Типы взаимодействия вируса и клетки. Продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой

Взаимодействие вириона с живой клеткой осуществляется в несколько этапов.

В начальный (подготовительный) период вирион прикрепляется к клетке, проникает внутрь ее, после чего белковая оболочка вириона разрушается, освобождая нуклеиновую к-ту.

Наступает скрытый (латентный) период вирусной инфекции, во время которого присутствие в зараженной клетке вирусных частиц нельзя обнаружить никакими методами - родительский вирион как бы исчезает. В этот период проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота организует синтез вирусных компонентов потомства, используя для этой цели ферментативную систему хозяина. Цикл размножения заканчивается формированием дочерних вирионов и выходом их из клетки (конечный период ).

Более просто устроенные бактерии не способны сами захватывать частицы из окружающей среды. Поэтому у бактериофагов имеются спец. приспособления для преодоления плотной бактериальной стенки. В концевой части хвоста содержится особый фермент, который растворяет бактериальную оболочку. Затем микроскопические «мышцы» хвоста сокращаются и нуклеиновая кислота фага «впрыскивается» внутрь клетки, происходит как бы инъекция с помощью шприца.

В результате белковый чехол фага остается на поверхности клетки, а внутрь клетки попадает лишь нуклеиновая кислота.

Нуклеиновые кислоты вирусов осуществляют программу по созданию в клетке нового вирусного потомства. Это было доказано оригинальными опытами. Удалось разделить вирусы на составляющие их компоненты - белки и нуклеиновые кислоты. Оказалось, что заражение клеток и размножение вирусов происходило только после добавления к клеткам вирусной нуклеиновой кислоты. Иными словами, нуклеиновые кислоты вирусов сами по себе могут вызывать размножение вирусов, т. е. обладают инфекционными свойствами. В другом опыте два вируса были разделены на составляющие компоненты, а затем «переодеты»: нуклеиновую кислоту одного вируса «одели» в оболочку другого. Полученными гибридами были заражены чувствительные клетки. Было обнаружено, что оба «переодетых» вируса способны размножаться, а образующееся потомство всегда подобно тому вирусу, нуклеиновую кислоту которого содержал гибрид.

Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота управляет всеми процессами размножения вируса. Сначала она заставляет клетку синтезировать так называемые ранние белки, подавляющие собственный обмен веществ клетки и обеспечивающие синтез нуклеиновых кислот дочерних частиц. Образование их происходит в результате самокопирования родительской нуклеиновой кислоты. Генетическая информация, заложенная в нуклеиновой кислоте вируса, определяет состав белков, из которых строятся дочерние частицы так называемых поздних белков. В ДНК-со держащих вирусах реализация этой информации осуществляется обычным для клетки путем: на ДНК синтезируется информационная РНК (транскрипция), управляющая последующим биосинтезом белков (трансляция). В нуклеиновой кислоте многих РНК-содержащих В. объединены и генетическая, и информационная функции: РНК участвует и в репликации, и в трансляции (в воспроизводстве нуклеиновых кислот и белка вируса). У многих вирусов построение белковых оболочек и внутреннего содержимого идет раздельно. Клетка «нарабатывает» отдельные детали, которые потом соединяются, образуя вирусные частицы. Когда в зараженной клетке накопится достаточное количество “заготовок” для будущих вирусных частиц, наступает как бы сборка деталей (композиция). Процесс этот происходит обычно вблизи клеточной оболочки, которая принимает в нем участие. В составе вирусной частицы часто обнаруживаются вещества,

характерные для клетки, в которой размножается вирус. Например, у вируса гриппа заключительный этап формирования вирусной частицы - своеобразное обволакивание ее слоем клеточной мембраны. То есть, клетка не только «кормит» и «поит» вирус, но на прощание еще и «одевает» их. Последний этап взаимодействия вируса и клетки, как правило, непродолжителен. Образовавшиеся полноценные вирусные частицы быстро выходят во внешнюю среду. Весьма своеобразно происходит выход потомства у бактериофагов. Он сопровождается обычно растворением (лизисом) бактериальных клеток под действием особого фермента, который накапливается в клетке параллельно размножению фага и приводит ее к разрушению и гибели. Под микроскопом хорошо видно, как это происходит. Иногда бактерии как бы взрываются, в других случаях в бактерии (в середине или на одном из концов) образуется отверстие, через которое вытекает ее содержимое. Из одной погибшей бактерии может освободиться до нескольких сотен новых частиц фага. Процесс размножения фагов продолжается до тех пор, пока не будут уничтожены все чувствительные к этому фагу бактерии. Для вируса оспы, полиомиелита, энцефалитов также характерен быстрый выход в окружающую среду сотен, а порой тысяч дочерних вирионов. Другие вирусы человека и животных (вирус герпеса, свинки, реовирусы) выходят из клеток по мере созревания. Эти вирусы до момента гибели клеток успевают проделать несколько циклов размножения, постепенно истощая синтетические ресурсы клеток и вызывая их разрушение. В отдельных случаях В. могут накапливаться внутри клеток, образуя кристаллоподобные скопления (В. бешенства, аденовирусы и др.), которые называют тельцами включений.

При гриппе, бешенстве, пситтакозе, оспе такие тельца обнаруживают в цитоплазме клеток, при весенне-летнем энцефалите, желтой лихорадке, герпесе и полиомиелите - в ядре; при некоторых инфекциях тельца включений находили как в ядре, так и в цитоплазме. Исследования последних лет показали, что в подавляющем большинстве случаев эти включения представляют собой колонии вируса, причем их образование закономерно на определенной стадии размножения возбудителей инфекции. Высокая специфичность внутриклеточных включений при вирусных заболеваниях позволяет использовать этот признак для диагностики. Например, обнаруженные в нервных клетках головного мозга цитоплазматические включения (так называемые тельца Негри) являются основным доказательством заболевания бешенством, а специфические образования круглой или овальной формы (так наз. тельца Гварниери), обнаруженные в эпителиальных клетках, указывают на заболевание оспой. Включения описаны также при энцефалите, детском спинномозговом параличе, ящуре и других заболеваниях. Очень своеобразные включения, имеющие кристаллическую форму, образуют вирусы растений. То есть, размножение вирусов происходит особым, ни с чем несравнимым способом. Сначала вирусные частицы проникают внутрь клеток и освобождаются вирусные нуклеиновые к-ты. Затем заготавливаются детали будущих вирусных частиц. Размножение заканчивается сборкой новых вирусных частиц и выходом их в окружающую среду. Выпадение любого из указанных этапов приводит к нарушению нормального цикла и влечет за собой либо полное подавление размножения В., либо появление неполноценного потомства.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.

1. Адсорбция - пусковой механизм, связанный с взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа- гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека - гликопротеин gp 120).

2. Проникновение - путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).

3. Освобождение нуклеиновых кислот - ―раздевание нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.

4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков , т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.

5. Сборка вирионов - ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.

6. Выход вирусных частиц из клетки , приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Формы вирусной инфекции.

На уровне макроорганизма основные формы вирусных поражений принципиально не отличаются от таковых, наблюдаемых при инфицировании вирусами отдельных клеток.

Продуктивная вирусная инфекция с образованием дочерних популяций и характерными клиническими проявлениями возможна лишь при наличии в заражённом организме чувствительных клеток, в которых осуществляется репродуктивный цикл возбудителя. Например, возбудитель полиомиелита может реплицировать только в клетках ЖКТ и ЦНС приматов и человека.

Абортивная инфекция развивается при проникновении возбудителя в нечувствительные клетки (например, при попадании вируса лейкоза коров в организм человека) либо в клетки, не способные обеспечить полный репродуктивный цикл (например, находящиеся в стадии клеточного цикла G0). Способность клеток к поддержанию вирусспецифических репродуктивных процессов также подавляет ИФН, противовирусный эффект которого направлен против самых различных вирусов.

Персистирующая вирусная инфекция возникает при таком взаимодействии между вирусом и заражённой клеткой, когда в последней продолжается выполнение собственных клеточных функций. Если заражённые клетки делятся, образуется инфицированный клон. Таким образом, увеличение числа заражённых клеток способствует увеличению общей популяции возбудителя в организме. Тем не менее персистирующие вирусные инфекции обычно нарушают функции клеток, что в конце концов приводит к клиническим проявлениям. У человека развитие персистирующих инфекций в определённой степени зависит от возраста. Например, внутриутробное заражение вирусом коревой краснухи или цитомегаловирусом (ЦМВ) приводит к ограниченному по времени персистированию возбудителя. Появление симптоматики связано с возможностью плода развивать иммунные реакции на инфекционный агент.

Латентная (скрытая) вирусная инфекция . В то время как персистирующие инфекции сопровождаются постоянным высвобождением дочерних вирусных популяций, при латентных поражениях они образуются спорадически. Репродуктивный цикл подобных возбудителей резко замедляется на поздних стадиях и активируется под влиянием различных факторов.

Латентные инфекции характерны для большинства герпесвирусов, вызывающих рецидивирующие и обычно не прогрессирующие заболевания.

Инаппарантные инфекции *от лат. in-, отрицание, + арраrео, являться+ сопровождаются бессимптомной циркуляцией незначительных количеств возбудителя в отдельных органах. При этом выявить возбудителя можно лишь специальными методами. От бессимптомного носительства подобные поражения отличает большая вероятность возникновения клинических проявлений. Этот термин применяют при целом ряде инфекций, при которых нет явных признаков заболевания. В практике вирусных инфекций у человека часто применяют альтернативный термин «субклиническая инфекция». Собственно, и латентные инфекции можно расценивать как хронически протекающие инаппаратные инфекции, при которых устанавливается баланс между организмом и возбудителем.

Дремлющая (криптогенная) вирусная инфекция - форма проявления вирусной инфекции при которой возбудитель в неактивном состоянии находится в отдельных очагах (например, в нервных ганглиях). Клинически инфекция проявляется лишь при резком ослаблении защитных сил организма. Например, вирус герпеса 3 типа, вызывающий при первичном заражении ветряную оспу, пожизненно сохраняется в организме. Рецидив заболевания в форме опоясывающего лишая возможен лишь при нарушениях иммунного статуса (наиболее часто в пожилом возрасте).

Медленные вирусная инфекции характеризуются длительным инкубационным периодом (месяцы и годы), в течение которого возбудитель размножается, вызывая всё более явные повреждения тканей. Первоначально возбудитель размножается в ограниченной группе клеток, но постепенно инфицирует всё большее их число. Заболевания заканчиваются развитием тяжёлых поражений и смертью больного. К медленным вирусным инфекциям относят подострый склерозирующий панэнцефалит, ВИЧ-инфекцию и др.

№ 19 Типы взаимодействия вируса с клеткой. Стадии ре­продукции вирусов.
Типы взаимодействия вируса с клеткой. Различают три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный, абортивный и интегративный.
Продуктивный тип - завершается обра­зованием нового поколения вирионов и ги­белью (лизисом) зараженных клеток (цитолитическая форма). Некоторые вирусы выходят из клеток, не разрушая их (нецитолитическая форма).
Абортивный тип - не завершается обра­зованием новых вирионов, поскольку инфек­ционный процесс в клетке прерывается на одном из этапов.
Интегративный тип, или вирогения - характеризуется встраиванием (интеграцией) вирусной ДНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместным сосуществованием (совместная репликация).
Репродукция вирусов осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: адсорбция вируса на клетке; проникновение вируса в клетку; «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; формирование вирусов; выход вирусов из клетки.
Адсорбция. Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбирует­ся на определенных участках клеточной мембраны - так назы­ваемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную хи­мическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических ре­цепторов на поверхности одной клетки колеблется от 10 4 до 10 5 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.
Проникновение в клетку. Существует два способа проникнове­ния вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорб­ции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка кле­точной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, ко­торая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транс­портироваться в любом направлении в разные участки цитоплаз­мы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.
«Раздевание». Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего ком­понента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с кле­точной мембраной процесс проникновения вируса в клетку со­четается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нук­леиновая кислота вируса.
Биосинтез компонентов вируса. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирус­ные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.
Реализация генетической информации вируса осуществляет­ся в соответствии с процес­сами транскрипции, трансляции и репликации.
Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфи­чески «узнавать» друг друга и при достаточной их концентра­ции самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, со­левых и водородных связей.
Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:
1. Формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;
2. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодей­ствии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала форми­руются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);
3. Формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;
4. Сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).
Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхо­да вирусного потомства из клетки. Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нук­леокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточ­ной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячива­ния образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «поч­ка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При та­ком механизме клетка может продолжительное время продуци­ровать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.
Время, необходимое для осуществления полного цикла реп­родукции вирусов, варьирует от 5-6 ч (вирусы гриппа, нату­ральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, адено­вирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репро­дукции.

Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Пер­вая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансля­цию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.

Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фикси­руются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют из­быточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от темпера­туры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, явля­ются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрица­тельно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфи­ческими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление не­прочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.

Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проник­новения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.

Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных за­щитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации яв­ляются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутрен­ним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.

Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.

Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.

Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологич­ных вирусному геному.

Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:

ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

РНК транскрипция и-РНК трансляция белок

У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:

РНК трансляция белок

У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:

РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).

После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ про­стым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток пу­тём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.

Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассо­вой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получа­ют из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полу­ченные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфек­ций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бес­смертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых об­наруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформиро­ванными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачест­венные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе росто­вых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, напри­мер, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все пита­тельные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированно­го солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и форми­рование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избы­ток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в тер­мостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может слу­жить:

1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие ви­руса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покры­вается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красно­го (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: ис­следуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В по­ложительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции по­ложительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают кури­ные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предва­рительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологиче­ских свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбрио­на, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение вирусов на лабораторных животных.

Лабораторные животные могут быть использованы для выделения виру­сов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у жи­вотных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экс­трактами из органов.

Конспект Вирусы

Вирусы играют большую роль в жизни человека. Они являются возбудителями ряда опасных заболеваний – оспы, гепатита, энцефалита, краснухи, бешенства, гриппа и др.

В 1892 г. русский ученый Д.И. Ивановский описал необычные свойства возбудителя болезни табака – табачной мозаики. Этот возбудитель проходил через бактериальные фильтры и кроме того, не рос на искусственных питательных средах. Таким образом, здоровые растения табака можно было заразить бесклеточным фильтратом сока больного растения.

Через насколько лет был обнаружен возбудитель ящура, который также проходил через бактериальные фильтры.

В 1898 г. Бейеринк придумал новое слово «вирус» (от лат. Яд), чтобы обозначить инфекционную природу некоторых профильтрованных растительных жидкостей.

В 1917 г. Ф. д’Эррель открыл бактериофаг – вирус поражающий бактерии . Однако долгое время структура вируса оставалась загадкой для ученых. Поэтому-то вирусы оказались в числе первых объектов, исследованных под электронным микроскопом сразу же после его открытия в 30-е годы.

Отличия вирусов от других организмов:

1. Вирусы – это мельчайшие организмы (в среднем они раз в 50 меньше бактерий), их нельзя увидеть в световой микроскоп . 30-300 нм.

2. Вирусы не имеют клеточного строения. Если считать клеточное строение обязательным признаком живого, то вирусы живыми не являются. Однако они обладают генетическим материалом и способны к самовоспроизведению. Существует предположение, что вирусы это генетический материал, некогда сбежавший из клетки и сохранивший способность к воспроизведению при возвращении в клеточное окружение.

3. Вирусы могут воспроизводить себя только внутри живой клетки и не являются самостоятельными организмами.

4. Вирусы состоят из одной небольшой молекулы нуклеиновой кислоты (ДНК либо РНК) и окружены белковой оболочкой

5. В отличие от клеточных организмов вирусы не могут самостоятельно синтезировать белки. Вирус вносит в клетку только свою нуклеиновую кислоту, которая отключает хозяйскую ДНК и дает клетке команду синтезировать нужные ему белки (для сборки и высвобождения новых копий вируса).

Строение вирусов

Вирусная частица, называемая также вирионом , состоит из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой. Эту оболочку называют капсидом . Капсид состоит из субъединиц – капсомеров. Капсид с нуклеиновой кислотой – нуклеокапсид - может быть голым или иметь дополнительную оболочку (вирусы гриппа и герпеса ).

Самые простые вирусы, например вирус табачной мозаики, имеет лишь белковый капсид. Аналогично устроен вирус бородавок, аденовирусы .

Вирусные частицы могут быть палочковидной или нитевидной формы, иметь форму многогранника.

Взаимодействие вируса с клеткой

1. Опознание вирусом своей клетки. Как правило, проникновению вируса предшествует связывание его с особым белком-рецептором на поверхности клетки.

2. Адсорбция – прикрепление вириона к поверхности клетки. Связывание осуществляется с помощью специальных белков на поверхности вирусной частицы, которые узнают соответствующий рецептор на поверхности клетки . Как ключ к замку.

3. Проникновение через мембрану. Участок мембраны, к которому присоединился вирус, погружается в цитоплазму и превращается в вакуоль, которая затем может сливаться с ядром.

4. «Раздевание» - освобождение от капсида. Происходит либо на поверхности клетки, либо в результате разрушения капсида ферментами клетки в цитоплазме.

5. Копирование (редупликация) вирусной нуклеиновой кислоты.

6. Синтез вирусных белков.

7. Сборка вирионов в ядре или цитоплазме.

8. Выход вирионов из клетки. Для некоторых вирусов это происходит путем «взрыва», в результате чего целостность клетки нарушается и она погибает. Другие вирусы выделяются способом, напоминающим почкование. В этом случае клетки хозяина могут долго сохранять свою жизнеспособность. Вирионы выделяются из клетки с различной скоростью. При некоторых типах инфекции вирионы могут достаточно долго находиться внутри клетки, не разрушая ее.

Вирусы бактерий

Вирусы, атакующие бактерии, называются бактериофагами или просто фагами.

Строение бактериофагов в основном изучено на примере Т-фага Eccherichia coli (колифаг). Колифаг состоит из полиэдрической головки и хвоста. Головка состоит из капсомеров и содержит внутри ДНК. Хвост имеет сложное строение и состоит из полого стержня, окружающего его сократимого чехла и базальной пластинки с шипами и нитями, (необходимыми для адсорбции на клетке-хозяине).

Проникновение бактериофага в клетку

Толстые клеточные стенки бактерий не позволяют вирусу погрузиться в цитоплазму, как при заражении клеток животных. Поэтому бактериофаг вводит полый стержень в клетку и выталкивает через него нуклеиновую кислоту, находящуюся в головке.

Открытие вирусов Д. И. Ивановским в 1892г. положило начало развитию науки вирусологии. Более быстрому ее развитию способствовали: изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

В настоящее время вирусология - бурно развивающаяся наука, что связано с рядом причин:

Ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры - вирус гриппа, ВИЧ -вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;

Использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

Основные свойства вирусов (и плазмид) , по которым они отличаются от остального живого мира.

1. Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие - от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.

3. Вирусы не способны к росту и бинарному делению.

4. Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.

6. Средой обитания вирусов являются живые клетки - бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.

Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной - вирион и внутриклеточной - вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов - конечной фазы развития вирусов.

Строение (морфология) вирусов

1. Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК -вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК -вирусов).

2. Капсид - белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц - капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид - спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).

При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего - двадцатигранники - икосаэдры.

3. Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид , т. е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”.

4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина - суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”.

Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов - плазмиды, вироиды и прионы.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина

1. Адсорбция - пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа - гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека - гликопротеин gp 120).

2. Проникновение - путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).

3. Освобождение нуклеиновых кислот - “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.

4. Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т. е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.

5. Сборка вирионов - ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.

6. Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина

1. Абортивный процесс - когда клетки освобождаются от вируса:

При инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нужен вирус - помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна (так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, его Hbs - антигена, аденоассоциированный вирус - в присутствии аденовируса);

При инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;

При заражении чувствительных клеток вирусом в неразрешающих условиях.

2. Продуктивный процесс - репликация (продукция) вирусов:

- гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект) - результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц - характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;

- стабильное взаимодействие , не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) - так называемая вирусная трансформация клетки.

3. Интегративный процесс - интеграция вирусного генома с геномом клетки хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия. Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии. Встраиваться в ДНК - геном хозяина могут только ДНК - вирусы (принцип “ДНК - в ДНК”). Единственные РНК - вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина - ретровирусы, имеют для этого специальный механизм. Особенность их репродукции - синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Основные методы культивирования вирусов

1. В организме лабораторных животных.

2. В куриных эмбрионах.

3. В клеточных культурах - основной метод.

Типы клеточных культур

1. Первичные (трипсинизированные) культуры - фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т. д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т. е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2. Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).

3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т. е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе - например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

Специальные питательные среды для культур клеток

Используются разнообразные синтетические вирусологические питательные среды сложного состава, включающие большой набор различных факторов роста - среда 199, Игла, раствор Хэнкса, гидролизат лактальбумина. В среды добавляют стабилизаторы рН (Hepes), различные в видовом отношении сыворотки крови (наиболее эффективной считают эмбриональную телячью сыворотку), L -цистеин и L -глютамин.

В зависимости от функционального использования среды могут быть ростовые (с большим содержанием сыворотки крови) - их используют для выращивания клеточных культур до внесения вирусных проб, и поддерживающие (с меньшим содержанием сыворотки или ее отсутствием) - для содержания инфицированных вирусом клеточных культур.

Выявляемые проявления вирусной инфекции клеточных культур

1. Цитопатический эффект.

2. Выявление телец включений.

3. Выявление вирусов методом флюоресцирующих антител (МФА), электронной микроскопией, авторадиографией.

4. Цветная проба. Обычный цвет используемых культуральных сред, содержащих в качестве индикатора рН феноловый красный, при оптимальных для клеток условиях культивирования (рН около 7,2) - красный. Размножение клеток меняет рН и соответственно - цвет среды с красного на желтый за счет смещения рН в кислую сторону. При размножении в клеточных культурах вирусов происходит лизис клеток, изменения рН и цвета среды не происходит.

5. Выявление гемагглютинина вирусов - гемадсорбция, гемагглютинация.

6. Метод бляшек (бляшкообразования). В результате цитолитического действия многих вирусов на клеточные культуры образуются зоны массовой гибели клеток. Выявляют бляшки - вирусные “ клеточно - негативные” колонии.

Номенклатура вирусов.

Название семейства вирусов заканчивается на “viridae”, рода - “virus”, для вида обычно используют специальные названия, например - вирус краснухи, вирус иммунодефицита человека - ВИЧ, вирус парагриппа человека типа 1 и т. д.

Вирусы бактерий (бактериофаги)

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.

Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки - икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т. е. внешне несколько напоминают сперматозоид.

Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т. е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий

1. Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).

2. Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.

3. Репродукция фага.

4. Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов

Различают вирулентные фаги , способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги , вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага). В последнем случае геном фага в клетке не не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении . Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией. Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка - репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями - в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина. Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на:

Поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);

Моновалентные (лизируют бактерии одного вида);

Типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое использование бактериофагов.

1. Для идентификации (определение фаготипа).

2. Для фагопрофилактики (купирование вспышек).

3. Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).

4. Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа.