пошкодження, що завдаються клітині при опроміненні лазерним променем, можуть накопичуватися при багаторазовому скануванні, тому цей вплив повинен бути зведений до мінімуму, необхідного та достатнього для отримання зображення. У культуральне середовище зазвичай додаються антиоксиданти, наприклад аскорбінова кислота, для скорочення кисню, що виділяється при опроміненні флуоресцентних молекул світлом збудження, і сприяє утворенню вільних радикалів, що вбивають клітини. Зазвичай необхідно проводити всебічні попередні контрольні досліди для оцінки впливу опромінення на флуоресцентно забарвлені клітини, уважно стежачи за відповідністю всіх параметрів зображення спостереженню, що проводиться. Після пробними зображеннями необхідно оцінити життєздатність живих зразків. Ембріони, наприклад, повинні продовжувати свій нормальний розвиток протягом всього процесу спостереження, тому необхідно виявляти будь-які аномалії, спричинені впливом опромінення або флуорохромами. На малюнку 2 представлена зйомка заданий часовий інтервал ембріона дрозофіли, флуоресцентно забарвленого зеленим кальцієм. Серія знімків показує зміну розподілу флуоресцентного світіння у часі.
Кожен тип клітин вимагає своїх заходів для підтримки їхньої життєздатності в процесі спостереження. Для деяких клітин комах достатньо підтримки кімнатної температури та наявності достатньо великого обсягу відповідного середовища. Однак більшість типів клітин вимагають підігріву предметного столика і, іноді, перфузійної камери для підтримки необхідного балансу вуглекислоти протягом їх перебування на предметному столику. Вибір типу клітин, котрим умови спостереження з допомогою ЛСКМ найменш «ворожі», допоможе уникнути багатьох експериментальних проблем. Удосконалення сучасних конфокальних приладів призвели до суттєвого скорочення потенційних проблем. Підвищена квантова ефективність, велика числова апертура (яскравість) об'єктивів та використання менш токсичних барвників для клітин призвели до того, що конфокальна мікроскопія стала практичним методом аналізу живих клітин. Необхідно прагнути до використання лазерів меншої потужності, що дозволяють, водночас, виконувати реєстрацію та обробку зображень якнайшвидше. Якщо для прискорення збору та реєстрації зображень збільшується апертура точкової діафрагми (порівняно зі спостереженням неживих зразків), то наступна деконволюція може іноді відновити втрачену якість знімка.
Мал. 2. Зйомка в заданий часовий інтервал
Багато фізіологічних процесів та подій протікають занадто швидко, і тому не можуть бути захоплені більшістю ЛСКМ, швидкість візуалізації яких у середньому один знімок на секунду. ЛСКМ, що використовують акустооптичні пристрої та щілинні діафрагми, що швидше збуджуються гальванометром точкових скануючих систем і більш практичні для фізіологічних досліджень. Ці більш швидкі установки з'єднують гарну просторову та тимчасову роздільну здатність, яка може досягати 30 кадрів в секунду при повноекранній роздільній здатності, або бути близьким до швидкості відео. У більш повільних мікроскопах, зі скануванням через точковий отвір, тимчасова роздільна здатність може бути збільшена тільки за рахунок зменшення області сканування зразка. Якщо потрібна повна просторова роздільна здатність, частота кадрів повинна бути зменшена, що веде до втрати тимчасової роздільної здатності. Конфокальні системи, в яких застосовуються сканування диском або дзеркалом, що коливається, також здатні візуалізувати швидкі фізіологічні процеси або інші швидкоплинні події.
Z-серія та тривимірні зображення
Z-серія - це послідовність оптичних зрізів зразка, виконаних різних рівнях у площині, перпендикулярної оптичної осі (z-вісь). Z-серії зображень виходять шляхом узгодження покрокових змін тонкої фокусування мікроскопа з подальшим отриманням зображення на кожному кроці. Покрокове переміщення фокусу зазвичай виконується кроковим двигуном під керуванням комп'ютера, який змінює фокус на задану величину. За допомогою макропрограми комп'ютера можна отримати та зберегти зображення, перефокусувати мікроскоп на задану глибину у зразку, отримати та зберегти друге зображення, знову провести рефокусування в новій площині тощо, доки не буде отримано запрограмоване число зображень.
Потрібні зображення можуть бути взяті з z-серії, отриманої під час зйомки обраної області зразка і оброблені спеціальною програмою для подальшого детального дослідження певних клітин, що становлять інтерес. Z-серія може бути представлена як фотомонтаж зображень, як, наприклад, на малюнку 3. Цей тип комбінації та відображення зображень, а також багато інших операцій із зображеннями входить у стандартний набір властивостей сучасних пакетів програмного забезпечення по роботі з зображеннями. Знімки на малюнку 3 є вибіркою з більшої серії з більш частим кроком по осі z. Зелене свічення визначає периферійну нервову систему ембріона дрозофіли, пофарбованого антитілом 22C10.
Мал. 3. Z-серія оптичних зрізів
По серіям із кількох сотень оптичних зрізів зразка, вироблених ЛСКМ, може бути складно уявити усьому комплексі взаємозалежних структур. Проте z-серія, після реєстрації, є ідеальним матеріалом для подальшого тривимірного представлення зразка за допомогою методик об'ємної візуалізації. Цей підхід зараз повсюдно використовується для прояснення відношення між структурою та функцією тканин у медицині та біології. Важливо задати правильний крок z-сканування зразка, що визначається кроком двигуна, що змінює фокус; у цьому випадку знімок відображатиме дійсну глибину зразка.
Доки зразок залишається нерухомим при його спостереженні, знімки z-серії, виробленої ЛСКМ, будуть чудово зареєстровані, а збережені в цифровому форматі, вони будуть відносно легко перетворені на тривимірне подання зразка. На малюнку 4 порівнюється окремий оптичний зріз (a) з проекцією z-серії (b) та ілюструється цінність цієї методики при візуалізації периферійної нервової системи ембріона дрозофіли, міченого антитілом 22C10.
Крок крокового двигуна, що встановлюється оператором мікроскопа, пов'язаний із товщиною оптичного зрізу, але може мати інше значення. Товщина оптичного зрізу прив'язана до товщини зрізу зразка, що спостерігається в мікроскоп, і залежить від об'єктива та діаметра точкової діафрагми. У деяких випадках, проте, крок фокусу може збігатися з товщиною оптичного зрізу, і це може призводити до плутанини.
Слідом за отриманням файлу z-серії його відправляють на обробку програмою тривимірної реконструкції, спеціально розроблену для обробки конфокальних зображень. Такі програми мають надзвичайну швидкодію при використанні на графічних станціях, але можуть бути успішно використані і на персональному комп'ютері або графічній станції самого конфокального мікроскопа, при досить швидкому процесорі та наявності великої оперативної пам'яті. За допомогою цих програм можна створювати як окремі тривимірні уявлення зразка, так і послідовність уявлень, що змінюють один одного, складених за різними видами зразка, що справляє ефект обертання або інших просторових трансформацій та дає краще сприйняття тривимірних властивостей зразка. Програма дозволяє варіювати довжину, глибину, проводити об'ємні вимірювання, а також інтерактивно змінювати спеціальні параметри зображення, такі як прозорість зразка для виділення різних структур у різних рівнях зразка.
Мал. 4. Оптичний зріз та проекція z-серії
Інший спосіб представлення серії оптичних зрізів, взятих з послідовності знімків, отриманих у заданий часовий інтервал - це тривимірне уявлення, в якому вісь z має функцію тимчасової осі. Цей підхід корисний при візуалізації фізіологічних змін у розвитку організму. Прикладом застосування цього методу було прояснення динаміки зміни концентрації кальцію у розвитку ембріонів морського їжака. Колірне кодування оптичних зрізів, взятих на різній глибині, - простий спосіб подання тривимірних даних. На практиці колір (зазвичай червоний, зелений або синій) приписується кожному оптичному зрізу, отриманому на різній глибині зразка, а потім кольорові зображення об'єднуються, і за рахунок зміни кольорів за допомогою програми обробки зображень досягається бажаний ефект.
Отримання чотиривимірних зображень
За допомогою ЛКСМ, динамічні явища, що виявляються в живих тканинах або в процесі підготовки живих тканинних культур і відображені в послідовності знімків, отриманих в заданий часовий інтервал, можуть бути представлені у чотиривимірному вигляді, згодом як четвертий вимір. Z-серії, отримані через певні інтервали, є чотиривимірними наборами даних: три просторових вимірювання (x, y і z) і час, як четвертий, що можна спостерігати за допомогою програми 4D перегляду. Такі програми дозволяють складати і програвати як фільм, стереопари, взяті в різні моменти часу, або, альтернативно, обробляти і представляти відтворені тривимірні зображення, зняті в різні моменти часу, як змонтований фільм.
X-Z зображення
Якщо необхідно отримати вид зразка збоку, як, наприклад, вертикальний розріз епітеліального шару, можна провести x-z переріз одним із двох способів. Вигляд збоку можна отримати скануванням по одній лінії зразка (вісь x) з різною глибиною (вісь z), контролюючи кроковим двигуном зміну фокусу, а потім поєднуючи всю серію зрізів в єдине зображення. Іншим методом є використання опції площину розрізу у програмі відтворення тривимірних зображень, коли вид збоку виділяється із існуючої z-серії оптичних зрізів. При формуванні зображення епітелію крила метелика на малюнку 5 лазер сканував по одній лінії (горизонтальна чорна лінія на лівому знімку) проникаючи в зразок при різних значеннях z-координати, або глибини. X-z зображення, представлене малюнку 5, було побудовано і представлено конфокальної системою візуалізації. Епітелій крила складається з двох епітеліальних шарів, але оскільки інтенсивність флуоресцентного світіння падає зі збільшенням глибини проникнення лазерного променя в зразок, чітко візуалізований тільки верхній шар.
Мал. 5. Зображення у X-Z площині
Створення зображення у відбитому світлі
Усі ранні конфокальні мікроскопи працювали у відбитому, чи назад розсіяному світлі. Використовуючи відображене світло, багато зразків у конфокальній мікроскопії можна спостерігати незабарвленими, або вони можуть бути позначені барвниками з високою здатністю, що відбиває, як, наприклад, імунозолотом або мікрокристалами галогенідів срібла. Перевага спостережень у відбитому світлі, особливо для живих тканин, полягає в тому, що зразок не піддається фотознебарвлення. Але фарбники деяких типів можуть послаблювати лазерний промінь. Іншою потенційною проблемою є те, що в деяких мікроскопах можуть виникати внутрішні відбиття від оптичних елементів на оптичному шляху променя. Для багатопроменевих версій ЛСКМ і ЛСКМ зі щілинною діафрагмою проблеми відбитого світла немає, а тих мікроскопах, де є, застосування поляризаторів, візуалізація областей без артефактів і зміщення від оптичної осі, допомагають зменшити проблему.
Створення зображень у світлі, що проходить
Будь-який з режимів візуалізації в світлі, що зазвичай застосовується в мікроскопії, може бути використаний в ЛСКМ, включаючи фазовий контраст, диференціальний інтерференційний контраст (ДИК), темне поле або поляризоване світло. Світло, що пройшло через зразок потрапляє на приймач світла, що проходить, сигнал якого, через волоконно-оптичний світловод, направляється в один з фотопомножувачів в скануючій головці мікроскопа. Зображення в світлі, що проходить, і конфокальні епіфлуоресцентні зображення можуть захоплюватися одночасно при використанні одного і того ж променя від освітлювача, що гарантує їх точну реєстрацію. При об'єднанні або синтезі зображень за допомогою відповідного програмного забезпечення може бути відображено точне положення мічених клітин тканини. У деяких дослідженнях пропонується наступний змістовий підхід: об'єднати неконфокальне зображення в світлі з одним або більше конфокальних флуоресцентних зображень мічених клітин того ж зразка. Такий підхід дозволить, наприклад, визначити просторові та часові аспекти міграції субпопуляції мічених клітин у межах популяції немічених клітин протягом кількох годин або навіть років.
Сьогодні вже широко використовується кольоровий приймач світла, що приймає, що проходять сигнали в червоному, зеленому і синьому кольорі (RGB) для створення кольорового зображення в реальних кольорах, подібно до того, як це робиться в деяких цифрових кольорових фотоапаратах. Такий приймач особливо корисний для патологоанатомів, які зазвичай спостерігають реальні кольори в тканинах у світлі, що проходить і накладають ці зображення на флуоресцентні дані для аналізу.