Luminiscences mikroskopija. elektronu mikroskopija

Šajā nodaļā tiks apskatīti konfokālā lāzerskenējošā mikroskopa (CLSM) galvenie principi, ierīce, pielietojums, izmantojot Leica ierīču piemēru. CLSM princips ir gaismas plūsmas reģistrēšana, kas izplūst no objektīva fokusa plaknes, kad perēkļi sakrīt, t.i., detektora diafragma ir jānovieto tā, lai tās attēls precīzi sakristu ar objektu apgaismojošās gaismas fokusu. Lāzeri un jutīgie detektori tiek izmantoti kā apgaismojuma avots attēla iegūšanai.

CLSM galvenā iezīme ir iespēja iegūt pētāmā objekta (piemēram, šūnas) slāņainu attēlu ar augstu izšķirtspēju un zemu trokšņu līmeni. Tas tiek panākts, pakāpeniski skenējot objektu ar fokusētu gaismas staru no koherenta avota vai galda, izmantojot īpašas dienasgaismas zondes un īpašas metodes gaismas plūsmu ierobežošanai.

Skenēšanas sistēmas CLSM var klasificēt šādi.

1. Staru skenēšana.

A) Spoguļu sistēmas: viena spoguļa, divu spoguļu, rezonējošas magnetoelektriskas.

B) Vieglo šķiedru sistēmas: vienas šķiedras, daudzšķiedru.

C) Skenēšana ar objektīvu:

· lēcas pjezoelektriskā kustība pa asīm X, Y;

lēcas pjezoelektriskā kustība pa Z asi.

D) Akustiski-optiskie staru deflektori: divi akustiski-optiskie deflektori skenēšanai pa X un Y asīm.

E) Disku sistēmas:

vienas spirāles vienpusējs un divpusējs;

Daudzspirālveida vienpusējs un divpusējs.

E) Kombinētās sistēmas: akustiski optiskais deflektors pa Y asi un spoguļu skenēšana pa X asi.

2. Skenēšanas tabula.

A) Stepper piedziņa: skenēšanas stadija ar pakāpju motoriem pa X, Y, Z asīm.

B) Kombinētā piedziņa: skenēšanas stadija ar soļu motoru X, Y asīs un pjezoelektrisko piedziņu Z asī.

Rīsi. 5. KLSM darba shematiskā diagramma.

1 - skenēšanas galds; 2 - testa paraugs; 3, 7 - lēcas; 4 - skenēšanas ierīce; 5 - staru sadalītāja plāksne; 6 - gaismas stars no lāzera; 8, 12 - punktu B un C attēls; 9 - adatas diafragma; 10 - punkta A attēls adatas diafragmas centrā; 11 - starojuma uztvērējs; 13, 15 - punktu B un C spīdums, kas ir ārpus objektīva 3 fokusa; 14 - punkta A mirdzums, kas atrodas objektīva 3 fokusā.

Ierosināšanas gaismas plūsma 6 no lāzera avota caur staru sadalīšanas plāksni 5, skenēšanas sistēmu 4 iekļūst lēcā 3 un tiek fokusēta testa sagatavošanas plaknes punktā A (piemēram, šūnā), kas ir fokusā. . Mēs uzskatām, ka intracelulārās struktūras ir saistītas ar fluorescējošām zondēm un staru kūļa fokusēšanas punktu A var uzskatīt par punktveida gaismas avotu, no kura fluorescences plūsma caur 3. objektīvu, staru sadalītāju 5, objektīvu 7 fokusējas adatas diafragmas plaknē. 9 ("pinhole") un reģistrē ar fotodetektoru 11 Apgaismojums ar ierosmes plūsmu preparāta fragmentiem, kas atrodas ārpus lēcas fokusa gar optisko asi (punktos B un C), ir mazāks nekā punktā A. Tāpēc detektora mērķa apgaismojuma komponentu no punktiem B un C var ievērojami samazināt. Fluorescences plūsmas, kas nāk no punktiem B un C, kas ir ārpus fokusa, ir ierobežotas ar caurumu un neietilpst detektorā, vai arī neliela daļa no tām nekrīt. Tādējādi, skenējot preparātu plaknē XY detektors reģistrē signālu, kura līmeni nosaka attālums no skenēšanas plaknes pa koordinātu Z. Objekta 3 fokusa apvienošana ar skenēšanas plakni un 7. objekta fokusa ar adatas diafragmu atspoguļojas terminā "konfokalitāte". Skenēšanas plaknes pakāpeniska kustība pa Z asi ļauj iegūt kontrasta attēlu sēriju pa slānim un rekonstruēt pētāmā objekta iekšējo trīsdimensiju struktūru (3-D). Attēla kvalitāte, plaknes izšķirtspēja XY un gar Z asi ir atkarīga no optikas kvalitātes, skenēšanas sistēmu kvalitātes, cauruma diafragmas izmēriem un ražošanas precizitātes, struktūras stingrības, izmantoto signālu apstrādes algoritmu efektivitātes un fluorescējošās zondes.

Lai noteiktu mikroskopa telpisko izšķirtspēju, tiek analizēts punktveida gaismas avota attēls. Punkta avota attēls, ko veido parasts objektīvs, ir difrakcijas gaisīgs plankums, kas sastāv no spilgtas centrālās kodola un vājākiem ārējiem gredzeniem.

Rīsi. 6. Gaisīgs difrakcijas plankums.

Divi vienāda spilgtuma punktveida avoti, attālums starp kuriem ir vienāds ar d , ir redzami kā divi atšķirīgi punkti, ja attālums starp Gaisīgo apļu centriem pārsniedz šādu vērtību:

r A = XY \u003d 0,6 λ / NA,

kur r A - pirmā tumšā gredzena rādiuss Airy aplī, λ ir gaismas avota viļņa garums nm, NA ir skaitliskā apertūra.

Šo izteiksmi sauc par Reilija kritēriju. Tas nosaka mikroskopa izšķirtspēju parauga plaknē (XY). Šajā gadījumā izšķirtspējas robežu galvenokārt nosaka gaismas viļņu raksturs, un tāpēc tas bieži tiek vienkāršots, ņemot vērā NA=1. CLSM attēlveidošanas rezultātā nedaudz samazinās gaisīgās vietas izmērs. Airy plankuma intensitāte standarta mikroskopam samazinās saskaņā ar likumu n -2 , kur n ir šķērseniskā nobīde, un CLSM gadījumā intensitāte samazinās par n -4 . Tas palielina CLSM izšķirtspēju 1,5 reizes. Konfokālajam mikroskopam Reilija kritērijam ir šāda forma:

XY c r \u003d 0,4 λ / NA,

kur XY c r ir CLSM izšķirtspēja.

Lai novērtētu CLSM priekšrocības, apsveriet instrumentālo funkciju (Erie plankuma struktūru) un analizējiet mikroskopa izšķirtspēju aksiālajā virzienā (Z). 3D Airy spot (intensitātes sadalījums) ir 3D aparatūras funkcija (TAF), kas nosaka objekta attēlu. Parastā mikroskopa TAF ir konisks, uzliesmojošs uz augšu un uz leju no centra, savukārt konfokālajam mikroskopam tas ir eliptisks un mazāk aksiāli izstiepts.

Rīsi. 7. attēls. Parastā mikroskopa punktveida avota trīsdimensiju instrumentālās funkcijas skats - (a) un CLSM - (b).

Rayleigh kritērijs ir piemērojams arī, lai noteiktu mikroskopa izšķirtspēju optiskās ass virzienā. Parastajam mikroskopam divus punktveida avotus, kas atrodas noteiktā attālumā gar optisko asi, var noteikt, ja to gaisīgo plankumu maksimumi atrodas attālumā:

Z r = 2 λ/NA 2 ,

kur Z r ir mikroskopa aksiālā izšķirtspēja.

Enerģijas sadalījums Airy vietā CLSM ir šaurāks, un izšķirtspēja aksiālajā virzienā ir 1,4 reizes lielāka. Konfokālajam mikroskopam Reilija kritērijam ir šāda forma:

Z r c \u003d 1,4 λ / NA 2,

kur Z r c ir CLSM aksiālā izšķirtspēja.

Mūsdienu CLSM ir viena galvenā priekšrocība - iespēja iegūt plānas optiskās sekcijas. Iegūstot plānas optiskās sekcijas, attēla kvalitāti ietekmē šādi parametri:

konfokālās apertūras izmērs;

Objektīva NA skaitliskā apertūra;

refrakcijas indekss;

gaismas absorbcija paraugā.

Gaismas intensitātes samazināšanās, palielinoties parauga biezumam, ietekmē mikroskopa izšķirtspēju gar optisko z asi Izšķirtspēja ir atkarīga no mikroskopa un parauga optikas. Optiskās sekcijas biezumu konfokālajā mikroskopā parasti raksturo izkliedes platums intensitātes maksimuma pusaugstumā ∆z 1/2 = 0,65 μm. Ja paraugs un detektors ir ideāli, šis parametrs ir atkarīgs no objektīva skaitliskās apertūras, viļņa garuma λ un iegremdēšanas vides refrakcijas indeksa n i .

Rīsi. 8. att. Mikroskopa aksiālās izšķirtspējas ∆z 1/2 atkarība no objektīva skaitliskās apertūras.

KLSM detektora priekšā ir novietota regulējama diafragma, kas maina gaismas daudzumu. Adatu diafragmas ir paredzētas, lai radītu apstākļus maksimālai vai pilnīgai gaismas filtrēšanai, kas nonāk attēlveidošanas plaknē no punktiem, kas nesakrīt ar fokusa plakni vai atrodas netālu no analizējamā objekta elementa fokusa plaknē. Adatas diafragmas izmērs ir ierobežots, un no tā ir atkarīga ierīces šķērsvirziena izšķirtspēja, preparāta apgaismoto elementu spilgtums, kas nobīdīts attiecībā pret fokusa plakni pa Z asi, un lauka dziļums. Diafragmas izmērs ietekmē iegūtās sekcijas biezumu. Jo mazāka ir apertūra, jo tuvāk sekcijas biezums teorētiskajai robežai (sadales platums pie intensitātes maksimuma puses maksimuma), un pie ļoti lielām apertūrām iespēja iegūt plānu griezumu kļūst neiespējama.

Kā minēts iepriekš, CLSM ļauj iegūt optisko griezumu ievērojamā dziļumā no parauga virsmas, savukārt svarīgs punkts ir refrakcijas indekss un dziļuma problēma. Negadījuma un atstarotā staru kūļa pāreja caur paraugu ietekmē attēla kvalitāti. Ja iegremdēšanas vides un parauga laušanas koeficienti ir tuvi (iegremdēšanas šķidruma un objekta refrakcijas koeficientu atšķirības ietekme uz izkliedētās gaismas parādīšanos, samazinot attēla kontrastu un darbojoties kā sfēriskas aberācijas efekts), gaismas konuss saplūdīs. Ja refrakcijas rādītāji ir atšķirīgi, parādās sfēriskā aberācija.

Rīsi. 9. Imersijas vides un parauga laušanas rādītāji.

a – attēla veidošana ar imersijas objektīvu bez aberācijas; b – sfēriskā aberācija indikatoru nesakritības dēļ.

Ar dažādiem refrakcijas rādītājiem gaismas stari, kas pārvietojas dažādos attālumos no optiskās ass, netiek fokusēti vienā punktā, kas noved pie attēla kvalitātes zuduma. Ja iespējams, ir jāsaskaņo parauga un objektīva refrakcijas rādītāji. Ja parauga un iegremdēšanas vides refrakcijas rādītāji atšķiras, objekta attēls dziļumā pa optisko asi ir izplūdis un fokusa plakne tiek nobīdīta. Lai palielinātu iespiešanās dziļumu, objektīvam ir jābūt ar lielu skaitlisko apertūru, piemēram, iegremdējamam objektīvam. Tomēr šādiem objektīviem ir neliels maksimālais attālums no objektīva lēcas līdz fokusa plaknei. Iespiešanās dziļumu ietekmē parauga neviendabīgums, kas noved pie gaismas intensitātes samazināšanās lielā dziļumā un ēnas parādīšanās. Ideālā gadījumā paraugam, kas sasniedz maksimālo iespiešanās dziļumu un maksimālo izšķirtspēju, refrakcijas koeficientam jābūt vienādam ar objektīva refrakcijas koeficientu, taču tas ir viendabīgs paraugs, un šādi bioloģiskie paraugi neeksistē.

Skenēšanas laikā KLSM iegūst virkni optisko sekciju ar regulāri pieaugošu dziļumu no parauga virsmas. Lielākajai daļai CLSM simtiem 2D attēlu iegūšana aizņem tikai dažas minūtes. Optisko attēlu var iegūt divos veidos:

1) optisko sekciju secības iegūšana XY plaknē, kas atrodas ∆z attālumā viens no otra. Objektu centru koordinātu salīdzinājums dažādās sekcijās ļauj noteikt to orientāciju un sadalījumu garumā.

Rīsi. 10. Trīsdimensiju struktūras izpēte XY plaknē.

2) iegūstot vairākus optiskos griezumus XZ plaknē, kas atrodas attālumā ∆y. Ja paraugs ir paralēls griezuma plaknei, tad tā griezums XZ plaknē būs gandrīz apaļš, salīdzinot attēlus dažādos XZ griezumos, iespējams noteikt pētāmā objekta izliekumu.

Rīsi. 11. Trīsdimensiju struktūras izpēte XZ plaknē.

Pētīto objektu trīsdimensiju rekonstrukcija, izmantojot CLSM metodes, ir vērsta uz divu problēmu risināšanu:

objekta trīsdimensiju attēla vizualizācija, kas iegūta, "saliekot" tā optiskās sadaļas;

· objekta iekšējo struktūru kvantitatīvā analīze.

Līdz šim ir diezgan daudz CLSM ražotāju. CLSM ražotāju inovācijas:

· 2002. gadā Leica paziņoja par akustiski-optisko staru sadalītāju (AOBS), kas ļauj efektīvi atdalīt ierosmes lāzera staru un luminiscenci;

· 2002. gads Carl Zeiss sāka ražot konfokālo mikroskopu LSM 510 META ar oriģinālu fotodetektoru, kas reģistrē signālu vienlaicīgi 32 spektrālajos kanālos;

· 2004 Zeiss izveido ātrdarbīgu LSM 5 Live, kura skenēšanas ātrums ir 20 reizes lielāks nekā parastajam CLSM;

· Olympus ir izstrādājis ierīci ar diviem skeneriem, ļaujot efektīvāk izmantot, piemēram, FRAP tehniku;

· Nikon - rada kompaktu un lētu KLSM vienkāršotu dizainu;

· 2007. gadā Leica paziņoja par 4Pi-konfokālā mikroskopa izlaišanu, kas uzlabo aksiālo izšķirtspēju 4 līdz 7 reizes.

Apsveriet ierīci KLSM, kas saistīta ar jaunu, progresīvāku ierīču paaudzi - TCS SP5 no Leica.

Rīsi. 12. Daudzfotonu/konfokālā platjoslas sistēma TCS SP5 (apgrieztais mikroskops).

CLSM TCS SP5 galvenie elementi: AOTF – akustiski-optiski regulējams filtrs, AOBS – akustiski-optiskais staru sadalītājs, SP-Detector – spektrālā fotometra sensors.

AOTF - Akustiskais optiskais regulējams filtrs - kalpo, lai samazinātu optisko ekspozīciju, pielāgo lāzera jaudu atkarībā no parauga un fluorohroma. Ļauj izvēlēties vēlamo viļņa garumu un kontrolēt ierosmes gaismas intensitāti. AOTF ir elektriski regulējams filtrs, kas darbojas pēc gaismas stara tilpuma difrakcijas principa pēc refrakcijas indeksa neviendabīguma. Šādas neviendabības rodas, ja ultraskaņas akustiskais vilnis tiek ierosināts divkāršās laušanas kristālos. Ar anizotropu difrakciju vieniālos kristālos ir minimālā ultraskaņas frekvence, pie kuras sakrīt krišanas un difrakcijas leņķi, un notiek tā sauktā kolineārā akusto-optiskā mijiedarbība.

Rīsi. 13. Akustiski-optiski regulējams filtrs.

AOBS - akustiski-optiskais staru sadalītājs, ir akustiski optiskais kristāls - noskaņojama refrakcijas ierīce, kas darbojas apgrieztā režīmā. Kas nodrošina AOBS izmantošanu:

1. Lai iegūtu skaidru attēlu ar zemu trokšņu līmeni, ir nepieciešama augsta gaismas caurlaidības pakāpe. Trokšņa samazināšana, aprēķinot attēla vidējo vērtību daudzās secīgās skenēs, noteikti noved pie pētāmā objekta fotobalināšanas. AOBS gaismas caurlaidības ātrums ir pārāks par lielāko daļu dihromisko spoguļu visā redzamajā spektrā. Tāpēc ir nepieciešams vidējais rādītājs mazākam skenēšanas reižu skaitam. Tā rezultātā zāles ilgs daudz ilgāk;

2. Lai iegūtu spilgtus un skaidrus attēlus, no objekta uz detektoru ir jāpāriet pēc iespējas vairāk fotonu, kas uzlabo attēla kvalitāti. AOBS nodrošina platāko fluorescences joslu reģistrāciju, tas ir, maksimālo fotonu skaitu;

3. Zema balināšana attēlveidošanas laikā ir svarīga, lai aizsargātu paraugu no izbalēšanas un dzīvos objektus no toksiskiem fluorohroma fotolīzes produktiem. AOBS gaismas caurlaidības līknēm ir ļoti stāvas nogāzes, kas ļauj reģistrēt fluorohroma fluorescenci pēc iespējas tuvāk tās ierosmes joslai;

4. Jebkuru krāsu redzamajā diapazonā var uzbudināt, jo atspulgu var pielāgot individuāli;

5. Atrisināts daudzparametru fluorescences jautājums: var ieprogrammēt līdz astoņām lāzera emisijas līnijām, atstājot pietiekami daudz vietas fluorescences reģistrācijai, kamēr tiek regulētas frekvences;

6. Krāsvielu attiecībai kā metabolīta - paraugu ierosmes attiecībai, piemēram, Ca 2+ , membrānas potenciālam, pH vajadzētu ātri mainīties secīgās skenēšanas laikā. AOBS pārslēdzas dažās mikrosekundēs;

7. Vēl viena izmantošanas iespēja ir attēla reģistrācija atstarotā gaismā. AOBS ļauj individuāli pielāgot atstarotās ierosmes gaismas caurlaidību;

8. Uzlabota arī ROI skenēšana (secīgā skenēšana un specifiskā apgabala skenēšana): vienas skenēšanas laikā dažādām zonām ir piemērojami dažādi ierosmes režīmi;

9. Liels 3D ierakstu apjoms, secīgā režīmā, gūst labumu no ātras pārslēgšanas ierīcēm, jo ​​ātrums palielina sistēmas efektivitāti;

10. Fluorescences korelācijas spektroskopijai (FCS) ir nepieciešama zema fona un vāja gaismas izkliede. Tikai AOBS efektīvi bloķē tuvumā esošās emisijas līnijas no, piemēram, Ar lāzeriem;

11. Spektrālā ierakstīšana (Lambda skenēšana) nodrošina precīzu spektru, jo AOBS gaismas caurlaidība ir "balta", kas nozīmē, ka tas neievieš izmaiņas emisijas spektrā - kas ir izplatīta problēma, veicot spektrālo skenēšanu sistēmā ar dihromu. spoguļi;

12. Patiesai konfokālai optiskai sekcijai ir nepieciešams punktveida apgaismojums un punktu fluorescences ierakstīšana. AOBS ir piemērots lietošanai ar konfokālajiem punktu skeneriem;

13. Daudzfotonu vai ultravioleto attēlveidošanu var veikt paralēli bez kļūdām un ierobežojumiem. AOBS nemaina neredzamo lāzeru ierosmi un nemaina fluorescences spektru;

14. Nav iespējams veikt kļūdainu darbību, jo AOBS kopā ar piedziņas vadību kontrolē AOTF (akustiskais optiskais regulējams filtrs). Ja ir izvēlēta ierosmes līnija, tad AOBS tiek attiecīgi ieprogrammēts. Operatoram nav jāpieņem lēmumi – darbs tiek veikts pareizi un automātiski;

15. Nav novirzes, jo nav kustīgu elementu, kas raksturīgi filtru tvertnēm un slīdņiem. Kristāls ir stingri uzstādīts, programmēšana tiek veikta elektroniski;

16. Nav nepieciešams dārgs papildu aprīkojums, piemēram, filtru klucīši, dihromiskie spoguļu slīdņi utt. Līdz ar to tehniskās palīdzības izmaksas jaunu optisko elementu uzstādīšanai ir daudz zemākas.

Rīsi. 14. AOBS - akustiski-optiskais staru sadalītājs.

SP-Detector ir spektrālā fotometra sensors. Gaisma no parauga, kas ir inducētās fluorescences spektru summa, iet caur cauruma diafragmu, kas veido konfokālu optisko sekciju. Turklāt ar prizmas palīdzību šī gaisma tiek sadalīta spektrā. Izejot cauri pirmajam detektoram, gaisma iziet cauri spraugas fotometra ierīcei, kas sastāv no diviem slēģiem ar piedziņu. Šie slēģi nogriež spektra malas abās diapazona pusēs un novirza tos uz 2. un 3. kārtas sensoriem. Rezultātā spektrs tiek sadalīts vienlaicīgi piecos kanālos. Rezultātā, izmantojot SP detektoru, tiek reģistrēts starojums no dažādām paraugā esošajām krāsvielām.

Rīsi. 15. Spektrālais detektors SP.

SP detektors ļauj veikt lambda skenēšanu: tiek uzkrāti spektrālie attēli, lai nekavējoties analizētu eksperimentā iesaistīto krāsvielu īpašības.

2013. gada 4. jūnijs

Ievērojama daļa no Maskavas Valsts universitātes Bioloģijas fakultātē veiktajiem zinātniskajiem pētījumiem, ar tiem cieši saistītu izglītības programmu veiksmīga īstenošana nav iedomājama bez modernāko mikroskopisko tehnoloģiju izmantošanas. Maskavas Universitātes Attīstības programmas ietvaros Bioloģijas fakultātē izveidota starpresoru konfokālās mikroskopijas laboratorija, kas ir pilnībā aprīkota ar nepieciešamo aprīkojumu un darbojas efektīvi.

3T3 fibroblasti uz matricas makroporas sieniņām

Teksts: Tretjakovs Artemijs

Ko var darīt?

Izmantojot konfokālais mikroskops jūs varat iegūt vairākus šūnas virtuālo daļu attēlus vai no tiem samontētu trīsdimensiju modeli. Šādas iespējas sniedz lāzers, kura staru var fokusēt jebkurā šūnas punktā. Lai iegūtu attēlu, objektam ir jābūt fluorescējoši aktīvam, tas ir, kad lāzera stars trāpa pret to (pareizāk sakot, noteiktām molekulām tā sastāvā), tam ir jāizstaro gaisma ar garāku viļņa garumu nekā tam, kas uz to trāpa, ko uztver mikroskopu. Attēls ir veidots, pamatojoties tikai uz šo fluorescenci.

Fotoattēls

Kā tas darbojas?

“Pašreizējais fundamentālo un lietišķo starpdisciplināro zinātnisko pētījumu attīstības līmenis, kā arī speciālistu sagatavošanas uzdevumi ar starpdisciplinārām kompetencēm prasa intensīvu materiāli tehniskās bāzes attīstību un modernizāciju” (Maskavas Universitātes Attīstības programma, 5. lpp.;) .

Papildus lāzeram elektromehāniskā ierīce ietver arī optisko filtru, kas pārraida lāzera staru, bet atstaro garāka viļņa garumu uz diafragmu, ko sauc par “pinhole” (no angļu valodas. Pinhole ir caurums, kas izveidots ar tapu, burtiskā nozīmē tulkojums lieliski raksturo pinhole ierīci), kas nogriež visu nevajadzīgo fona gaismu un tādējādi samazina vai pilnībā noliedz pamatā esošo optisko slāņu ietekmi uz šūnas skenētā laukuma attēla skaidrību. Ja caurums nenogrieztu fona gaismu, tad optiskie slāņi pārklātos un traucētu novērotājam - it kā viņš skatītos caur lapotni tālumā. Aiz diafragmas atrodas fotodetektors, kas digitalizē saņemto informāciju.

Skaidrs, ka šāda "spot" skenēšana prasa laiku. Lai paātrinātu šo procesu konfokālajā sistēmā, tiek izmantots cits modulis, ko sauc par vērpšanas disku, kas ļauj vienā lāzera darbības aktā iegūt nevis viena punkta, bet visas līnijas attēlu.

Patentu šādai sistēmai 1961. gadā ieguva MIT profesors Mārvins Minskis. To aktīvi sāka izmantot 80. gados, un tagad konfokālā mikroskopija piedzīvo savus ziedu laikus. Krievijā pirmais mikroskops parādījās 2003. gadā, tas bija Axiovert 200M LSM510 Meta. Sekoja citi, un tagad mūsu valstī ir vairākas lielas laboratorijas, tostarp starpresoru laboratorija Maskavas Valsts universitātes Bioloģijas fakultātē. Laboratorijas rīcībā ir pieci mikroskopi, tostarp: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

Konfokālā mikroskopija ir sasniegusi ne tikai augstāko kontrastu un trīsdimensionalitāti, tā ir apguvusi arī ceturto dimensiju – laiku, ļaujot pētīt šūnās notiekošās izmaiņas. Šiem nolūkiem katra iekārta ir aprīkota ar dzīvības uzturēšanas sistēmām. Tas viss sniedz plašas iespējas pētniekiem, kuri šīs iespējas veiksmīgi izmanto.

Un, tā kā runa ir par Maskavas Valsts universitātes Bioloģijas fakultātes laboratoriju, tad kā piemēri jāmin šajā laboratorijā veiktie pētījumi.

Zīds un tīkls

Konfokālā mikroskopija ir sasniegusi ne tikai augstāko kontrastu un trīsdimensionalitāti, tā ir apguvusi arī ceturto dimensiju – laiku, ļaujot pētīt šūnās notiekošās izmaiņas.

Viens no interesantiem darbiem ir bioloģiski noārdāmu protēžu izveide asinsvadu un citu dobu orgānu atjaunošanai. Šādas audu inženierijas konstrukcijas ārēji vienkāršākajos gadījumos attēlo caurules vai plēves, kuras tiek uzliktas bojājuma vietā un tādējādi pilda “plākstera” lomu. Tos var izgatavot no dažādiem materiāliem, tostarp no zīdtārpiņa kokona zīda fibroīna. Šī materiāla priekšrocība ir tā, ka tas ir stabils un veido elastīgu un izturīgu protēzes struktūru. Pati protēze tikai ar neapbruņotu aci izskatās pēc plēves, patiesībā tā ir matrica - tīklveida daudzslāņu pamatne, rāmis, kas imitē dzīvo audu struktūru. Šīs sastatnes palīdz jaunajām šūnām ieņemt pareizo pozīciju, nodrošinot to vienmērīgu sadalījumu. Rezultātā tiek atjaunota bojātā orgāna siena, un rāmis, kas kļuvis nevajadzīgs, tiek pakļauts bioloģiskai noārdīšanai. Bet nav tik vienkārši pārbaudīt, cik vienmērīgi šūnas ir sadalītas pa sastatnēm, kā arī to, vai tās labi dzīvo matricas dziļajos slāņos (ja rodas grūtības gāzu apmaiņā un vielmaiņas produktu apmaiņā), un vai tie maina morfoloģiju, kad tie tajā iekļūst, nav tik vienkārši. Tieši šajā posmā mikroskopa (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) izmantošana ievērojami vienkāršoja uzdevumu. Galvenokārt pateicoties iespējai izmeklēt objektu bez iznīcināšanas, kā arī mikroskopa spēju ieskatīties matricas iekšienē līdz 600 mikronu dziļumam.

Fotoattēls

Līdzīgs darbs tika veikts ar kaulaudiem, kuru matrica tika izgatavota gan no viena un tā paša fibroīna, gan no spidroīna, proteīna, kas sākotnēji tika atrasts zirnekļa ķermenī un ko tas izmantoja tīklu aušanai. Laboratorijas apstākļos proteīnu ražo nevis zirnekļi, bet gan raugs, kura genomā tiek ieviests nedaudz modificēts zirnekļa gēns, kas ir atbildīgs par šī proteīna sintēzi.

Nav tik vienkārši

Bet, ja bojājumu rašanās audos ir vienkāršs un saprotams process, citas patoloģijas ne vienmēr ir skaidras. Un pirms efektīvas ārstēšanas uzsākšanas un turklāt to attīstības novēršanas ir jānoskaidro to rašanās mehānisms. Tie ietver aterosklerozi - artēriju slimību, kuras rezultātā lipīdi uzkrājas asinsvada sieniņā vai, pareizāk sakot, intimā - tā iekšējā slānī, padarot sienu biezāku, kas galu galā var pat novest pie pilnīgas asinsvada bloķēšanas. kuģis. Sakarā ar to, ar ko šī slimība rodas, nav līdz galam skaidrs, tāpat kā nav skaidrs, kādu lomu spēlē imūnkompetentās šūnas, kuru uzkrāšanās vietās drīz sākas ateroģenēze. Pilnīgas atbildes uz šiem jautājumiem vēl nav atrastas, taču ateroģenēzes izpēte turpinās, lai gan publikāciju par šo tēmu ir daudz mazāk nekā par audu inženierijas protēžu tēmu.

Fotoattēls

Molekulu liktenis

Starpresoru konfokālās mikroskopijas laboratoriju regulāri izmanto vairāk nekā 20 bakalaura un maģistrantūras studenti no gandrīz 10 nodaļām.

Iepriekš aprakstītajos pētījumos galvenokārt tiek uzraudzīts šūnu stāvoklis. Bet konfokālā mikroskopa iespējas ar to neaprobežojas; tas ir diezgan spējīgs izsekot pat vienas molekulas liktenim šūnā, ja vien tai ir fluorescējoša aktivitāte. Lai to izdarītu, molekulas parasti marķē ar fluorohromiem - īpašām krāsvielām, kurām ir šāda aktivitāte. Fluorohromi pastāv kā atsevišķas molekulas, un to marķēšana sastāv no fluorohroma ķīmiskās saistīšanās ar pētnieku interesējošo molekulu. Pēc tam šādas iezīmētās molekulas nonāk šūnā un to tālākais liktenis tiek uzraudzīts ar mikroskopa palīdzību. Tādā veidā, piemēram, tika salīdzināta ricīna un viskumīna aktivitāte un kustības šūnā. Abas vielas ir olbaltumvielu toksīni, abas ir augu izcelsmes un sastāv no divām daļām – apakšvienībām, no kurām viena ir atbildīga par saistīšanos ar šūnu un iekļūšanu iekšā, bet otra par ribosomas inaktivāciju, kas galu galā noved pie šūnu nāves. Praktiskais ieguvums atkal saistīts ar citas bīstamas slimības – vēža – ārstēšanu. Šāda skaidra "pienākumu nodalīšana" starp apakšvienībām ļauj aizstāt pirmo apakšvienību, piemēram, ar antivielu. Jūs saņemsiet "imunotoksīnu", kas iedarbojas tikai uz noteiktām šūnām, kurām šī antiviela iederēsies. Ir divas galvenās problēmas. Pirmkārt: tādu antivielu izvēle, kas tuvosies vēža šūnām un neļaus toksīnam iekļūt veselajās. Un otrkārt: toksīna izvēle, kas, pārvēršoties imūntoksīnā, saglabāsies ļoti efektīva.

Fotoattēls: Jaundzimušo žurku sirds šūnu primārā kultūra: A - kontrole, B - dienas laikā apstrādāta ar 20 μM izoproterenolu. 1 - mitohondriju krāsošana ar TMRE; 2 - fāzes kontrasts. Mērogs 10 µm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. "Jaundzimušo žurku kultivēto kardiomiocītu mitohondrijās adaptīvās izmaiņas izoproterenola ietekmē". Starptautiskā konference "Receptori un intracelulārā signalizācija" 2011. gada 24.-26. MAIJS, Puščino).

Izglītība

Ar konfokālās mikroskopijas palīdzību veikto darbu sarakstu var turpināt vēl ilgi. Efektīva metode, kas ļauj strādāt arī ar dzīvām šūnām, ir pieprasīta gandrīz visos zinātniskajos pētījumos. Un tāpēc studentu sagatavošanai darbam šajā laboratorijā ir milzīga loma. To regulāri apmeklē vairāk nekā 20 bakalaura un maģistrantūras studenti, kas iesaistīti kursa darbu, pirmskursu un diplomdarbu sagatavošanā.

Iestādēs strādā embriologi, molekulārie biologi, citologi, bioinženieri, imunologi un zoologi.

Konfokālās mikroskopijas laboratorija dibināta 2004. gadā.

Laboratorijas vadītājs - asociētais profesors M.M. Moysenovičs

Laboratorijā strādā jaunie speciālisti A.A.Ramonova un A.Yu.Arkhipova

Šobrīd laboratorijā ir uzstādītas 2 konfokālās sistēmas:

• Axiovert 200M ar LSM510 META konfokālo stiprinājumu (Carl Zeiss, Vācija)
• Konfokālā lāzerskenēšanas sistēma, ko ražo "NIKON CORPORATION" (Japāna) - apgriezts biomedicīnas mikroskops laboratorijas pētījumiem Eclipse ar piederumiem: ar Ti-E statīvu, ar TIRF izgaismotāju, ar A1 konfokālo moduli un konfokālo moduli uz griežamā diska bāzes .

Visas ziņas"

Margolin 389s.

Optiskā mikroskopija izmantojusi visus gan inženierzinātņu un tehnoloģiju, gan informācijas un datortehnoloģiju sasniegumus. Tas ļāva būtiski uzlabot esošās iekārtas un tās izmantošanas metodes, kas savukārt izraisīja jaunu metožu, jo īpaši konfokālās mikroskopijas, rašanos. Konfokālais mikroskops atšķiras no klasiskā optiskā mikroskopa ar to, ka katrā laika momentā tiek fiksēts viena objekta punkta attēls un pilnvērtīgs attēls tiek veidots skenējot (pārvietojot paraugu vai pārstrukturējot optisko sistēmu). Tādējādi skenējošās elektronmikroskopijas princips tiek īstenots savdabīgā formā, kas ļauj ierakstīt un apstrādāt signālu no katra atsevišķa punkta patvaļīgi ilgu laiku.

Klasiskā mikroskopā gaisma no dažādiem parauga punktiem nonāk fotodetektorā. Konfokālajā mikroskopā, lai reģistrētu gaismu tikai no viena punkta, aiz objektīva lēcas novieto nelielu diafragmu tā, lai analizējamā punkta izstarotā gaisma izietu cauri diafragmai un tiktu reģistrēta, un gaisma no objektīva. atlikušos punktus galvenokārt saglabā diafragma, kā parādīts attēlā. 7.28.

Rīsi. 7.28. Staru pārejas shēma konfokālajā optiskajā mikroskopā

Vēl viena iezīme ir tāda, ka apgaismotājs nerada vienmērīgu redzes lauka apgaismojumu, bet fokusē gaismu uz analizējamo punktu. To var panākt, novietojot aiz parauga otru fokusēšanas sistēmu, taču tas prasa, lai paraugs būtu caurspīdīgs. Turklāt objektīvi parasti ir dārgi, tāpēc nav vēlams izmantot otru fokusēšanas sistēmu apgaismojumam. Alternatīva ir izmantot staru sadalītāju, lai gan krītošā, gan atstarotā gaisma tiktu fokusēta ar vienu un to pašu objektīvu. Šāda shēma arī atvieglo pielāgošanos.

Tagad apskatīsim, kā un kā kvantitatīvi mainās kontrasts, izmantojot konfokālo mikroskopiju. Tā kā konfokālajā mikroskopā gaisma caur objektīvu iziet divas reizes, punktu izplūšanas funkcija (turpmāk tekstā – PŠŠ) būs neatkarīgu varbūtību rezultāts, ka fotons trāpīs punktā ar savām koordinātām vai fotons tiks reģistrēts no šī punkta.

Ja izšķirtspējai izmantojat Rayleigh kritēriju, izrādās, ka izšķirtspēja konfokālajā mikroskopā palielinās, bet ne būtiski. Konfokālajam mikroskopam ir izšķirtspējas r izteiksme:

Parastajam mikroskopam:

Tomēr galvenā konfokālā mikroskopa priekšrocība ir nevis izšķirtspējas palielināšanās Reilija kritērija izpratnē, bet gan ievērojams kontrasta pieaugums. Jo īpaši parastajām PŠŠ fokusa plaknē amplitūdas attiecība pirmajā sānu maksimumā pret amplitūdu centrā ir 2%, un konfokālajam mikroskopam šī attiecība būs 0,04%. No tā izriet, ka blāvu objektu, kura intensitāte, piemēram, 200 reižu mazāka nekā spilgtam objektam, nevar noteikt parastajā mikroskopā, lai gan attālums starp objektiem var būt ievērojami lielāks par attālumu, ko nosaka Reilija kritērijs. . Tajā pašā laikā šāds objekts ir labi jāreģistrē konfokālajā mikroskopā.

Svarīgs parametrs ir atvēruma lielums apstarojošo un saplūstošo lēcu fokusa plaknē. Diafragmas attēls objekta plaknē nosaka, no kuriem apgabaliem gaismu reģistrē fotodetektors. Ir acīmredzams, ka diafragmas atvēruma lieluma samazināšana samazina caurlaidīgās gaismas daudzumu, palielina trokšņa līmeni un galu galā var liegt visas iegūtās kontrasta priekšrocības. Tādējādi rodas jautājums par optimālo diafragmas izmēra izvēli un saprātīgu kompromisu.

Diafragmas atvērums, kas ir mazāks par Airy punktu, vienkārši izraisa intensitātes zudumu un nekādā veidā neietekmē izšķirtspēju. Diafragmas atvērums ar viena cauruma lielumu Gaisīgs punkts palielina objektīva objektīva izšķirtspēju. Tomēr vispiemērotākais kompromiss šķiet diafragma, kuras cauruma izmērs ir aptuveni 3 līdz 5 reizes lielāks par Airy plankumu. Jāsaprot, ka šeit apskatītajam izmēram ir attēla lieluma nozīme objekta plaknē, un tāpēc diafragmas cauruma faktiskais izmērs ir atkarīgs no objektīva palielinājuma. Jo īpaši, izmantojot 100x objektīvu, diafragma ar 1 mm diafragmu tiks projicēta objekta plaknē aplī ar rādiusu 10 µm.

Konfokālās mikroskopijas idejas attīstība bija konfokālā lāzera skenējošā mikroskopa (KJICM) izstrāde, ko izraisīja nepieciešamība pēc jutīgākām un metroloģiski stingrākām metodēm novēroto objektu formas un telpiskās struktūras analīzei. KLSM shematiska diagramma ar galvenajiem funkcionālajiem savienojumiem ir parādīta attēlā. 7.29.

CLSM galvenā iezīme ir iespēja pētāmā objekta attēlveidošanu pa slānim ar augstu izšķirtspēju un zemu trokšņa līmeni. Tas tiek panākts, pakāpeniski skenējot objektu ar fokusētu gaismas staru no koherenta avota vai pārvietojot skatuvi, izmantojot īpašas dienasgaismas zondes un īpašas metodes gaismas plūsmu ierobežošanai.

Rīsi. 7.29. KJICM strukturālā diagramma:

1 - skenēšanas galds; 2 - testa paraugs; 3, 6 - lēcas; 4 - skenēšanas ierīce; 5 - staru sadalīšanas plāksne; 7, 9 - adatu diafragmas; 8 - starojuma uztvērējs; 10 - lāzers; 11 - Vadības bloks; 12 - dators; 13 - asu skenēšanas diskdzinis z.

Cauruma diafragmas izmantošana CLSM, kuras izmēri atbilst mikroskopa palielinājumam un viļņa garumam, ļauj palielināt izšķirtspēju par vairāk nekā 10%. Acīmredzot CLSM izšķirtspēja un attiecīgi smalko struktūru analīzes iespējas var pārsniegt parastā mikroskopa līdzīgās iespējas ne vairāk kā par 40% apstākļos, kad preparāts tiek skenēts ar plānu staru. KLCM izšķirtspēja ir atkarīga no mikroskopijas un apgaismojuma metodes. Tiek noteikta KLCM izšķirtspēja gan optiskā sistēma, gan elektroniskais ceļš informācijas apstrāde. Tāpēc KLCM projektēšanā ir jāsaskaņo tā shēmas, tādi parametri kā optiskās sistēmas izšķirtspēja, skenēšanas solis, detektora raksturlielumi, kā arī jāizvēlas optimālie apstrādes algoritmi un atbilstoša programmatūra.

Vispārīgā gadījumā KLCM lauka dziļums ir atkarīgs no apertūras, viļņa garuma, gaismas avotu koherences un adatas diafragmas izmēra. Adatas diafragma ir galvenais dizaina elements, kas atšķir KLCM no cita veida mikroskopiem. Adatu diafragmas ir paredzētas, lai radītu apstākļus maksimālai vai pilnīgai gaismas filtrēšanai, kas nonāk attēlveidošanas plaknē no punktiem, kas nesakrīt ar fokusa plakni vai atrodas netālu no analizējamā objekta elementa fokusa plaknē.

Adatas diafragmas optimālā diametra izvēle ir svarīga, lai iegūtu instrumentam nepieciešamās īpašības. Sakarības sānu izšķirtspējas un lauka dziļuma KJICM novērtēšanai iegūtas, pieņemot, ka adatas diafragmai ir maza apertūra, kas ir gaismas punkts. Patiesībā adatas diafragmas izmērs ir ierobežots, un no tā ir atkarīga ierīces šķērseniskā izšķirtspēja, preparāta apgaismoto elementu spilgtums, kas nobīdīts attiecībā pret fokusa plakni pa asi. z, un lauka dziļums. Ar mazu adatas diafragmas diametru gaismas plūsma kļūst maza, kas samazina signāla un trokšņa attiecību un samazina kontrastu. Pie liela diametra adatas diafragmas efektivitāte tiek samazināta, samazinot diafragmas atvērumu.

Pamata koncepcija

Konfokālā punkta sensora princips no Minskovas patenta

Konfokālās mikroskopijas principu 1957. gadā patentēja Mārvins Minskis, un tā mērķis ir pārvarēt dažus tradicionālo platleņķa fluorescences mikroskopu ierobežojumus. Parastā (t.i., plaša lauka) fluorescences mikroskopā viss paraugs tiek vienmērīgi appludināts ar gaismu no gaismas avota. Visas parauga daļas optiskajā ceļā tiek ierosinātas vienlaikus, un iegūtā fluorescence tiek noteikta, izmantojot fotodetektora mikroskopu vai kameras, ieskaitot lielo nefokusēto fona daļu. Turpretim konfokālais mikroskops izmanto apgaismojuma punktu (skatiet punktu izkliedes funkciju) un niecīgu caurumu optiski konjugētajā plaknē detektora priekšā, lai izslēgtu nefokusa signālus - nosaukums "konfokāls" cēlies no šīs konfigurācijas. Kad var noteikt gaismu, ko izstaro fluorescence ļoti tuvu fokusa plaknei, attēls optiskajā izšķirtspējā, īpaši parauga dziļuma virzienā, ir daudz labāks nekā plata lauka mikroskopos. Tomēr, tā kā lielāko daļu gaismas no fluorescences parauga bloķē punkcija, šī palielinātā izšķirtspēja rodas uz samazinātas signāla intensitātes rēķina, tāpēc bieži vien ir nepieciešama ilga ekspozīcija. Lai kompensētu šo signāla kritumu pēc punkcija, gaismas intensitāte tiek noteikta, izmantojot jutīgu detektoru, parasti fotopavairotāja cauruli (PMT) vai lavīnas fotodiodi, pārvēršot gaismas signālu elektriskā signālā, ko ieraksta dators.

Tiklīdz tiek izgaismots viens parauga punkts, 2D vai 3D attēli ir jāskenē pa parastu rastru (ti, paralēlu skenēšanas līniju taisnstūra rakstu). Staru skenē pāri paraugam horizontālā plaknē, izmantojot vienu vai vairākus (servovadāmus) oscilējošus spoguļus. Šai skenēšanas metodei parasti ir zema reakcijas aizkave, un skenēšanas ātrumu var mainīt. Lēna skenēšana nodrošina labāku signāla un trokšņa attiecību, kā rezultātā ir labāks kontrasts un augstāka izšķirtspēja.

Sasniedzamo fokusa plaknes biezumu galvenokārt nosaka izmantotās gaismas viļņa garums, dalīts ar šī objektīva skaitlisko apertūru, kā arī parauga optiskajām īpašībām. Smalka optiskā sagriešana, iespējams, padara šāda veida mikroskopus īpaši piemērotus 3D vizualizācijai un paraugu virsmas profilēšanai.

Secīgas šķēles veido "Z-stack", ko var apstrādāt ar īpašu 3D attēlveidošanas programmatūru, vai arī to var apvienot 2D steksā (pārsvarā tiek ņemta maksimālā pikseļu intensitāte, citas izplatītas metodes ietver standarta novirzes vai pikseļu sakraušanas izmantošanu).

Konfokālā mikroskopija nodrošina tiešu, neinvazīvu, sērijveida neskartu, tauku un dzīvu paraugu optisku griezumu ar minimālu parauga sagatavošanu, kā arī nelielu sānu izšķirtspējas uzlabojumu. Lai izvēlētos objektus padarītu redzamus, bioloģiskos paraugus bieži apstrādā ar fluorescējošām krāsvielām. Tomēr faktisko krāsvielu koncentrāciju var uzturēt zemu, lai samazinātu bioloģisko sistēmu traucējumus: daži instrumenti var izsekot atsevišķas fluorescējošās molekulas. Turklāt transgēnās metodes var radīt organismus, kas ražo savas himēriskās fluorescējošās molekulas (piemēram, GFP saplūšana, zaļā fluorescējošā olbaltumviela ar interesējošo proteīnu). Konfokālie mikroskopi darbojas pēc punktveida ierosināšanas paraugā (difrakcija ierobežota ar punktu) un iegūtā fluorescējošā signāla punktveida noteikšanas principa. Detektora caurums nodrošina fizisku barjeru, kas bloķē ārpusfokusa fluorescenci. Tiek ierakstīts tikai fokuss jeb Airy diska centrālais punkts. Parauga rastra skenēšana vienā punktā ļauj savākt plānas optiskās daļas, vienkārši mainot Z-fokusu. Iegūtos attēlus var sakraut, lai iegūtu parauga 3D attēlu.

Horizontālajai skenēšanai izmantotās metodes

Tirdzniecībā ir pieejami četru veidu konfokālie mikroskopi:

Konfokālajos lāzera skenēšanas mikroskopos tiek izmantoti vairāki spoguļi (parasti 2 vai 3 skenēšana lineāri gar x un y asi), lai skenētu lāzeru uz parauga un "atskenētu" attēlu caur fiksētu caurumu un detektoru.

Ieguvumi

CLSM tiek plaši izmantots daudzās bioloģijas zinātnes disciplīnās, sākot no šūnu bioloģijas un ģenētikas līdz mikrobioloģijai un attīstības bioloģijai. To izmanto arī kvantu optikā un nanokristālu attēlveidošanā un spektroskopijā.

Bioloģija un medicīna

Konfokālās mikroskopijas attēlu kaudzes piemērs, kas parāda aktīna pavedienu sadalījumu visā šūnā.

Klīniski CLSM izmanto dažādu acu slimību novērtēšanā, un tas ir īpaši noderīgs radzenes endotēlija šūnu attēlveidošanai, kvalitatīvai analīzei un kvantitatīvai noteikšanai. To izmanto, lai lokalizētu un identificētu pavedienveida sēnīšu elementu klātbūtni radzenes stromā keratomikozes gadījumos, ļaujot ātri diagnosticēt un tādējādi agrīni noteikt galīgo terapiju. Pētījumi par CLSM metodēm endoskopiskām procedūrām (endomikroskopija) arī parāda daudzsolījumu. Farmācijas nozarē ir ieteikts uzraudzīt plānslāņa zāļu formu ražošanas procesu, lai kontrolētu zāļu izplatīšanas kvalitāti un vienmērīgumu.

Optika un kristalogrāfija

CLSM tiek izmantots kā datu izguves mehānisms dažās 3D optisko datu uzglabāšanas sistēmās, un tas ir palīdzējis noteikt Magdalēnas papirusa vecumu.

Varianti un uzlabojumi

Aksiālās izšķirtspējas uzlabošana

Punktu izkliedes funkcija ir punktveida elipsoīds, vairākas reizes garāks, ja tas ir plats. Tas ierobežo mikroskopa aksiālo izšķirtspēju. Viena no metodēm, kā to pārvarēt, ir 4 π mikroskopija, kurā krītošā un izstarotā gaisma vai var traucēt gan parauga augšdaļu, gan apakšējo daļu, lai samazinātu elipsoīda tilpumu. Alternatīvā metode konfokālā mikroskopija teta. Izmantojot šo paņēmienu, apgaismojuma gaismas konuss un uztveramā gaisma atrodas viens pret otru leņķī (labākie rezultāti, ja tie ir perpendikulāri). Abu handikapa funkciju krustpunkts dod daudz mazāku efektīvo izlases apjomu. No tā attīstījās viena mikroskopa apgaismojuma lidmašīna. Turklāt dekonvolūciju var izmantot, izmantojot eksperimentāli atvasinātu punktu izkliedes funkciju, lai noņemtu ārpus fokusa esošo gaismu, uzlabojot kontrastu gan aksiālajā, gan sānu plaknē.

super izšķirtspēja

Ir konfokālie varianti, kas sasniedz izšķirtspēju zem difrakcijas robežas, piemēram, stimulētās emisijas noplicinātās (STED) mikroskopijas. Papildus šai tehnikai ir pieejamas daudzas citas (nekonfokālas) superizšķirtspējas metodes, piemēram, plaukstas, (e) STORM, SIM un tā tālāk. Visām tām ir savas priekšrocības, piemēram, lietošanas vienkāršība, izšķirtspēja un nepieciešamība pēc īpaša aprīkojuma, bufera vai fluorofora.

Zema temperatūra

Paraugu attēlveidošanai zemā temperatūrā ir izmantotas divas galvenās pieejas, abas balstās uz lāzera skenēšanas konfokālās mikroskopijas arhitektūru. Viena pieeja ir nepārtrauktas plūsmas kriostata izmantošana: tikai paraugs ir zemā temperatūrā, un tā optiskā adresācija notiek caur caurspīdīgu logu. Vēl viena iespējama pieeja ir optikas (īpaši objektīva mikroskopa) sadalīšana kriogēnajā krātuvē Dewar. Šī otrā pieeja, lai arī apgrūtinošāka, garantē labāku mehānisko stabilitāti un novērš zudumus loga dēļ.

attēlus

1 eiro monētas daļējs virsmas profils, kas mērīts ar Nipkovas diska konfokālo mikroskopiju.

Atspulga dati 1 eiro monētai.

stāsts

Sākums: 1940-1957

Pirmais konfokāls skenēšana Mikroskopu uzbūvēja Marvins Minskovs 1955. gadā, un patents tika iesniegts 1957. gadā. Apgaismojuma punkta skenēšana fokusa plaknē tika panākta, pārvietojot skatuvi. Neviens zinātnisks izdevums nav iesniegts, un nav saglabājušies ar to izgatavoti attēli.

Tandēma skenēšanas mikroskops

Petrana tandēma skenēšanas mikroskopijas diagramma. Sarkanā josla ir pievienota, lai norādītu Nipkow disku.

1960. gadā Čehoslovākijas Mojmirs Petrans, Pilzenes Kārļa universitātes Medicīnas fakultāte, izstrādāja Tandēma skenēšanas mikroskopu, pirmo komercializēto konfokālo mikroskopiju. Uzņēmums Tracor-Northern (vēlāk NORAN) to pārdeva nelielam uzņēmumam Čehoslovākijā un ASV, un izmantoja rotējošu Nipkovas disku, lai radītu vairākas ierosmes un caurumu emisijas.

Čehoslovākijas patentu 1966. gadā iesniedza Petrans un Čehoslovākijas kolēģis Milans Hadravski. Pirmo zinātnisko publikāciju ar datiem un attēliem, kas iegūti ar šo mikroskopu, žurnālā Science 1967. gadā publicēja M. Deivids Egers no Jēlas universitātes un Petrana. Šī raksta zemsvītras piezīmē minēts, ka Petrans izstrādāja mikroskopu un uzraudzīja tā uzbūvi un ka viņš daļēji bija "līdzstrādnieks" Jēlā. Otrajā 1968. gada izdevumā bija aprakstīta instrumenta teorija un tehniskās detaļas, un kā papildu autori bija Hadravskis un Jēlas komandas vadītājs Roberts Galamboss. 1970. gadā tika izdots ASV patents. Tas tika iesniegts 1967. gadā.

1969: Pirmais konfokālais lāzerskenēšanas mikroskops

1969. un 1971. gadā M. Deivids Egers un Pols Davidovits no Jēlas universitātes publicēja divus rakstus, aprakstot pirmo konfokālo. lāzers skenējošā mikroskopija. Tas bija punktu skeneris, kas nozīmē, ka tika ģenerēts tikai viens apgaismojuma punkts. Tas izmanto epi-apgaismojuma-refleksijas mikroskopiju, lai novērotu nervu audus. 5 mW hēlija-neona lāzers ar viļņa garumu 633 nm atstaroja gaismu no caurspīdīga spoguļa mērķa virzienā. Mērķis bija vienkāršs objektīvs ar fokusa attālumu 8,5 mm. Atšķirībā no visām iepriekšējām un jaunākajām sistēmām, paraugs tika skenēts ar šī objektīva (skenēšanas mērķa) kustību, kas noved pie fokusa punkta kustības. Atstarotā gaisma atgriezās caurspīdīgajā spogulī, pārraidītā daļa punktu noteikšanai tika orientēta uz citu objektīvu, aiz kura tika novietota fotopavairotāja caurule. Signāls tika vizualizēts, izmantojot CRT osciloskopu, katoda stars tika pārsūtīts vienlaikus ar mērķi. Speciāla ierīce ļāva uzņemt Polaroid fotogrāfijas, no kurām trīs tika parādītas 1971. gada publikācijā.

Autori pārdomā fluorescējošās krāsvielas in vivo pētījumiem. Viņi atsaucas uz Minska patentu, pateicoties Stīvam Bēram, kurš toreiz bija doktorants Alberta Einšteina Medicīnas skolā Ņujorkā, kur viņš izstrādāja konfokālās līnijas skenēšanas mikroskopu, ieteica izmantot lāzeru ar "Minska mikroskopu" un pateicas Galambosam Hadravskim. un Petranu par diskusijām, kas noveda pie viņa mikroskopa izstrādes. To izstrādes motivācija bija tāda, ka tandēma skenēšanas mikroskopijā tikai 10–7 daļa no apgaismojošās gaismas ir iesaistīta attēla veidošanā acs daļā. Tādējādi attēla kvalitāte nebija pietiekama lielākajai daļai bioloģisko pētījumu.

1977-1985: Punktu skeneri ar lāzeriem un ainu skenēšanu

1977. gadā Kolins Dž. R. Šepards un Tonijs Vilsons aprakstīja konfokālu ar epilāzera apgaismojumu, skenēšanas stadiju un fotopavairotāja lampām kā detektorus. Skatuves varētu pārvietoties pa optisko asi (Z-ass), pieļaujot optiskās sērijas sekcijas.

1979. gadā Freds Brekenhofs un viņa kolēģi parādīja, ka teorētiskie ieguvumi no optiskās sadalīšanas un izšķirtspējas uzlabošanas patiešām ir sasniedzami praksē. 1985. gadā šī grupa bija pirmā, kas publicēja pārliecinošus konfokālās mikroskopijas attēlus, kas spēja atbildēt uz bioloģiskiem jautājumiem. Drīz pēc tam daudzas citas grupas sāka izmantot konfokālo mikroskopiju, lai atbildētu uz zinātniskiem jautājumiem, kas joprojām bija noslēpums tehnoloģisko ierobežojumu dēļ.

1983. gadā IJ Cox un S. Sheppard no Oksfordas publicēja pirmo darbu, saskaņā ar kuru datorvadāmais konfokālais mikroskops. Pirmo komerciālo lāzera skenēšanas mikroskopu SOM-25 skatuves skeneri piedāvāja Oxford Optoelectronics (pēc vairākiem BioRad iegūtajiem TAKE kadriem), sākot no 1982. gada. Tas tika balstīts uz Oksfordas grupas dizainu.

Kopš 1985. gada: lāzera punktu skeneri ar staru skenēšanu

Astoņdesmito gadu vidū Viljams Bredšovs Amoss un Džons Greiems Vaits un kolēģi, kas strādāja Molekulārās bioloģijas laboratorijā Kembridžā, uzbūvēja pirmo konfokālo staru skenēšanas mikroskopu. Skatuves ar paraugu nekustas, tā vietā ir punktveida apgaismojums, kas ļauj ātrāk iegūt attēlu: četri attēli sekundē ar 512 līnijām katrā. Starpattēli ir stipri pārspīlēti, 1-2 metrus garā stara ceļa dēļ kā "pinhole" ir atļauts izmantot parasto varavīksnenes diafragmu, ar diametru ~ 1 mm. Pirmie mikrogrāfi tika uzņemti ilgstošas ​​filmas ekspozīcijas laikā, pirms tika pievienota digitālā kamera. Turpmākie uzlabojumi ļāva pirmo reizi palielināt mērogošanu treniņos. Zeiss aptuveni tajā pašā laikā noveda pie tā, ka komerciālo CLSM izplatīja Zviedrijas uzņēmums Sarastro. 1990. gadā uzņēmumu iegādājās Molecular Dynamics, taču galu galā CLSM tika pārtraukta. Vācijā 1984. gadā dibinātais Heidelberg Instruments izstrādāja CLSM, kas sākotnēji bija paredzēts rūpnieciskiem lietojumiem, nevis bioloģijai. Šis papīrs tika nodots 1990. gadā Leica Lasertechnik. Zeiss jau ir tirgū pieejams nekonfokāls lidojošs punktveida lāzera skenēšanas mikroskops, kas ir modernizēts uz konfokālu. 1990. gada ziņojums, kurā atzīmēti "daži" konfokālo ierīču sarakstu ražotāji: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-North un Zeiss.

1989. gadā Frics Karls Preikshats kopā ar savu dēlu Ekhardu Preikshatu izgudroja skenējošu diožu lāzermikroskopu daļiņu izmēra analīzei. Viņš un Ekhards Preikshats līdzdibināja Lasentec, lai komercializētu. 2001. gadā Lasentec iegādājās Mettler Toledo (NYSE: MPD). Visā pasaulē, galvenokārt farmācijas rūpniecībā, ir uzstādīti aptuveni desmit tūkstoši sistēmu, lai nodrošinātu kristalizācijas procesa kontroli in situ lielās attīrīšanas sistēmās.

• Divu fotonu ierosmes mikroskopi: lai gan tiek izmantota atbilstoša tehnoloģija (abi ir lāzera skenēšanas mikroskopi), daudzfotonu fluorescences mikroskopi nav stingri konfokāli mikroskopi. Jēdziens konfokāls rodas no klātbūtnes diafragma V konjugētā fokusa plakne(konfokāls). Šīs apertūras parasti nav daudzfotonu mikroskopos.
• Kopējās iekšējās refleksijas fluorescences mikroskops (TIRF) apm
  konfokālā mikroskopija
  • Virtuālā CLSM (uz Java bāzes)
  • animācija un skaidrojumi par dažāda veida mikroskopiem, tostarp fluorescējošiem un konfokālajiem mikroskopiem. (Universite Paris Sud)

  

Konfokālajai mikroskopijai ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar parasto optisko mikroskopiju, tostarp regulējams lauka dziļums, attēlu degradējošas ārpusfokusa informācijas novēršana un iespēja secīgi analizēt biezu paraugu optiskās daļas. Konfokālās metodes būtība ir telpiskās filtrēšanas izmantošana, lai nogrieztu gaismu no nefokusētas parauga daļas (fona apgaismojums), ja parauga biezums ir lielāks par fokusa plakni. Pēdējos gados konfokālās mikroskopijas popularitāte ir strauji pieaugusi, daļēji tāpēc, ka ir viegli iegūt īpaši augstas kvalitātes attēlus no parastajai optiskajai mikroskopijai sagatavotiem paraugiem, un daļēji tāpēc, ka ir daudz pielietojumu daudzās mūsdienās interesējošās pētniecības jomās. .

Pamatjēdzieni

Lai gan mūsdienu instrumenti būtiski atšķiras no senākajām versijām, visos mūsdienu konfokālajos mikroskopos tiek izmantots Marvina Minska aizsācējs un 1957. gadā patentēts konfokālās attēlveidošanas princips. Tradicionālajos plaša lauka mikroskopos viss paraugs tiek apgaismots ar dzīvsudraba vai ksenona gaismas avotu, un attēls tiek novērots vizuāli vai projicēts uz attēla uztveršanas ierīces vai fotofilmas. Attēla veidošanas metode ar konfokālo mikroskopu būtiski atšķiras. Apgaismošana tiek veikta, skenējot visu parauga virsmu ar vienu vai vairākiem fokusētiem gaismas stariem, parasti no lāzera loka avota. Parauga apgaismoto laukumu fokusē objektīvs un pēc tam skenē, izmantojot datora vadītu skeneri. Gaismas staru secība no parauga tiek noteikta caur caurumu (vai dažos gadījumos spraugu) ar fotopavairotāja cauruli (PMT), kuras izvade tiek pārveidota par attēlu, kas tiek parādīts datorā. Lai gan nekrāsotus paraugus var novērot ar no tiem atstaroto gaismu, tie parasti ir marķēti ar vienu vai vairākām fluorescējošām krāsvielām.

Attēlu iegūšanas metodes

Konfokālā mikroskopija izmanto dažādas attēlveidošanas metodes, lai pārbaudītu milzīgu skaitu dažādu veidu paraugu. Visi no tiem ir balstīti uz tehnisko iespēju iegūt augstas izšķirtspējas attēlus, ko sauc par optiskajām sekcijām, samērā biezu sekciju vai visa parauga secībā (kopējā sagatavošana). Optiskā sadaļa ir attēla pamatelements. Paši attēli tiek iegūti, novērojot salīmētos un iekrāsotos paraugus viena, dubultā, trīskāršā un vairāku viļņu garuma apgaismojuma režīmos, savukārt attēli, kas veidoti, izmantojot dažādas apgaismošanas un krāsošanas tehnikas, tiks precīzi korelēti savā starpā. Ir iespējams iegūt dzīvas šūnas attēlus un laikā atlocītu attēlu secību (attēlu reģistrēšana noteiktā laika intervālā), un attēlu secībām pielietotās skaitliskās apstrādes metodes ļauj no attēlu sērijas izveidot integrētu veselu attēlu. pa z asi un paraugu trīsdimensiju attēlus., kā arī trīsdimensiju datu attēlojumu laika secībā, tas ir, četrdimensiju attēlu. Agrīnajos konfokālajos mikroskopos attēli tika iegūti, izmantojot atstarotu gaismu, bet faktiski lāzerskenēšanas konfokālajā mikroskopā var izmantot attēlveidošanas metodi, izmantojot jebkuru mikroskopijā parasti izmantoto pārraidītās gaismas avotu.

Attēlu veidošana

Paraugu sagatavošanas un attēlveidošanas procedūras ar konfokālajiem mikroskopiem pamatā ir tās, kas gadu gaitā ir izstrādātas parastajā plaša lauka mikroskopijā. Biomedicīnā konfokālās mikroskopijas galvenais pielietojums ir saistīts vai dzīvu šūnu un audu attēlojums, kas parasti tiek iekrāsots ar vienu vai vairākām fluorescējošām etiķetēm. Ir liels skaits dažādu fluorescējošu traipu, kurus var ievadīt salīdzinoši vienkāršos protokolos un izmantot, lai iekrāsotu specifiskus šūnu organellus un struktūras. Starp daudzajiem pieejamajiem traipiem ir, piemēram, kodola, Golgi aparāta, endoplazmatiskā tīkla, mitohondriju traipi, kā arī krāsvielas, piemēram, fluorescējošais faloidīns, kas liecina par polimerizētu aktīnu šūnās. Neatkarīgi no izmantotās parauga sagatavošanas metodes galvenā konfokālās mikroskopijas priekšrocība ir attēlu prezentācijas un analīzes elastība, kas izriet no vairāku attēlu vienlaicīgas savākšanas un to digitālās prezentācijas datorā.

Konfokālās mikroskopijas kritiskie aspekti

Kvantitatīvo 3D attēlveidošanu fluorescences mikroskopijā bieži sarežģī paraugu sagatavošanas artefakti kontrolētu un nekontrolētu eksperimentālo vērtību vai mikroskopa pozicionēšanas un izkārtojuma problēmu dēļ. Šajā rakstā, ko rakstījis Dr. James B. Pauly, ir uzskaitīti visizplatītākie vides faktori, kas bieži vien aizēno plaša lauka fluorescences un konfokālās mikroskopijas rezultātus. Pārrunātās tēmas ietver lāzera sistēmu, optisko komponentu izlīdzināšanu, objektīva palielinājumu, balināšanas artefaktus, aberācijas, iegremdēšanas eļļu, pārklājuma biezumu, kvantu iznākumu (kvantu efektivitāti) un parauga vidi.

Aberācijas daudzkrāsu konfokālajā mikroskopijā

Dizaina uzlabojumi ir vienkāršojuši konfokālo mikroskopiju līdz vietai, kur tā ir kļuvusi par kopīgu pētniecības instrumentu šūnu bioloģijā. Bet, tā kā konfokālie mikroskopi ir kļuvuši jaudīgāki, to optikai ir izvirzītas lielākas prasības. Faktiski optiskās aberācijas, kas rada nelielus attēla defektus plaša lauka mikroskopijā, var būt postošas ​​konfokālajā mikroskopijā. Diemžēl stingrās optiskās prasības konfokālajā mikroskopijā bieži vien aizēno optiskās sistēmas, kas garantē skaidru attēlu pat ar vāju mikroskopu. Optikas ražotāji ražo daudz dažādu mikroskopa objektīvu, kas paredzēti īpašiem lietojumiem. Šis raksts parāda, kā objektīva dizaina kompromisi ietekmē konfokālo mikroskopiju.

Trīskrāsu attēlveidošana konfokālajā mikroskopijā

Lāzerskenējošo konfokālo mikroskopu (LSCM) parasti izmanto, lai digitāli attēlotu fluorescējošos paraugus, kas marķēti ar vienu, divām un trim etiķetēm. Sarkanās, zaļās un zilās (RGB) krāsu izmantošana ir visinformatīvākā, lai attēlotu līdz trīs fluorescējošu šūnu zīmju gaismas sadalījumu, ja katrai relatīvajai pozīcijai tiek izmantota papildu krāsa un ja dažādu krāsu attēli veido vienu trīs. - krāsu raksts. Šajā sadaļā mēs apskatīsim nesen publicētas metodes vienkāršotu versiju trīskrāsu konfokālo attēlu iegūšanai, izmantojot populāro attēlu apstrādes programmu Adobe Photoshop. Turklāt tiek apspriestas vairākas lietojumprogrammas trīskrāsu attēlveidošanas protokola izveidei konfokālo attēlu attēlošanai. Ir vērts paturēt prātā, ka šīs skaitliskās metodes neaprobežojas tikai ar LSCM attēliem un tās var izmantot digitālajiem attēliem, kas importēti programmā Photoshop no citiem avotiem.

Konfokālās atstarošanas mikroskopijas pamati

Konfokālās atstarošanas mikroskopiju var izmantot, lai iegūtu papildu informāciju par paraugu ar salīdzinoši nelielu papildu piepūli, jo metodēm ir nepieciešama minimāla parauga sagatavošana un aprīkojuma pārregulēšana. Turklāt konfokālās atstarošanas mikroskopijā informācija par nekrāsotiem audiem ir tikpat viegli pieejama kā dati, kas iegūti no krāsotiem, atstarojošiem paraugiem. Šo metodi var kombinēt arī ar biežāk izmantotajām fluorescences attēlveidošanas metodēm. Jaunāko lietojumu piemēri ir nekrāsotu šūnu reģistrācija fluorescējoši krāsotu šūnu populācijā un mijiedarbības novērošana starp fluorescējoši krāsotām šūnām, kas aug uz necaurspīdīga strukturēta substrāta.

Konfokālo attēlu galerija

Nikon MicroscopyU konfokālo attēlu galerija ir digitālo attēlu sērija, kas uzņemta, izmantojot Nikon PCM-2000 konfokālo mikroskopu kopā ar Eclipse E-600 vertikālo mikroskopu. Optisko sekciju attēlu secība dažādās parauga plaknēs iegūta, skenējot pa mikroskopa optisko asi. Secību attēlo interaktīva Java lietojumprogramma, kas ļauj automātiski "atskaņot" virkni šķēlumu vai ritināt tās uz priekšu un atpakaļ kā slaidus.

Lāzerskenējošā konfokālā mikroskopija

Ir izstrādātas vairākas metodes, lai pārvarētu vāja kontrasta parādību, kas raksturīga biezu paraugu attēlveidošanai, ko parasti ražo ar mikroskopiem. Konfokālās un dekonvolūcijas metodes rada ievērojami labākus vidēja biezuma paraugu attēlus (5 līdz 15 mikroni). Biezākie paraugi (20 mikroni vai vairāk) tiek degradēti, pakļaujot tiem stipru apkārtējo gaismu no ārpusfokusa apgabaliem, un, iespējams, tos vislabāk iegūt, izmantojot konfokālās mikroskopijas metodes. Izmantojot šo apmācību, paraugi tiek parādīti kā virkne optisko sekciju gar z asi, izmantojot virtuālo konfokālo mikroskopu.

Atstarojošā konfokālā mikroskopija

Izmantojot šo pamācību, varat pārbaudīt atsevišķus integrālo shēmu virsmas slāņus. Digitālie attēli norādījumiem tika iegūti, izmantojot Nikon Optiphot C200 atstarojošo konfokālo mikroskopu. Katrai sērijai tika reģistrēta optisko sekciju secība gar z asi, kad mikroskops iekļuva un fokusējās dziļi (ar 1 mikrometra soli) ķēžu mozaīkā uz silīcija kristāla virsmas.

Galvenie punkti

Salīdzinot ar tradicionālo mikroskopiju, konfokālajai mikroskopijai ir vairākas priekšrocības, tostarp neliels iespiešanās dziļums pētāmajā paraugā, fona apgaismojuma trūkums un iespēja iegūt biezu paraugu optisko sekciju sēriju. Biomedicīnā konfokālās mikroskopijas galvenais pielietojums ir saistīts vai dzīvu šūnu un audu attēlojums, kas parasti ir marķēti ar vienu vai vairākām fluorescējošām etiķetēm.

Rīsi. 1. Staru ceļa shēma konfokālajā mikroskopijā

Attēlojot fluorescējošus paraugus ar parasto plata lauka mikroskopu, sekundārā gaisma, ko izstaro no parauga ārpus darbības jomas zonām, bieži traucē fokusēto detaļu asumu. Tas ir īpaši problemātiski paraugiem, kas biezāki par 2 mikrometriem. Konfokālā mikroskopija sniedz nelielu izšķirtspējas uzlabojumu gan gar asi, gan plaknē; bet tieši spēja izslēgt fona gaismu, kas rodas biezi fluorescējoši iekrāsotos paraugos, ir izraisījusi šīs pētniecības metodes neseno popularitātes pieaugumu. Tā kā lielākā daļa mūsdienu konfokālo mikroskopu ir salīdzinoši viegli lietojami, tie ir kļuvuši par daļu no pamataprīkojuma daudzās daudzlietotāju attēlveidošanas sistēmās. Tā kā lāzerskenējošā konfokālā mikroskopa (LSCM) izšķirtspēja ir nedaudz labāka nekā tradicionālajam platlauka optiskajam mikroskopam, taču joprojām ir ievērojami zemāka par pārraides (transmisijas) elektronu mikroskopa izšķirtspēju, tas zināmā mērā bija tilts starp divām visizplatītākajām pētniecības metodēm. 1. attēlā parādīta shematiska diagramma par gaismas caurlaidību pamata konfokālajā mikroskopā.

Tradicionālajos plaša lauka mikroskopos viss paraugs tiek apgaismots ar dzīvsudraba vai ksenona gaismas avotu, un attēls tiek novērots vizuāli vai projicēts uz attēlveidošanas ierīci vai fotofilmu. Attēla iegūšanas metode ar konfokālo mikroskopu būtiski atšķiras. Paraugu apgaismo, skenējot to ar vienu vai vairākiem fokusētiem stariem, parasti ar lāzeru (2. attēls). Attēlus, kas iegūti, skenējot paraugu, tādējādi sauc par optiskām sekcijām. Šī terminoloģija attiecas uz neinvazīvu izpētes metodi, kad attēli tiek iegūti, izmantojot fokusētu gaismu, nevis fiziski sadalot paraugu.

Rīsi. 2. Paraugu skenēšana platā laukā un punktos

Konfokālā mikroskopija ir ievērojami vienkāršojusi dzīvo paraugu izmeklēšanu, ļāvusi iegūt datus trīs dimensijās (z-sērijā) un uzlabojusi daudzkrāsotu paraugu attēlu iegūšanas procesu. 3. attēlā ir salīdzināta parastā fluorescences attēlveidošana ar episkopisku konfokālo attēlveidošanas apgaismotāju, kas aptver tos pašus apgabalus tauriņu krizāles ar propīdija jodīdu krāsotu epitēliju. Acīmredzot iespaidīgs izšķirtspējas pieaugums un līdz ar to arī kodolu attēla asums LSCM attēlā, izslēdzot nefokusētu fluorescējošu mirdzumu.

Lāzerskenējošs konfokālais mikroskops (LSCM)

LSCM tagad ir visizplatītākā biomedicīnā izmantoto konfokālo mikroskopu versija. Ievadā īpaša uzmanība pievērsta LSCM, jo šo mikroskopu konstrukcija un uzbūve ļauj ar tiem strādāt pat iesācējiem. Citi konstruktīvie risinājumi ir ieņēmuši savas īpašās nišas bioloģijā. Jebkuram konfokālā mikroskopa modelim vai modifikācijai piemēro lielāko daļu paraugu sagatavošanas noteikumu ar nelielām modifikācijām, kā arī citas optiskās šķēlēšanas metodes, piemēram, dekonvolūcijas un daudzfotonu metodes.

Konfokālās mikroskopijas attīstība

Tiek uzskatīts, ka konfokālā mikroskopa izgudrojums pieder Mārvinam Minskim, kurš 1955. gadā izveidoja darba mikroskopu. Konfokālās mikroskopijas attīstību lielā mērā noteica vēlme novērot bioloģiskos procesus dzīvos audos (in vivo) (ķermenī), un Minskis izvirzīja sev mērķi iegūt neironu tīkla attēlu dzīvu smadzeņu neaptraipītā preparātā. . Minska izvirzītie un 1957. gadā patentētie konfokālās mikroskopijas principi tiek izmantoti visos mūsdienu konfokālajos mikroskopos. 1. attēlā ir izskaidrots konfokālais princips, ko piemēro epifluorescences mikroskopijai, kas ir visu mūsdienu konfokālo sistēmu pamatā, ko izmanto fluorescences attēlveidošanā. Sākotnējā konfigurācijā Minskis izmantoja caurumu (diafragmu), kas novietots cirkonija loka gaismas avota priekšā, ko izmantoja kā punktveida gaismas avotu.

Rīsi. 3. Tauriņa spārnu epitēlijs

Gaisma no punktveida avota tika fokusēta punkta veidā ar objektīvu uz noteiktu fokusa plakni paraugā un, ejot cauri tai, tika fokusēta ar otru objektīvu uz otru cauruma diafragmu (pinhole), kas bija fokusā ar pirmais (tie bija konfokāli, t.i., konfokāli). Stari, kas iet caur otro caurumu, skāra zema trokšņa fotopavairotāja cauruli, kas ģenerēja signālu atkarībā no gaismas spilgtuma, kas nāk no parauga. Otrais caurums nogrieza gaismu no fotopavairotāja, kas nāk no reģioniem virs vai zem parauga fokusa plaknes. Konfokālās mikroskopijas galvenais princips ir telpiskās filtrēšanas izmantošana, lai novērstu nefokusētu gaismu un uzplaiksnījumus, strādājot ar paraugiem, kas ir biezāki par fokusa plakni. Savos rakstos Minskis aprakstīja arī atstarojošo mikroskopu ar vienu objektīvu un dihromatisku spoguli, kura dizains kļuva par mūsdienās izmantoto sistēmu pamatu.

Lai iegūtu attēlu ar konfokālo metodi, ir nepieciešams skenēt paraugu ar gaismu, kas fokusēta uz punktu. Sākotnējā Minska samontētajā aparātā gaismas stars bija nekustīgs, un pats paraugs pārvietojās uz vibrācijas skatuves. Skenēšanas stara nekustīgums attiecībā pret mikroskopa optisko asi bija šī iestatījuma priekšrocība, jo tas ļāva novērst lielāko daļu optisko defektu, kas varētu izkropļot attēlu. Tomēr, pārbaudot bioloģiskos paraugus, tas var izraisīt vibrācijas un kropļojumus, kas galu galā noved pie attēla izšķirtspējas un skaidrības zuduma. Turklāt, pārvietojot skatuvi un paraugu, nav iespējams veikt nekādas manipulācijas, piemēram, fluorescējoši krāsotu šūnu mikroinjekcijas.

Bet neatkarīgi no tā, kā paraugs tiek skenēts, ir nepieciešams iegūt tā attēlu. Un Minska oriģinālā shēma neradīja īstu attēlu, jo fotopavairotāja izejas signāls tika ievadīts armijā izmantotā ilgstošas ​​pēcspīdēšanas osciloskopā, kuram nebija ierakstītāja. Minskis vēlāk rakstīja, ka viņa attēla neizteiksmīgā kvalitāte nav saistīta ar paša mikroskopa zemo izšķirtspēju, bet gan ar osciloskopa displeju. Tagad ir skaidrs, ka tehnoloģiju trūkuma dēļ Minskis nevarēja pilnībā demonstrēt visu konfokālās metodes potenciālu, it īpaši, attēlveidojot bioloģiskās struktūras. Viņš norādīja, ka, iespējams, tas ir iemesls, kāpēc konfokālo mikroskopiju uzreiz nepieņēma ļoti prasīga biologu kopiena, kurai iegūto attēlu kvalitāte vienmēr bijusi prioritāte. Tolaik viņu rīcībā bija gaismas mikroskopi ar izcilu optiku, kas ļāva novērot un fotografēt spilgtas krāsas histoloģiskos griezumus uz īpaši jutīgas krāsu filmas. Mūsdienu konfokālajos mikroskopos attēlus veido no signāliem no fotopavairotāja lampas vai tver ar digitālo kameru ar iebūvētu CCD, tiešā veidā apstrādā datora attēlveidošanas sistēma, parāda augstas izšķirtspējas ekrānā un izcilā attēlu dokumentācijas ierīcē. . Mūsdienu lāzerskenējošā konfokālā mikroskopa diagramma ir parādīta 4. attēlā.

Rīsi. 4. Mūsdienu lāzerskenējošā konfokālā mikroskopa shēma

Optiskā mikroskopa pamatoptika nav būtiski mainījusies gadu desmitiem, jo ​​instrumenta galīgo izšķirtspēju nosaka viļņa garums, objektīvs un paša parauga īpašības. Krāsas, ko izmanto, lai uzlabotu paraugu kontrastu un citas optiskās mikroskopijas metodes, pēdējo 20 gadu laikā ir ievērojami uzlabojušās. Konfokālās metodes pieaugums un uzlabošana bija optiskās mikroskopijas atdzimšanas sekas, ko daudzos aspektos izraisīja mūsdienu tehnoloģiju panākumi. Daudzi tehnoloģiskie sasniegumi, kas varētu būt noderīgi Minska dizainā, pakāpeniski kļūst pieejami (tostarp par cenu) biologiem un citiem mikroskopiem. Tostarp stabili daudzfrekvenču lāzeri, ko izmanto kā progresīvus punktveida gaismas avotus, uzlaboti dihromatiskie spoguļi, jutīgi zema trokšņa līmeņa fotodetektori, ātrdarbīgi mikrodatori ar uzlabotām iespējām (lielas ietilpības atmiņas pieejamības dēļ), sarežģīta attēlveidošanas programmatūra, augstas kvalitātes izšķirtspējas monitori un digitālie printeri.

Šīs tehnoloģijas ir attīstījušās neatkarīgi un kopš 1955. gada pakāpeniski integrētas konfokālās attēlveidošanas sistēmās. Piemēram, digitālās attēlu apstrādes metodes pirmo reizi veiksmīgi pielietoja 80. gadu sākumā Vudsholas okeanogrāfijas institūta pētnieki. Izmantojot savā terminoloģijā "video mikroskopus", viņi varēja attēlot mikrotubulu šūnu struktūru zem optiskā mikroskopa teorētiskās izšķirtspējas robežas. Šķietamais izšķirtspējas pieaugums ir iespējams, digitāli optimizējot attēlus, kas uzņemti ar augstas jutības supersilīcija (SIT) videokameru, kas savienota ar digitālo attēlu procesoru. Šūnu struktūras tika vizualizētas, izmantojot diferenciālo traucējumu kontrasta (DIC) optiku un turpmāku digitālo attēlu apstrādi.

Konfokālo mikroskopu dizainu klasifikācija parasti balstās uz parauga skenēšanas metodi. Ir divas galvenās skenēšanas metodes: Stage Scan un Illumination Beam Scan; un vismaz divi veidi, kā skenēt staru. Minska oriģinālā instrumenta pamatā bija skatuves skenēšanas sistēma, ko darbina primitīvs kamertonis ģenerators, kas attēlu radīja diezgan lēni. Mūsdienu skatuves skenēšanas konfokālie iestatījumi, kas ir tālu priekšā to prototipiem, galvenokārt tiek izmantoti materiālu zinātnē, piemēram, mikrokristālu ražošanā. Sistēmas, kas balstītas uz šo principu, pēdējā laikā ir kļuvušas populāras biomedicīnas jomās, kur tiek veikta DNS analīze uz mikrokristāliem.

Praktiskāka alternatīva bioloģisko sistēmu attēlveidošanai ir stacionāra parauga staru skenēšana. Šis princips ir daudzu mērīšanas sistēmu pamatā, kuru pilnveidošanas rezultātā radās mūsdienās populāri pētnieciskie mikroskopi. Šajā ievadā mēs nepieskaramies konfokālās mikroskopijas tehniskajām detaļām, bet būtībā tajā tiek izmantotas divas principiāli atšķirīgas staru skenēšanas metodes: vairākstaru skenēšana un viena stara skenēšana. Viena stara skenēšana ir visizplatītākā, un tieši šī metode tiek izmantota LSCM. Šeit staru skenē ar datora vadītiem spoguļiem, ko darbina galvanometri ar ātrumu viens kadrs sekundē. Lai panāktu ātrāku skenēšanu, aptuveni ar video kadru ātrumu, dažās sistēmās tiek izmantota akustiski-optiska ierīce vai oscilējoši spoguļi. Alternatīva metode gandrīz reāllaika skenēšanai izmanto divus starus, parasti izmantojot rotējoša Nipkova diska formu. Šīs sistēmas ir pāru (tandēma) skenēšanas mikroskopu (TSM) modifikācijas un pilnveidošanas rezultāts, lai izveidotu efektīvākus modeļus fluorescējošu krāsotu paraugu attēlveidošanai. 5. attēlā parādīta šāda uzlabota sistēma ar diviem Nipkow diskiem un mikroobjektīviem, lai uzlabotu jutību pret zemu fluorescējošu gaismu reāllaika attēlveidošanā.

Rīsi. 5. Optiskais dizains, kas balstīts uz Nipkow diskiem

Līdz šim ir divas alternatīvas metodes optisko sekciju iegūšanai konfokālajā mikroskopijā: dekonvolūcijas metode un daudzfotonu. Tās atšķiras tehniski, bet, tāpat kā konfokālās metodes, ir balstītas uz tradicionālo optisko mikroskopiju. Dekonvolūcijas pamatā ir skaitļošanas algoritmi, lai aprēķinātu un noņemtu informāciju, kas tiek iegūta, veidojot attēlu no nefokusa apgabaliem. Šis paņēmiens ir kļuvis ļoti ērts, pateicoties efektīviem algoritmiem un augstas veiktspējas minidatoriem. Daudzfotonu mikroskopijā tiek izmantota tāda pati skenēšanas sistēma kā LSCM, taču uztvērējā nav nepieciešams caurums. Tas nav nepieciešams, jo lāzers ierosina fluorohroma etiķeti tikai fokusa punktā, tādējādi izslēdzot ārpusfokusa starojumu. Novērojot dzīvos audus, šīs metodes papildu priekšrocība ir fotobalināšanas samazināšana, jo tiek samazināts lāzera stara pārraidītās un parauga audu absorbētās enerģijas daudzums.

Tradicionālais optiskais mikroskops ir LSCM pamats. Volframa vai dzīvsudraba lampas vietā tiek izmantots lāzers, kas savienots ar jutīgu fotopavairotāja cauruli (PMT) un datoru, kas kontrolē skenēšanas spoguļus un citas skenēšanas ierīces, kā arī atvieglo attēlu savākšanu un prezentāciju. Saņemtie dati tiek glabāti digitālajos datu nesējos un tos var apstrādāt, izmantojot daudzas programmatūras pakotnes vai nu pašā sistēmas datorā, vai kādā citā.

Saskaņā ar LSCM konstrukciju signāla apgaismojums un uztveršana (reģistrācija) ir ierobežota līdz parauga punktam ar difrakcijas robežu. Mikroskopa mērķi fokusē apgaismojuma punktu, un skenēšanas ierīce datora kontrolē skenē paraugu ar šo punktu. Signāli no parauga kvēlojošajiem punktiem caur cauruma (vai dažos gadījumos caur spraugu) diafragmu nonāk fotopavairotājā, un PMT izejas signāli tiek veidoti attēlā un vizuāli atveidoti ar datoru. Lai gan nekrāsotus paraugus var novērot atstarotā gaismā no parauga, tie parasti tiek iekrāsoti ar vienu vai vairākām fluorescējošām krāsvielām. Viens no biežāk sastopamajiem LSCM, kas literatūrā aprakstīts ap 1990. gadu, tika izstrādāts, reaģējot uz fundamentālu problēmu, ar kuru saskaras pētniecības bioloģija. Daudzas struktūras un atsevišķas makromolekulas imunofluorescējoši krāsotos embrijos pēc divu šūnu stadijas nevar vizualizēt ar tradicionālo epifluorescences mikroskopu, jo embrija tilpums paliek aptuveni tāds pats, palielinoties šūnu skaitam. Tas nozīmē, ka ar blīvāku šūnu izvietojumu tiek pastiprināta luminiscence no šūnām ārpus fokusa plaknes, kas noved pie attēla izšķirtspējas pasliktināšanās.

Rīsi. 6. Nikon lāzerskenējošā konfokālā mikroskopa konfigurācija

Pētnieku grupa, kas strādāja pie šīs problēmas, atklāja, ka neviena no tajā laikā pieejamajām konfokālajām sistēmām neatbilst viņu prasībām. Tolaik mikroskopi ar skatuves skenēšanu bija pārāk lēni. Viena attēla izveide prasīja aptuveni 10 sekundes, un daudzstaru instrumenti vēl nebija praktiski fluorescences attēlveidošanai. LSCM tika izstrādāts, lai atbilstu tradicionālās epifluorescences mikroskopijas prasībām, un kopā ar citiem, kas tika izstrādāti tajā pašā laikā, kļuva par sarežģītu sistēmu prototipu, ko biomedicīnas kopienai tagad piedāvā dažādi uzņēmumi. Mūsdienās lietotas sistēmas (Nikon E1000) piemērs ir parādīts 6. attēlā.

Speciāli izstrādātās ierīcēs optisko sekciju biezums var mainīties, mainoties cauruma diametram fotodetektora priekšā. Salīdzinot ar citiem fiksētu caurumu dizainiem, šī papildu funkcija ir ārkārtīgi elastīga bioloģisko struktūru attēlveidošanā. Attēlu var palielināt, nezaudējot izšķirtspēju, samazinot parauga skenēto laukumu un ievietojot skenēto informāciju tāda paša izmēra datu masīvā uzglabāšanai un vizualizācijai (līdzīgi mainās palielinājums skenējošā elektronu mikroskopā). Tādējādi vienam objektīvam tiek piešķirts tālummaiņas intervāls, kas var būt ļoti noderīgs, renderējot retus vai īslaicīgus notikumus, kurus var palaist garām vai pazaudēt, mainot objektīvus.

Pateicoties sarežģītajām un elastīgajām LSCM iespējām, kas tagad ir pieejamas tirdzniecībā par pieņemamām cenām, konfokālā mikroskopija pēdējos gados ir strauji pieaugusi, un daudzas daudzlietotāju laboratorijas dod priekšroku šim aprīkojumam, nevis elektronu mikroskopiem. Konfokālās mikroskopijas priekšrocība ir relatīvā vieglums, ar kādu var iegūt augstas kvalitātes attēlus no paraugiem, kas sagatavoti tradicionālajai optiskajai mikroskopijai, un liels pielietojumu skaits dažādās pētniecības jomās.

Pirmās paaudzes LSCM labi strādāja ar fiksētiem paraugiem, taču tie nespēja kontrolēt lāzeru gaismas enerģiju, kas pārāk bieži noveda pie dzīva parauga nāvējoša iznīcināšanas, ja netika veikti nopietni piesardzības pasākumi. Neskatoties uz šiem ierobežojumiem, fiksēto paraugu attēli bija tik augstas kvalitātes, ka speciālisti bez nosacījumiem pieņēma konfokālo pieeju. Nākamās instrumentu paaudzes ir uzlabojušas visus attēlveidošanas procesa aspektus. Turklāt jaunās ierīces ir kļuvušas daudz ergonomiskākas un ērtāk lietojamas, līdz ar to centrēšana, filtru kombinācijas maiņa, lāzera jaudas regulēšana, kas veikta, izmantojot datoru, ir kļuvusi daudz vienkāršāka un ātrāka. Tagad ir iespējams uzņemt attēlus ar trim fluorohromiem vienlaikus un secīgi ar vēl vairāk. Pateicoties uzlabotai un uzticamākai programmatūrai, ātrākiem datoriem, lielākai diska ietilpībai un RAM cenu kritumam, arī attēlu apstrāde ir ievērojami attīstījusies.

Attēlveidošanas režīmi

Konfokālā mikroskopa galvenais pielietojums ir dažāda veida biezu paraugu attēlošana. Konfokālās metodes priekšrocības izriet no spējas izveidot parauga attēlus kā atsevišķu augstas izšķirtspējas un izšķirtspējas optisko sekciju secību. Tas izmanto vairākus attēlveidošanas režīmus; katra no tām ir balstīta uz optisko sekciju kā attēla pamatvienību.

Rīsi. 1. Optiskās sekcijas, kas marķētas ar trim atzīmēm

Atsevišķas optiskās sekcijas

Optiskā sekcija ir attēla pamatvienība konfokālās mikroskopijas tehnikā. Salīmētus un iekrāsotus paraugus var attēlot viena, divu, trīskāršu un vairāku viļņu garumu apgaismojumā, daudzkrāsainus paraugus attēlojot vienu uz otra (ja tiek izmantoti objektīvi ar atbilstošu hromatiskās aberācijas korekciju). Papildu izlīdzināšanu parasti veic, izmantojot digitālās attēlu apstrādes metodes. Lielākajai daļai lāzera skenēšanas konfokālo mikroskopu (LSCM) ir nepieciešama aptuveni 1 sekunde, lai iegūtu optisko šķēli, lai gan parasti vairākām optiskajām šķēlītēm tiek aprēķināts vidējais signāls, lai uzlabotu signāla un trokšņa attiecību. Attēla iegūšanas laiks, protams, ir atkarīgs no attēla pikseļu izmēriem un sistēmas datora ātruma. Lai saglabātu tipisku 8 bitu attēlu ar 768 × 512 pikseļiem, ir nepieciešams aptuveni 0,3 Mb atmiņas.

1. attēlā redzamās optiskās sekcijas tika iegūtas vienlaikus ar trīs dažādu viļņu garumu (488, 568 un 647 nanometri) ierosmes gaismu, kā starojuma avotu izmantojot vienu kriptona/argona lāzeru. Kā paraugs parādīts Drosophila spārna imaginālais disks trešajā vecuma posmā, kurā iezīmēti trīs spārna veidošanā iesaistītie gēni. Trīs parādītie gēni un atbilstošās fluorohroma etiķetes ir: a) vestigiāls (fluoresceīns – 496 nanometri); b) bez spārniem (lizamīna rodamīns – 572 nanometri); un © CiD (cianīns 5 - 649 nanometri). Spārnu veidojošo gēnu trīs telpiski attēloto domēnu apvienotais attēls atrodas apakšējā labajā stūrī (attēls (d)).

Fotografēšana noteiktā laika intervālā un dzīvas šūnas vizualizācija

Dzīvu šūnu izpēte noteiktā laika intervālā ir ieguvusi jaunu impulsu, palielinoties LSCM izšķirtspējai. Iepriekš šūnu struktūru kustību pētījumi tika veikti, izmantojot 16 mm fotofilmu un pulksteņa intervāla mērītāju, kas savienots ar kameru, vēlāk izmantojot time-lapse videomagnetofonu, optisko disku ierakstītāju vai video attēla digitalizācijas plati. Tagad ar LSCM palīdzību ir iespējams iegūt optiskās sekcijas noteiktos, iepriekš iestatītos intervālos reāllaikā.

Dzīvo audu vizualizācija ar LSCM ir daudz grūtāka nekā saistīto paraugu attēlveidošana, un tā ne vienmēr ir praktiska, jo paraugs var neizturēt novērošanas apstākļus. 1. tabulā ir uzskaitīti daži faktori, kas jāņem vērā, novērojot dzīvās un saistītās šūnas ar LSCM. Dažus paraugus vienkārši fiziski nav iespējams novietot uz mikroskopa skatuves, vai arī tie nespēs palikt dzīvi uz tā visa novērošanas perioda laikā. Pētāmā parādība vai struktūra var neietilpst objektīva redzamības laukā. Piemēram, Drosophila iztēles spārnu diski attīstās pārāk dziļi kāpurā, lai tos varētu novērot; un pēc tam, kad tie ir sadalīti, tie nevar attīstīties kultūrā. Tāpēc šodien vienīgā pieejamā metode gēnu ekspresijas novērošanai šāda veida audos ir kāpuru preparēšana, sasiešana un iekrāsošana no paraugiem dažādās attīstības stadijās.

Tab. 1. Saistīto un dzīvo šūnu novērošana, izmantojot LSCM

Veiksmīgai dzīvu šūnu novērošanai un attēlveidošanai nepieciešama īpaša piesardzība visa procesa laikā. Obligāti jāuztur pieņemami apstākļi uz mikroskopa skatuves. Bojājumi, kas šūnai nodarīti, apstarojot ar lāzera staru, var uzkrāties, veicot atkārtotu skenēšanu, tāpēc šī ekspozīcija ir jāsamazina līdz minimumam, nepieciešama un pietiekama, lai iegūtu attēlu. Antioksidantus, piemēram, askorbīnskābi, parasti pievieno barotnei, lai samazinātu skābekļa daudzumu, kas izdalās, kad fluorescējošās molekulas tiek pakļautas ierosmes gaismai, un veicina šūnu iznīcinošo brīvo radikāļu veidošanos. Parasti ir jāveic plaši provizoriskie kontroles eksperimenti, lai novērtētu apstarošanas ietekmi uz fluorescējoši krāsotām šūnām, rūpīgi uzraugot visu attēla parametru atbilstību veicamajam novērojumam. Pēc izmēģinājuma attēliem ir jānovērtē dzīvo īpatņu dzīvotspēja. Piemēram, embrijiem ir jāturpina normāla attīstība visā novērošanas procesā, tāpēc ir jāatklāj visas anomālijas, ko izraisa starojuma vai fluorohromu iedarbība. 2. attēlā parādīts Drosophila embrija kadrs, kas fluorescējoši iekrāsots ar zaļu kalciju, noteiktā laika intervālā. Attēlu sērija parāda dienasgaismas gaismas sadalījuma izmaiņas laika gaitā.

Katram šūnu tipam ir nepieciešami savi pasākumi, lai saglabātu to dzīvotspēju novērošanas procesa laikā. Dažām kukaiņu šūnām pietiek ar istabas temperatūras uzturēšanu un pietiekami lielu piemērotas barotnes daudzumu. Tomēr lielākajai daļai šūnu tipu ir nepieciešama skatuves un dažreiz arī perfūzijas kameras uzsildīšana, lai uzturētu pareizu oglekļa dioksīda līdzsvaru, kamēr tie atrodas uz skatuves. Šūnu tipa izvēle, kurai novērošanas apstākļi, izmantojot LSCM, ir vismazāk "naidīgi", palīdzēs izvairīties no daudzām eksperimentālām problēmām. Mūsdienu konfokālo instrumentu uzlabojumi ir ievērojami samazinājuši iespējamās problēmas. Paaugstināta kvantu efektivitāte, liela objektīvu skaitliskā apertūra (spilgtums) un mazāk toksisku šūnu traipu izmantošana ir padarījusi konfokālo mikroskopiju par praktisku metodi dzīvo šūnu analīzei. Ir jācenšas izmantot mazākas jaudas lāzerus, kas vienlaikus ļauj pēc iespējas ātrāk veikt reģistrāciju un attēlu apstrādi. Ja cauruma diafragma tiek palielināta, lai paātrinātu attēlu iegūšanu un reģistrāciju (salīdzinājumā ar nedzīvu paraugu novērošanu), tad sekojošā dekonvolūcija dažkārt var atjaunot zaudēto attēla kvalitāti.

Rīsi. 2. Šaušana noteiktā laika intervālā

Daudzi fizioloģiskie procesi un notikumi notiek pārāk ātri, un tāpēc tos nevar uztvert lielākā daļa LSCM, kuru attēlveidošanas ātrums ir vidēji viens attēls sekundē. LSCM, izmantojot akustiskās-optiskās ierīces un spraugas diafragmas, ir ātrākas nekā punktu skenēšanas sistēmas, ko ierosina galvanometrs, un ir praktiskākas fizioloģiskiem pētījumiem. Šie ātrākie iestatījumi apvieno labu telpisko un laika izšķirtspēju, kas var būt līdz 30 kadriem sekundē pilnekrāna izšķirtspējā vai tuvu video attēla ātrumam. Lēnākos, caurumu skenēšanas mikroskopos laika izšķirtspēju var palielināt, tikai samazinot parauga skenēšanas laukumu. Ja ir nepieciešama pilna telpiskā izšķirtspēja, ir jāsamazina kadru ātrums, kā rezultātā tiek zaudēta laika izšķirtspēja. Konfokālās sistēmas, kas izmanto diska vai svārstīgo spoguļa skenēšanu, spēj arī attēlot ātrus fizioloģiskos procesus vai citus pārejošus notikumus.

Z sērija un 3D skati

Z sērija ir parauga optisko sekciju secība, kas izgatavota dažādos līmeņos plaknē, kas ir perpendikulāra optiskajai asij (z ass). Z sērijas attēli tiek iegūti, saskaņojot pakāpeniskas izmaiņas mikroskopa smalkajā fokusā, kam seko attēlveidošana katrā solī. Fokusēšanu parasti veic ar datora vadītu soļu motoru, kas maina fokusu par noteiktu daudzumu. Izmantojot datora makroprogrammu, var iegūt un saglabāt attēlu, pārfokusēt mikroskopu noteiktā parauga dziļumā, iegūt un saglabāt otru attēlu, atkārtoti fokusēt jaunā plaknē un tā tālāk, līdz tiek sasniegts ieprogrammētais attēlu skaits. ir iegūti.

Vēlamos attēlus var ņemt no z sērijas, kas iegūti no atlasītā parauga apgabala, un apstrādāt ar īpašu programmu, lai vēlāk detalizēti pārbaudītu konkrētas interesējošās šūnas. Z sēriju var attēlot kā attēlu fotomontāžu, kā parādīts 3. attēlā. Šāda veida attēlu kombinācija un attēlošana, kā arī daudzas citas attēlu manipulācijas ir mūsdienu attēlveidošanas programmatūras pakotņu standarta funkciju komplekts. Attēli 3. attēlā ir atlasīti no lielākas sērijas ar vēl biežāku z-soli. Zaļais mirdzums identificē ar 22C10 antivielu iekrāsota Drosophila embrija perifēro nervu sistēmu.

Rīsi. 3. Optisko sekciju Z-sērija

Pamatojoties uz vairākiem simtiem LSCM ražotā parauga optisko sekciju sēriju, var būt grūti iegūt priekšstatu par visu savstarpēji savienoto struktūru kompleksu. Tomēr z sērija pēc reģistrācijas ir ideāls materiāls turpmākai parauga 3D attēlošanai, izmantojot tilpuma attēlveidošanas metodes. Šo pieeju tagad plaši izmanto, lai noskaidrotu saistību starp audu struktūru un funkcijām medicīnā un bioloģijā. Paraugam ir svarīgi iestatīt pareizo z-scan soli, ko nosaka fokusa maiņas motora solis; šajā gadījumā attēls atspoguļos faktisko parauga dziļumu.

Kamēr paraugs, skatoties, paliek nekustīgs, LSCM z sērijas attēli tiks lieliski ierakstīti un saglabāti digitāli, tos būs salīdzinoši viegli pārveidot parauga 3D attēlojumā. 4. attēlā ir salīdzināta viena optiskā sadaļa (a) ar z-sērijas projekciju (b) un parādīta šīs metodes vērtība Drosophila embrija perifērās nervu sistēmas vizualizācijā, kas marķēta ar 22C10 antivielu.

Mikroskopa operatora iestatītais pakāpju motora solis ir saistīts ar optiskās sekcijas biezumu, taču tam var būt cita vērtība. Optiskās sekcijas biezums ir saistīts ar mikroskopā novērotā parauga sekcijas biezumu un ir atkarīgs no objektīva un cauruma diametra. Tomēr dažos gadījumos fokusa solis var atbilst optiskās sekcijas biezumam, un tas var radīt neskaidrības.

Kad z sērijas fails ir saņemts, tas tiek nosūtīts uz 3D rekonstrukcijas programmu, kas īpaši izstrādāta konfokālai attēlu apstrādei. Šādas programmas ir ārkārtīgi ātras, ja tās tiek izmantotas grafiskajās stacijās, taču tās var veiksmīgi izmantot arī personālajā datorā vai paša konfokālā mikroskopa grafiskajā stacijā ar pietiekami ātru procesoru un lielu operatīvo atmiņu. Ar šo programmu palīdzību ir iespējams izveidot gan atsevišķus parauga 3D attēlojumus, gan viens otru aizstājošu attēlojumu secību, kas sastāv no dažāda veida paraugiem, kas rada rotācijas vai citu telpisku transformāciju efektu un dod labāk uztvert parauga trīsdimensiju īpašības. Programma ļauj variēt ar garumu, dziļumu, veikt tilpuma mērījumus, kā arī interaktīvi mainīt īpašus attēla parametrus, piemēram, parauga caurspīdīgumu, lai izceltu dažādas struktūras dažādos parauga līmeņos.

Rīsi. 4. Optiskā šķēle un z-sērijas projekcija

Vēl viens veids, kā attēlot optisko slāņu sēriju, kas uzņemta no attēlu secības, kas uzņemtas noteiktā laika intervālā, ir trīsdimensiju attēlojums, kurā z-ass darbojas kā laika ass. Šī pieeja ir noderīga, lai vizualizētu fizioloģiskās izmaiņas, organismam attīstoties. Šīs metodes pielietojuma piemērs bija kalcija koncentrācijas izmaiņu dinamikas noskaidrošana jūras ežu embriju attīstības laikā. Dažādos dziļumos uzņemto optisko sekciju krāsu kodēšana ir vienkāršs veids, kā attēlot 3D datus. Praksē katrai optiskajai sekcijai, kas uzņemta dažādos parauga dziļumos, tiek piešķirta krāsa (parasti sarkana, zaļa vai zila), un pēc tam krāsu attēli tiek apvienoti, un vēlamais efekts tiek panākts, mainot krāsas ar attēlu apstrādes programmu.

4D attēlveidošana

Ar LKSM palīdzību dinamiskas parādības, kas izpaužas dzīvos audos vai dzīvo audu kultūru sagatavošanas laikā un atspoguļojas noteiktā laika intervālā uzņemto attēlu secībā, var tikt attēlotas četrdimensionālā formā, ar laiku kā ceturto. dimensiju. Regulāros intervālos iegūtās Z sērijas ir četrdimensiju datu kopas: trīs telpiskās dimensijas (x, y un z) un laiks kā ceturtais, ko var novērot, izmantojot 4D skatītāju. Šādas programmas ļauj, piemēram, filmu, sacerēt un atskaņot stereo pārus, kas uzņemti dažādos laika momentos, vai, alternatīvi, apstrādāt un prezentēt atjaunotus trīsdimensiju attēlus, kas uzņemti dažādos laika momentos, piemēram, izgrieztu filmu.

X-Z attēli

Ja nepieciešams iegūt parauga sānskatu, piemēram, epitēlija slāņa vertikālo griezumu, x-z griezumu var izveidot vienā no diviem veidiem. Sānu skatu var iegūt, skenējot vienu parauga līniju (x ass) dažādos dziļumos (z ass), kontrolējot fokusu ar pakāpju motoru un pēc tam apvienojot visu slāņu sēriju vienā attēlā. Vēl viena metode ir izmantot griešanas plaknes opciju 3D renderēšanas programmā, kad sānskats tiek iegūts no esošas optisko sekciju z sērijas. Attēlojot tauriņa spārna epitēliju 5. attēlā, lāzers skenēja pa vienu līniju (horizontāla melna līnija kreisajā attēlā), kas iekļūst paraugā dažādās z-koordinātās vai dziļumos. 5. attēlā parādītais X-z attēls tika izveidots un parādīts ar konfokālās attēlveidošanas sistēmu. Spārna epitēlijs sastāv no diviem epitēlija slāņiem, bet, tā kā fluorescējošās emisijas intensitāte samazinās, palielinoties lāzera stara iespiešanās dziļumam paraugā, ir skaidri redzams tikai augšējais slānis.

Rīsi. 5. Attēls X-Z plaknē

Attēla izveide atstarotā gaismā

Visi agrīnie konfokālie mikroskopi darbojās atstarotā vai atpakaļ izkliedētā gaismā. Izmantojot atstaroto gaismu, daudzus paraugus var novērot nekrāsotus konfokālajā mikroskopijā vai arī tos var marķēt ar ļoti atstarojošām krāsvielām, piemēram, imūnzelta vai sudraba halogenīda mikrokristāliem. Atstarotās gaismas novērojumu priekšrocība, īpaši attiecībā uz dzīviem audiem, ir tāda, ka paraugs netiek pakļauts fotobalināšanai. Bet daži krāsvielu veidi var vājināt lāzera staru. Vēl viena iespējamā problēma ir tā, ka daži mikroskopi var piedzīvot iekšējos atstarojumus no optiskajiem elementiem staru kūļa optiskajā ceļā. Daudzstaru LSCM un spraugas diafragmas LSCM versijām atstarotās gaismas problēma nepastāv, un tajos mikroskopos, kur tā pastāv, problēmu palīdz mazināt polarizatoru izmantošana, apgabalu vizualizācija bez artefaktiem un nobīde no optiskās ass.

Pārraidītās gaismas attēlveidošana

LSCM var izmantot jebkuru no pārraidītās gaismas attēlveidošanas režīmiem, ko parasti izmanto mikroskopijā, tostarp fāzes kontrastu, diferenciālo traucējumu kontrastu (DIC), tumšo lauku vai polarizēto gaismu. Gaisma, kas iet cauri paraugam, nonāk raidītās gaismas uztvērējā, kura signāls caur optiskās šķiedras gaismas vadu tiek novirzīts uz vienu no mikroskopa skenēšanas galviņā esošajiem fotopavairotājiem. Pārraidāmās gaismas attēlus un konfokālās epifluorescences attēlus var uzņemt vienlaikus, izmantojot vienu un to pašu apgaismotāja staru, nodrošinot to precīzu reģistrāciju. Apvienojot vai sintezējot attēlus, izmantojot atbilstošu programmatūru, var atspoguļot precīzu marķēto šūnu atrašanās vietu audos. Daži pētījumi liecina par šādu jēgpilnu pieeju: apvienot nekonfokālas caurlaidīgas gaismas attēlu ar vienu vai vairākiem konfokāliem fluorescējošiem iezīmētu šūnu attēliem no tā paša parauga. Šāda pieeja ļaus, piemēram, noteikt marķēto šūnu apakšpopulācijas migrācijas telpiskos un laika aspektus nemarķēto šūnu populācijā vairāku stundu vai pat gadu laikā.

Mūsdienās jau plaši tiek izmantots pārraidītās gaismas krāsu uztvērējs, kas uztver pārraidītos signālus sarkanā, zaļā un zilā krāsā (RGB), lai iegūtu krāsainu attēlu reālās krāsās, līdzīgi kā tas tiek darīts dažās digitālajās krāsu kamerās. Šāds uztvērējs ir īpaši noderīgs patologiem, kuri regulāri novēro reālās krāsas audos caurlaidīgā gaismā un uzliek šos attēlus uz fluorescējošiem datiem analīzei.