Lüminesans mikroskobu. Elektron mikroskobu

Bu bölümde Leica cihazlarını örnek olarak kullanarak eş odaklı lazer tarama mikroskobunun (CLSM) ana prensipleri, tasarımı ve uygulaması tartışılacaktır. CLSM'nin prensibi, odaklar çakıştığında merceğin odak düzleminden yayılan ışık akısının kaydedilmesidir; yani dedektör diyaframının, görüntüsü nesneyi aydınlatan ışığın odağıyla tam olarak çakışacak şekilde konumlandırılması gerekir. Görüntü elde etmek için ışık kaynağı olarak lazerler ve hassas dedektörler kullanılır.

CLSM'nin ana özelliği, incelenen nesnenin (örneğin bir hücre) yüksek çözünürlük ve düşük gürültüyle katman katman görüntüsünü elde etme yeteneğidir. Bu, belirli floresan problar ve ışık akılarını sınırlamak için özel yöntemler kullanılarak, tutarlı bir kaynaktan veya aşamadan gelen odaklanmış bir ışık ışınıyla bir nesnenin adım adım taranmasıyla elde edilir.

CLSM tarama sistemleri aşağıdaki gibi sınıflandırılabilir.

1. Işın taraması.

A) Ayna sistemleri: tek aynalı, çift aynalı, rezonanslı manyetoelektrik.

B) Hafif fiber sistemler: tek fiber, çoklu fiber.

B) Lens taraması:

· merceğin X, Y eksenleri boyunca piezoelektrik hareketi;

· merceğin Z ekseni boyunca piezoelektrik hareketi.

D) Akusto-optik ışın saptırıcılar: X ve Y eksenleri boyunca tarama yapmak için iki akustik-optik saptırıcı.

D) Disk sistemleri:

· tek spiralli, tek taraflı ve çift taraflı;

· çok spiralli tek taraflı ve çift taraflı.

E) Kombine sistemler: Y ekseni boyunca akustik-optik saptırıcı ve X ekseni boyunca bir ayna ile tarama.

2. Tabloyla tarama.

A) Kademeli sürücü: X, Y, Z eksenleri boyunca kademeli motorlara sahip tarama tablosu.

B) Kombine tahrik: X, Y eksenleri boyunca kademeli motor ve Z ekseni boyunca piezoelektrik tahrikli tarama aşaması.

Pirinç. 5. CLSM'nin çalışmasının şematik diyagramı.

1 - tarama tablosu; 2 - test örneği; 3, 7 - lensler; 4 - tarama cihazı; 5 - ışın ayırıcı; 6 - lazerden gelen ışık huzmesi; 8, 12 - B ve C noktalarının görüntüsü; 9 - iğne diyaframı; 10 - iğne diyaframının ortasındaki A noktasının görüntüsü; 11 - radyasyon alıcısı; 13, 15 - mercek 3'ün odağının dışında bulunan B ve C noktalarının parıltısı; 14 - mercek 3'ün odağında bulunan A noktasının parıltısı.

Lazer kaynağından gelen uyarım ışık akısı (6), ışın ayırıcı plaka (5) ve tarama sistemi (4) aracılığıyla merceğin (3) üzerine girer ve odakta olan test numunesi düzleminin (örneğin bir hücre) A noktasına odaklanır. . Hücre içi yapıların floresan problarla ilişkili olduğuna ve ışın odaklama noktası A'nın bir nokta ışık kaynağı olarak kabul edilebileceğine inanıyoruz; floresans akısı, lens 3, ışın ayırıcı plaka 5, lens 7 aracılığıyla iğne diyaframı 9 düzleminde odaklanır. (“iğne deliği”) ve fotodetektör 11 tarafından kaydedilir. Optik eksen (B ve C noktaları) boyunca mercek odağının dışında kalan ilaç parçalarının uyarılma akışıyla aydınlatma, A noktasından daha düşüktür. Sonuç olarak, dedektörün aydınlatma bileşeni B ve C noktalarından hedef önemli ölçüde azaltılabilir. Odak dışı olan B ve C noktalarından yayılan floresans akıları iğne deliği diyaframla sınırlanır ve dedektöre ulaşmaz veya küçük bir kısmı ulaşır. Böylece, bir preparatı düzlemde tararken XY Dedektör, seviyesi Z koordinatı boyunca tarama düzleminden uzaklığa göre belirlenen bir sinyali kaydeder. Lensin (3) odağının tarama düzlemi ile hizalanması ve lensin (7) iğne diyaframlı odağı, görüntüde yansıtılır. “eş odaklılık” terimi. Tarama düzleminin Z ekseni boyunca adım adım hareketi, bir dizi kontrast katman katman görüntü elde etmenize ve incelenen nesnenin iç üç boyutlu yapısını (3-D) yeniden yapılandırmanıza olanak tanır. Görüntü kalitesi, düzlem içi çözünürlük XY ve Z ekseni boyunca optiklerin kalitesine, tarama sistemlerinin kalitesine, iğne deliği diyaframının boyutuna ve üretim doğruluğuna, yapının sağlamlığına, kullanılan sinyal işleme algoritmalarının verimliliğine ve kullanılan sinyal işleme algoritmalarının özgüllüğüne bağlıdır. floresan problar.

Mikroskopun uzaysal çözünürlüğünü belirlemek için bir nokta ışık kaynağının görüntü analizi gerçekleştirilir. Geleneksel bir mercek tarafından oluşturulan bir nokta kaynağının görüntüsü, parlak bir merkezi çekirdek ve daha sönük dış halkalardan oluşan bir Airy kırınım noktasıdır.

Pirinç. 6. Havadar kırınım noktası.

Eşit parlaklığa sahip iki nokta kaynağı, aralarındaki mesafe d , Airy dairelerinin merkezleri arasındaki mesafe aşağıdaki değeri aşarsa iki farklı nokta olarak görünür:

r A = XY =0,6 λ/NA,

nerede r A - Airy dairesindeki ilk karanlık halkanın yarıçapı, λ ışık kaynağının nm cinsinden dalga boyu, NA sayısal açıklıktır.

Bu ifadeye Rayleigh kriteri denir. Mikroskobun numune düzlemindeki (XY) çözünürlüğünü belirler. Bu durumda çözünürlük sınırı öncelikle ışığın dalga doğası tarafından belirlenir ve bu nedenle sıklıkla NA=1 dikkate alınarak basitleştirilir. CLSM görüntülemede Airy spotunun boyutunda hafif bir azalma meydana gelir. Standart bir mikroskop için Airy spotunun yoğunluğu, n'nin enine yer değiştirme olduğu n -2 yasasına göre azalırken, CLSM için yoğunluk n -4 olarak azalır. Bu, CLSM'nin çözünürlüğünde 1,5 kat artışa yol açar. Konfokal bir mikroskop için Rayleigh kriteri şu şekildedir:

XY cr =0,4 λ/NA,

burada XY cr CLSM'nin çözünürlüğüdür.

CLSM'nin avantajlarını değerlendirmek için enstrümantal fonksiyonu (Airy noktasının yapısı) dikkate alıyoruz ve mikroskobun çözünürlüğünü eksenel yönde (Z) analiz ediyoruz. Üç boyutlu Airy spot (yoğunluk dağılımı), bir nesnenin görüntüsünü tanımlayan üç boyutlu bir donanım işlevidir (THF). Geleneksel bir mikroskop için TAF, merkezden yukarı ve aşağı doğru genişleyen konik bir şekle sahipken, eş odaklı bir mikroskop için eliptik bir şekle sahiptir ve eksenel yönde daha az uzar.

Pirinç. 7. Geleneksel bir mikroskobun - (a) ve CLSM - (b) nokta kaynağının üç boyutlu donanım fonksiyonunun görünümü.

Rayleigh kriteri aynı zamanda bir mikroskobun optik eksen yönündeki çözünürlüğünü belirlemek için de geçerlidir. Geleneksel bir mikroskop için, optik eksen boyunca belirli bir mesafede bulunan iki nokta kaynağı, Airy noktalarının maksimumları uzaktaysa çözülebilir:

Zr =2 λ/NA 2 ,

burada Zr mikroskobun eksenel çözünürlüğüdür.

CLSM için Airy noktasındaki enerji dağılımı daha dardır ve eksenel yöndeki çözünürlük 1,4 kat daha yüksektir. Konfokal bir mikroskop için Rayleigh kriteri şu şekildedir:

Z r c =1,4 λ/NA 2 ,

burada Zrc CLSM'nin eksenel çözünürlüğüdür.

Modern CLSM'nin bir ana avantajı vardır - ince optik kesitler elde etme yeteneği. İnce optik kesitler elde ederken görüntü kalitesi aşağıdaki parametrelerden etkilenir:

· eş odaklı açıklık boyutu;

· merceğin sayısal açıklığı NA;

· kırılma indisi;

· numunedeki ışığın emilmesi.

Numunenin kalınlığı arttıkça ışık yoğunluğundaki azalma, mikroskobun optik Z ekseni boyunca çözünürlüğünü etkiler. Çözünürlük, mikroskobun ve numunenin optiklerine bağlıdır. Konfokal bir mikroskopta optik bölümün kalınlığı genellikle yoğunluk zirvesi ∆z 1/2 = 0,65 μm'nin yarı yüksekliğindeki dağılımın genişliği ile karakterize edilir. Numune ve detektör ideal ise, bu parametre objektifin sayısal açıklığına, dalga boyuna λ ve daldırma ortamının kırılma indisine n, bağlıdır.

Pirinç. 8. Mikroskop ∆z 1/2'nin eksenel çözünürlüğünün merceğin sayısal açıklığına bağımlılığı.

CLSM'de dedektörün önüne ışık miktarını değiştiren ayarlanabilir bir diyafram yerleştirilmiştir. İğne diyaframlar, odak düzlemiyle çakışmayan veya odak düzleminde nesnenin analiz edilen öğesinin yanında bulunan noktalardan görüntü oluşum düzlemine giren ışığın maksimum veya tamamen filtrelenmesi için koşullar oluşturmak üzere tasarlanmıştır. İğne diyaframının boyutu sonludur ve cihazın yanal çözünürlüğü, numunenin aydınlatılan elemanlarının parlaklığı Z ekseni boyunca odak düzlemine göre kaydırılır ve alan derinliği buna bağlıdır. Diyaframın boyutu, ortaya çıkan bölümün kalınlığını etkiler. Açıklık ne kadar küçük olursa kesit kalınlığı teorik sınıra (yoğunluk zirvesinin yarı yüksekliğindeki dağılımın genişliği) o kadar yakın olur ve çok büyük açıklıklarda ince bir kesit elde etme yeteneği imkansız hale gelir.

Daha önce de belirtildiği gibi CLSM, numunenin yüzeyinden önemli bir derinlikte optik bir kesit elde etmeyi mümkün kılar; önemli nokta kırılma indisi ve derinlik meselesidir. Gelen ve yansıyan ışının numuneden geçişi görüntü kalitesini etkiler. Daldırma ortamının ve numunenin kırılma indisleri yakınsa (daldırma sıvısının ve nesnenin kırılma indisleri arasındaki farkın, görüntü kontrastını azaltan ve küresel bir sapma etkisi görevi gören dağınık ışığın görünümü üzerindeki etkisi) ışık konisi birleşecektir. Kırılma indeksleri farklıysa küresel sapma ortaya çıkar.

Pirinç. 9. Daldırma ortamının ve numunenin kırılma indeksleri.

a – sapma olmadan daldırma merceği kullanılarak görüntü oluşumu; b – göstergeler arasındaki tutarsızlıktan kaynaklanan küresel sapma.

Farklı kırılma indisleri ile optik eksenden farklı uzaklıklara gelen ışık ışınları tek bir noktaya odaklanmaz, bu da görüntü kalitesinde kayıplara neden olur. Mümkünse numunenin ve objektifin kırılma indisleri eşleştirilmelidir. Numunenin ve daldırma ortamının kırılma indisleri farklıysa, nesnenin derinlikteki görüntüsü optik eksen boyunca bulanıklaşır ve odak düzlemi kayar. Penetrasyon derinliğini arttırmak için merceğin, yağa batırılmış mercekler gibi geniş bir sayısal açıklığa sahip olması gerekir. Bununla birlikte, bu tür merceklerin objektif merceğinden odak düzlemine kadar küçük bir maksimum mesafesi vardır. Nüfuz derinliği numunenin heterojenliğinden etkilenir, bu da büyük derinliklerde ışık yoğunluğunun azalmasına ve gölge görünümüne yol açar. İdeal olarak, maksimum penetrasyon derinliğine ve maksimum çözünürlüğe ulaşmak için bir numunenin kırılma indisi merceğinkine eşit olacaktır, ancak bu homojen bir numunedir ve bu tür biyolojik numuneler mevcut değildir.

Tarama sırasında CLSM, numunenin yüzeyinden düzenli olarak artan derinliklere sahip bir dizi optik bölüm elde eder. Çoğu CLSM için yüzlerce 2D görüntünün elde edilmesi yalnızca birkaç dakika sürer. Optik görüntü iki şekilde elde edilebilir:

1) XY düzleminde birbirinden ∆z uzaklıkta bulunan bir dizi optik kesitin elde edilmesi. Farklı bölümlerdeki nesnelerin merkezlerinin koordinatlarının karşılaştırılması, bunların yönelimini ve uzunluk dağılımını belirlemeyi mümkün kılar.

Pirinç. 10. XY düzleminde üç boyutlu yapının incelenmesi.

2) XZ düzleminde ∆y mesafesinde bulunan bir dizi optik kesitin elde edilmesi. Numune kesit düzlemine paralelse, XZ düzlemindeki kesiti neredeyse dairesel olacaktır; farklı XZ kesitlerindeki görüntüleri karşılaştırarak incelenen nesnenin eğriliği belirlenebilir.

Pirinç. 11. XZ düzleminde üç boyutlu yapının incelenmesi.

İncelenen nesnelerin CLSM yöntemleri kullanılarak üç boyutlu olarak yeniden yapılandırılması iki sorunu çözmeyi amaçlamaktadır:

· bir nesnenin optik bölümlerinin "birleştirilmesiyle" elde edilen üç boyutlu görüntüsünün görselleştirilmesi;

· bir nesnenin iç yapılarının niceliksel analizi.

Bugün CLSM üreten oldukça fazla firma var. CLSM imalat şirketlerinin yenilikleri:

· 2002 Leica, lazer uyarma ışınının ve lüminesansın verimli bir şekilde ayrılmasına olanak tanıyan bir akustik-optik ışın ayırıcının (AOBS) duyurusunu yaptı;

· 2002 Carl Zeiss, 32 spektral kanaldaki sinyalleri aynı anda kaydeden orijinal bir fotodetektöre sahip LSM 510 META eş odaklı mikroskobu üretmeye başladı;

· 2004 Zeiss, geleneksel CLSM'den 20 kat daha yüksek tarama hızına sahip yüksek hızlı LSM 5 Live'ı yarattı;

· Olympus, örneğin FRAP tekniğinin daha etkili şekilde kullanılmasını mümkün kılan iki tarayıcılı bir cihaz geliştirdi;

· Nikon - basitleştirilmiş tasarıma sahip kompakt ve ucuz bir CLSM oluşturur;

· 2007 Leica, eksenel çözünürlüğü 4 - 7 kat artıran 4Pi-eş odaklı mikroskobun piyasaya sürüldüğünü duyurdu.

Yeni, daha gelişmiş nesil cihazlara ait bir CLSM cihazını ele alalım - Leica'dan TCS SP5.

Pirinç. 12. Multifoton/eş odaklı geniş bant sistemi TCS SP5 (ters mikroskop).

CLSM TCS SP5'in temel unsurları: AOTF – akustik-optik ayarlanabilir filtre, AOBS – akustik-optik ışın ayırıcı, SP-Detector – spektral fotometre sensörü.

AOTF - Akustik-Optik Ayarlanabilir Filtre - optik maruziyeti en aza indirmeye yarar ve numuneye ve florokroma bağlı olarak lazer gücünü ayarlar. Gerekli dalga boyunu seçmenizi ve uyarma ışığının yoğunluğunu kontrol etmenizi sağlar. AOTF, bir ışık ışınının kırılma indisindeki homojensizlikler yoluyla hacimsel kırınım prensibine göre çalışan, elektriksel olarak ayarlanabilen bir filtredir. Bu tür homojensizlikler, çift kırılımlı kristallerde ultrasonik bir akustik dalga uyarıldığında ortaya çıkar. Tek eksenli kristallerdeki anizotropik kırınım ile, geliş ve kırınım açılarının çakıştığı minimum bir ultrason frekansı vardır ve eşdoğrusal akustik-optik etkileşim olarak adlandırılan etkileşim meydana gelir.

Pirinç. 13. Akustik-optik ayarlanabilir filtre.

AOBS - akustik-optik ışın ayırıcı, ters modda çalışan ayarlanabilir bir kırılma cihazı olan akustik-optik bir kristaldir. AOBS kullanmak size ne sağlar:

1. Net, düşük gürültülü bir görüntü elde etmek için yüksek derecede ışık iletimi gerekir. Birbirini takip eden birçok tarama üzerinden görüntünün ortalaması alınarak gürültünün azaltılması, mutlaka incelenen nesnenin ışıkla ağartılmasına yol açar. AOBS'nin ışık geçirgenliği, görünür spektrumun tamamındaki çoğu dikroik aynadan daha üstündür. Bu nedenle daha az sayıda taramanın ortalamasının alınması gerekir. Sonuç olarak ilaç çok daha uzun süre dayanır;

2. Parlak ve net görüntüler, nesneden dedektöre mümkün olduğu kadar çok fotonun geçmesini gerektirir, bu da görüntü kalitesini artırır. AOBS mümkün olan en geniş floresans bantlarının, yani maksimum foton sayısının kaydedilmesini sağlar;

3. Görüntü elde etme sırasında düşük ağartma, numuneyi solmaya karşı ve canlı nesneleri toksik florokrom fotoliz ürünlerinden korumak için önemlidir. AOBS'nin ışık iletim eğrileri çok dik eğimlere sahiptir, bu da bir florokromun floresansını uyarma bandına mümkün olduğu kadar yakın kaydetmeyi mümkün kılar;

4. Yansıma ayrı ayrı ayarlanabildiğinden görünür aralıktaki herhangi bir boya uyarılabilir;

5. Çok parametreli floresans sorunu çözüldü: sekize kadar lazer emisyon çizgisi programlanabilir, böylece floresansın kaydedilmesi için yeterli alan bırakılırken frekanslar da ayarlanabilir;

6. Boyaların oranı, metabolitlerin uyarılma oranı gibi - numuneler, örneğin Ca2+ için, membran potansiyeli, pH değeri, sıralı tarama sırasında hızla değişmelidir. AOBS birkaç mikrosaniyede değişir;

7. Yansıyan ışıkta görüntü kaydı başka bir kullanım olanağıdır. AOBS, yansıtılan uyarı ışığının iletiminin ayrı ayrı ayarlanmasına olanak tanır;

8. ROI taraması (sıralı tarama ve belirli alan taraması) da geliştirildi: tek bir tarama sırasında farklı alanlara farklı uyarma modları uygulanabilir;

9. Sıralı modda büyük hacimli 3D kayıtlar, hızın sistem verimliliğini arttırması nedeniyle hızlı anahtarlama cihazlarından yararlanır;

10. Floresan korelasyon spektroskopisi (FCS), düşük arka plan ve düşük ışık saçılımını gerektirir; yalnızca AOBS, örneğin Ar lazerlerinden gelen yakındaki emisyon hatlarını etkili bir şekilde engeller;

11. Spektral kayıt (Lambda taraması), AOBS'nin ışık iletimi "beyaz" olduğundan doğru bir spektrum sağlar; bu, emisyon spektrumunda değişikliklere yol açmadığı anlamına gelir - dikroik ayna sisteminde spektral taramalar gerçekleştirirken yaygın bir sorun;

12. Gerçek eş odaklı optik kesitleme, spot aydınlatmayı ve floresansın spot tespitini gerektirir. AOBS, nokta taramalı eş odaklı cihazlarla kullanıma uygundur;

13. Çoklu foton modunda veya ultraviyole uyarımla görüntüleme, hata veya sınırlama olmaksızın paralel olarak gerçekleştirilebilir. AOBS, görünmez lazerlerin uyarımını değiştirmez ve floresans spektrumunu değiştirmez;

14. AOBS, AOTF (Acousto-Optical Ayarlanabilir Filtre) kullanılarak uyarım kontrolü ile birlikte kontrol edildiğinden hatalı işlem yapılması mümkün değildir. Uyarma hattı seçilirse AOBS buna göre programlanır. Operatörün karar vermesine gerek yoktur; iş doğru ve otomatik olarak gerçekleştirilir;

15. Filtre tamburları ve sürgülerinde hareketli elemanlar bulunmadığından ayar yoktur. Kristal sıkıca monte edilir ve programlama elektronik olarak yapılır;

16. Filtre küpleri, dikroik ayna sürgüleri vb. gibi pahalı ek ekipmanlara gerek yoktur. Bu nedenle, yeni optik elemanların kurulumuna yönelik teknik yardımın maliyeti çok daha düşüktür.

Pirinç. 14. AOBS – akustik-optik ışın ayırıcı.

SP-Detector – spektral fotometre sensörü. İndüklenen floresans spektrumlarının toplamı olan numuneden gelen ışık, eş odaklı bir optik bölüm oluşturan bir iğne deliği diyaframından geçer. Daha sonra bir prizma kullanılarak bu ışık bir spektruma ayrıştırılır. Işık, ilk dedektörü geçerken iki motorlu perdeden oluşan bir yarık fotometre cihazından geçer. Bu perdeler aralığın her iki tarafındaki spektrumun kenarlarını keserek 2. ve 3. derece sensörlere yönlendirir. Sonuç olarak spektrum aynı anda beş kanala bölünür. Sonuç olarak, SP dedektörü kullanıldığında numunedeki çeşitli boyalardan gelen radyasyon kaydedilir.

Pirinç. 15. Spektral dedektör SP.

SP dedektörü lambda taramasına izin verir: deneyde yer alan boyaların özelliklerini anında analiz etmek için spektral görüntüler toplanır.

4 Haziran 2013

Moskova Devlet Üniversitesi Biyoloji Fakültesi'nde yürütülen bilimsel araştırmaların önemli bir kısmı ve bunlarla yakından ilişkili eğitim programlarının başarılı bir şekilde uygulanması, en modern mikroskobik teknoloji kullanılmadan düşünülemez. Moskova Üniversitesi Geliştirme Programının bir parçası olarak, Biyoloji Fakültesi'nde gerekli ekipmanlarla tam donanımlı ve etkin bir şekilde çalışan bölümler arası bir konfokal mikroskopi laboratuvarı oluşturuldu.

Matris makrogözeneğinin duvarlarındaki 3T3 fibroblastlar

Metin: Tretyakov Artemy

Ne yapabilir?

Kullanarak eş odaklı mikroskop Bir hücrenin sanal bölümlerinin çeşitli görüntülerini veya bunlardan birleştirilmiş üç boyutlu bir modeli elde edebilirsiniz. Bu tür olasılıklar, ışını hücrenin herhangi bir noktasına odaklanabilen bir lazer tarafından sağlanmaktadır. Bir görüntü elde etmek için, nesnenin floresan olarak aktif olması, yani bir lazer ışınına çarptığında, nesnenin (veya daha doğrusu bileşimindeki bazı moleküllerin), üzerine gelen olaydan daha uzun dalga boyunda ışık yayması gerekir. mikroskop. Görüntü tam olarak bu floresans temel alınarak oluşturulmuştur.

Fotoğraf

O nasıl çalışır?

“Temel ve uygulamalı disiplinlerarası bilimsel araştırmanın mevcut gelişme düzeyi ve disiplinlerarası yeterliliklere sahip uzmanların yetiştirilmesi görevleri, malzeme ve teknik temelin yoğun bir şekilde geliştirilmesini ve modernizasyonunu gerektirir” (Moskova Üniversitesi Geliştirme Programı, s. 5;) .

Elektronik-mekanik cihaz, lazere ek olarak, lazer ışınını ileten, ancak daha uzun dalga boyundaki ışığı "iğne deliği" adı verilen bir diyaframa yansıtan bir optik filtre içerir (İngiliz İğne Deliği'nden - bir pim tarafından yapılan bir delik, kelimenin tam anlamıyla çevirisi). Gereksiz tüm arka plan ışığını kesen ve böylece altta yatan optik katmanların hücrenin taranan alanının ekranının netliği üzerindeki etkisini azaltan veya tamamen ortadan kaldıran iğne deliği cihazını mükemmel şekilde karakterize eder. Arka plan ışığı iğne deliği tarafından kesilmeseydi, optik katmanlar üst üste gelecek ve izleyiciye müdahale edecekti; sanki yeşilliklerin arasından uzağa bakıyormuş gibi. Diyaframın arkasında alınan bilgiyi sayısallaştıran bir fotodetektör bulunmaktadır.

Böyle bir “nokta” taramanın zaman alacağı açıktır. Bu süreci hızlandırmak için eş odaklı sistem, dönen disk adı verilen başka bir modül kullanır; bu, tek bir lazer işlemiyle yalnızca bir noktanın değil, tüm bir çizginin görüntüsünün elde edilmesini mümkün kılar.

Böyle bir sistemin patenti 1961'de MIT profesörü Marvin Minsky tarafından alındı. Aktif kullanımı 80'li yıllarda başladı ve şimdi konfokal mikroskopi en parlak dönemini yaşıyor. İlk mikroskop 2003 yılında Rusya'da ortaya çıktı, Axiovert 200M LSM510 Meta idi. Bunu diğerleri takip etti ve şimdi ülkemizde, Moskova Devlet Üniversitesi Biyoloji Fakültesi'ndeki bölümler arası laboratuvar da dahil olmak üzere birçok büyük laboratuvar var. Laboratuvarda Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL dahil olmak üzere beş mikroskop bulunmaktadır.

Konfokal mikroskopi yalnızca en yüksek kontrastı ve üç boyutluluğu elde etmekle kalmadı, aynı zamanda dördüncü boyut olan zamana da hakim oldu ve hücrelerde meydana gelen değişiklikleri incelemeyi mümkün kıldı. Bu amaçlar doğrultusunda her tesisat ömrünü uzatacak sistemlerle donatılmıştır. Bütün bunlar, bu fırsatları başarıyla kullanan araştırmacılara geniş fırsatlar sunuyor.

Ve Moskova Devlet Üniversitesi Biyoloji Fakültesi'nin laboratuvarından bahsettiğimiz için bu laboratuvarda yapılan araştırmaları örnek olarak belirtmek gerekir.

İpek ve ağ

İlginç çalışmalardan biri, kan damarlarının ve diğer içi boş organların restorasyonu için biyolojik olarak parçalanabilen protezlerin oluşturulmasıdır. En basit durumlarda, bu tür doku mühendisliği yapılan yapılar, hasar bölgesine yerleştirilen tüplere veya filmlere benzer ve dolayısıyla bir "yama" görevi görür. İpekböceği kozasından elde edilen ipek fibroini de dahil olmak üzere farklı malzemelerden yapılabilirler. Bu malzemenin avantajı stabil olması ve protezin esnek ve dayanıklı yapısını oluşturmasıdır. Protezin kendisi yalnızca çıplak gözle bakıldığında bir film gibi görünüyor; aslında bir matristir - çok katmanlı ağ örgüsü bir taban, canlı dokunun yapısını taklit eden bir çerçeve. Bu iskele, yeni hücrelerin doğru pozisyona gelmesine yardımcı olarak eşit dağılımlarını sağlar. Sonuç olarak, hasarlı organ duvarı onarılır ve gereksiz çerçeve biyolojik olarak parçalanmaya uğrar. Ancak hücrelerin çerçeve boyunca ne kadar eşit dağıldığını, matrisin derin katmanlarında iyi yaşayıp yaşamadıklarını (gaz değişiminde ve metabolik ürünlerin değişiminde herhangi bir zorluk olup olmadığını) ve bunların olup olmadığını kontrol etmek o kadar kolay değil. içine nüfuz ederken morfolojiyi değiştirin. İşte bu aşamada mikroskop (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) kullanımı görevi büyük ölçüde basitleştirdi. Esas olarak bir nesneyi tahrip etmeden inceleme yeteneğinin yanı sıra mikroskobun matrisin içine 600 mikron derinliğe kadar bakabilmesi nedeniyle.

Fotoğraf

Benzer bir çalışma, matrisi hem aynı fibroinden hem de orijinal olarak örümceğin vücudunda keşfedilen ve onun tarafından ağ örmek için kullanılan bir protein olan spidroinden yapılan kemik dokusu üzerinde gerçekleştirildi. Laboratuvar koşullarında protein, örümcekler tarafından değil, bu proteinin sentezinden sorumlu olan, genomuna biraz değiştirilmiş bir örümcek geninin eklendiği maya tarafından üretilir.

O kadar basit değil

Ancak dokularda hasar oluşması basit ve anlaşılır bir süreç ise diğer patolojiler her zaman netlik kazanmaz. Etkili tedaviye başlamadan ve özellikle gelişimlerini önlemeden önce, oluşum mekanizmasını bulmak gerekir. Bunlar arasında ateroskleroz - arterlerin bir hastalığı olup, bunun sonucunda lipitler damar duvarında veya daha doğrusu intimada - iç tabakasında birikerek duvarı daha kalın hale getirir ve sonuçta damarın tamamen tıkanmasına bile yol açabilir. . Bu hastalığa neyin sebep olduğu tam olarak açık değildir, tıpkı bağışıklık sistemi yeterli hücrelerin biriktiği yerlerde nasıl bir rol oynadığının net olmadığı gibi, aterogenez de kısa sürede başlar. Bu soruların tam cevapları henüz bulunamadı, ancak bu konuyla ilgili doku mühendisliği protezleri konusuna göre çok daha az yayın olmasına rağmen aterogenez çalışmaları devam ediyor.

Fotoğraf

Moleküllerin kaderi

Bölümler arası konfokal mikroskopi laboratuvarı, yaklaşık 10 bölümden 20'den fazla lisans ve yüksek lisans öğrencisi tarafından çalışmalarında düzenli olarak kullanılmaktadır.

Yukarıda açıklanan çalışmalar esas olarak hücrelerin durumunu izler. Ancak eş odaklı mikroskobun yetenekleri bununla sınırlı değil; floresan aktiviteye sahip olduğu sürece hücredeki tek bir molekülün kaderini bile takip etme yeteneğine sahip. Bunu yapmak için moleküller genellikle florokromlarla (bu aktiviteye sahip özel boyalar) etiketlenir. Florokromlar ayrı moleküller halinde bulunur ve bunların etiketlenmesi, florokromun araştırmacının ilgilendiği moleküle kimyasal olarak bağlanmasını içerir. Bundan sonra bu tür etiketli moleküller hücreye girer ve sonraki akıbetleri mikroskop kullanılarak izlenir. Bu şekilde örneğin risin ve viskuminin hücresindeki aktivite ve hareket karşılaştırıldı. Her iki madde de protein toksinleridir, her ikisi de bitki kökenlidir ve iki parçadan oluşur - alt birimlerden biri hücreye bağlanmaktan ve içeriye nüfuz etmekten sorumludur, diğeri ise sonuçta hücre ölümüne yol açan ribozomu etkisiz hale getirmekten sorumludur. Pratik fayda yine başka bir tehlikeli hastalığın (kanser) tedavisiyle ilişkilidir. Alt birimler arasındaki bu açık "sorumluluklar ayrılığı", ilk alt birimin örneğin bir antikorla değiştirilmesini mümkün kılar. Sonuç, yalnızca bu antikorun uygun olduğu belirli hücrelere etki eden bir "immünotoksin"dir. İki ana sorun var. Birincisi: kanser hücrelerine yaklaşacak ve toksinin sağlıklı hücrelere nüfuz etmesini önleyecek bir antikor seçmek. İkincisi: İmmünotoksine dönüştürüldüğünde son derece etkili kalacak bir toksinin seçilmesi.

Fotoğraf: Yeni doğmuş sıçan yavrularının kalp hücrelerinin birincil kültürü: A - kontrol, B - 24 saat boyunca 20 uM izoproterenol ile tedavi edildi. 1 - Mitokondrinin TMRE boyaması; 2 fazlı kontrast. Ölçek 10 μm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. “İzoproterenolün etkisi altında yenidoğan sıçanların kültürlenmiş kardiyomiyositlerinin mitokondrilerindeki adaptif değişiklikler.” Uluslararası konferans “Reseptörler ve hücre içi sinyalleşme” 24-26 MAYIS 2011. Pushchino).

Eğitim

Konfokal mikroskopi kullanılarak yapılan çalışmaların listesine uzun süre devam edilebilir. Canlı hücrelerle çalışmaya da olanak sağlayan bu etkili yöntem, hemen hemen her bilimsel araştırmada talep görmektedir. Bu nedenle öğrencileri bu laboratuvarda çalışmaya hazırlamak çok büyük bir rol oynuyor. Kurs çalışmaları, kurs öncesi çalışmalar ve diploma çalışmaları yapan 20'den fazla lisans ve lisansüstü öğrencisi düzenli olarak katılmaktadır.

Tesislerde embriyologlar, moleküler biyologlar, sitologlar, biyomühendisler, immünologlar ve zoologlar çalışıyor.

Konfokal Mikroskopi Laboratuvarı 2004 yılında kuruldu.

Laboratuvar başkanı – doçent M.M.

Genç uzmanlar A.A. Ramonova ve A.Yu.

Şu anda laboratuvarda kurulu 2 eş odaklı sistem bulunmaktadır:

Axiovert 200M, eş odaklı bağlantı LSM510 META ile (Carl Zeiss, Almanya)
NIKON CORPORATION (Japonya) tarafından üretilen eş odaklı lazer tarama sistemi - laboratuvar araştırmalarına yönelik ters çevrilmiş bir tıbbi ve biyolojik mikroskop Eclipse ve aksesuarları: Ti-E standı, TIRF aydınlatıcı, A1 eş odaklı modül ve dönen disk tabanlı eş odaklı modülü.

Bütün haberler "

Margolin 389p.

Optik mikroskop, hem teknoloji hem de teknolojinin tüm başarılarının yanı sıra bilgi ve bilgisayar teknolojilerini de kullandı. Bu, mevcut ekipman ve kullanım yöntemlerinde önemli gelişmelere yol açtı ve bu da, özellikle eş odaklı mikroskopi olmak üzere yeni yöntemlerin ortaya çıkmasına yol açtı. Konfokal mikroskop, klasik optik mikroskoptan farklıdır; çünkü her anda bir nesnenin bir noktasının görüntüsü kaydedilir ve tarama yoluyla (örneği hareket ettirerek veya optik sistemi yeniden düzenleyerek) tam bir görüntü oluşturulur. Böylece, taramalı elektron mikroskobu prensibi, her bir noktadan gelen sinyalin istenildiği kadar kaydedilmesini ve işlenmesini mümkün kılan benzersiz bir biçimde uygulanmaktadır.

Klasik bir mikroskopta numunenin çeşitli noktalarından gelen ışık fotodetektöre girer. Konfokal mikroskopta, yalnızca bir noktadan gelen ışığın kaydedilmesi için, objektif merceğin arkasına, incelenen noktadan yayılan ışık diyaframdan geçerek kaydedilecek şekilde küçük bir diyafram yerleştirilir ve mercekten gelen ışık geri kalan noktalar, Şekil 2'de gösterildiği gibi esas olarak diyafram tarafından bloke edilir. 7.28.

Pirinç. 7.28. Eş odaklı optik mikroskopta ışın iletim şeması

Diğer bir özellik ise aydınlatıcının görüş alanında tekdüze bir aydınlatma yaratmaması, ışığı analiz edilen noktaya odaklamasıdır. Bu, numunenin arkasına ikinci bir odaklama sistemi yerleştirilerek sağlanabilir ancak bu, numunenin şeffaf olmasını gerektirir. Ayrıca objektif lensler genellikle pahalı olduğundan aydınlatma için ikinci bir odaklama sisteminin kullanılması pek tercih edilmez. Bir alternatif, hem gelen hem de yansıyan ışığın tek bir mercek tarafından odaklanmasını sağlayacak şekilde bir ışın ayırıcı kullanmaktır. Bu şema aynı zamanda ayarlamayı da kolaylaştırır.

Şimdi eş odaklı mikroskopi kullanıldığında kontrastın nasıl ve ne kadar niceliksel olarak değiştiğini ele alalım. Eş odaklı bir mikroskopta ışık mercekten iki kez geçtiğinden, nokta bulanıklığı işlevi (bundan sonra PSF olarak anılacaktır), bir fotonun kendi koordinatlarıyla bir noktaya çarpması veya bu noktadan bir fotonun algılanması bağımsız olasılıklarının ürünü olacaktır.

Çözünürlük için Rayleigh kriterini kullanırsak, eş odaklı bir mikroskopta çözünürlüğün arttığı, ancak önemli ölçüde olmadığı ortaya çıkar. Eş odaklı bir mikroskop için r çözünürlüğü için bir ifademiz vardır:

Geleneksel bir mikroskop için ise:

Ancak eş odaklı mikroskobun temel avantajı Rayleigh kriteri anlamında çözünürlükte bir artış değil, kontrastta önemli bir artıştır. Özellikle odak düzlemindeki geleneksel bir PSF için birinci yan maksimumdaki genliğin merkezdeki genliğe oranı %2'dir ve eş odaklı bir mikroskop için bu oran %0,04 olacaktır. Bundan, örneğin parlak bir nesneninkinden 200 kat daha az yoğunluğa sahip loş bir nesnenin geleneksel bir mikroskopta tespit edilemeyeceği sonucu çıkar, ancak nesneler arasındaki mesafe Rayleigh kriteri tarafından belirlenen mesafeden önemli ölçüde daha büyük olabilir. . Aynı zamanda böyle bir nesnenin eş odaklı bir mikroskopta iyi kaydedilmesi gerekir.

Önemli bir parametre, ışınlama ve toplama merceklerinin odak düzlemindeki açıklıkların boyutudur. Nesne düzlemindeki açıklığın görüntüsü, ışığın fotodetektör tarafından hangi alanlardan algılanacağını belirler. Açıkçası, açıklık boyutunun azaltılması iletilen ışık miktarında bir azalmaya yol açar, gürültü seviyesini artırır ve sonuçta elde edilen kontrast avantajlarını ortadan kaldırabilir. Bu nedenle, en uygun açıklık boyutu seçimi ve makul bir uzlaşma sorusu ortaya çıkıyor.

Airy noktasından daha küçük delik boyutuna sahip bir açıklık, yalnızca yoğunluk kaybına neden olur ve çözünürlük üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Tek noktalı Airy diyafram açıklığı, objektif merceğin çözme gücünün maksimum düzeyde kullanılmasına olanak tanır. Bununla birlikte, Airy noktasından yaklaşık 3 ila 5 kat daha büyük açıklık boyutuna sahip bir diyafram en uygun uzlaşma gibi görünmektedir. Burada tartışılan boyutun, nesne düzlemindeki görüntünün boyutunu ifade ettiği ve dolayısıyla açıklık deliğinin gerçek boyutunun merceğin büyütülmesine bağlı olduğu anlaşılmalıdır. Spesifik olarak, 100x lens kullanıldığında, 1 mm açıklığa sahip bir açıklık, nesne düzlemine 10 µm yarıçaplı bir daireye yansıtılacaktır.

Konfokal mikroskopi fikrinin gelişimi, gözlemlenen nesnelerin şeklini ve mekansal yapısını analiz etmek için daha hassas ve metrolojik açıdan titiz yöntemlere duyulan ihtiyaçtan kaynaklanan bir konfokal lazer tarama mikroskobunun (KJICM) geliştirilmesiydi. CLSM'nin ana fonksiyonel bağlantılarıyla birlikte şematik bir diyagramı Şekil 1'de gösterilmektedir. 7.29.

CLSM'nin ana özelliği, incelenen nesnenin yüksek çözünürlük ve düşük gürültü seviyesiyle katman katman görüntülenmesi olanağıdır. Bu, tutarlı bir kaynaktan gelen odaklanmış bir ışık huzmesi ile nesnenin adım adım taranmasıyla veya özel floresan problar ve ışık akısını sınırlamak için özel yöntemler kullanılarak sahnenin hareket ettirilmesiyle elde edilir.

Pirinç. 7.29. KJICM'nin blok şeması:

1 - tarama tablosu; 2 - örnek test; 3, 6 - lensler; 4 - tarama cihazı; 5 - ışın ayırıcı plaka; 7, 9 - iğne diyaframları; 8 - radyasyon alıcısı; 10 - lazer; 11 - Kontrol bloğu; 12 - bilgisayar; 13 - eksen tarama sürücüsü z.

CLSM'de boyutları mikroskop büyütmesi ve dalga boyu ile koordine edilen iğne deliği diyaframının kullanılması, çözünürlüğün %10'dan fazla arttırılmasını mümkün kılar. CLSM'nin çözünürlüğünün ve buna bağlı olarak ince yapıları analiz etme yeteneklerinin, bir numuneyi ince bir ışınla tarama koşulları altında geleneksel bir mikroskobun benzer yeteneklerini% 40'tan fazla aşamayacağı açıktır. KLCM'nin çözünürlüğü mikroskopi yöntemine ve aydınlatmaya bağlıdır. KLCM çözünürlüğü belirlendi hem optik sistem hem de elektronik yol bilgi işlem. Bu nedenle KLCM'nin tasarımında devrelerinin, optik sistemin çözünürlüğü, tarama adımı, dedektör özellikleri gibi parametrelerin koordine edilmesi, optimal işleme algoritmalarının ve uygun yazılımın seçilmesi gerekmektedir.

Genel olarak KLCM'nin alan derinliği açıklığa, dalga boyuna, ışık kaynaklarının tutarlılığına ve pin diyaframının boyutuna bağlıdır. İğne diyaframı, KLCM'yi diğer mikroskop türlerinden ayıran ana tasarım öğesidir. İğne diyaframlar, odak düzlemiyle çakışmayan veya odak düzleminde nesnenin analiz edilen öğesinin yanında bulunan noktalardan görüntü oluşum düzlemine giren ışığın maksimum veya tamamen filtrelenmesi için koşullar oluşturmak üzere tasarlanmıştır.

Optimum iğne diyafram çapının seçilmesi, gerekli cihaz özelliklerinin elde edilmesi açısından önemlidir. KJICM'nin yanal çözünürlüğünü ve alan derinliğini tahmin etmeye yönelik ilişkiler, iğne diyaframının parlak bir nokta olan küçük bir açıklığa sahip olduğu varsayımıyla elde edilir. Gerçekte, iğne diyaframının boyutu sınırlıdır ve cihazın enine çözünürlüğü ve eksen boyunca odak düzlemine göre kaydırılan numunenin aydınlatılmış elemanlarının parlaklığı buna bağlıdır. z, ve alan derinliği. Küçük iğne diyafram çaplarında ışık akısı düşük olur, bu da sinyal-gürültü oranını düşürür ve kontrastı azaltır. Daha büyük çaplarda, açıklık azaltılarak iğne diyaframının etkinliği azaltılır.

Temel kavram

Minsk patentinden eş odaklı nokta sensörü prensibi

Konfokal mikroskopinin prensibi 1957'de Marvin Minsky tarafından patentlendi ve geleneksel geniş alanlı floresans mikroskoplarının bazı sınırlamalarının üstesinden gelmeyi hedefliyor. Geleneksel (yani geniş alanlı) bir floresans mikroskobunda, numunenin tamamı ışık kaynağından gelen ışıkla eşit şekilde doldurulur. Numunenin optik yoldaki tüm parçaları aynı anda uyarılır ve ortaya çıkan floresans, büyük odak dışı arka plan kısmı da dahil olmak üzere bir fotodetektör mikroskobu veya kameralar kullanılarak tespit edilir. Buna karşılık, eş odaklı bir mikroskop, sinyalin odağını bozmak için bir aydınlatma noktası (nokta yayılma fonksiyonuna bakın) ve dedektörün ön kısmındaki optik olarak eşleştirilmiş bir düzlemde küçük bir delik kullanır; "eş odaklı" adı bu konfigürasyondan gelir. Odak düzlemine çok yakın floresans tarafından yayılan ışık tespit edilebildiğinde, optik çözünürlükteki görüntü, özellikle numunenin derinlik yönünde, geniş alan mikroskoplarından çok daha iyidir. Bununla birlikte, numuneden gelen floresan ışığın çoğu delik tarafından engellendiğinden, bu artan çözünürlük, sinyal yoğunluğunun azalması pahasına gerçekleşir; bu nedenle, genellikle uzun pozlamalar gerekir. Bu sinyal düşüşünü telafi etmek için delik Işık yoğunluğu, ışık sinyalini bir bilgisayar tarafından kaydedilen bir elektrik sinyaline dönüştüren, genellikle bir fotomultiplier tüp (PMT) veya bir çığ fotodiyodu olan hassas bir dedektör kullanılarak tespit edilir.

Numunedeki bir nokta aynı anda aydınlatıldığında, 2D veya 3D görüntülerin numunedeki düzenli bir raster (yani paralel tarama çizgilerinden oluşan dikdörtgen bir desen) üzerinden taranması gerekir. Işın, bir veya daha fazla (servo kontrollü) salınımlı ayna kullanılarak yatay bir düzlemde numune boyunca taranır. Bu tarama yöntemi tipik olarak düşük reaksiyon gecikmesine sahiptir ve tarama hızı değişebilir. Yavaş tarama, daha iyi bir sinyal-gürültü oranı sağlayarak daha iyi kontrast ve daha yüksek çözünürlük sağlar.

Ulaşılabilir odak düzlemi kalınlığı öncelikle kullanılan ışığın dalga boyunun o merceğin sayısal açıklığına bölünmesiyle ve aynı zamanda numunenin optik özellikleriyle belirlenir. İnce optik kesit alma, bu tür mikroskopları özellikle 3 boyutlu görüntülemede ve numunelerin yüzey profilini çıkarmada iyi kılar.

Ardışık dilimler, bir 3 boyutlu görüntü oluşturmak için belirli bir yazılım tarafından işlenebilen veya 2 boyutlu bir yığın halinde birleştirilebilen bir "Z yığını" oluşturur (ağırlıklı olarak maksimum piksel yoğunluğu alınır; diğer yaygın yöntemler arasında standart sapma veya piksel yığılması).

Konfokal mikroskopi, minimum numune hazırlama ve yanal çözünürlükte çok az gelişme ile sağlam, yağlı ve canlı numunelerin doğrudan, invazif olmayan, seri optik kesitlerinin alınmasına olanak sağlar. Biyolojik numuneler, seçilen nesnelerin görünür hale getirilmesi için sıklıkla floresan boyalarla işlenir. Bununla birlikte, biyolojik sistemlerdeki bozulmayı en aza indirmek için gerçek boya konsantrasyonu düşük tutulabilir: bazı cihazlar tek tek floresan moleküllerini izleyebilir. Ek olarak transgenik teknikler, kendi kimerik floresan moleküllerini üreten organizmalar yaratabilir (örneğin, GFP, yeşil floresan proteininin ilgilenilen bir proteinle füzyonu). Konfokal mikroskoplar, bir numunedeki nokta uyarımı (nokta ile sınırlı kırınım) ve ortaya çıkan floresan sinyal noktasının saptanması prensibiyle çalışır. Dedektör üzerindeki iğne deliği, odak dışı floresansı engelleyen fiziksel bir bariyer sağlar. Airy diskinin yalnızca odağı veya merkezi noktası kaydedilir. Raster örneği tek bir noktada tarar ve Z odağını değiştirerek ince optik bölümlerin toplanmasına olanak tanır. Ortaya çıkan görüntüler, numunenin 3 boyutlu görüntüsünü oluşturmak için istiflenebilir.

Yatay tarama için kullanılan yöntemler

Dört tip konfokal mikroskop ticari olarak mevcuttur:

Eş odaklı lazer tarama mikroskopları, lazeri numune üzerine taramak ve sabit bir iğne deliği ve detektör yoluyla görüntüyü "temizlemek" için birden fazla ayna (genellikle x ve y ekseni boyunca doğrusal olarak 2 veya 3 tarama) kullanır.

Faydalar

CLSM, hücre biyolojisi ve genetiğinden mikrobiyoloji ve gelişim biyolojisine kadar birçok biyolojik bilimsel disiplinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Aynı zamanda kuantum optik ve nanokristalin görüntüleme ve spektroskopide de kullanılır.

Biyoloji ve Tıp

Aktin filamentlerinin bir hücre boyunca dağılımını gösteren eş odaklı mikroskopi görüntüleri yığınının bir örneği.

Klinik olarak CLSM, çeşitli oküler hastalıkların değerlendirilmesinde kullanılır ve özellikle korneadaki endotel hücrelerinin görüntüleme, niteliksel analizi ve miktarının belirlenmesi için faydalıdır. Keratomikoz vakalarında kornea stromasındaki filamentli mantar elemanlarının varlığını lokalize etmek ve tanımlamak için kullanılır, hızlı tanıya ve dolayısıyla kesin tedavinin erken kurulmasına olanak tanır. Endoskopik prosedürler (endomikroskopi) için CLSM tekniklerine ilişkin araştırmalar da umut vericidir. İlaç endüstrisinde, ilaç dağıtımının kalitesini ve tekdüzeliğini kontrol etmek için ince farmasötik film formlarının üretim sürecinin izlenmesi tavsiye edilmiştir.

Optik ve kristalografi

CLSM, bazı 3 boyutlu optik veri depolama sistemlerinde bir veri alma mekanizması olarak kullanılır ve Magdalene papirüsünün yaşının belirlenmesine yardımcı olur.

Seçenekler ve iyileştirme

Geliştirilmiş eksenel çözünürlük

Nokta yayılma fonksiyonu, genişliğinin birkaç katı olan bir nokta elipsoididir. Bu, mikroskobun eksenel çözünürlüğünü sınırlar. Bunun üstesinden gelmenin bir yöntemi, gelen ve yayılan ışığın elipsoidin hacmini azaltmak için numunenin hem üstüne hem de altına müdahale edebildiği 4π mikroskopidir. Alternatif teknik konfokal mikroskopi teta. Bu teknikte aydınlatıcı ışık konisi ve algılama ışığı birbirine açılı olarak konumlandırılır (en iyi sonuçlar dik olduklarında). İki handikap fonksiyonunun kesişimi çok daha küçük bir etkin örnek hacmi verir. Bundan tek düzlemli bir aydınlatma mikroskobu geliştirildi. Ek olarak, odak dışı ışığı ortadan kaldırmak ve hem eksenel hem de yanal düzlemlerdeki kontrastı iyileştirmek için deneysel olarak türetilmiş bir nokta yayma işlevi kullanılarak ters evrişim kullanılabilir.

Süper çözünürlük

Uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED) gibi kırınım sınırının altında çözünürlük elde eden eş odaklı varyantlar vardır. Bu tekniğin yanı sıra avuç içi, (e)STORM, SIM kartlar vb. gibi çok çeşitli diğer (eş odaklı olmayan) süper çözünürlük teknikleri de mevcuttur. Hepsinin kullanım kolaylığı, çözünürlük ve özel ekipman, tampon veya florofor ihtiyacı gibi avantajları vardır.

Düşük Sıcaklık Performansı

Düşük sıcaklıklarda numunelerin görüntülenmesi için, her ikisi de lazer taramalı konfokal mikroskopi tabanlı mimariler olmak üzere iki ana yaklaşım kullanılmıştır. Bir yaklaşım, sürekli akışlı bir kriyostat kullanmaktır: yalnızca numune düşük sıcaklıkta tutulur ve şeffaf bir pencere aracılığıyla optik olarak adreslenir. Başka bir olası yaklaşım, optiğin bir kısmını (özellikle objektif bir mikroskobu) kriyojenik bir depolama Dewar şişesine yerleştirmektir. Bu ikinci yaklaşım, daha hantal olmasına rağmen, daha iyi mekanik stabiliteyi garanti eder ve pencereden kaynaklanan kayıpları önler.

Görüntüler

1 Euro'luk madeni paranın yüzeyinin Nipkow disk eş odaklı mikroskobu kullanılarak ölçülen kısmi profili.

1 euroluk madeni paraya ilişkin verilerin yansıması.

hikaye

Başlangıç: 1940-1957

İlk eş odaklı tarama Mikroskop 1955'te Marvin Minskow tarafından yapıldı ve 1957'de patenti alındı. Odak düzlemi aydınlatma noktasının taranması, sahne hareket ettirilerek sağlandı. Hiçbir bilimsel yayın sunulmadı ve bundan yapılmış hiçbir görüntü korunmadı.

Tandem tarama mikroskobu

Petran'ın tandem tarama mikroskobunun şeması. Nipkow diskini belirtmek için kırmızı bir çubuk eklendi.

1960 yılında, Pilsen'deki Charles Üniversitesi'ndeki Çekoslovak Mojmir Petran Tıp Fakültesi, ticarileştirilmiş ilk eş odaklı mikroskopi olan Tandem tarama mikroskobunu geliştirdi. Tracor-North (daha sonra NORAN) tarafından Çekoslovakya ve Amerika Birleşik Devletleri'ndeki küçük bir şirkete satıldı ve çok sayıda mikro delik uyarımı ve emisyonu oluşturmak için dönen bir Nipkow diski kullanıldı.

Çekoslovak patenti 1966 yılında Çekoslovak meslektaşı Petran ve Milan Hadravsky tarafından dosyalandı. Bu mikroskopla elde edilen veri ve görüntülerin yer aldığı ilk bilimsel yayın, 1967 yılında Yale Üniversitesi'nden M. David Egger ve Petran'ın yazdığı Science dergisinde yayımlandı. Bu makalenin dipnotunda Petran'ın mikroskobu tasarladığı ve yapımını denetlediği ve kendisinin kısmen Yale Üniversitesi'nde "araştırma görevlisi" olduğu belirtiliyor. 1968 tarihli ikinci baskı, enstrümanın teorisini ve teknik ayrıntılarını tanımladı ve ek yazarlar olarak Yale Üniversitesi'nde grup lideri Hadravsky ve Robert Galambos'a yer verdi. 1970 yılında bir ABD patenti yayınlandı. 1967'de dosyalanmış.

1969: İlk eş odaklı lazer tarama mikroskobu

1969 ve 1971'de Yale Üniversitesi'nden M. David Egger ve Paul Davidovits, ilk eş odaklılığı anlatan iki makale yayınladılar. lazer tarama mikroskobu. Bu bir tarayıcı noktasıydı, yani yalnızca bir nokta aydınlatması üretildi. Sinir dokusunu gözlemlemek için epi-aydınlatma-yansıma mikroskopisini kullanır. 633 nm dalga boyuna sahip 5 mW helyum-neon lazer, yarı saydam bir aynadan gelen ışığı hedefe doğru yansıttı. Hedef, odak uzaklığı 8,5 mm olan basit bir mercekti. Önceki ve en yeni sistemlerin hepsinden farklı olarak, örnek, odak noktasının hareket etmesine neden olan bu merceğin (tarama hedefi) hareket ettirilmesiyle taranıyordu. Yansıyan ışık yarı saydam aynaya geri döndü, iletilen kısım başka bir mercek tarafından, arkasına fotomultiplikatör tüpünün yerleştirildiği nokta tespitine yönlendirildi. Sinyal bir CRT osiloskopu kullanılarak görselleştirildi; elektron ışını eşzamanlı olarak hedefe aktarıldı. Özel bir cihaz, üçü 1971 tarihli bir yayında yer alan Polaroid fotoğraflarını çekmeyi mümkün kıldı.

Yazarlar in vivo çalışmalar için floresan boyalar üzerinde düşünüyorlar. O zamanlar New York'taki Albert Einstein Tıp Fakültesi'nde doktora öğrencisi olan ve "Minsky mikroskobu" ile bir lazer kullanmayı öneren bir eş odaklı çizgi tarama mikroskobu geliştirdiği Steve Baer sayesinde Minsky patentinden bahsediyorlar ve teşekkürler Mikroskopunun geliştirilmesine yol açan tartışmalar için Galambos, Hadravsky ve Petran'a. Bunların geliştirilmesindeki motivasyon, Tandem taramalı mikroskopide aydınlatıcı ışığın yalnızca 10-7'lik bir kısmının gözün bir kısmındaki görüntünün oluşturulmasında yer almasıydı. Bu nedenle çoğu biyolojik çalışma için görüntü kalitesi yeterli değildi.

1977-1985: Lazerli ve sahne taramalı nokta tarayıcılar

1977'de Colin JR Sheppard ve Tony Wilson, eş odaklı epi-lazerle aydınlatılan, tarama aşaması ve fotoçoğaltıcı tüp dedektörlerini tanımladılar. Sahne, optik seri bölümlere izin verecek şekilde optik eksen (Z ekseni) boyunca hareket ettirilebilir.

1979'da Fred Brakenhoff ve meslektaşları, optik kesit almanın ve geliştirilmiş çözünürlüğün teorik faydalarının pratikte gerçekten elde edilebilir olduğunu gösterdiler. 1985 yılında bu grup, biyolojik sorulara cevap verebilecek ilgi çekici eş odaklı mikroskopi görüntülerini yayınlayan ilk grup oldu. Kısa bir süre sonra çok daha fazla grup, teknolojik sınırlamalar nedeniyle hâlâ gizemini koruyan bilimsel soruları yanıtlamak için eş odaklı mikroskopiyi kullanmaya başladı.

1983 yılında Oxford'dan IJ Cox ve S. Sheppard, bilgisayar kontrollü eş odaklı mikroskop üzerine ilk çalışmayı yayınladı. İlk ticari lazer tarama mikroskobu olan sahne tarayıcısı SOM-25, 1982'den itibaren Oxford Optoelectronics tarafından (BioRad'ın birkaç TAKE-frame satın almasının ardından) teklif edildi. Oxford grubunun tasarımına dayanıyordu.

1985'ten beri: Işın taramalı lazer nokta tarayıcıları

1980'lerin ortalarında, Cambridge'deki Moleküler Biyoloji Laboratuvarı'nda çalışan William Bradshaw Amos ve John Graham White ve meslektaşları, ilk eş odaklı ışın taramalı mikroskobu inşa etti. Örnek aşaması hareket etmez, bunun yerine noktayı aydınlatarak daha hızlı görüntü alımına olanak tanır: her biri 512 satırlık saniyede dört görüntü. Işın yolunun 1-2 metre uzunluğunda olması ve ~1 mm çapındaki geleneksel iris diyaframının "iğne deliği" olarak kullanılmasına izin vermesi nedeniyle ara görüntüler büyük ölçüde abartılmıştır. İlk mikrograflar, dijital kameranın eklenmesinden önce uzun süre filme maruz bırakılarak çekildi. Daha fazla iyileştirme, ilk kez hazırlığa ölçeklendirme yapılmasına olanak sağladı. Zeiss aynı sıralarda İsveçli Sarastro şirketi tarafından dağıtılan ticari CLSM'nin de yolunu açtı. Kuruluş 1990 yılında Molecular Dynamics tarafından satın alındı, ancak sonunda CLSM durduruldu. Almanya'da 1984 yılında kurulan Heidelberg Instruments, başlangıçta biyolojiden çok endüstriyel uygulamalara yönelik olan CLSM'yi geliştirdi. Bu belge 1990 yılında Leica Lasertechnik'e devredildi. Zeiss zaten piyasada bulunan, eş odaklı olmayan bir uçan nokta lazer tarama mikroskobuydu ve daha sonra eş odaklı bir mikroskoba yükseltildi. 1990 raporunda "bazı" üretici konfokallerinin listelendiği belirtildi: Sarastro, Teknik Cihazlar, Meridian Cihazlar, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic ve Zeiss.

1989 yılında Fritz Karl Preikschat, oğlu Ekhard Preikschat ile birlikte parçacık boyutu analizi için lazer diyot tarama mikroskobunu icat etti. O ve Ekhard Preikschat, ticarileştirmek için Lasentec'i kurdu. 2001 yılında Lasentec, Mettler Toledo (NYSE: MPD) tarafından satın alındı. Büyük saflaştırma sistemlerinde kristalizasyon sürecinin yerinde kontrolünü sağlamak için başta ilaç endüstrisinde olmak üzere dünya çapında yaklaşık on bin sistem kurulmuştur.

İki fotonlu uyarma mikroskobu: Her ne kadar uygun teknolojiyi kullansalar da (her ikisi de lazer taramalı mikroskoplar), multifoton floresans mikroskopları tam olarak eş odaklı mikroskoplar değildir. Terim eş odaklı varlığından dolayı ortaya çıkar açıklık V eşlenik odak düzlemi(eş odaklı). Bu diyafram genellikle multifoton mikroskoplarda yoktur.
Toplam iç yansımalı floresan mikroskobu (TIRF) o
eş odaklı mikroskopi
- Sanal CLSM (Java tabanlı)
- Floresan ve eş odaklı mikroskoplar da dahil olmak üzere farklı mikroskop türlerine ilişkin animasyon ve açıklamalar. (Paris Sud Üniversitesi)

Konfokal mikroskopi, ayarlanabilir alan derinliği, görüntüyü bozan odak dışı bilgilerin hariç tutulması ve kalın numunelerin optik kesitlerinin sıralı olarak analiz edilebilmesi gibi geleneksel optik mikroskopiye göre çok sayıda avantaja sahiptir. Konfokal yöntemin özü, numunenin kalınlığı odak düzleminden daha büyük olduğunda, numunenin odak dışı (arka plan aydınlatması) kısmından gelen ışığı kesmek için uzamsal filtrelemenin kullanılmasıdır. Son yıllarda, kısmen geleneksel optik mikroskopi için hazırlanan numunelerin son derece yüksek kalitede görüntülerinin elde edilmesinin kolaylığı ve kısmen de günümüzde araştırma konusu olan pek çok alandaki geniş uygulama yelpazesi nedeniyle, eş odaklı mikroskopinin popülaritesinde bir patlama yaşandı. .

Temel konseptler

Modern cihazlar ilk versiyonlardan önemli ölçüde farklı olmasına rağmen, Marvin Minsky'nin öncülüğünü yaptığı ve 1957'de patenti alınan eş odaklı görüntüleme ilkesi tüm modern eş odaklı mikroskoplarda kullanılmaktadır. Geleneksel geniş alan mikroskoplarında, numunenin tamamı bir cıva veya ksenon ışık kaynağı ile aydınlatılır ve görüntü ya görsel olarak gözlemlenir ya da bir görüntü kaydediciye ya da fotoğraf filmine yansıtılır. Konfokal mikroskopla görüntü oluşturma yöntemi temelde farklıdır. Aydınlatma, numunenin tüm yüzeyinin, genellikle bir lazer ark kaynağından gelen bir veya daha fazla odaklanmış ışık ışınıyla taranmasıyla gerçekleştirilir. Numunenin aydınlatılan alanı bir mercekle odaklanır ve daha sonra bilgisayar kontrollü bir tarama cihazı kullanılarak taranır. Numuneden gelen ışık ışınlarının dizisi, çıktısı bilgisayarda görüntülenen bir görüntüye dönüştürülen bir fotomultiplier tüp (PMT) tarafından bir iğne deliği diyaframı (veya bazı durumlarda bir yarık diyafram) aracılığıyla tespit edilir. Lekesiz numuneler yansıyan ışıkla gözlenebilmesine rağmen genellikle bir veya daha fazla floresan boyayla işaretlenirler.

Görüntü elde etme yöntemleri

Konfokal mikroskopi, çok sayıda farklı türde numuneyi incelemek için çeşitli görüntüleme teknikleri kullanır. Bunların hepsi, göreceli olarak kalın bölümler halinde veya tüm numunede (tüm montaj) optik bölümler adı verilen yüksek çözünürlüklü görüntülerin elde edilmesine yönelik teknik yeteneğe dayanmaktadır. Optik dilim görüntünün temel öğesidir. Görüntüler, tekli, ikili, üçlü ve çoklu dalga boylu aydınlatma modları altında birleştirilmiş ve boyanmış numunelerin gözlemlenmesiyle elde edilir ve farklı aydınlatma ve boyama teknikleri kullanılarak oluşturulan görüntüler birbiriyle doğru şekilde ilişkilendirilir. Canlı bir hücrenin görüntülerini ve geçici olarak açılmış bir görüntü dizisini (belirli bir zaman aralığında görüntülerin kaydedilmesi) elde etmek mümkündür ve görüntü dizilerine uygulanan sayısal işleme yöntemleri, bir z- dizisinden entegre bir bütün görüntünün oluşturulmasına olanak tanır. eksen görüntüleri ve örneklerin üç boyutlu görüntülerinin yanı sıra üç boyutlu verilerin zaman dizisinde temsili, yani dört boyutlu bir görüntü. Yansıyan ışık kullanılarak görüntülenen ilk eş odaklı mikroskoplar, ancak gerçekte, mikroskopide yaygın olarak kullanılan herhangi bir iletilen ışık kaynağını kullanarak görüntüleme yapmak için bir lazer taramalı eş odaklı mikroskop kullanılabilir.

Resim Oluşturma

Eş odaklı mikroskoplarla numune hazırlama ve görüntüleme prosedürleri esasen geleneksel geniş alan mikroskopisinde yıllar içinde geliştirilen prosedürlerdir. Biyotıpta, konfokal mikroskopinin ana uygulaması, tipik olarak bir veya daha fazla floresan etiketle boyanan bağlı veya canlı hücrelerin ve dokuların görüntülenmesidir. Nispeten basit protokollere dahil edilebilecek ve belirli hücresel organelleri ve yapıları boyamak için kullanılabilen çok sayıda farklı floresan boya vardır. Mevcut çok çeşitli boyalar arasında, örneğin çekirdek, Golgi aygıtı, endoplazmik retikulum, mitokondri için boyaların yanı sıra hücrelerde polimerize aktin olduğunu gösteren floresan falloidin gibi boyalar da bulunur. Kullanılan numune hazırlama yönteminden bağımsız olarak, eş odaklı mikroskopinin temel avantajı, birden fazla görüntünün eşzamanlı olarak elde edilmesi ve bunların bir bilgisayarda dijital sunumundan kaynaklanan görüntü sunumu ve analizindeki esnekliktir.

Konfokal mikroskopinin kritik yönleri

Floresan mikroskobunda kantitatif 3 boyutlu görüntüleme, kontrollü ve kontrolsüz deneysel miktarlar veya mikroskop konumlandırma ve düzen sorunları nedeniyle numune hazırlama sırasında ortaya çıkan yapaylıklar nedeniyle sıklıkla karmaşık hale gelir. Dr. James B. Pauley tarafından yazılan bu makale, geniş alanlı floresans ve eş odaklı mikroskopide elde edilen sonuçları sıklıkla gizleyen en yaygın dış faktörleri sistematik hale getirmektedir. Tartışılan konular arasında lazer sistemi, optik bileşenlerin hizalanması, objektif büyütme, beyazlatma eserleri, sapmalar, immersiyon yağı, lamel kalınlığı, kuantum verimliliği ve numune ortamı yer almaktadır.

Çok renkli eş odaklı mikroskopide sapmalar

Tasarım iyileştirmeleri, eş odaklı mikroskopiyi, hücre biyolojisi araştırmaları için ortak bir araç haline gelecek kadar basitleştirdi. Ancak eş odaklı mikroskoplar daha güçlü hale geldikçe, optiklerine yönelik talepler de arttı. Aslında, geniş alan mikroskopisinde küçük görüntü kusurlarına neden olan optik sapmalar, konfokal mikroskopide yıkıcı etkilere sahip olabilir. Ne yazık ki, eş odaklı mikroskopinin katı optik gereklilikleri çoğu zaman zayıf bir mikroskopla bile keskin görüntüleri garanti eden optik sistemler tarafından gizlenmektedir. Optik üreticileri, belirli uygulamalar için tasarlanmış birçok farklı mikroskop lensi üretir. Bu makale, nesnel değiş tokuşların eş odaklı mikroskopiyi nasıl etkilediğini göstermektedir.

Konfokal mikroskopide üç renkli görüntüleme

Bir, iki ve üç etiketle etiketlenmiş floresan numunelerin dijital görüntülerini elde etmek için yaygın olarak bir lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM) kullanılır. Kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) renklerin kullanımı, her bir göreceli konum için tamamlayıcı bir renk kullanıldığında ve farklı renkteki görüntüler tek bir üçlü görüntü oluşturduğunda, üçe kadar floresan hücre işaretinin ışık dağılımını temsil etme açısından en bilgilendiricidir. renk deseni. Bu bölümde, popüler görüntü işleme programı Adobe Photoshop'u kullanarak üç renkli eş odaklı görüntüler elde etmek için yakın zamanda yayınlanan bir yöntemin basitleştirilmiş versiyonuna bakacağız. Ek olarak, eş odaklı görüntü sunumu için üç renkli bir görüntüleme protokolü oluşturmaya yönelik çeşitli uygulamalar tartışılmaktadır. Bu sayısal yöntemlerin LSCM görüntüleri ile sınırlı olmadığını ve diğer kaynaklardan Photoshop'a aktarılan dijital görüntülere de uygulanabileceğini akılda tutmakta fayda var.

Konfokal Yansıma Mikroskobunun Temelleri

Konfokal yansıma mikroskobu, nispeten az bir ek çaba ile bir numune hakkında ek bilgi elde etmek için kullanılabilir çünkü teknikler minimum numune hazırlama ve ekipman değişimi gerektirir. Ek olarak, eş odaklı yansıma mikroskobu ile boyanmamış dokulardan elde edilen bilgiler, ışığı yansıtan boyalı örneklerden elde edilen veriler kadar kolaylıkla elde edilebilir. Bu yöntem aynı zamanda daha yaygın floresan görüntüleme teknikleriyle birleştirilebilir. Son uygulamaların örnekleri arasında, floresanla boyanmış hücrelerden oluşan bir popülasyon içindeki boyanmamış hücrelerin kaydedilmesi ve opak yapılı bir substrat üzerinde büyüyen floresanla boyanmış hücreler arasındaki etkileşimlerin gözlemlenmesi yer alır.

Konfokal Resim Galerisi

Nikon MicroscopyU Eş Odaklı Görüntü Galerisi, Nikon PCM-2000 eş odaklı mikroskop ile Eclipse E-600 dik mikroskop kullanılarak elde edilen bir dizi dijital görüntüdür. Numunenin farklı düzlemlerindeki optik kesitlerin bir dizi görüntüsü, mikroskobun optik ekseni boyunca taranarak elde edildi. Dizi, bir dizi dilimi otomatik olarak "oynatmanıza" veya bunları slaytlar gibi ileri geri kaydırmanıza olanak tanıyan etkileşimli bir Java uygulamasıyla temsil edilir.

Lazer taramalı eş odaklı mikroskopi

Tipik olarak mikroskoplar tarafından üretilen kalın numunelerin görüntülerinin doğasında bulunan zayıf kontrast olgusunun üstesinden gelmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Eş odaklı ve ters evrişim teknikleri, orta kalınlıkta numunelerin (5 ila 15 mikron) önemli ölçüde daha iyi görüntülerini üretir. En kalın örneklerin (20 mikron veya daha fazla) görüntüleri, odak dışı alanlardan gelen yüksek ortam ışığına maruz bırakıldığında bozulur ve belki de en iyi şekilde eş odaklı mikroskopi teknikleriyle elde edilir. Bu öğreticiyi kullanarak örnekler, sanal bir eş odaklı mikroskop kullanılarak z ekseni boyunca bir dizi optik bölüm olarak sunulur.

Yansıma eş odaklı mikroskopi

Entegre devrelerin bireysel yüzey katmanlarını keşfetmek için bu öğreticiyi kullanın. Rehberlik amaçlı dijital görüntüler, Nikon Optiphot C200 yansıma eş odaklı mikroskop kullanılarak elde edildi. Her seri için, mikroskop silikon kristalin yüzeyindeki devreler mozaiğinin derinliklerine (1 mikrometrelik artışlarla) nüfuz edip odaklandıkça z ekseni boyunca bir dizi optik bölüm kaydedildi.

Temel hükümler

Geleneksel mikroskopi ile karşılaştırıldığında, konfokal mikroskopi, incelenen numuneye sığ bir penetrasyon derinliği, arka plan aydınlatmasının olmaması ve kalın numunelerden bir dizi optik kesit elde etme yeteneği dahil olmak üzere çeşitli avantajlara sahiptir. Biyotıpta, eş odaklı mikroskopinin ana uygulaması, tipik olarak bir veya daha fazla floresan etiketle etiketlenen bağlı veya canlı hücrelerin ve dokuların görüntülenmesidir.

Pirinç. 1. Konfokal mikroskopide ışın yolunun şeması

Floresan numuneleri geleneksel bir geniş alan mikroskobu ile görüntülerken, numunenin çalışma dışındaki alanlardan yaydığı ikincil parlaklık genellikle odaktaki özelliklerin görüntüsünün netliğini etkiler. Bu özellikle 2 mikrometreden daha kalın numuneler için problemlidir. Konfokal mikroskopi hem eksenel hem de düzlem içi çözünürlükte mütevazı gelişmeler sağlar; Ancak son zamanlarda bu araştırma yönteminin popülaritesinde bir artışa neden olan şey, büyük kalınlıktaki floresanla boyanmış numunelerde oluşan arka plan ışığını ortadan kaldırma yeteneğidir. Kullanımı nispeten kolay olduğundan çoğu modern eş odaklı mikroskop, birçok çok kullanıcılı görüntüleme sisteminin temel ekipmanının bir parçası haline gelmiştir. Lazer taramalı eş odaklı mikroskobun (LSCM) elde ettiği çözünürlük, geleneksel geniş alanlı optik mikroskoptan biraz daha iyi olmasına rağmen yine de transmisyon elektron mikroskobunun çözünürlüğünden önemli ölçüde daha düşük olduğundan, bir anlamda en yaygın iki araştırma yöntemi. Şekil 1, temel konfigürasyonlu bir eş odaklı mikroskopta ışığın geçişine ilişkin şematik bir diyagramı göstermektedir.

Geleneksel geniş alan mikroskoplarında numunenin tamamı cıva veya ksenon ışık kaynağıyla aydınlatılır ve görüntü ya görsel olarak gözlemlenir ya da bir görüntüleyiciye ya da fotoğraf filmine yansıtılır. Konfokal mikroskopla görüntü elde etme yöntemi temelde farklıdır. Numune, genellikle bir lazer olan bir veya daha fazla odaklanmış ışınla taranarak aydınlatılır (Şekil 2). Numunenin taranmasıyla elde edilen görüntülere bu nedenle optik kesitler adı verilir. Bu terminoloji, numunenin fiziksel olarak parçalara ayrılması yerine odaklanmış ışık kullanılarak görüntülerin elde edildiği, invaziv olmayan bir test tekniğini ifade eder.

Pirinç. 2. Örneklerin geniş alan ve nokta taraması

Eş odaklı mikroskopi, canlı örneklerin incelenmesini büyük ölçüde basitleştirerek üç boyutlu (z serisi) veri elde etmeyi mümkün kıldı ve çok lekeli örneklerin görüntülenme sürecini geliştirdi. Şekil 3, geleneksel bir episkopik floresans görüntüsünü, propidyum iyodür lekeli epitelyuma sahip bir kelebek pupasının tüm montajının aynı bölümlerinin konfokal görüntüsüyle karşılaştırmaktadır. Odak dışı floresan emisyonunun ortadan kaldırılması nedeniyle, çözünürlükte etkileyici bir artış ve bunun sonucunda LSCM görüntüsündeki çekirdeklerin görüntüsünün keskinliği belirgindir.

Lazer taramalı eş odaklı mikroskop (LSCM)

LSCM artık biyotıpta kullanılan konfokal mikroskopların en yaygın versiyonudur. Giriş bölümünde, bu mikroskopların tasarımı ve yapısı acemi kullanıcıların bile onlarla çalışmasına izin verdiği için LSCM'ye özel önem verilmektedir. Diğer tasarım çözümleri biyolojide kendi özel alanlarını işgal etti. Eş odaklı bir mikroskobun herhangi bir modeli veya modifikasyonu için, ters evrişim ve çoklu foton teknikleri gibi optik kesite dayalı diğer teknikler gibi, numune hazırlama kurallarının çoğu, küçük değişikliklerle birlikte geçerlidir.

Konfokal mikroskopinin gelişimi

Eş odaklı mikroskobun icadı, 1955'te çalışan bir mikroskobu yaratan Marvin Minsky'ye atfedilir. Konfokal mikroskopinin gelişimi büyük ölçüde canlı dokudaki (in vivo) biyolojik süreçleri gözlemleme arzusundan kaynaklandı ve Minsky'nin hedefi, canlı bir beynin boyanmamış bir preparasyonundaki sinir ağını görüntülemekti. Minsky'nin öncülük ettiği ve 1957'de patenti alınan eş odaklı mikroskopi ilkeleri, tüm modern eş odaklı mikroskoplarda kullanılmaktadır. Şekil 1, floresan görüntülemede kullanılan tüm modern konfokal sistemlerin temelini oluşturan epifloresan mikroskobuna uygulanan konfokal prensibi açıklamaktadır. Orijinal konfigürasyonda Minsky, iğne deliği ışık kaynağı olarak kullanılan zirkonyum ark ışık kaynağının karşısına yerleştirilmiş bir iğne deliği (diyafram) kullandı.

Pirinç. 3. Kelebek kanadı epiteli

Bir nokta kaynağından gelen ışık, örnekteki belirli bir odak düzlemindeki bir mercek tarafından bir nokta şeklinde odaklandı ve içinden geçerek ikinci bir mercek tarafından, odak düzleminde olan ikinci bir iğne deliğine (iğne deliği) odaklandı. ilki (eş odaklıydılar, yani eş odaklıydılar). İkinci iğne deliğinden geçen ışınlar, örnekten gelen ışığın parlaklığına bağlı olarak bir sinyal üreten düşük gürültülü bir fotoçoğaltıcı tüpe çarptı. İkinci bir iğne deliği, fotoçoğaltıcı tüpten alınan numunedeki odak düzleminin üstündeki veya altındaki bölgelerden gelen ışığı keser. Odak düzleminden daha kalın örneklerle çalışırken odak dışı ışığı ve parlamayı ortadan kaldırmak için uzaysal filtrelemenin kullanılması, eş odaklı mikroskopinin temel ilkesidir. Minsky, çalışmasında, tasarımı günümüzde kullanılan sistemlerin temeli haline gelen, tek mercekli ve dikromatik aynalı bir yansıma mikroskobunu da tanımladı.

Konfokal bir görüntü elde etmek için numuneyi ışık bir noktaya odaklanarak taramak gerekir. Minsky tarafından monte edilen orijinal cihazda ışık huzmesi sabitti ve numunenin kendisi titreşimli bir platform üzerinde hareket ediyordu. Tarama ışınının mikroskobun optik eksenine göre hareketsizliği bu kurulumun bir avantajıydı çünkü görüntüyü bozabilecek çoğu optik kusuru ortadan kaldırıyordu. Ancak biyolojik örnekleri incelerken bu durum dalgalanmalara ve bozulmalara neden olabilir ve sonuç olarak çözünürlük ve görüntü netliği kaybına yol açabilir. Üstelik, sahneyi ve numuneyi hareket ettirirken, örneğin floresanla boyanmış hücrelerin mikroenjeksiyonları gibi herhangi bir manipülasyonun gerçekleştirilmesi imkansızdır.

Ancak numuneyi tarama yöntemi ne olursa olsun görüntüsünün elde edilmesi gerekir. Ve Minsky'nin orijinal tasarımı gerçek bir görüntü üretmiyordu çünkü fotoçoğaltıcı tüpten gelen çıktı, ordu tarafından kullanılan ve kaydedicisi olmayan uzun ömürlü bir osiloskopa besleniyordu. Minsky daha sonra görüntülerinin ezici kalitesinin mikroskobun düşük çözünürlüğünden değil, osiloskop ekranının düşük çözünürlüğünden kaynaklandığını yazdı. Teknoloji eksikliği nedeniyle Minsky'nin özellikle biyolojik yapıları görüntülerken eş odaklı yöntemin tam potansiyelini tam olarak gösteremediği artık açık. Kendisi, ortaya çıkan görüntülerin kalitesinin her zaman öncelikli olduğu biyologlardan oluşan çok talepkar bir topluluk tarafından konfokal mikroskopinin hemen kabul edilmemesinin nedeninin bu olabileceğini belirtti. O zamanlar, son derece hassas renkli film üzerinde parlak renkli histolojik kesitleri gözlemlemelerine ve fotoğraflamalarına olanak tanıyan mükemmel optiklere sahip ışık mikroskopları ellerindeydi. Modern eş odaklı mikroskoplarda görüntüler, bir fotoçoğaltıcı tüpten gelen sinyallerden üretilir veya dijital şarj bağlantılı bir cihaz kamerası tarafından yakalanır, doğrudan bir bilgisayar görüntüleme sistemi tarafından işlenir ve yüksek çözünürlüklü bir ekranda ve üstün kalitede görüntü dokümantasyon cihazında görüntülenir. Modern bir lazer taramalı konfokal mikroskobun diyagramı Şekil 4'te gösterilmektedir.

Pirinç. 4. Modern bir lazer taramalı eş odaklı mikroskobun şeması

Bir optik mikroskobun temel optikleri onlarca yıldır temel olarak değişmemiştir, çünkü cihazın nihai çözünürlüğü dalga boyu, objektif lens ve numunenin kendi özellikleri tarafından belirlenmektedir. Numunelerin kontrastını arttırmak için kullanılan boyalar ve diğer optik mikroskopi teknikleri, son 20 yılda önemli ölçüde gelişme gösterdi. Eş odaklı yöntemin yükselişi ve gelişmesi, büyük ölçüde modern teknolojilerin başarısının neden olduğu optik mikroskopinin yeniden canlanmasının bir sonucuydu. Minsky'nin tasarımına fayda sağlayabilecek teknolojik ilerlemelerin çoğu, yavaş yavaş biyologların ve diğer mikroskopçuların kullanımına (ve uygun fiyatlı) sunuluyor. Bunlar arasında, gelişmiş nokta ışık kaynakları olarak kullanılan kararlı çok frekanslı lazerler, geliştirilmiş dikromatik aynalar, hassas düşük gürültülü fotodetektörler, gelişmiş yeteneklere sahip yüksek hızlı mikro bilgisayarlar (yüksek kapasiteli belleğin varlığı nedeniyle), gelişmiş görüntüleme yazılımı, yüksek çözünürlüklü monitörler ve dijital yazıcılar.

Bu teknolojiler bağımsız olarak geliştirildi ve 1955'ten bu yana kademeli olarak eş odaklı görüntüleme sistemlerine entegre edildi. Örneğin, dijital görüntü işleme teknikleri ilk kez 1980'lerin başında Woods Hole Oşinografi Enstitüsü'ndeki araştırmacılar tarafından başarıyla kullanıldı. "Video mikroskopları" adını verdikleri şeyi kullanarak, mikrotüplerin hücresel yapısının optik mikroskobun teorik çözünürlük sınırından daha küçük görüntülerini elde edebildiler. Çözünürlükteki gözle görülür artış, dijital görüntü işlemcisine bağlı yüksek hassasiyetli süper silikon (SIT) video kamera tarafından çekilen görüntülerin dijital optimizasyonu sayesinde mümkün oluyor. Hücresel yapılar, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optikleri ve daha ileri dijital görüntü işleme kullanılarak görselleştirildi.

Konfokal mikroskop tasarımlarının sınıflandırılması genellikle numunenin taranma yöntemine dayanmaktadır. İki ana tarama yöntemi vardır: sahne taraması ve aydınlatma ışını taraması; ve ışını taramanın en az iki yolu. Minsky'nin orijinal enstrümanı, oldukça yavaş bir görüntü üreten, ilkel bir diyapazon jeneratörü tarafından çalıştırılan bir sahne tarama sistemine dayanıyordu. Prototiplerinin çok ötesine geçen, sahne taramalı modern eş odaklı kurulumlar esas olarak malzeme biliminde, örneğin mikro kristallerin üretiminde kullanılmaktadır. Bu prensibe dayalı sistemler son zamanlarda mikrokristaller üzerinde DNA analizinin yapıldığı biyomedikal alanlarda popüler hale gelmiştir.

Biyolojik sistemlerin görüntülenmesi için daha pratik bir alternatif, sabit bir numunenin ışınla taranmasıdır. Bu prensip, geliştirilmesi günümüzün popüler araştırma mikroskoplarının ortaya çıkmasına yol açan birçok ölçüm sisteminin temelini oluşturmaktadır. Bu girişte eş odaklı mikroskopinin teknik detaylarına girmeyeceğiz, ancak temelde iki farklı ışın tarama tekniğini kullanıyor: çok ışınlı tarama ve tek ışınlı tarama. Tek ışınlı tarama günümüzde en yaygın olanıdır ve LSCM'de kullanılan da bu yöntemdir. Burada ışın, galvanometrelerle çalıştırılan bilgisayar kontrollü aynalar kullanılarak saniyede bir kare hızla taranır. Yaklaşık video kare hızında daha hızlı tarama elde etmek için bazı sistemler akustik optik cihaz veya salınımlı aynalar kullanır. Alternatif bir yöntem, genellikle dönen bir Nipkow diskinin bir varyasyonunu kullanarak, neredeyse gerçek zamanlı tarama için iki ışın kullanır. Bu sistemler, floresan lekeli örneklerin görüntülenmesi için daha verimli modeller oluşturmak üzere tandem tarama mikroskoplarının (TSM'ler) değiştirilmesi ve geliştirilmesinden kaynaklanmıştır. Şekil 5, gerçek zamanlı görüntüleme için zayıf floresan emisyonuna karşı duyarlılığı artırmak üzere eşleştirilmiş Nipkow diskleri ve mikro merceklere sahip böylesine gelişmiş bir sistemi göstermektedir.

Pirinç. 5. Nipkow disklerine dayalı optik tasarım

Günümüzde eş odaklı mikroskopide optik kesitler elde etmek için iki alternatif yöntem vardır: ters evrişim yöntemi ve multifoton. Teknik olarak farklılık gösterirler ancak eş odaklı yöntemler gibi geleneksel optik mikroskopiye dayanırlar. Dekonvolüsyon, bir görüntü oluştururken odak dışı alanlardan gelen bilgilerin hesaplanması ve kaldırılması için kullanılan hesaplamalı algoritmalara dayanmaktadır. Bu teknik, verimli algoritmalar ve yüksek performanslı mini bilgisayarlar sayesinde çok kullanışlı hale geldi. Multifoton mikroskopi, LSCM ile aynı tarama sistemini kullanır ancak alıcıda iğne deliği diyaframı gerektirmez. Lazer, florokrom işaretini yalnızca odak noktasında uyardığı ve böylece odak dışı radyasyonu ortadan kaldırdığı için buna gerek yoktur. Canlı doku gözlemlenirken, bu yöntemin ek avantajları vardır: lazer ışınının aktardığı ve numunenin dokusu tarafından emilen enerji miktarı azaldığı için ışıkla ağartma azalır.

Geleneksel optik mikroskop, LSCM'nin temelini oluşturur. Tungsten veya cıva lambası yerine, hassas bir fotoçoğaltıcı tüpe (PMT) ve tarama aynalarını ve diğer tarama cihazlarını kontrol eden ve görüntülerin toplanmasını ve sunumunu kolaylaştıran bir bilgisayara bağlı bir lazer kullanılır. Elde edilen veriler dijital ortamda depolanır ve sistemin kendi bilgisayarında veya başka bir bilgisayarda çok sayıda yazılım paketi kullanılarak işlenebilir.

LSCM'nin tasarımına göre aydınlatma ve sinyal alımı (kayıt), numune üzerinde kırınım sınırı olan bir nokta ile sınırlıdır. Mikroskop lensleri aydınlatma noktasını odağa getirir ve tarama cihazı, bilgisayar kontrolü altında bu nokta ile numuneyi tarar. Numunenin parlak noktalarından gelen sinyaller, bir iğne deliği (veya bazı durumlarda bir yarık) diyaframı yoluyla bir foto-çoğaltıcı tüpüne girer ve foto-çoğaltıcıdan gelen çıkış sinyalleri bir görüntü halinde oluşturulur ve bir bilgisayar tarafından görsel olarak yeniden üretilir. Boyanmamış numuneler numuneden yansıyan ışıkla gözlenebilmesine rağmen genellikle bir veya daha fazla floresan boyayla boyanırlar. Literatürde 1990 civarında açıklanan en yaygın LSCM'lerden biri, biyolojik araştırmacıların karşılaştığı temel bir soruna yanıt olarak geliştirildi. İmmünfloresanla boyanmış embriyolardaki birçok yapı ve bireysel makromolekül, iki hücreli aşamadan sonra geleneksel bir epifloresan mikroskobu ile görüntülenemez, çünkü embriyonun hacmi, hücre sayısı arttıkça yaklaşık olarak aynı kalır. Bu, hücrelerin daha yoğun düzenlenmesiyle odak düzlemi dışındaki hücrelerden gelen parlaklığın arttığı ve bunun da görüntü çözünürlüğünde bozulmaya yol açtığı anlamına gelir.

Pirinç. 6. Nikon lazer taramalı eş odaklı mikroskop yapılandırması

Bu sorun üzerinde çalışan bir grup araştırmacı, o dönemde mevcut olan eş odaklı sistemlerin hiçbirinin gereksinimlerini karşılamadığını buldu. O zamanlar sahne taramalı mikroskoplar çok yavaştı. Tek bir görüntünün oluşturulması yaklaşık 10 saniye sürdü ve çok ışınlı tarama cihazları henüz floresan görüntüleme için pratik değildi. LSCM, geleneksel epifloresan mikroskobunun gereksinimlerini karşılamak üzere tasarlandı ve aynı zamanda geliştirilen diğer sistemlerle birlikte, çeşitli şirketler tarafından biyomedikal camiaya sunulan karmaşık sistemlerin prototipi haline geldi. Günümüzde kullanılan bir sistemin örneği (Nikon E1000) Şekil 6'da gösterilmektedir.

Özel olarak tasarlanmış cihazlarda, optik bölümlerin kalınlığı, fotodetektörün önündeki iğne deliğinin çapındaki değişikliklere göre değişebilmektedir. Sabit iğne deliği boyutuna sahip diğer tasarımlarla karşılaştırıldığında bu ek özellik, biyolojik yapıları görüntülerken son derece esnektir. Numunenin taranan alanını azaltarak ve taranan bilgiyi depolama ve görsel sunum için aynı boyutta bir veri dizisine yerleştirerek görüntü, çözünürlük kaybı olmadan büyütülebilir (büyütme, taramalı elektron mikroskobunda benzer şekilde değişir). . Bu, tek bir merceğe bir yakınlaştırma aralığı verir; bu, mercekleri değiştirirken gözden kaçabilecek veya kaybolabilecek nadir veya geçici olayları görselleştirirken son derece yararlı olabilir.

LSCM'nin gelişmiş ve esnek özelliklerinin artık ticari olarak makul fiyatlara sunulmasıyla birlikte, birçok çok kullanıcılı laboratuvarın elektron mikroskopları yerine bu ekipmanı seçmesiyle, eş odaklı mikroskopi son yıllarda popülerlik kazanmıştır. Konfokal mikroskopinin avantajı, geleneksel optik mikroskopi için hazırlanan numunelerin yüksek kaliteli görüntülerinin elde edilebilmesindeki göreceli kolaylık ve çeşitli araştırma alanlarında geniş bir uygulama yelpazesine sahip olmasıdır.

İlk nesil LSCM'ler sabit numunelerle iyi çalıştı, ancak lazerlerin ışık enerjisini kontrol etmekte başarısız oldular ve bu da ciddi önlemler alınmadığı takdirde çoğu zaman canlı numunenin ölümcül şekilde yok edilmesiyle sonuçlandı. Bu sınırlamalara rağmen kaydedilen örneklerin görüntüleri o kadar yüksek kalitedeydi ki, konfokal yaklaşım uzmanlar tarafından koşulsuz kabul edildi. Sonraki nesil cihazlar görüntüleme sürecinin her yönünü geliştirdi. Buna ek olarak, yeni cihazlar çok daha ergonomik ve kullanımı kolay hale geldi, böylece ayarlamalar, filtre kombinasyonlarının değiştirilmesi ve lazer gücünün bilgisayar kullanılarak ayarlanması çok daha kolay ve hızlı hale geldi. Artık üç florokromla aynı anda ve hatta daha fazlasını sırayla görüntülemek mümkün. Geliştirilmiş ve daha güvenilir yazılımlar, daha hızlı bilgisayarlar, daha büyük disk sürücüleri ve rastgele erişimli depolama aygıtlarının düşen fiyatları sayesinde görüntü işleme de önemli ölçüde ilerleme kaydetti.

Görüntüleme Modları

Konfokal mikroskobun ana uygulaması, çeşitli tiplerdeki kalın numunelerin görüntülerini elde etmektir. Konfokal yöntemin avantajı, numunenin görüntülerini yüksek çözünürlüklü ve çözünürlüklü bireysel optik bölümlerin bir dizisi olarak oluşturma yeteneğinden kaynaklanmaktadır. Bu durumda birkaç görselleştirme modu kullanılır; Her biri görüntünün temel birimi olarak optik dilime dayanmaktadır.

Pirinç. 1. Üç işaretle etiketlenmiş optik bölümler

Bireysel optik bölümler

Optik bölüm, konfokal mikroskopi tekniklerinde temel görüntüleme ünitesidir. Bağlı ve lekeli numunelerin görüntüleri tek, ikili, üçlü ve çoklu dalga boylu aydınlatma modlarında elde edilebilirken, çok renkli numunelerin görüntüleri birbiriyle birleştirilecektir (eğer yeterli renk sapması düzeltmesine sahip lensler kullanılırsa). Ek kayıt genellikle dijital görüntü işleme yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilir. Çoğu lazer taramalı konfokal mikroskop (LSCM), bir optik bölüm elde etmek için yaklaşık 1 saniye gerektirir, ancak birden fazla optik bölümden gelen görüntülerin tipik olarak sinyal-gürültü oranını iyileştirmek için ortalaması alınır. Bir görüntü elde etmek için gereken süre elbette görüntünün piksel boyutuna ve sistem bilgisayarının hızına bağlıdır. 768x512 piksellik tipik bir 8 bitlik görüntüyü depolamak için yaklaşık 0,3 Mbit bellek gerekli olacaktır.

Şekil 1'de gösterilen optik kesitler, radyasyon kaynağı olarak tek bir kripton/argon lazer kullanılarak üç farklı dalga boyunda (488, 568 ve 647 nanometre) uyarım ışığıyla eş zamanlı olarak elde edildi. Örnek olarak, üçüncü evredeki bir Drosophila kanadının hayali diski sunulmuştur; burada kanat oluşumunda rol oynayan üç gen etiketlenmiştir. Sunulan üç gen ve karşılık gelen florokrom etiketleri şunlardır: (a) körelmiş (floresein - 496 nanometre); (b) kanatsız (lisamin rodamin - 572 nanometre); ve © CiD (siyanin 5 - 649 nanometre). Kanadı oluşturan üç uzamsal olarak temsil edilen gen alanının kompozit görüntüsü sağ altta yer almaktadır (resim (d)).

Belirli bir zaman aralığında kayıt yapma ve canlı bir hücreyi görselleştirme

Canlı hücrelerin hızlandırılmış çalışmaları, LSCM'nin artan çözünürlüğü nedeniyle yeni bir ivme kazandı. Daha önce hücresel yapıların hareketlerine ilişkin çalışmalar, 16 mm'lik fotoğraf filmi ve bir kameraya bağlı saat mekanizmalı bir aralık ölçer kullanılarak, daha sonra hızlandırılmış işlevli bir video kaydedici, bir optik disk kaydedici veya bir video sayısallaştırma kartı kullanılarak gerçekleştiriliyordu. . Artık LSCM'yi kullanarak belirli, önceden ayarlanmış aralıklarla gerçek zamanlı olarak optik kesitler elde etmek mümkün.

LSCM kullanarak canlı dokuların görüntülenmesi, bağlı örneklerin görüntülenmesinden çok daha zordur ve örnek görüntüleme koşullarına dayanamayabileceğinden her zaman pratik değildir. Tablo 1, LSCM kullanarak canlı ve ilişkili hücreleri gözlemlerken dikkate alınması gereken bazı faktörleri özetlemektedir. Bazı örneklerin mikroskop sahnesine yerleştirilmesi fiziksel olarak imkansızdır veya tüm gözlem süresi boyunca burada canlı kalamayacaklardır. İncelenen olay veya yapı merceğin görüş alanı içinde olmayabilir. Örneğin, Drosophila kanadının hayali diskleri larvada gözlemlenemeyecek kadar derinde gelişir; ve diseksiyondan sonra kültürde gelişemezler. Bu nedenle, günümüzde bu tip dokularda gen ekspresyonunu gözlemlemek için mevcut tek yöntem, larvaları parçalara ayırmak, farklı gelişim aşamalarındaki örneklerden alınan hayali diskleri bağlamak ve lekelemektir.

Masa 1. LSCM kullanılarak bağlı ve canlı hücrelerin gözlemlenmesi

Canlı hücrelerin başarılı bir şekilde gözlemlenmesi ve görüntülenmesi, tüm süreç boyunca son derece dikkatli olmayı gerektirir. Mikroskop aşamasında kabul edilebilir koşulların sağlanması bir zorunluluktur. Lazer ışını ışınımının bir hücreye verdiği hasar, tekrarlanan taramalar sonucunda birikebilir, dolayısıyla bu maruz kalma, bir görüntü elde etmek için gereken ve yeterli minimum düzeyde tutulmalıdır. Askorbik asit gibi antioksidanlar, floresan moleküller uyarıcı ışıkla ışınlandığında salınan oksijeni azaltmak ve hücre öldürücü serbest radikallerin oluşumunu teşvik etmek için tipik olarak kültür ortamına eklenir. Işınlamanın floresan boyalı hücreler üzerindeki etkisini değerlendirmek için kapsamlı ön kontrol deneyleri yapmak genellikle gereklidir ve tüm görüntüleme parametrelerinin yapılan gözlemlerle tutarlı olduğundan emin olun. Test görüntülerinin ardından canlı numunelerin yaşayabilirliği değerlendirilmelidir. Örneğin embriyoların gözlem süreci boyunca normal şekilde gelişmeye devam etmesi gerekir, dolayısıyla radyasyona maruz kalmanın veya florokromların neden olduğu anormallikler tespit edilmelidir. Şekil 2, kalsiyum yeşili ile floresan boyalı bir Drosophila embriyosunun hızlandırılmış kaydını göstermektedir. Bir dizi görüntü, floresan ışığın zaman içindeki dağılımındaki değişiklikleri gösteriyor.

Her hücre tipi, gözlem sırasında canlılığını korumak için kendi önlemlerini gerektirir. Bazı böcek hücreleri için oda sıcaklığının korunması ve yeterince büyük hacimde uygun ortamın bulundurulması yeterlidir. Ancak çoğu hücre tipi, sahnede uygun karbondioksit dengesini korumak için ısıtılmış bir aşamaya ve bazen de bir perfüzyon odasına ihtiyaç duyar. LSCM kullanılarak gözlem koşullarının en az "düşmanca" olduğu hücre tipinin seçilmesi, birçok deneysel sorunun önlenmesine yardımcı olacaktır. Modern eş odaklı cihazlardaki gelişmeler, potansiyel problemlerde önemli bir azalmaya yol açmıştır. Artan kuantum verimliliği, hedeflerin daha büyük sayısal açıklığı (parlaklığı) ve daha az toksik hücre boyalarının kullanılması, eş odaklı mikroskopinin canlı hücreleri analiz etmek için pratik bir yöntem haline gelmesine yol açtı. Daha düşük güçlü lazerlerin kullanımına yönelik çaba sarf etmek, aynı zamanda görüntü elde etme ve işlemenin mümkün olduğu kadar hızlı gerçekleştirilmesine olanak sağlamak gerekir. Görüntü toplama ve kaydetmeyi hızlandırmak için iğne deliği açıklığı artırılırsa (cansız örneklerin gözlemlenmesiyle karşılaştırıldığında), sonraki ters evrişim bazen kayıp görüntü kalitesini geri yükleyebilir.

Pirinç. 2. Belirli bir zaman aralığında çekim yapmak

Birçok fizyolojik süreç ve olay, görüntüleme için saniyede ortalama bir görüntü kullanan çoğu LSCM tarafından yakalanamayacak kadar hızlı gerçekleşir. Akusto-optik cihazlar ve yarık diyaframlar kullanan LSCM'ler, galvanometre uyarılı nokta tarama sistemlerinden daha hızlıdır ve fizyolojik çalışmalar için daha pratiktir. Bu daha hızlı kurulumlar, tam ekran çözünürlüğünde saniyede 30 kareye veya video görüntü hızına yakın hıza ulaşabilen iyi uzamsal ve zamansal çözünürlüğü birleştirir. Daha yavaş iğne deliği taramalı mikroskoplarda zamansal çözünürlük yalnızca numune tarama alanının azaltılmasıyla artırılabilir. Tam uzamsal çözünürlük gerekiyorsa, kare hızının azaltılması gerekir, bu da zamansal çözünürlük kaybına neden olur. Disk veya salınımlı ayna taraması kullanan eş odaklı sistemler aynı zamanda hızlı fizyolojik süreçleri veya diğer geçici olayları görüntüleme yeteneğine de sahiptir.

Z serisi ve 3D görüntüler

Z serisi, optik eksene (z ekseni) dik bir düzlemde farklı seviyelerde alınan bir numunenin optik kesitlerinin bir dizisidir. Z serisi görüntüler, mikroskobun ince odaklamasındaki değişikliklerin adım adım eşleştirilmesi ve ardından her adımda bir görüntü elde edilmesiyle elde edilir. Adım adım odaklama hareketi genellikle bilgisayar kontrollü bir adımlı motor tarafından gerçekleştirilir ve bu motor, odağı önceden belirlenmiş bir miktarda değiştirir. Bir bilgisayar makro programı kullanarak, bir görüntü elde edip kaydedebilir, mikroskobu örnekteki belirli bir derinliğe yeniden odaklayabilir, ikinci bir görüntü elde edip kaydedebilir, yeni bir düzlemde yeniden odaklanabilir ve programlanan sayıda görüntü elde edilene kadar bu şekilde devam edebilirsiniz. .

Numunenin seçilen bir alanının çekilmesiyle elde edilen z serisinden istenilen görüntüler alınabilir ve ilgilenilen belirli hücrelerin daha sonra ayrıntılı incelenmesi için özel yazılımla işlenebilir. Z serisi, Şekil 3'teki gibi görüntülerin fotomontajı olarak düşünülebilir. Görüntülerin bu tür birleştirilmesi ve görüntülenmesi, diğer birçok görüntü manipülasyonu gibi, modern görüntü işleme yazılım paketlerinin standart bir özelliğidir. Şekil 3'teki görüntüler, daha sık z-adımlarına sahip daha geniş bir seriden bir seçimdir. Yeşil parıltı, 22C10 antikoru ile boyanmış bir Drosophila embriyosunun periferik sinir sistemini tanımlar.

Pirinç. 3. Z serisi optik bölümler

LSCM tarafından üretilen bir numunenin birkaç yüz optik bölümünden oluşan bir diziden, birbirine bağlı yapıların tüm kompleksi hakkında fikir edinmek zor olabilir. Ancak z serisi, bir kez kaydedildiğinde, hacimsel görüntüleme teknikleri kullanılarak numunenin sonraki üç boyutlu temsili için ideal bir malzemedir. Bu yaklaşım artık tıp ve biyolojide doku yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi açıklığa kavuşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Odak değiştirme motorunun adımıyla belirlenen doğru örnek z-tarama adımını ayarlamak önemlidir; bu durumda görüntü numunenin gerçek derinliğini yansıtacaktır.

Numune gözlemlenirken sabit kaldığı sürece, LSCM tarafından üretilen z serisi görüntüler mükemmel bir şekilde kaydedilecek ve dijital olarak saklandıklarında nispeten kolay bir şekilde numunenin 3 boyutlu temsiline dönüştürülecek. Şekil 4, tek bir optik kesiti (a) bir z serisi projeksiyonla (b) karşılaştırmakta ve 22C10 antikoru ile etiketlenmiş bir Drosophila embriyosunun periferik sinir sisteminin görüntülenmesinde bu tekniğin değerini göstermektedir.

Mikroskop operatörü tarafından ayarlanan adım motoru adımı optik kesit kalınlığıyla ilgilidir ancak başka değerlere de sahip olabilir. Optik bölümün kalınlığı mikroskopta gözlemlenen örnek bölümün kalınlığına bağlıdır ve merceğe ve iğne deliği diyaframının çapına bağlıdır. Ancak bazı durumlarda odak aralığı optik dilim kalınlığıyla aynı olabilir ve bu da karışıklığa neden olabilir.

Z serisi dosyası alındıktan sonra, eş odaklı görüntülerin işlenmesi için özel olarak tasarlanmış bir 3 boyutlu yeniden yapılandırma programı tarafından işlenmek üzere gönderilir. Bu tür programlar, grafik istasyonlarında kullanıldığında son derece hızlıdır, ancak aynı zamanda yeterince hızlı bir işlemci ve büyük RAM ile kişisel bir bilgisayarda veya eş odaklı mikroskobun kendisinin grafik istasyonunda da başarıyla kullanılabilir. Bu programları kullanarak, hem bir numunenin bireysel üç boyutlu temsillerini hem de dönme veya diğer mekansal dönüşümlerin etkisini üreten ve daha iyi bir algı sağlayan, farklı numune türlerinden oluşan, birbirinin yerine geçen bir temsil dizisi oluşturabilirsiniz. numunenin üç boyutlu özellikleri. Program, numunenin farklı seviyelerindeki farklı yapıları vurgulamak için uzunluğu, derinliği değiştirmenize, hacimsel ölçümler yapmanıza ve ayrıca numune şeffaflığı gibi özel görüntü parametrelerini etkileşimli olarak değiştirmenize olanak tanır.

Pirinç. 4. Optik bölüm ve z serisi projeksiyon

Belirli bir zaman aralığında elde edilen bir dizi görüntüden alınan bir dizi optik kesiti temsil etmenin başka bir yolu, z ekseninin zaman ekseni işlevine sahip olduğu üç boyutlu bir temsildir. Bu yaklaşım organizmanın gelişimi sırasındaki fizyolojik değişiklikleri görselleştirmede faydalıdır. Bu yöntemin uygulanmasına bir örnek, deniz kestanesi embriyolarının gelişimi sırasında kalsiyum konsantrasyonundaki değişikliklerin dinamiklerini açıklığa kavuşturmaktı. Farklı derinliklerde alınan optik kesitlerin renk kodlaması, 3 boyutlu verileri temsil etmenin basit bir yoludur. Pratikte numunenin farklı derinliklerinden alınan her optik kesite bir renk (genellikle kırmızı, yeşil veya mavi) atanır ve daha sonra renkli görüntüler birleştirilir ve bir görüntü işleme programı kullanılarak renkler değiştirilerek istenilen etki elde edilir.

4D Görüntüleme

LCSM ile canlı dokularda veya canlı doku kültürlerinin hazırlanması sırasında meydana gelen ve belirli bir zaman aralığında alınan bir dizi görüntüye yansıyan dinamik olaylar, dördüncü boyut olarak zaman olmak üzere dört boyutta temsil edilebilir. Düzenli aralıklarla elde edilen Z serisi dört boyutlu veri kümeleridir: 4 boyutlu bir görüntüleyici kullanılarak gözlemlenebilen üç uzamsal boyut (x, y ve z) ve dördüncüsü zaman. Bu tür programlar, zamanın farklı noktalarında alınan stereo çiftleri bir film olarak oluşturup oynatmanıza veya alternatif olarak, kurgulanmış bir film gibi, zamanın farklı noktalarında alınan yeniden yapılandırılmış üç boyutlu görüntüleri işleyip sunmanıza olanak tanır.

X-Z görselleri

Örneğin epitel tabakasının dikey kesiti gibi yandan görünüşü isteniyorsa, iki yoldan biriyle x-z kesiti yapılabilir. Numunenin tek bir çizgisi (x-ekseni) boyunca farklı derinliklerde (z-ekseni) tarayarak, odaktaki değişikliği bir step motorla kontrol ederek ve ardından tüm dilim serisini tek bir görüntüde birleştirerek bir yan görünüm elde edilebilir. görüntü. Diğer bir yöntem, yan görünümün mevcut bir z serisi optik dilimlerden çıkarıldığı bir 3B oluşturma programında kesit düzlemi seçeneğini kullanmaktır. Şekil 5'te kelebek kanadı epitelini görüntülerken lazer, numuneye farklı z koordinatlarında veya derinliklerde nüfuz eden tek bir çizgi (soldaki görüntüdeki yatay siyah çizgi) boyunca taranır. Şekil 5'te gösterilen x-z görüntüsü, eş odaklı bir görüntüleme sistemi tarafından oluşturulmuş ve sunulmuştur. Kanat epiteli iki epitel katmanından oluşur, ancak lazer ışınının numuneye nüfuz etme derinliği arttıkça floresans yoğunluğu azaldığından, yalnızca üst katman net bir şekilde görselleştirilir.

Pirinç. 5. X-Z düzlemindeki görüntü

Yansıyan ışıkta görüntü oluşturma

Tüm eski eş odaklı mikroskoplar, yansıyan veya geri saçılan ışıkla çalışıyordu. Yansıyan ışık kullanılarak, birçok numune eş odaklı mikroskopide lekelenmeden gözlemlenebilir veya immün altın veya gümüş halojenür mikro kristalleri gibi yüksek oranda yansıtıcı boyalarla etiketlenebilir. Yansıyan ışık gözlemlerinin özellikle canlı doku için bir avantajı, numunenin ışıkla ağartmaya maruz kalmamasıdır. Ancak bazı boya türleri lazer ışınını zayıflatabilir. Diğer bir potansiyel problem ise bazı mikroskopların optik ışın yolu boyunca optik elemanlardan kaynaklanan iç yansımalara maruz kalabilmesidir. LSCM'lerin ve yarık diyaframlı LSCM'lerin çok ışınlı versiyonları için, yansıyan ışık sorunu mevcut değildir ve bu mikroskoplarda, polarizörlerin kullanımı, yapay olmayan alanların görüntülenmesi ve optik eksenden sapma, sorunun azaltılmasına yardımcı olur.

İletilen ışık görüntüleme

Mikroskopide yaygın olarak kullanılan iletilen ışık görüntüleme modlarından herhangi biri, faz kontrastı, diferansiyel girişim kontrastı (DIC), karanlık alan veya polarize ışık dahil olmak üzere LFCM'de kullanılabilir. Numunenin içinden geçen ışık, iletilen ışık alıcısına çarpar ve bunun sinyali, fiber optik bir ışık kılavuzu aracılığıyla mikroskobun tarama kafasındaki fotomultiplikatörlerden birine gönderilir. İletilen ışık ve konfokal epifloresans görüntüleri, aynı aydınlatıcı ışını kullanılarak eş zamanlı olarak yakalanarak doğru kayıt sağlanır. Uygun yazılım kullanılarak görüntülerin birleştirilmesi veya sentezlenmesi yoluyla etiketli hücrelerin dokudaki tam konumu yansıtılabilir. Bazı çalışmalar şu anlamlı yaklaşımı önermektedir: eş odaklı olmayan iletilen ışık görüntüsünü, aynı örnekteki etiketli hücrelerin bir veya daha fazla eş odaklı floresans görüntüsüyle birleştirin. Bu yaklaşım, örneğin, etiketlenmemiş hücrelerden oluşan bir popülasyon içindeki etiketli hücrelerin bir alt popülasyonunun birkaç saat hatta yıllar boyunca göçünün mekansal ve zamansal yönlerini belirlemeye olanak sağlayacaktır.

Günümüzde, bazı dijital renkli kameralarda yapılana benzer şekilde, gerçek renkli bir görüntü oluşturmak için kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) iletilen sinyalleri kabul eden renkli iletilen ışık alıcısı halihazırda yaygın olarak kullanılmaktadır. Böyle bir alıcı, iletilen ışık altında dokudaki gerçek renkleri rutin olarak gözlemleyen ve analiz için bu görüntüleri floresan verilerle kaplayan patologlar için özellikle kullanışlıdır.

Makaleyi beğendin mi? Paylaş

Bu makaleyi yazdır