В ветеринарной клинике неврологии, травматологии и интенсивной терапии доктора Сотникова помимо других услуг осуществляется лечение рептилий. Эта область, к сожалению, не сильно развита в нашей стране, поэтому в нашем отделении герпетологии встречаются пациенты, диагноз которым не могли поставить многие ветеринарные врачи других клиник. Так, одним их самых проблемных заболеваний в лечении змей является болезнь телец включений.
Болезнь телец включений (IBD- Inclusion Body Disease) – это инфекционное заболевание, вызывающее системное нарушение клеточного метаболизма рептилий, индуцированное ретровирусом и имеющее характерные клинические манифестации (проявление первых симптомов, начало видимой части болезни).Данное заболевание у змей вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae. В основном данное заболевание поражает боид (питонов, удавов). Сомнительные случаи болезни телец включений были описаны у ужеобразных змей, маисовых полозов, пальмовых ботропсов.
IBD у змей характеризуется хроническим поражением клеток, не приводящим на раннем этапе к их разрушению, образованием крупных эозинофильных включений в цитоплазме различных клеток эпителия и нейронах центральной нервной системы.
Источником инфекции являются персистентные (длительные) носители и клинически больные животные. Распространение, вероятно, происходит: с помощью пассивной передачи змеиным клещом; контактно; через пищу и воду, а также путем вертикальной передачи – от родителей к потомству.
Клинически болезнь у змей проявляется истощением организма, слабостью, снижением активности физиологических процессов, затруднением или нарушением линьки, стоматитом, пневмонией, неврологическими расстройствами - неравенством величины зрачков, задиранием и подергиванием головы, искривленным положением колец тела, опистотонусом (судорожная поза «дуги»). Некоторые змеи с IBD имеют клинику лимфомы, лейкоцитарные реакции, кожные новообразования.
Патогномоничным симптомом, то есть однозначно описывающим болезнь, для удавов и питонов считают воспаление и формирование абсцессов (очаговых гнойных воспалений, которые характеризуются образованием полостей, заполненных гноем) в салитарных фолликулах пищевода, развитых у ложноногих змей.
Диагностика болезни телец включений в нашей стране может быть осуществлена при помощи гистологического исследования желез пищевода, полученного при эзофагоскопии с последующей биопсией, и обнаружение в цитоплазме клеток крупных эозинофильных включений. Включения изредка можно обнаружить в миелоцитах и лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. При лейкоцитарных реакциях включения выявляются в цитоплазме приблизительно в 1 % периферических лимфоцитов.

При экспрессии эукариотических генов в бактериальных клетках часть рекомбинантных эукариотических белков и некоторые прокариотические белки при высоком уровне биосинтеза переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые тельца включения.

Тельца включения представляют собой частицы, состоящие из агрегатов рекомбинантного белка и ряда бактериальных белков. Рекомбинантные белки в тельцах включения находятся в денатурированном неактивном состоянии, и для их получения в растворимом виде приходится применять мощные денатурирующие агенты, такие как мочевина, гуанидинхлорид и детергенты. Солюбилизированный в этих жестких условиях рекомбинантный белок для восстановления нативной конформации требует ренатурации, в процессе обработки белки могут изменять свою структуру, а при концентрировании из разбавленных растворов, в которых проводится ренатурация, часто вновь выпадают в осадок.

Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основных механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации. Образующиеся в результате трансляции мРНК рибосомами в эндоплазматическом ретикулуме полипептидные цепи не распределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посттрансляционные модификации. Внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, pH в которых составляет 4,5-5,5. pH цитоплазмы бактериальных клеток около 7,8, в этих условиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидов мембран. Белки молока являются интегральной частью мицелл, стабилизированных ионами Ca2+.

Посттрансляционные модификации белков (фосфорилирование, гидроксилирование, гликозилирование и ограниченный протеолиз), происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток, также влияют на растворимость белков, их стабильность и биологические функции. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы посттрансляционных модификаций белков отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии.

На растворимость белков влияет их нативная конформация в растворе. Правильное сворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в клетках эукариот обеспечивается специфическими белками шаперонами , а так же фолдазами и изомеразами .

Поскольку условия, необходимые для поддержания эукариотических рекомбинантных белков в растворимой форме, не могут быть реализованы в бактериальных клетках, в них происходит агрегация рекомбинантных белков с образованием телец включения. Не существует универсального метода, позволяющего получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных клетках в нативном виде. В некоторых случаях уже понижение температуры выращивания рекомбинантных бактерий до 30o приводит к образованию полностью растворимых рекомбинантных белков. Это наблюдали в случае рекомбинантного гамма-интерферона , A-цепи рицина , щелочного фактора роста фибробластов и в ряде других случаев.

Более универсальным подходом к получению рекомбинантных белков в растворимой форме является обеспечение секретируемого характера их экспрессии, т.е. секреции синтезирующихся рекомбинантных белков в питательную среду. Системы секреции у грамположительных и грамотрицательных бактерий интенсивно изучаются. Получение рекомбинантных эукариотических белков в секретируемой форме высокотехнологично, поскольку значительно облегчает их очистку. Кроме того, у секретируемых белков больше шансов приобрести нативную конформацию, так как сворачивание полипептидных цепей происходит в большом объеме, а следовательно, и более низкой их концентрации, что предотвращает агрегацию полипептидных цепей, не полностью сформировавших свою третичную структуру. Примером эффективного использования секреторной системы E. coli является получение рекомбинантного инсулино-подобного фактора роста I (IGF-I) в секретируемой форме. В этой системе удавалось нарабатывать до 1 г рекомбинантного белка в 1 л бактериальной культуры.

Возможным подходом к эффективному синтезу растворимых рекомбинантных белков в бактериальных клетках является введение экспрессирующихся генов шаперонов в клетки бактерий-хозяев. Так, сверхэкспрессия гомологичного gro-оперона в клетках E. coli, содержащих экспрессирующиеся гены большой и малой субъединиц Rubisco цианобактерии Anacistis nidulans, приводила к 5-10- кратному возрастанию внутриклеточного содержания нативного рекомбинантного белка Rubisco. В некоторых случаях внутриклеточную агрегацию сверхэкспрессирующихся белков удается предотвратить искусственной заменой отдельных аминокислот в полипептидных цепях методами белковой инженерии . Например, удаление семи аминокислот перед спиралью G в N-концевой части полипептидной цепи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli , а также замена нескольких гидрофобных аминокислот, боковые цепи которых экспонированы на поверхности спирали G, на остатки аспарагина полностью предотвращали внутриклеточную агрегацию фрагмента и образование агрегатов в процессе его очистки. В нативной молекуле ДНК-полимеразы I участок полипептидной цепи, в котором проведены замены, закрыт доменом 5"->3"-экзонуклеазы, отсутствующим у фрагмента Кленова, и не оказывает влияния на агрегационные свойства фермента.

Ветеринарный словарь

Тельца-включения

ТЕЛЬЦА-ВКЛЮЧЕНИЯ, различные по форме и размеру образования, появляющиеся в клетках различных тканей при мн. вирусных болезнях. Т.-в. классифицируют по локализации в клетке (цитоплазматич., внутриядерные), составу нуклеиновой к-ты (ДНК-, РНК-содержащие), тинкториальным свойствам (базофильные, оксифильные), гомогенности (аморфные, зернистые).Т.-в. локализуются избирательно.
Цитоплазматич. Т.-в. образуются при болезнях, вызываемых сравнительно крупными вирусами (оспа человека, осповакцина, оспа птиц, бешенство, грипп, парагрипп, чума кр.рог. скота, пситтакоз и др.). Чаще они представлены в виде округлых, овальных или неправильной формы образований размером от 1-2 до 20-30 мкм.
В поражённой клетке может быть неск. Т.- в. различных размеров и форм. Для каждого Т.-в. характерна внутренняя структура. Внутри ядерные Т. - в. встречаются при инфекциях, вызываемых как относительно крупными вирусами (герпес, болезнь Ауески, рино-трахеит), так и вирусами, имеющими очень мелкие размеры (ящур, гепатит собаки др.).
Они лучше выявляются в гистол. препаратах, их морфологич. детали видны только при контрастной окраске среза. Форма и размеры этих Т.-в. зависят от штаммовых особенностей вируса, а также методов гистол. обработки материала. В зависимости от структурных особенностей внутриядерных Т.-в. и состояния нуклеоплазмы поражённой клетки различают2 типа Т.-в.- А и В.
При нек-рых вирусных болезнях (бешенство, оспа, ринопневмония лошадей, ринотрахеит кр.рог.скота) обнаружение специфич. Т.-в. имеет диагностич. значение. В диагностике гриппа животных, болезни Ауески, ларинготрахеита птиц, энцефаломиелита лисиц, чумы плотоядных и др. болезней выявление Т.-в.- вспомогательный метод.
См. также Вирусы и лит. при этой статье.

Источник: Энциклопедический сельскохозяйственный словарь-справочник.

ИММУНОЛОГИЯ (от иммунитет и греч. logos - учение), наука, изучающая иммунитет. Как самостоятельная наука выделилась из микробиологии. В И. можно выделить ряд разделов: иммуноморфология; иммунохимия; сравнительная И. (изучение иммунных реакций у разных видов животных); физиология иммунных реакций (исследование механизмов иммунитета); иммунопатология

АКАНТОЗ (от греч. akantha - шип, колючка), выросты эпидермиса кожи и эпителия слизистых оболочек с удлинением межсосочковых отростков. А. обусловлен усиленной пролиферацией клеток шиповидного слоя. Наблюдается, напр., при папилломатозе, трихофитии, хронич. дерматитах.

АНОМАЛИЯ ЯЙЦЕОБРАЗОВАНИЯ, нарушение формирования яиц у кур. Причины - поражения яичника и яйцевода, обусловленные в большинстве случаев нарушением у несушки обмена веществ. К А. я. условно относят: мелкие или карликовые яйца (масса 30-35 г, могут быть без желтка), ненормально крупные яйца (масса 110-120 г, часто имеют два желтка), двойные яйца (одн

УРОСУЛЬФАН (Urosulfanum; ФХ, список Б), антибактериальное средство; сульфаниламид. Белый кристаллический порошок без запаха. Мало растворим в воде, легко растворим в ацетоне, разведённых кислотах и растворах едких щелочей. Активен в отношении стафилококков и кишечной палочки, малотоксичен.Применяют при цистите, пиелонефрите, гидронефрозе. Дозы внут

Обнаружение специфических телец-включений . Это вспомогательный метод идентификации вируса. Внутриядерные тельца-включения обнаруживают в препаратах из зараженной культуры клеток, окрашенных гематоксилин-эозином, а также при электронной микроскопии, в случае типичного ЦПД, культуры клеток куриного эмбриона и почки свиньи.

Вирусные тельца-включения – образования, состоящие или из скоплений вирусных частиц (вирионов), или из клеточного материала. Они встречаются при многих вирусных инфекциях и представляют собой овальные оксифильные тельца величиной1-10мкм, периферически окруженные светлой зоной – мантией. Их классифицируют по локализации в клетке (внутриядерные, цитоплазматические), составу нуклеиновой кислоты (ДНК-, РНК-содержащие), тинкториальным свойствам (базофильные, оксифильные), гомогенности (аморфные, зернистые и т.д.). Тельца включения локализуются избирательно. При оспе всех видов животных, в том числе птиц, бешенстве, гриппе, парагриппе, чуме крупного рогатого скота, пситтакозе и других болезнях, как правило, развиваются цитоплазматические тельца-включения; при болезни Борна, ринотрахеите крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, везикулярном стоматите, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других – ядерные.

Цитоплазматические тельца – включения развиваются при болезнях, вызываемых сравнительно крупными вирусами (оспа, бешенство). Чаще они представленны в виде округлых, овальных, или неправильной формы образований. В пораженной клетке может быть несколько телец – включений различных размеров и форм. Обычно они прилегают к ядру, отодвигая его к периферии или окружая его, и обнаруживаются в хорошо сохранившихся клетках. Для каждого тельца-включения характерна внутренняя структура. Так, тельца Гварнирьери при оспе имеют вид рыхлых, зернистых образований, при бешенстве тельца Бабеша – Негри кажутся плотными,

При одной и той же болезни характер вирусных включений различен, Так при кори накопление цитоплазматических включений кореллирует с накоплением вируса, а внутриядерных – с реакцией клетки на вирус.

Ядерные включения встречаются при инфекциях, вызываемых как относительно крупными вирусами (герпес, болезнь Ауески, ИРТ, ринопневмония лошадей и др.) так и вирусами, имеющими очень мелкие размеры (ящур, гепатит собак). Ядерные включения лучше выявляются в гистологических препаратах, морфологические детали включений видны только при контрастной окраске срезов; форма и размеры их зависят от штаммовых особенностей вируса, а также от методов гистологической обработки материала. Различаютдва типа внутриядерных включений: А и В. Включения типа А – аморфные или округлой формы оксифильные образования, четко отграниченные от базофильной массы ядра; нуклеоплазма находится в состоянии глубокой деструкции; хроматин расположен глыбками на деформированной оболочке ядра. Включения типа А встречаются при ринопневмонии лошадей, ИРТ КРС, ларинготрахеите птиц, болезни Ауески. Включения типа В имеют вид ацидофилных гиалиновых зерен, нуклеоплазма относительно мало изменена. Они преимущественно при болезни Тешена, Аденоинфекции.

При ряде вирусных болезней обнаружение телец – включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько патогномоничны, что обнаружение их, стало основным из экспресс методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, аденовирусной инфекции и ИРТ КРС. В диагностике гриппа животных, болезни Ауески, ларинготрахеита птиц и других болезней выявление телец включений – вспомогательный метод. На частоту выявления телец – включений, кроме штаммовых различий влияет и возраст животного (у молодых они появляются с большим постоянством) и физиологическое состояние организма.

Тема 3. Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Контрольные вопросы:

1. Каковы общие правила взятия материала от больных животных и трупов?

2. Как консервируют и транспортируют патологический материал?

3. Что вы знаете о подготовке патологического материала к исследованию?

Цель занятия: ознакомить студентов с методами прямого обнаружения вируса в исследуемом материале. Освоить технику приготовления мазка из вируссодержащего материала и методику окраски мазков по Морозову. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного и люминесцентного микроскопов. Изучить приготовление препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

Оборудование и материалы: световые микроскопы, вируссодержащий материал, предметные стекла, спиртовки, фильтровальная бумага, эксикаторы, мостики, промывалки с дистиллированной водой, песочные часы, жидкость Руге, протрава, красящий раствор аммиачного серебра, электронный и люминесцентный микроскопы, схема строения электронного микроскопа, фотографии вирусов под электронным микроскопом, фоторепродукции вирусов в поле люминесцентного микроскопа (РИФ), мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point и плакаты по теме занятия.

Объяснение преподавателя: Вирусы находящиеся в живых клетках одно- и многоклеточных организмов представлены чаще всего в виде скоплений не связанных между собой молекул (или частей молекул) РНК или ДНК, в которых закодирована генетическая информация о вирусных белках. В результате реализации этой информации в тех же клетках синтезируются и накапливаются молекулы вирусных белков. Внутри клеток все вирусные молекулы (ДНК, РНК, белки) защищены от разрушительного действия внеклеточных факторов (ферментов, кислот, температуры, излучений и др.). Если же вирусы оказываются вне клеток, то быстро разрушаются.

3.1 Методы прямого обнаружения вируса в исследуемом материале. Многие вирусные белки, которые называются структурными, обладают свойством самопроизвольно под действием межмолекулярных сил собираться в комочки, агрегаты (процесс самосборки). В каждый такой агрегат включается обычно по одной молекуле вирусных ДНК или РНК. Иногда в них могут включаться еще и липиды клеточного происхождения. Образующиеся таким путем частицы называются вирионами. В вирионах молекулы белков так взаимно ориентированы, что на них не могут действовать протеолитические ферменты, а молекулы вирусных ДНК или РНК оказываются недоступными для нуклеаз и защищенными ох действия физических факторов среды. Формирование вирионов каждого отдельного вируса возможно только в клетках определенного типа.

Вирионы можно рассматривать как покоящуюся неактивную форму существования вирусов. Поэтому в форме вирионов вирусы могут определенное время находиться и вне клеток без потери биологической активности.

Крупные вирусы (оспа, эктима), видимые в иммерсионной системе светового микроскопа получили название элементарные тельца.

Внутриклеточные тельца-включения – это обломки скоплений вирусных частиц или продукт реакции клетки на вирусную инфекцию. Их классифицируют по месту локализации в клетке, по гомогенности, по составу нуклеиновой кислоты, по тинкториальным свойствам.

При ряде вирусных инфекций обнаружение телец - включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько типичны, что обнаружение их стало одним из основных экспресс-методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, ринотрахеита крупного рогатого скота.

3.2 Методы окраски вирионов. Существует много методов окраски мазков, мазков - отпечатков. Самым распространенным является метод окраски по Морозову. Метод окраски прост, не требует дефицитных реактивов, выполним на занятиях.

Приготовленные мазки сушат на воздухе, помещают в вертикальном положении в дистиллированную воду на 10-15 минут и красят. Для окраски по Морозову готовят три реактива.

1) жидкость Руге.

2) протраву

3) красящий раствор аммиачного серебра.

Рассматривают препарат в иммерсионной системе. Элементарные тельца на светло - коричневом фоне препарата имеют вид темно - коричневых почти черных мелких зерен, образований.

Тельца-включения, образуемые рядом вирусов, получили специальные названия. Так, цитоплазматические тельца - включения, образуемые в нервных клетках млекопитающих вирусом бешенства, называют тельца Бабеша-Негри, в эпителиальных клетках овец - вирусом оспы овец - тельца Борреля, вирусом оспы кур - тельца Болингера. Как правило, РНК-содержащие вирусы образуют цитоплазматические, а ДНК-содержащие – внутриядерные тельца-включения Небольшая группа вирусов вызывает образование телец-включений обоих типов. Наибольшее практическое значение приобрели тельца Бабеша-Негри в диагностике бешенства. Из кусочков определенных отделов головного мозга (Аммоновых рогов, мозжечка, продолговатого мозга) готовят гистологические срезы. Полученные препараты окрашивают по методу Муромцева, Туревича, Селлерса и др. Каждый метод окраски дает свою характерную картину.

3.3 Устройство и принципы работы электронного и люминесцентного микроскопов. При любых микроисследованиях необходимо именно точные сведения о морфологических особенностях интересующего нас организма. Эти сведения не могут быть получены иначе, как путем изучения данного организма под микроскопом. В силу этого микроскоп становится важнейшим орудием для практического изучения микроорганизмов, и знакомство с ним является первым условием успеха в этой работе.

Целью различных видов микроскопии являются дальнейшее изучение морфологии вирусов и дифференциальная диагностика инфекционных болезней. По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому. В отличие от светового в электронных микроскопах изображение получается с помощью потока электронов.

Пучок электронов проходит через исследуемый препарат и его изображение проецируется на люминесцентный экран. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая нить), нагреваемая электротоком. Электроны ускоряются и направляются вниз по колонке, проходя через несколько магнитных линз (конденсорная, объективная, проекционная). На экране возникает видимое изображение объекта, которое можно сфотографировать или просматривать на экране монитора (рис.7).

Чтобы предотвратить поглощение электронов воздухом, из микроскопа откачивают воздух вакуум - насосом.

Основные части микроскопа: колонка, панель управления, пишущее устройство, вакуумная система, соединительные кабели. В нижней части электронного микроскопа расположены масляные и диффузные насосы.

Максимальная разрешающая способность электронного микроскопа 2А°. По характеру исследования объектов различают микроскопы просвечивающего типа, сканирующие, эмиссионные, теневые.

При работе с электронным микроскопом важное значение имеет подготовка препаратов. Для просвечивающего электронного микроскопа исследуемые объекты должны быть в виде тонких срезов или вирусных суспензий. Объекты помещают на медные сеточки с подложками.

3.4 Методы подготовки препаратов: метод негативного контрастирования, метод отпечатков, метод напыления, метод ультратонких срезов.

Материалом для электронно-микроскопических исследований вирусов могут быть смывы со слизистых оболочек, содержимое кишечника, кожные поражения, корочки, кусочки органов и тканей, аллантоисная жидкость куриного эмбриона, вируссодержащая культуральная жидкость культуры клеток. При подготовке препаратов большое значение имеет концентрация вируса в материале и степень его контаминации балластными веществами. В зависимости от этих факторов и выбирают методику подготовки исходного материала.

С помощью электронного микроскопа в отдельных случаях в считанные минуты по морфологии вирусных частиц можно определить таксономическое положение вируса.

Метод иммунофлуоресценции называют еще РИФ, метод меченых антител.

Принцип РИФ основан на использовании явления флюоресценции, который состоит в испускании света атомами вещества, поглотившими избыточную внешнюю энергию и пришедшими в состояние возбуждения. При этом используют люминесцентную микроскопию (рис. 7)

Рисунок 7. Люминесцентный микроскоп МЛ-2

В диагностических исследованиях методом РИФ в качестве объекта исследования могут быть мазки – отпечатки, срезы органов и тканей, соскобы, гистологические срезы, препараты тканевых культур.

При прямом методе РИФ мазок - отпечаток обрабатывают сывороткой, меченной антителами, гомологичными тому вирусу, наличие которого предполагается. Если в мазке содержится антиген, гомологичный антителам сыворотки, то образуется комплекс антиген + антитело. Препараты отмывают, сушат и исследуют под люминесцентным микроскопом, который устроен так, что на препарат падает пучок сине-фиолетовых лучей, а в глаз наблюдателя попадают только желто-зеленые лучи, которые испускает комплекс антиген + антитело. По этому свечению и судят о наличии в материале антигенов, гомологичных антителам меченой сыворотки.

Непрямой метод состоит в том, что мазок - отпечаток обрабатывают дважды: вначале немеченой антивирусной сывороткой, а затем после отмывания - меченной антивидовой. После второго отмывания препарат высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом. Обнаружение в препарате специфической флюоресценции указывают на наличие в материале антигенов, гомологичных использованной противовирусной сыворотке.

По эффективности непрямой метод имеет преимущества перед прямым методом.

В целом метод флюоресцирующих антител обладает рядом достоинств перед другими методами.