Lumineszcens mikroszkóp. Elektronmikroszkópia
Ez a fejezet a konfokális lézeres pásztázó mikroszkóp (CLSM) fő elveit, tervezését és alkalmazását tárgyalja, példaként Leica eszközöket használva. A CLSM elve a lencse fókuszsíkjából kiinduló fényáram regisztrálása a fókuszok egybeesésekor, azaz a detektor membránját úgy kell elhelyezni, hogy képe pontosan egyezzen a tárgyat megvilágító fény fókuszával. Lézereket és érzékeny detektorokat használnak fényforrásként a kép készítéséhez.
A CLSM fő jellemzője az a képesség, hogy a vizsgált objektumról (például egy celláról) rétegről rétegre képet kapjunk nagy felbontással és alacsony zajjal. Ezt úgy érik el, hogy egy tárgyat egy koherens forrásból vagy színpadról fókuszált fénysugárral lépésről lépésre pásztáznak, speciális fluoreszcens szondák és speciális fényáram-korlátozási módszerek segítségével.
A CLSM szkennelő rendszerek a következők szerint osztályozhatók.
1. Nyaláb pásztázás.
A) Tükörrendszerek: egytükrös, kéttükrös, rezonáns magnetoelektromos.
B) Fényszálas rendszerek: egyszálas, többszálas.
B) Objektív szkennelés:
· a lencse piezoelektromos mozgása az X, Y tengelyek mentén;
· a lencse piezoelektromos mozgása a Z tengely mentén.
D) Akuszto-optikai sugárterelők: két akuszto-optikai terelő az X és Y tengely mentén történő pásztázáshoz.
D) Lemezrendszerek:
· egyspirálos, egyoldalas és kétoldalas;
· többspirálos egy- és kétoldalas.
E) Kombinált rendszerek: akusztikus-optikai terelő az Y tengely mentén és pásztázás tükörrel az X tengely mentén.
2. Szkennelés táblázattal.
A) Léptető hajtás: letapogató asztal léptetőmotorokkal az X, Y, Z tengelyek mentén.
B) Kombinált hajtás: pásztázó fokozat léptetőmotorral az X, Y tengely mentén és piezoelektromos hajtással a Z tengely mentén.
Rizs. 5. A CLSM működésének sematikus diagramja.
1 - szkennelő asztal; 2 - vizsgálati minta; 3, 7 - lencsék; 4 - szkennelő eszköz; 5 - sugárosztó; 6 - fénysugár a lézerből; 8, 12 - a B és C pont képe; 9 - tűmembrán; 10 - az A pont képe a tűmembrán közepén; 11 - sugárzás vevő; 13, 15 - a B és C pontok fénye, amelyek a 3 lencse fókuszán kívül helyezkednek el; 14 - az A pont fénye, amely a 3 lencse fókuszában található.
A lézerforrásból származó 6 gerjesztő fényáram az 5 sugárosztó lemezen, a 4 letapogató rendszeren keresztül a 3 lencsére jut, és a vizsgálandó minta (például cella) síkjának A pontjára fókuszál, amely fókuszban van. . Úgy gondoljuk, hogy az intracelluláris struktúrákhoz fluoreszcens szondák kapcsolódnak, és pontszerű fényforrásnak tekinthető az A sugárfókuszálási pont, amelyből a fluoreszcencia fluxus a 3. lencsén, az 5. sugárosztó lemezen, a 7. lencsén keresztül a 9 tűmembrán síkjába fókuszál. ("csaplyuk") és a 11-es fotodetektor rögzíti. A lencsefókuszon kívül eső gyógyszerfragmensek gerjesztési fluxusának megvilágítása az optikai tengely mentén (B és C pontok) alacsonyabb, mint az A pontban. Következésképpen a detektor megvilágításának összetevője célpontja a B és C pontból jelentősen csökkenthető. A B és C pontokból kiáramló, életlen fluoreszcencia fluxusokat lyukmembrán korlátozza, és nem éri el a detektort, vagy egy kis részük igen. Így egy készítmény repülőben történő szkennelésekor XY A detektor egy jelet regisztrál, melynek szintjét a pásztázási síktól mért távolság határozza meg a Z koordináta mentén. A 3. lencse fókuszának a pásztázási síkhoz és a 7. lencse fókuszának egy tűmembránhoz való igazítása tükröződik. „konfokalitás” kifejezés. A szkennelési sík lépésről lépésre történő mozgatása a Z tengely mentén lehetővé teszi, hogy rétegről rétegre kontrasztos képeket kapjon, és rekonstruálja a vizsgált objektum belső háromdimenziós szerkezetét (3-D). Képminőség, síkbeli felbontás XY a Z tengely mentén pedig függ az optika minőségétől, a letapogató rendszerek minőségétől, a lyukmembrán méretétől és gyártási pontosságától, a szerkezet merevségétől, az alkalmazott jelfeldolgozó algoritmusok hatékonyságától, valamint a jelfeldolgozó algoritmusok specifikusságától. fluoreszcens szondák.
A mikroszkóp térbeli felbontásának meghatározásához egy pontszerű fényforrás képanalízisét végezzük. A hagyományos lencsék által alkotott pontforrás képe egy fényes középső magból és halványabb külső gyűrűkből álló levegős diffrakciós folt.
Rizs. 6. Levegős diffrakciós folt.
Két azonos fényerejű pontforrás, a köztük lévő távolság d , két különböző pontként láthatók, ha az Airy körök középpontjai közötti távolság meghaladja a következő értéket:
r A = XY = 0,6 λ/NA,
hol r A - az első sötét gyűrű sugara az Airy körben, λ a fényforrás hullámhossza nm-ben, NA a numerikus apertúra.
Ezt a kifejezést Rayleigh-kritériumnak nevezik. Meghatározza a mikroszkóp felbontását a mintasíkban (XY). Ebben az esetben a felbontási határt elsősorban a fény hullámtermészete határozza meg, ezért gyakran leegyszerűsítik az NA=1 figyelembevételével. CLSM-ben a képalkotás az Airy folt méretének enyhe csökkenését eredményezi. Az Airy folt intenzitása standard mikroszkóp esetén az n -2 törvény szerint csökken, ahol n a keresztirányú elmozdulás, a CLSM esetében pedig az intenzitás n -4 értékkel csökken. Ez 1,5-szeresére növeli a CLSM felbontását. Konfokális mikroszkóp esetén a Rayleigh-kritérium a következő:
XY c r = 0,4 λ/NA,
ahol XY c r a CLSM felbontása.
A CLSM előnyeinek felméréséhez figyelembe vesszük a műszeres funkciót (az Airy folt szerkezetét), és elemezzük a mikroszkóp felbontását axiális irányban (Z). A háromdimenziós Airy spot (intenzitáseloszlás) egy háromdimenziós hardverfüggvény (THF), amely meghatározza egy objektum képét. A hagyományos mikroszkóp TAF-ja kúpos alakú, a középponttól felfelé és lefelé tágul, míg a konfokális mikroszkóp esetében ellipszis alakú és kevésbé megnyúlt axiális irányban.
Rizs. 7. Egy hagyományos mikroszkóp pontforrásának háromdimenziós hardverfunkciójának nézete - (a) és CLSM - (b).
A Rayleigh-kritérium a mikroszkóp optikai tengely irányú felbontásának meghatározására is alkalmazható. Hagyományos mikroszkóp esetén két, az optikai tengely mentén bizonyos távolságra elhelyezkedő pontforrás feloldható, ha a levegős foltok maximumai egymástól távol vannak:
Z r = 2 λ/NA 2,
ahol Z r a mikroszkóp tengelyirányú felbontása.
A CLSM Airy spot energiaeloszlása keskenyebb, a tengelyirányú felbontás pedig 1,4-szer nagyobb. Konfokális mikroszkóp esetén a Rayleigh-kritérium a következő:
Z r c = 1,4 λ/NA2,
ahol Z r c a CLSM axiális felbontása.
A modern CLSM-nek van egy fő előnye - az a képesség, hogy vékony optikai metszeteket kapjanak. A vékony optikai metszetek képminőségét a következő paraméterek befolyásolják:
· konfokális rekesz mérete;
· az objektív numerikus rekeszértéke NA;
· törésmutató;
· fényelnyelés a mintában.
A fényintenzitás csökkenése a minta vastagságának növekedésével befolyásolja a mikroszkóp felbontását az optikai Z tengely mentén. A felbontás a mikroszkóp és a minta optikájától függ. Az optikai metszet vastagságát egy konfokális mikroszkópban általában az intenzitáscsúcs félmagasságánál lévő eloszlás szélességével jellemezzük ∆z 1/2 = 0,65 μm. Ha a minta és a detektor ideális, ez a paraméter függ az objektív numerikus apertúrájától, a λ hullámhossztól és a merülő közeg n i törésmutatójától.
Rizs. 8. A mikroszkóp tengelyirányú felbontásának ∆z 1/2 függése a lencse numerikus apertúrájától.
A CLSM-ben egy állítható membránt helyeznek el a detektor előtt, amely megváltoztatja a fény mennyiségét. A tűmembránokat úgy alakították ki, hogy feltételeket teremtsenek a képalkotási síkba olyan pontokról érkező fény maximális vagy teljes szűréséhez, amelyek nem esnek egybe a fókuszsíkkal, vagy a tárgy elemzett eleme mellett helyezkednek el a fókuszsíkban. A tűmembrán mérete véges, ettől függ a készülék oldalirányú felbontása, a Z tengely mentén a fókuszsíkhoz képest eltolt minta megvilágított elemeinek fényereje és a mélységélesség. A membrán mérete befolyásolja a kapott szakasz vastagságát. Minél kisebb a nyílás, annál közelebb van a szelvényvastagság az elméleti határhoz (az eloszlás szélessége az intenzitáscsúcs félmagasságánál), és nagyon nagy nyílásoknál lehetetlenné válik a vékony metszet elérése.
Amint azt korábban említettük, a CLSM lehetővé teszi, hogy a minta felületéről jelentős mélységben optikai keresztmetszetet kapjunk, ahol a fontos szempont a törésmutató és a mélység kérdése. A beeső és visszavert sugár áthaladása a mintán befolyásolja a képminőséget. Ha az immerziós közeg és a minta törésmutatói közel vannak (az immerziós folyadék és a tárgy törésmutatói különbségének hatása a szórt fény megjelenésére, ami csökkenti a kép kontrasztját és szférikus aberrációs hatásként működik) , a fénykúp konvergálni fog. Ha a törésmutatók eltérnek, gömbi aberráció jelenik meg.
Rizs. 9. Az immerziós közeg és a minta törésmutatói.
a – képalkotás merülőlencsével aberráció nélkül; b – a mutatók közötti eltérés okozta szférikus aberráció.
Különböző törésmutatókkal az optikai tengelytől eltérő távolságra érkező fénysugarak nem fókuszálnak egy pontra, ami a képminőség romlásához vezet. Ha lehetséges, a minta és az objektív törésmutatóit össze kell hangolni. Ha a minta és az immerziós közeg törésmutatója eltérő, a mélységben lévő tárgy képe az optikai tengely mentén elmosódik, és a fókuszsík eltolódik. A behatolási mélység növelése érdekében az objektívnek nagy numerikus rekesznyílással kell rendelkeznie, például olajimmerziós lencsével. Az ilyen objektíveknek azonban kicsi a maximális távolsága az objektív és a fókuszsík között. A behatolási mélységet befolyásolja a minta heterogenitása, ami nagy mélységben a fényintenzitás csökkenéséhez és árnyék megjelenéséhez vezet. Ideális esetben a maximális behatolási mélységet és maximális felbontást elérő minta törésmutatója megegyezik a lencse törésmutatójával, de ez egy homogén minta, és ilyen biológiai minták nem léteznek.
A szkennelés során a CLSM rendszeresen növekvő mélységű optikai metszeteket kap a minta felületéről. A legtöbb CLSM esetében a több száz 2D kép beszerzése csak néhány percet vesz igénybe. Az optikai kép kétféleképpen készíthető:
1) az XY síkban egymástól ∆z távolságra elhelyezkedő optikai szakaszok sorozatának kinyerése. A különböző metszetekben lévő objektumok középpontjainak koordinátáinak összehasonlítása lehetővé teszi azok tájolásának és hosszeloszlásának meghatározását.
Rizs. 10. Háromdimenziós szerkezet vizsgálata XY síkban.
2) az XZ síkban ∆y távolságra elhelyezkedő optikai metszetek kinyerése. Ha a minta párhuzamos a metszetsíkkal, akkor az XZ síkban lévő metszete a különböző XZ metszetekben lévő képek összehasonlításával meghatározható a vizsgált objektum görbülete.
Rizs. 11. Háromdimenziós szerkezet vizsgálata XZ síkban.
A vizsgált objektumok háromdimenziós rekonstrukciója CLSM módszerekkel két probléma megoldására irányul:
· egy tárgy háromdimenziós képének megjelenítése, amelyet optikai szakaszainak „összeállításával” kapunk;
· egy tárgy belső szerkezetének kvantitatív elemzése.
Ma már nagyon sok cég gyárt CLSM-et. A CLSM gyártó cégek innovációi:
· 2002 A Leica bejelentette az akuszto-optikai sugárosztót (AOBS), amely lehetővé teszi a lézergerjesztő sugár és a lumineszcencia hatékony szétválasztását;
· 2002 A Carl Zeiss megkezdte az LSM 510 META konfokális mikroszkóp gyártását eredeti fotodetektorral, amely egyidejűleg 32 spektrális csatornán rögzíti a jeleket;
· 2004 A Zeiss megalkotta a nagy sebességű LSM 5 Live-t, amelynek a pásztázási sebessége 20-szor nagyobb, mint a hagyományos CLSM;
· Az Olympus kifejlesztett egy két szkenneres eszközt, amely lehetővé teszi például a FRAP technika hatékonyabb használatát;
· Nikon – kompakt és olcsó CLSM-et hoz létre egyszerűsített kialakítással;
· 2007 A Leica bejelentette egy 4Pi-konfokális mikroszkóp kiadását, amely 4-7-szer javítja az axiális felbontást.
Vegyünk egy CLSM-eszközt, amely az eszközök új, fejlettebb generációjához tartozik - a Leica TCS SP5-éhez.
Rizs. 12. Többfoton/konfokális szélessávú rendszer TCS SP5 (fordított mikroszkóp).
A CLSM TCS SP5 legfontosabb elemei: AOTF – akusztikus-optikai hangolható szűrő, AOBS – akusztikus-optikai sugárosztó, SP-Detector – spektrális fotométer érzékelő.
AOTF – Akusztikus-optikai hangolható szűrő – az optikai expozíció minimalizálására szolgál, és a lézerteljesítményt a mintától és a fluorokrómtól függően állítja be. Lehetővé teszi a kívánt hullámhossz kiválasztását és a gerjesztő fény intenzitásának szabályozását. Az AOTF egy elektromosan hangolható szűrő, amely a fénysugár térfogati diffrakciójának elvén működik a törésmutató inhomogenitása miatt. Ilyen inhomogenitások keletkeznek, amikor ultrahang akusztikus hullámot gerjesztenek kettős törő kristályokban. Az egytengelyű kristályok anizotróp diffrakciója esetén van egy minimális ultrahangfrekvencia, amelynél a beesési szög és a diffrakció egybeesik, és létrejön az úgynevezett kollineáris akuszto-optikai kölcsönhatás.
Rizs. 13. Akusztikus-optikai hangolható szűrő.
Az AOBS - akuszto-optikai sugárosztó, egy akuszto-optikai kristály - egy hangolható fénytörő eszköz, amely fordított üzemmódban működik. Mit ad az AOBS használata:
1. A tiszta, alacsony zajszintű kép eléréséhez nagy fényáteresztés szükséges. A zaj csökkentése a kép átlagolásával több egymást követő pásztázás során szükségszerűen a vizsgált objektum fényfehéredéséhez vezet. Az AOBS fényáteresztő képessége a teljes látható spektrumban jobb, mint a legtöbb dikroikus tükör. Ezért kisebb számú vizsgálat átlagolása szükséges. Ennek eredményeként a gyógyszer sokkal tovább tart;
2. A világos és tiszta képekhez a lehető legtöbb fotonnak kell átjutnia az objektumból a detektorba, ami javítja a képminőséget. Az AOBS biztosítja a lehető legszélesebb fluoreszcencia sáv regisztrálását, azaz a fotonok maximális számát;
3. A képalkotás során az alacsony fehérítés fontos, hogy megvédjük a mintát a fakulástól és az élő tárgyakat a mérgező fluorokróm fotolízis termékektől. Az AOBS fényáteresztési görbéi nagyon meredek lejtésűek, ami lehetővé teszi, hogy a fluorokróm fluoreszcenciáját a lehető legközelebb a gerjesztési sávhoz rögzítsük;
4. Bármilyen festék a látható tartományban gerjeszthető, mivel a visszaverődés egyedileg állítható;
5. Megoldódott a többparaméteres fluoreszcencia kérdése: maximum nyolc lézeremissziós vonal programozható, így elegendő hely marad a fluoreszcencia rögzítésére, miközben a frekvenciák állíthatók;
6. A színezékek arányának, akárcsak a metabolit gerjesztésének aránya - minták, például Ca 2+-ra, membránpotenciálra, pH-értékre, gyorsan át kell váltani a szekvenciális szkennelés során. Az AOBS néhány mikroszekundum alatt kapcsol;
7. Egy másik felhasználási lehetőség a képregisztráció visszavert fényben. Az AOBS lehetővé teszi a visszavert gerjesztő fény átvitelének egyéni beállítását;
8. A ROI szkennelés (szekvenciális szkennelés és specifikus terület szkennelés) is javult: egyetlen pásztázás során különböző gerjesztési módok alkalmazhatók a különböző területeken;
9. A nagy volumenű 3D felvételek szekvenciális módban a gyors kapcsolási eszközök előnyeit élvezik, mivel a sebesség növeli a rendszer hatékonyságát;
10. A fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) alacsony háttér- és fényszórást igényel. Csak az AOBS blokkolja hatékonyan a közeli emissziós vonalakat, például az Ar lézereknél.
11. A spektrális felvétel (Lambda scan) pontos spektrumot biztosít, mivel az AOBS fényáteresztése „fehér”, vagyis nem okoz változást az emissziós spektrumban – ez gyakori probléma, amikor a spektrális pásztázást dikroikus tükörrendszeren végezzük;
12. A valódi konfokális optikai metszéshez spot megvilágításra és a fluoreszcencia spot detektálására van szükség. Az AOBS alkalmas a pontszkennelő konfokális eszközökkel való használatra;
13. A képalkotás többfoton módban vagy ultraibolya gerjesztéssel párhuzamosan is elvégezhető hiba és korlátok nélkül. Az AOBS nem változtatja meg a láthatatlan lézerek gerjesztését és nem változtatja meg a fluoreszcencia spektrumot;
14. Hibás működés nem hajtható végre, mivel az AOBS-t az AOTF (Acousto-Optical Tunable Filter) gerjesztésvezérléssel együtt vezérlik. Ha a gerjesztési vonal van kiválasztva, akkor az AOBS ennek megfelelően van programozva. Az üzemeltetőnek nem kell döntéseket hoznia - a munka megfelelően és automatikusan történik;
15. Nincs beállítás, mivel nincsenek mozgó elemek a szűrődobokban és a csúszkákban. A kristály szilárdan rögzítve van, és a programozás elektronikusan történik;
16. Nincs szükség drága kiegészítő felszerelésekre, például szűrőkockákra, dikroikus tükörcsúszkákra stb. Ezért az új optikai elemek felszereléséhez szükséges technikai segítségnyújtás költsége sokkal alacsonyabb.
Rizs. 14. AOBS – akuszto-optikai sugárosztó.
SP-Detector – spektrális fotométer érzékelő. A mintából származó fény, amely az indukált fluoreszcencia spektrumok összege, áthalad egy lyukmembránon, amely konfokális optikai szakaszt alkot. Majd egy prizma segítségével ezt a fényt spektrumra bontják. Az első detektoron áthaladva a fény egy résfotométeren halad át, amely két motoros függönyből áll. Ezek a függönyök levágják a spektrum széleit a tartomány mindkét oldalán, és a 2. és 3. rendű érzékelőkre irányítják őket. Ennek eredményeként a spektrum egyidejűleg öt csatornára oszlik. Ennek eredményeként SP detektor használatakor a mintában lévő különböző színezékek sugárzását rögzítik.
Rizs. 15. Spektrális detektor SP.
Az SP detektor lehetővé teszi a lambda pásztázást: spektrális képek halmozódnak fel, hogy azonnal elemezzék a kísérletben részt vevő festékek jellemzőit.
2013. június 4A Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karán folyó tudományos kutatások jelentős része, az ehhez szorosan kapcsolódó oktatási programok sikeres megvalósítása elképzelhetetlen a legmodernebb mikroszkópos technológia alkalmazása nélkül. A Moszkvai Egyetem Fejlesztési Programjának részeként a Biológiai Karon létrehoztak egy konfokális mikroszkópos tanszékközi laboratóriumot, amely a szükséges felszerelésekkel teljesen felszerelt és hatékonyan működik.
3T3 fibroblasztok a mátrix makropórusának falán
Szöveg: Tretyakov Artemy
Mit tehet?
Használva konfokális mikroszkóp több képet is kaphatunk egy cella virtuális szakaszairól, vagy azokból összeállított háromdimenziós modellt. Ilyen lehetőségeket biztosít a lézer, melynek sugara a cella bármely pontjára fókuszálható. A kép elkészítéséhez a tárgynak fluoreszcensen aktívnak kell lennie, vagyis ha lézersugárral éri, akkor (vagy inkább összetételében bizonyos molekuláknak) nagyobb hullámhosszú fényt kell kibocsátania, mint a ráeső hullámhosszúságú fény, amelyet a lézersugár megfog. a mikroszkóp. A kép pontosan erre a fluoreszcenciára épül fel.
Fénykép
Hogyan működik?
„A fundamentális és alkalmazott interdiszciplináris tudományos kutatások jelenlegi fejlettségi szintje, valamint az interdiszciplináris kompetenciákkal rendelkező szakemberek képzési feladatai intenzív fejlesztést és az anyagi és technikai bázis korszerűsítését igénylik” (Moszkvai Egyetem Fejlesztési Programja, 5. o. ;) .
Az elektronikus-mechanikus eszköz a lézeren kívül tartalmaz egy optikai szűrőt is, amely továbbítja a lézersugarat, de a hosszabb hullámhosszú fényt egy „pinhole” nevű membránra verik vissza (az angol Pinhole - pinhole - lyuk, amelyet egy tűvel készített, szó szerinti fordítás) tökéletesen jellemzi a tűlyuk eszközt), amely levág minden szükségtelen háttérfényt, és ezáltal csökkenti vagy teljesen megsemmisíti az alatta lévő optikai rétegek hatását a cella beolvasott területének megjelenítésének tisztaságára. Ha a háttérfényt nem vágná le a tűlyuk, az optikai rétegek átfedik egymást, és zavarják a nézőt - mintha lombokon keresztül nézne a távolba. A membrán mögött egy fotodetektor található, amely digitalizálja a kapott információkat.
Nyilvánvaló, hogy az ilyen „pontos” szkennelés időt vesz igénybe. Ennek a folyamatnak a felgyorsítására a konfokális rendszer egy másik, forgó korongnak nevezett modult használ, amely lehetővé teszi, hogy egy lézerművelet során ne csak egy pontról, hanem egy teljes vonalról készítsünk képet.
Az MIT professzora, Marvin Minsky 1961-ben kapott szabadalmat egy ilyen rendszerre. Aktív használata a 80-as években kezdődött, és most éli virágkorát a konfokális mikroszkópia. Az első mikroszkóp 2003-ban jelent meg Oroszországban, az Axiovert 200M LSM510 Meta volt. Mások követték, és ma már több nagy laboratórium működik hazánkban, köztük a Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karának tanszékközi laboratóriuma. A laboratórium öt mikroszkóppal rendelkezik, köztük: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
A konfokális mikroszkópia nemcsak a legnagyobb kontrasztot és háromdimenziósságot érte el, hanem a negyedik dimenziót is – az időt –, lehetővé téve a sejtekben végbemenő változások tanulmányozását. Ebből a célból minden létesítmény fel van szerelve olyan rendszerekkel, amelyek megőrzik élettartamukat. Mindez bőséges lehetőséget biztosít azoknak a kutatóknak, akik sikeresen élnek ezekkel a lehetőségekkel.
És mivel a Moszkvai Állami Egyetem Biológiai Karának laboratóriumáról beszélünk, példaként meg kell említeni az ebben a laboratóriumban végzett kutatásokat.
Selyem és háló
A konfokális mikroszkópia nemcsak a legnagyobb kontrasztot és háromdimenziósságot érte el, hanem a negyedik dimenziót is – az időt –, lehetővé téve a sejtekben végbemenő változások tanulmányozását.
Az egyik érdekes munka a biológiailag lebomló protézisek létrehozása az erek és más üreges szervek helyreállítására. A legegyszerűbb esetekben az ilyen szövet-manipulált szerkezetek csöveknek vagy filmeknek tűnnek, amelyeket a károsodás helyére helyeznek, és így „tapaszként” működnek. Különböző anyagokból készülhetnek, beleértve a selyemhernyógubóból származó selyemfibrint is. Ennek az anyagnak az az előnye, hogy stabil, rugalmas és tartós szerkezetet alkot a protézisben. Maga a protézis csak szabad szemmel nézve filmszerűnek tűnik, valójában egy mátrix – egy hálós többrétegű alap, egy keret, amely utánozza az élő szövet szerkezetét. Ez az állvány segít az új celláknak a megfelelő pozícióba kerülni, biztosítva egyenletes eloszlásukat. Ennek eredményeként a sérült szervfal helyreáll, és a felesleges keret biológiailag lebomlik. De nem olyan egyszerű ellenőrizni, hogy a sejtek mennyire egyenletesen oszlanak el a keretben, és jól élnek-e a mátrix mély rétegeiben (vannak-e nehézségek a gázcserében és az anyagcseretermékek cseréjében), megváltoztatja a morfológiát, amikor behatol a belsejébe. Ebben a szakaszban a mikroszkóp (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) használata nagymértékben leegyszerűsítette a feladatot. Főleg annak a képességének köszönhető, hogy egy tárgyat roncsolás nélkül képes megvizsgálni, valamint amiatt, hogy a mikroszkóp 600 mikron mélységig képes a mátrix belsejébe nézni.
Fénykép
Hasonló munkát végeztek csontszövettel is, amelynek mátrixát ugyanabból a fibroinból és spidroinból, egy eredetileg a pók testében felfedezett fehérjéből állították elő, amelyet hálószövésre használt. Laboratóriumi körülmények között a fehérjét egyáltalán nem pókok termelik, hanem élesztőgombák, amelyek genomjába egy enyhén módosított pókgén kerül be, amely e fehérje szintéziséért felelős.
Nem olyan egyszerű
De ha a szövetek károsodásának előfordulása egyszerű és érthető folyamat, más patológiák nem mindig egyértelműek. A hatékony kezelés megkezdése és különösen a fejlődésük megelőzése előtt meg kell találni az előfordulásuk mechanizmusát. Ide tartozik az érelmeszesedés - az artériák betegsége, melynek következtében a lipidek felhalmozódnak az érfalban, pontosabban az intimában - annak belső rétegében, vastagabbá téve a falat, ami végső soron akár az ér teljes elzáródásához is vezethet. . Nem teljesen tisztázott, hogy mi okozza ezt a betegséget, ahogy az sem, hogy az immunkompetens sejtek milyen szerepet játszanak, a felhalmozódásuk helyén hamar megindul az atherogenezis. Ezekre a kérdésekre még nem találtak teljes választ, de az atherogenezis tanulmányozása folytatódik, bár sokkal kevesebb publikáció jelenik meg ebben a témában, mint a szöveti protézisek témájában.
Fénykép
A molekulák sorsai
A konfokális mikroszkópos tanszékközi laboratóriumot közel 10 tanszék több mint 20 egyetemi és posztgraduális hallgatója használja rendszeresen munkája során.
A fent leírt vizsgálatok elsősorban a sejtek állapotát követik nyomon. De a konfokális mikroszkóp képességei nem korlátozódnak erre, még egy sejtben lévő egyedi molekula sorsát is képes nyomon követni, amennyiben az fluoreszcens aktivitással rendelkezik. Ehhez a molekulákat általában fluorokrómokkal jelölik - speciális színezékekkel, amelyek rendelkeznek ezzel az aktivitással. A fluorokrómok egyedi molekulákként léteznek, és jelölésük magában foglalja a fluorokróm kémiai kötését a kutató számára érdekes molekulához. Ezt követően az ilyen jelölt molekulák bejutnak a sejtbe, és mikroszkóppal követik nyomon további sorsukat. Ilyen módon hasonlították össze például a ricin és a viszkumin aktivitását és mozgását a sejtben. Mindkét anyag fehérje toxin, mindkettő növényi eredetű és két részből áll - alegységekből, amelyek közül az egyik a sejthez való kötődésért és a belsejébe való behatolásért, a másik pedig a riboszóma inaktiválásáért felelős, ami végső soron sejthalálhoz vezet. A gyakorlati haszon ismét egy másik veszélyes betegség - a rák - kezeléséhez kapcsolódik. Az alegységek közötti egyértelmű „felelősségi szétválasztás” lehetővé teszi az első alegység helyettesítését például antitesttel. Az eredmény egy „immuntoxin”, amely csak bizonyos sejtekre hat, amelyekre ez az antitest alkalmas. Két fő probléma van. Először is: olyan antitest kiválasztása, amely megközelíti a rákos sejteket, és megakadályozza, hogy a toxin behatoljon az egészségesekbe. Másodszor pedig: válasszunk olyan toxint, amely immunotoxinná alakulva rendkívül hatékony marad.
Fénykép: Újszülött patkánykölykök szívsejtjeinek elsődleges tenyésztése: A - kontroll, B - 20 µM izoproterenollal kezelve 24 órán keresztül. 1 - Mitokondriumok TMRE festése; 2 - fázis kontraszt. Mérete 10 µm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. „Adaptive changes in mitochondria of cultured cardiomyocytes of newborn patkányok izoproterenol hatására.” Nemzetközi konferencia „Receptorok és intracelluláris jelátvitel” 2011. MÁJUS 24-26. Pushchino).
Oktatás
A konfokális mikroszkóppal végzett munkák listája még sokáig folytatható. Ez a hatékony módszer, amely lehetővé teszi az élő sejtekkel való munkát is, szinte minden tudományos kutatásban igényes. Ezért óriási szerepet játszik a hallgatók felkészítése a laboratóriumi munkára. Rendszeresen részt vesz több mint 20 egyetemi és posztgraduális hallgató, akik tanfolyami munkával, kurzus előtti munkával és diplomamunkával foglalkoznak.
A létesítményekben embriológusok, molekuláris biológusok, citológusok, biomérnökök, immunológusok és zoológusok dolgoznak.
A Konfokális Mikroszkópiai Laboratóriumot 2004-ben alapították.
A laboratórium vezetője – egyetemi docens M. M. Moisenovic
Fiatal szakemberek, A.A. Ramonova és A.Yu a laboratóriumban dolgoznak
Jelenleg a laboratóriumban 2 konfokális rendszer van telepítve:
- Axiovert 200M konfokális rögzítéssel LSM510 META (Carl Zeiss, Németország)
- Konfokális lézeres letapogató rendszer, a NIKON CORPORATION (Japán) által gyártott - fordított orvosi és biológiai mikroszkóp laboratóriumi kutatásokhoz Eclipse tartozékokkal: Ti-E állvánnyal, TIRF megvilágítóval, A1 konfokális modullal és forgó korong alapú konfokális modul.
Minden hír"
Margolin 389p.
Az optikai mikroszkópia a technológia és a technológia, valamint az információs és számítógépes technológiák összes vívmányát felhasználta. Ez a meglévő berendezések és felhasználási módszerek jelentős fejlesztéséhez vezetett, ami viszont új módszerek, különösen a konfokális mikroszkópia megjelenéséhez vezetett. A konfokális mikroszkóp abban különbözik a klasszikus optikai mikroszkóptól, hogy minden időpillanatban egy tárgy egy-egy pontjának képét rögzítik, és pásztázással (a minta mozgatásával vagy az optikai rendszer átrendezésével) teljes képet készítenek. Így a pásztázó elektronmikroszkópia elve egyedi formában valósul meg, amely lehetővé teszi az egyes pontokból érkező jelek tetszőleges ideig történő rögzítését és feldolgozását.
A klasszikus mikroszkópban a fény a minta különböző pontjairól jut be a fotodetektorba. Konfokális mikroszkópban, hogy csak egy pontról rögzítsék a fényt, egy kis membránt helyeznek el az objektív lencséje után oly módon, hogy a vizsgált pont által kibocsátott fény áthalad a membránon és rögzítésre kerül, és a tárgyból származó fényt rögzítik. A fennmaradó pontokat főként a membrán blokkolja, ahogy ez az ábrán látható. 7.28.
Rizs. 7.28. A sugárátvitel sémája konfokális optikai mikroszkópban
További jellemző, hogy a megvilágító nem hozza létre a látómező egyenletes megvilágítását, hanem a fényt a vizsgált pontra fókuszálja. Ezt úgy érhetjük el, hogy a minta mögé egy második fókuszáló rendszert helyezünk el, de ehhez a mintának átlátszónak kell lennie. Ezenkívül az objektívek általában drágák, így a második fókuszrendszer használata a megvilágításhoz nem előnyös. Egy másik lehetőség a sugárosztó használata, így a beeső és a visszavert fényt is egyetlen lencse fókuszálja. Ez a séma is megkönnyíti a beállítást.
Vizsgáljuk meg most, hogyan és milyen mértékben változik a kontraszt konfokális mikroszkópia használatakor. Mivel egy konfokális mikroszkópban a fény kétszer halad át a lencsén, a pontelmosás függvény (a továbbiakban PSF) annak a független valószínűségnek a szorzata lesz, hogy egy foton a koordinátáival eltalál egy pontot, vagy ebből a pontból fotont észlelnek.
Ha a felbontásra a Rayleigh-kritériumot használjuk, akkor kiderül, hogy a konfokális mikroszkópban a felbontás nő, de nem jelentősen. Konfokális mikroszkóp esetén van egy kifejezésünk az r felbontásra:
Hagyományos mikroszkóp esetén:
A konfokális mikroszkóp fő előnye azonban nem a Rayleigh-kritérium értelmében vett felbontásnövekedés, hanem a kontraszt jelentős növekedése. Egy hagyományos PSF esetében a fókuszsíkban az első oldali maximum amplitúdójának és a középponti amplitúdónak az aránya 2%, a konfokális mikroszkópnál ez az arány 0,04%. Ebből az következik, hogy egy halvány tárgy, amelynek intenzitása például 200-szor kisebb, mint egy fényes tárgyé, nem észlelhető hagyományos mikroszkóppal, bár a tárgyak közötti távolság lényegesen nagyobb lehet, mint a Rayleigh-kritérium által előírt távolság. . Ugyanakkor egy ilyen tárgyat jól rögzíteni kell egy konfokális mikroszkópban.
Fontos paraméter a besugárzó és gyűjtő lencsék fókuszsíkjában lévő rekesznyílások mérete. A tárgysíkban lévő apertúra képe határozza meg, hogy a fotodetektor mely területekről érzékeli a fényt. Nyilvánvaló, hogy a rekesznyílás méretének csökkentése az áteresztett fény mennyiségének csökkenéséhez vezet, növeli a zajszintet, és végső soron érvénytelenítheti a kontraszt előnyeit. Felmerül tehát a kérdés a rekesznyílás méretének optimális megválasztása és az ésszerű kompromisszum.
Az Airy foltnál kisebb lyukméretű rekesz egyszerűen intenzitásvesztést eredményez, és nincs hatással a felbontásra. Az egypontos Airy rekesz lehetővé teszi az objektív felbontóképességének maximális kihasználását. Azonban az Airy foltnál körülbelül 3-5-ször nagyobb nyílásméretű membrán tűnik a legalkalmasabb kompromisszumnak. Meg kell érteni, hogy az itt tárgyalt méret a kép méretére vonatkozik a tárgysíkban, ezért a rekesznyílás tényleges mérete a lencse nagyításától függ. Pontosabban, ha 100x-os objektívet használ, az 1 mm-es rekesznyílás a tárgysíkba 10 µm sugarú körbe fog belevetülni.
A konfokális mikroszkópia ötletének kidolgozása egy konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (KJICM) kifejlesztése volt, amelyet az érzékenyebb és metrológiailag szigorúbb módszerek szükségessége okozott a megfigyelt objektumok alakjának és térszerkezetének elemzésére. A CLSM sematikus diagramja a fő funkcionális csatlakozásokkal az ábrán látható. 7.29.
A CLSM fő jellemzője a vizsgált objektum nagy felbontású és alacsony zajszintű rétegről rétegre történő leképezésének lehetősége. Ezt úgy érik el, hogy lépésről lépésre pásztázzák a tárgyat egy koherens forrásból származó fókuszált fénysugárral, vagy speciális fluoreszcens szondák és speciális fényáram-korlátozási módszerek segítségével mozgatják a színpadot.
Rizs. 7.29. A KJICM blokkdiagramja:
1 - szkennelő asztal; 2 - vizsgálati minta; 3, 6 - lencsék; 4 - lapolvasó eszköz; 5 - gerendaosztó lemez; 7, 9 - tűmembránok; 8 - sugárzás vevő; 10 - lézer; 11 - Vezérlőblokk; 12 - számítógép; 13 - tengely pásztázó meghajtó z.
A CLSM-ben a lyukmembrán használata, amelynek méretei összhangban vannak a mikroszkóp nagyításával és hullámhosszával, lehetővé teszi a felbontás több mint 10%-os növelését. Nyilvánvaló, hogy a CLSM felbontása és ennek megfelelően a finom struktúrák elemzési képessége legfeljebb 40%-kal haladhatja meg a hagyományos mikroszkóp hasonló képességeit a minta vékony nyalábbal történő pásztázása esetén. A KLCM felbontása a mikroszkópos módszertől és a megvilágítástól függ. A KLCM felbontást meghatároztuk optikai rendszer és elektronikus út egyaránt információ feldolgozás. Ezért a KLCM tervezésénél össze kell hangolni annak áramköreit, paramétereit, mint az optikai rendszer felbontása, letapogatási lépése, a detektor karakterisztikája, és ki kell választani az optimális feldolgozási algoritmusokat és a megfelelő szoftvert.
Általában a KLCM mélységélessége a rekesznyílástól, a hullámhossztól, a fényforrások koherenciájától és a tűmembrán méretétől függ. A tűmembrán a fő tervezési elem, amely megkülönbözteti a KLCM-et más típusú mikroszkópoktól. A tűmembránokat úgy alakították ki, hogy feltételeket teremtsenek a képalkotási síkba olyan pontokról érkező fény maximális vagy teljes szűréséhez, amelyek nem esnek egybe a fókuszsíkkal, vagy a tárgy elemzett eleme mellett helyezkednek el a fókuszsíkban.
Az optimális tűmembrán-átmérő kiválasztása fontos a készülék szükséges jellemzőinek eléréséhez. A KJICM oldalirányú felbontásának és mélységélességének becslésére vonatkozó összefüggéseket abból a feltételezésből kapjuk, hogy a tűmembrán kicsi apertúrájú, mivel egy fénypont. A valóságban a tűmembrán mérete véges, és ettől függ az eszköz keresztirányú felbontása és a minta megvilágított elemeinek fényereje, a fókuszsíkhoz képest a tengely mentén eltolva. z,és mélységélesség. Kis tűmembrán átmérővel a fényáram alacsony lesz, ami csökkenti a jel-zaj arányt és a kontrasztot. Nagyobb átmérőnél a tűmembrán hatékonysága csökken a rekesznyílás csökkentésével.
Alapkoncepció
Konfokális pont érzékelő elve a minszki szabadalomból
A konfokális mikroszkóp elvét 1957-ben szabadalmaztatta Marvin Minsky, és célja a hagyományos, széles látómezős fluoreszcens mikroszkópok korlátainak leküzdése. A hagyományos (azaz széles látóterű) fluoreszcens mikroszkópban a teljes mintát egyenletesen elárasztják a fényforrásból származó fénnyel. Az optikai úton lévő minta minden részét egyidejűleg gerjesztik, és a keletkező fluoreszcenciát fotodetektoros mikroszkóp vagy kamerák segítségével detektálják, beleértve a nagy, életlen háttérrészt is. Ezzel szemben a konfokális mikroszkóp egy megvilágítási pontot (lásd a pontszórási funkciót) és a detektor elején egy optikailag csatolt síkban egy apró lyukat használ a jel defókuszálására – a „konfokális” elnevezés ebből a konfigurációból származik. Ha a fluoreszcencia által a fókuszsíkhoz nagyon közel kibocsátott fény észlelhető, az optikai felbontású kép, különösen a minta mélységi irányában, sokkal jobb, mint a széles látóterű mikroszkópoké. Mivel azonban a mintából származó fluoreszcens fény nagy részét a defekt blokkolja, ez a megnövekedett felbontás a jelintenzitás csökkenése rovására megy – ezért gyakran hosszú expozícióra van szükség. Ennek a jelcsökkenésnek a kompenzálására szúrás A fényintenzitást egy érzékeny detektor, általában egy fotosokszorozó cső (PMT) vagy egy lavina fotodióda segítségével érzékeli, amely a fényjelet elektromos jellé alakítja, amelyet számítógép rögzít.
Ha a mintában egyszerre csak egy pont van megvilágítva, 2D vagy 3D képeket kell beolvasni egy szabályos raszteren (azaz párhuzamos letapogatási vonalak téglalap alakú mintáján) a mintában. A sugarat egy vagy több (szervovezérlésű) oszcilláló tükör segítségével vízszintes síkban pásztázzák a mintán. Ennek a szkennelési módszernek általában alacsony a reakciókésleltetése, és a pásztázási sebesség változtatható. A lassú pásztázás jobb jel-zaj arányt biztosít, ami jobb kontrasztot és nagyobb felbontást eredményez.
Az elérhető fókuszsík vastagságot elsősorban a felhasznált fény hullámhossza határozza meg, osztva az adott lencse numerikus apertúrájával, de a minta optikai tulajdonságai is. A finom optikai metszetek az ilyen típusú mikroszkópokat különösen alkalmassá teszik a minták 3D-s képalkotására és felületi profilozására.
Az egymást követő szeletek egy "Z-stack"-et alkotnak, amelyet vagy bizonyos szoftverek feldolgozhatnak 3D-s kép létrehozásához, vagy 2D-s veremmé kombinálják (elsősorban a maximális pixelintenzitást veszik figyelembe; más gyakori módszerek közé tartozik a szabvány használata eltérés vagy pixelhalmozás).
A konfokális mikroszkópia lehetővé teszi az érintetlen, kövér és élő minták közvetlen, nem invazív, soros optikai metszését minimális minta-előkészítés mellett, és az oldalsó felbontás kismértékű javulását. A biológiai mintákat gyakran fluoreszcens festékekkel kezelik, hogy láthatóvá tegyék a kiválasztott objektumokat. A tényleges festékkoncentráció azonban alacsonyan tartható a biológiai rendszerek megzavarásának minimalizálása érdekében: egyes műszerek képesek nyomon követni az egyes fluoreszcens molekulákat. Ezenkívül a transzgenikus technikák olyan organizmusokat hozhatnak létre, amelyek saját kiméra fluoreszcens molekulákat termelnek (például GFP, zöld fluoreszcens fehérje fúziója egy érdekes fehérjével). A konfokális mikroszkópok a mintában történő pontgerjesztés (a diffrakció a pontra korlátozódik) és a kapott fluoreszcens jelpont detektálása elvén működnek. A detektoron lévő lyuk fizikai akadályt képez, amely blokkolja a fókuszon kívüli fluoreszcenciát. Csak a fókusz vagy az Airy lemez központi pontja kerül rögzítésre. A minta raszteres pásztázása egyetlen ponton, miközben lehetővé teszi vékony optikai metszetek összegyűjtését a Z-fókusz egyszerű megváltoztatásával. Az eredményül kapott képeket egymásra lehet helyezni, így 3D-s képet készíthetünk a mintáról.
Vízszintes szkenneléshez használt módszerek
Négyféle konfokális mikroszkóp kapható a kereskedelemben:
A konfokális lézeres pásztázó mikroszkópok több tükröt használnak (általában 2 vagy 3 pásztázást lineárisan az x- és y-tengely mentén), hogy a lézert a mintára pásztázzák, és a képet egy rögzített tűlyukon és detektoron keresztül „leszkenneljék”.
Előnyök
A CLSM-et széles körben használják számos biológiai tudományágban, a sejtbiológiától és genetikától a mikrobiológiáig és a fejlődésbiológiáig. A kvantumoptikában és a nanokristályos képalkotásban és spektroszkópiában is használják.
Biológia és orvostudomány
Példa konfokális mikroszkópos képek halmazára, amely az aktin filamentumok sejten belüli eloszlását mutatja.
Klinikailag a CLSM-et különféle szembetegségek értékelésére használják, és különösen hasznos a szaruhártya endothel sejtek képalkotó, kvalitatív elemzése és mennyiségi meghatározására. Keratomycosis esetén a szaruhártya stromában található fonalas gombaelemek lokalizálására és azonosítására használják, lehetővé téve a gyors diagnózist és ezáltal a végleges terápia korai felállítását. Az endoszkópos eljárások (endomikroszkópia) CLSM technikáival kapcsolatos kutatások szintén ígéretesek. A gyógyszeriparban javasolták a vékony gyógyszerfilm formák gyártási folyamatának figyelemmel kísérését a gyógyszerelosztás minőségének és egységességének ellenőrzése érdekében.
Optika és krisztallográfia
A CLSM-et adatvisszakereső mechanizmusként használják egyes 3D optikai adattároló rendszerekben, és segített meghatározni a Magdolna papirusz korát.
Lehetőségek és fejlesztés
Javított axiális felbontás
A pontszórás függvény egy pontellipszoid, többszörös olyan hosszú, mint amennyi széles. Ez korlátozza a mikroszkóp tengelyirányú felbontását. Ennek leküzdésének egyik módja a 4π-mikroszkópia, ahol a beeső és kibocsátott fény, vagy interferálhat a minta tetejével és aljával is, hogy csökkentse az ellipszoid térfogatát. Alternatív technika konfokális mikroszkópos théta. Ennél a technikánál a megvilágító fénykúp és az érzékelőfény szöget zár be egymással (a legjobb eredmény akkor, ha merőleges). Két hendikepfüggvény metszéspontja sokkal kisebb effektív mintamennyiséget ad. Ebből fejlődött ki az egysíkú megvilágító mikroszkóp. Ezenkívül a dekonvolúció használható egy kísérletileg származtatott pontszórási függvény segítségével a fókuszon kívüli fény eltávolítására, javítva a kontrasztot mind az axiális, mind az oldalsó síkban.
Szuper felbontás
Vannak olyan konfokális változatok, amelyek a diffrakciós határ alatti felbontást érik el, ilyen például a stimulált emissziós kimerülési mikroszkóp (STED). Ezen a technikán kívül számos egyéb (nem konfokális alapú) szuperfelbontású technika áll rendelkezésre, mint például tenyér, (e)STORM, SIM-kártya stb. Mindegyiknek megvannak a maga előnyei, mint például a könnyű használat, a felbontás és a speciális felszerelés, puffer vagy fluorofor szükségessége.
Alacsony hőmérsékletű teljesítmény
A minták alacsony hőmérsékleten történő leképezésére két fő megközelítést alkalmaztak, mindkettő lézeres pásztázó konfokális mikroszkópián alapuló architektúrát. Az egyik megközelítés a folyamatos áramlású kriosztát használata: csak a mintát tartják alacsony hőmérsékleten, és optikailag egy átlátszó ablakon keresztül irányítják. Egy másik lehetséges megközelítés az optika egy részét (különösen egy objektív mikroszkópot) egy kriogén tároló Dewar-lombikba helyezni. Ez a második megközelítés, bár körülményesebb, jobb mechanikai stabilitást garantál, és elkerüli az ablak miatti veszteségeket.
Képek
Egy 1 eurós érme felületének részleges profilja, Nipkow korongkonfokális mikroszkóppal mérve.
Az 1 eurós érme adatainak tükrözése.
sztori
Kezdete: 1940-1957
Első konfokális szkennelés A mikroszkópot Marvin Minskow építette 1955-ben, a szabadalmat pedig 1957-ben nyújtották be. A fókuszsík megvilágítási pontjának letapogatását a színpad mozgatásával sikerült elérni. Tudományos publikációt nem mutattak be, és az erről készült képeket sem őrizték meg.
Tandem pásztázó mikroszkóp
A Petran-féle tandem pásztázó mikroszkóp vázlata. A Nipkow lemez jelzésére piros sáv került hozzáadásra.
1960-ban a Pilsen-i Károly Egyetem csehszlovák Mojmir Petran Orvostudományi Kara kifejlesztette a Tandem pásztázó mikroszkópot, az első kereskedelmi forgalomba hozott konfokális mikroszkópot. A Tracor-North (később NORAN) eladta egy kis cégnek Csehszlovákiában és az Egyesült Államokban, és egy forgó Nipkow-korongot használt, hogy több mikrolyuk-gerjesztést és kibocsátást generáljon.
A csehszlovák szabadalmat Petran és Milan Hadravský csehszlovák kollégája nyújtotta be 1966-ban. Az első tudományos publikáció ezzel a mikroszkóppal nyert adatokkal és képekkel a Science folyóiratban jelent meg 1967-ben, szerzője M. David Egger, a Yale Egyetem és Petran. A cikkhez fűzött lábjegyzet megemlíti, hogy Petran tervezte a mikroszkópot és felügyelte az építését, és részben a Yale Egyetem "kutatója" volt. A második, 1968-as kiadás a hangszer elméletét és műszaki részleteit ismertette, további szerzőként pedig Hadravskýt és Robert Galambost, a Yale Egyetem csoportvezetőjét. Egy amerikai szabadalmat 1970-ben adtak ki. 1967-ben nyújtották be.
1969: Az első konfokális lézeres pásztázó mikroszkóp
1969-ben és 1971-ben M. David Egger és Paul Davidovits a Yale Egyetemről két tanulmányt publikáltak az első konfokálisról. lézer pásztázó mikroszkóp. Ez egy szkenner spot volt, ami azt jelenti, hogy csak egy spot megvilágítás jött létre. Epi-illuminációs-reflexiós mikroszkópiát használ az idegszövet megfigyelésére. Egy 5 mW-os, 633 nm hullámhosszú hélium-neon lézer egy áttetsző tükör fényét verte vissza a cél felé. A cél egy egyszerű, 8,5 mm-es gyújtótávolságú objektív volt. Az összes korábbi és legújabb rendszerrel ellentétben a mintát ennek az objektívnek (a szkennelési célpont) mozgatásával vizsgálták, ami a fókuszpont elmozdulását okozza. A visszavert fény visszakerült az áttetsző tükörbe, az áteresztett részt egy másik lencsével irányították a pontérzékelésre, amely mögé került a fotosokszorozó cső. A jelet CRT oszcilloszkóp segítségével vizualizáltuk, az elektronsugarat egyidejűleg továbbítottuk a célpontra. Egy speciális eszköz lehetővé tette Polaroid fényképek készítését, amelyek közül három szerepelt egy 1971-es kiadványban.
A szerzők fluoreszcens festékekre gondolnak in vivo vizsgálatokhoz. A Minsky-szabadalmat idézik, köszönhetően Steve Baernek, aki akkoriban doktorandusz volt a New York-i Albert Einstein Orvostudományi Iskolában, ahol konfokális vonalpásztázó mikroszkópot fejlesztett ki, aki lézer használatát javasolta "Minsky mikroszkóppal" és köszönetet mondott. Galambosnak, Hadravskynak és Petrannak a mikroszkópja kifejlesztéséhez vezető megbeszélésekért. Fejlesztésük motivációja az volt, hogy a tandem pásztázó mikroszkópiában a megvilágító fénynek csak a 10-7 hányadrésze vesz részt a kép létrehozásában a szem egy részén. Így a képminőség nem volt elegendő a legtöbb biológiai vizsgálathoz.
1977-1985: Spot szkennerek lézerrel és jelenetszkenneléssel
1977-ben Colin JR Sheppard és Tony Wilson konfokális epilézerrel megvilágított, pásztázó fokozatú és fénysokszorozó csöves detektorokat írt le. A tárgyasztal az optikai tengely (Z-tengely) mentén mozgatható, lehetővé téve az optikai soros szakaszokat.
1979-ben Fred Brakenhoff és munkatársai kimutatták, hogy az optikai metszet és a jobb felbontás elméleti előnyei a gyakorlatban is elérhetőek. 1985-ben ez a csoport volt az első, aki olyan lenyűgöző konfokális mikroszkópos képeket tett közzé, amelyek biológiai kérdésekre adhattak választ. Nem sokkal ezután több csoport kezdte használni a konfokális mikroszkópot, hogy megválaszolja azokat a tudományos kérdéseket, amelyek a technológiai korlátok miatt továbbra is rejtélyek maradtak.
1983-ban az oxfordi IJ Cox és S. Sheppard kiadta az első munkát a számítógéppel vezérelt konfokális mikroszkópról. Az első kereskedelmi forgalomban kapható lézeres pásztázó mikroszkóp, a SOM-25 színpadi szkennert az Oxford Optoelectronics kínálta (a BioRad több TAKE-keret beszerzését követően) 1982-től. Az Oxford csoport tervei alapján készült.
1985 óta: Lézeres pontszkennerek sugárszkenneléssel
Az 1980-as évek közepén William Bradshaw Amos és John Graham White, valamint kollégái a Cambridge-i Molekuláris Biológiai Laboratóriumban megépítették az első konfokális nyaláb pásztázó mikroszkópot. A mintafelület nem mozdul, ehelyett megvilágítja a helyet, ami gyorsabb képfelvételt tesz lehetővé: másodpercenként négy kép, egyenként 512 sorral. A közbülső képek erősen eltúlzottak, mivel a sugárút 1-2 méter hosszú, ami lehetővé teszi a hagyományos írisz diafragma használatát "tűlyukként", ~1 mm átmérőjű. Az első mikrofelvételek hosszan tartó filmezéssel készültek a digitális fényképezőgép hozzáadása előtt. A további fejlesztések lehetővé tették először a felkészülést. A Zeiss nagyjából ugyanebben az időben vezetett a svéd Sarastro cég által forgalmazott kereskedelmi CLSM-hez. A vállalkozást 1990-ben vásárolta fel a Molecular Dynamics, de a CLSM végül megszűnt. Németországban az 1984-ben alapított Heidelberg Instruments kifejlesztette a CLSM-et, amelyet eredetileg ipari alkalmazásokra szántak, nem pedig biológiára. Ezt a dokumentumot 1990-ben adták át a Leica Lasertechniknak. A Zeiss már nem konfokális repülő spot lézeres pásztázó mikroszkóp volt a piacon, amelyet konfokálisra frissítettek. Az 1990-es jelentés megjegyezte "néhány" gyártó konfokális termékét: Sarastro, Technical Instruments, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic és Zeiss.
1989-ben Fritz Karl Preikschat fiával, Ekhard Preikschattal feltalálta a lézerdióda pásztázó mikroszkópot a részecskeméret-elemzéshez. Ő és Ekhard Preikschat társalapítója a Lasentecnek, hogy kereskedelmi forgalomba kerüljön. 2001-ben a Lasentecet felvásárolta a Mettler Toledo (NYSE: MPD). Körülbelül tízezer rendszert telepítettek világszerte, főként a gyógyszeriparban a kristályosodási folyamat in situ szabályozására nagy tisztítórendszerekben.
- Kétfotonos gerjesztési mikroszkóp: Bár megfelelő technológiát alkalmaznak (mindkét lézeres pásztázó mikroszkóp), a többfoton fluoreszcens mikroszkópok nem szigorúan konfokális mikroszkópok. Term konfokális jelenléte miatt keletkezik nyílás V konjugált fókuszsík(konfokális). Ez a membrán általában hiányzik a többfoton mikroszkópokból.
- Teljes belső reflexiós fluoreszcens mikroszkóp (TIRF) o
konfokális mikroszkópia- Virtuális CLSM (Java alapú)
- Animáció és magyarázat különböző típusú mikroszkópokon, beleértve a fluoreszcens és konfokális mikroszkópokat. (Université Paris Sud)
Alapfogalmak
Bár a modern műszerek jelentősen eltérnek a legkorábbi verzióktól, a Marvin Minsky által úttörő és 1957-ben szabadalmaztatott konfokális képalkotási elvet minden modern konfokális mikroszkópban alkalmazzák. A hagyományos széles látószögű mikroszkópokban a teljes mintát higany vagy xenon fényforrás világítja meg, és a képet vagy vizuálisan figyelik, vagy képrögzítőre vagy fényképező filmre vetítik. A konfokális mikroszkópos képalkotás módja alapvetően más. A megvilágítás úgy valósul meg, hogy a minta teljes felületét egy vagy több fókuszált fénysugárral pásztázzák, általában lézerívforrásból. A minta megvilágított területét egy lencse fókuszálja, majd egy számítógép által vezérelt lapolvasó eszközzel szkenneli. A mintából származó fénysugarak sorozatát egy lyukmembránon (vagy bizonyos esetekben egy résrekeszen) keresztül érzékeli egy fotosokszorozócső (PMT), amelynek kimenetét számítógépen megjelenített képpé alakítják. Bár a festetlen minták a róluk visszaverődő fény hatására megfigyelhetők, általában egy vagy több fluoreszcens festékkel vannak megjelölve.
Képszerzési módszerek
A konfokális mikroszkópia különféle képalkotó technikákat használ számos különböző típusú minta vizsgálatára. Mindegyik azon a műszaki lehetőségen alapszik, hogy nagy felbontású képeket, úgynevezett optikai részeket kapjunk viszonylag vastag szakaszok sorozatában vagy a teljes mintában (teljes rögzítésben). Az optikai szelet a kép alapeleme. Magukat a képeket a kötött és festett minták egy-, két-, három- és többhullámhosszú megvilágítási módban történő megfigyelésével kapjuk, és a különböző megvilágítási és festési technikákkal előállított képeket pontosan korreláljuk egymással. Lehetőség van élő sejt képeinek és időlegesen kibontott képsorozatának beszerzésére (a képek egy adott időintervallumban történő regisztrálása), a képsorokra alkalmazott numerikus feldolgozási módszerek pedig lehetővé teszik egy integrált teljes kép létrehozását z-sorozatból. tengelyes képek és minták háromdimenziós képei, valamint háromdimenziós adatok időbeli sorrendben történő megjelenítése, azaz négydimenziós kép. A korai konfokális mikroszkópok visszavert fénnyel készültek, de valójában a lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp bármilyen, a mikroszkópiában általánosan használt áteresztő fényforrással is használható.
Kép létrehozása
A konfokális mikroszkóppal végzett minta-előkészítési és képalkotási eljárások lényegében azok, amelyeket az évek során a hagyományos széles látómezős mikroszkópban fejlesztettek ki. A biomedicinában a konfokális mikroszkópia fő alkalmazása a kötött vagy élő sejtek és szövetek képalkotása, amelyeket jellemzően egy vagy több fluoreszcens címkével festenek meg. Számos különböző fluoreszcens festék létezik, amelyek viszonylag egyszerű protokollokba építhetők be, és specifikus sejtszervecskék és -struktúrák megfestésére használhatók. A rendelkezésre álló színezékek hatalmas választéka között megtalálhatók például a sejtmag, a Golgi-készülék, az endoplazmatikus retikulum, a mitokondriumok színezékei, valamint olyan festékek, mint a fluoreszcens falloidin, amely a sejtekben polimerizált aktint jelzi. Az alkalmazott minta-előkészítési módszertől függetlenül a konfokális mikroszkópia fő előnye a képmegjelenítés és -elemzés rugalmassága, amely több kép egyidejű beszerzéséből és azok számítógépen történő digitális megjelenítéséből adódik.
A konfokális mikroszkópia kritikus szempontjai
A fluoreszcens mikroszkópos kvantitatív 3D-s képalkotást gyakran bonyolítják a minta-előkészítés során fellépő műtermékek az ellenőrzött és ellenőrizetlen kísérleti mennyiségek vagy a mikroszkóp pozicionálási és elrendezési problémái miatt. Ez a cikk, amelyet Dr. James B. Pauley írt, rendszerezi a leggyakoribb külső tényezőket, amelyek gyakran elfedik a széles látóterű fluoreszcenciával és konfokális mikroszkóppal kapott eredményeket. A megvitatott témák közé tartozik a lézerrendszer, az optikai alkatrészek igazítása, az objektív nagyítása, a fehérítő műtermékek, aberrációk, az immerziós olaj, a fedőlemez vastagsága, a kvantumhatékonyság és a mintakörnyezet.
Aberrációk többszínű konfokális mikroszkópban
A tervezési fejlesztések olyan mértékben leegyszerűsítették a konfokális mikroszkópot, hogy a sejtbiológiai kutatások általános eszközévé vált. De ahogy a konfokális mikroszkópok erősebbek lettek, egyre nagyobb követelményeket támasztanak az optikával szemben. Valójában az optikai aberrációk, amelyek kisebb képhibákat okoznak a széles látószögű mikroszkópiában, pusztító hatással lehetnek a konfokális mikroszkópiában. Sajnos a konfokális mikroszkópia szigorú optikai követelményeit gyakran elfedik az olyan optikai rendszerek, amelyek még gyenge mikroszkóp mellett is éles képeket garantálnak. Az optikai gyártók számos különféle mikroszkóp lencsét gyártanak, amelyeket speciális alkalmazásokhoz terveztek. Ez a cikk bemutatja, hogy az objektív kompromisszumok hogyan befolyásolják a konfokális mikroszkópot.
Háromszínű képalkotás konfokális mikroszkóppal
A lézeres pásztázó konfokális mikroszkópot (LSCM) általában egy, kettő és három címkével ellátott fluoreszcens minták digitális képeinek készítésére használják. A vörös, zöld és kék (RGB) színek használata a leginformatívabb legfeljebb három fluoreszkáló cella fényeloszlásának ábrázolásához, ha minden relatív pozícióhoz egy kiegészítő színt használnak, és ha a különböző színű képek egyetlen három- színes minta. Ebben a részben egy nemrégiben közzétett módszer egyszerűsített változatát tekintjük meg háromszínű konfokális képek előállítására a népszerű képfeldolgozó program, az Adobe Photoshop segítségével. Ezenkívül számos olyan alkalmazást tárgyalnak, amelyek háromszínű képalkotó protokollt hozhatnak létre konfokális képmegjelenítéshez. Érdemes szem előtt tartani, hogy ezek a numerikus módszerek nem korlátozódnak az LSCM-képekre, hanem más forrásokból a Photoshopba importált digitális képekre is alkalmazhatók.
A konfokális reflexiós mikroszkópia alapjai
A konfokális reflexiós mikroszkóppal viszonylag kis ráfordítással további információkat lehet szerezni a mintáról, mivel a technikák minimális minta-előkészítést és berendezéscserét igényelnek. Ezenkívül a konfokális reflexiós mikroszkóppal a festetlen szövetekből származó információ ugyanolyan könnyen elérhető, mint a fényt visszaverő festett mintákból nyert adatok. Ez a módszer kombinálható a gyakoribb fluoreszcens képalkotási technikákkal is. A közelmúltban alkalmazott alkalmazások példái közé tartozik a festetlen sejtek rögzítése fluoreszcensen festett sejtek populációjában, valamint a fluoreszcensen festett sejtek közötti kölcsönhatások megfigyelése átlátszatlan szerkezetű szubsztrátumon.
Konfokális Képgaléria
A Nikon MicroscopyU konfokális képgaléria digitális képek sorozata, amelyet egy Nikon PCM-2000 konfokális mikroszkóp és egy Eclipse E-600 álló mikroszkóp segítségével készítettek. A minta különböző síkjaiban lévő optikai metszetek képsorozatát a mikroszkóp optikai tengelye mentén történő letapogatással kaptuk. A sorozatot egy interaktív Java-alkalmazás képviseli, amely lehetővé teszi a szeletek sorozatának automatikus „lejátszását”, vagy a diákhoz hasonlóan ide-oda görgetését.
Lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp
Számos technikát fejlesztettek ki a mikroszkóppal általában előállított vastag minták képében rejlő gyenge kontraszt jelenségének leküzdésére. A konfokális és dekonvolúciós technikák lényegesen jobb képeket készítenek közepes vastagságú (5-15 mikron) mintákról. A legvastagabb (20 mikron vagy annál nagyobb) minták képei tönkremennek az életlen területekről érkező erős környezeti fény hatására, és talán legjobban konfokális mikroszkópos technikákkal lehet elkészíteni. Ennek az oktatóanyagnak a segítségével a mintákat optikai metszetek sorozataként mutatjuk be a z tengely mentén virtuális konfokális mikroszkóp segítségével.
Reflexiós konfokális mikroszkópia
Használja ezt az oktatóanyagot az integrált áramkörök egyes felületi rétegeinek felfedezéséhez. Az útmutatást szolgáló digitális képeket Nikon Optiphot C200 reflexiós konfokális mikroszkóppal készítettük. Minden sorozatnál egy optikai metszetsorozatot rögzítettünk a z tengely mentén, ahogy a mikroszkóp mélyen behatolt (1 mikrométeres lépésekben) a szilíciumkristály felületén lévő áramkörök mozaikjába, és ráfókuszált.
Alapvető rendelkezések
A hagyományos mikroszkóppal összehasonlítva a konfokális mikroszkópnak számos előnye van, beleértve a vizsgált mintába való kis behatolási mélységet, a háttérvilágítás hiányát és a vastag minták optikai metszete sorozatának készítését. A biomedicinában a konfokális mikroszkópia fő alkalmazása a kötött vagy élő sejtek és szövetek képalkotása, amelyek jellemzően egy vagy több fluoreszcens címkével vannak megjelölve.
Rizs. 1. A sugárút vázlata konfokális mikroszkópiában
A fluoreszcens minták hagyományos, széles látóterű mikroszkóppal történő leképezésekor a minta által a vizsgálaton kívül eső területekről kibocsátott másodlagos lumineszcencia gyakran befolyásolja a fókuszban lévő elemek képének tisztaságát. Ez különösen problémás a 2 mikrométernél nagyobb vastagságú minták esetében. A konfokális mikroszkópia szerény javulást biztosít mind az axiális, mind a síkbeli felbontásban; Ennek a kutatási módszernek a népszerűsége a közelmúltban azonban a fluoreszcensen festett, nagy vastagságú mintákban előforduló háttérfény megszüntetésének képessége okozta. Viszonylag könnyen kezelhető, ezért a legtöbb modern konfokális mikroszkóp sok többfelhasználós képalkotó rendszer alapfelszerelésének részévé vált. Mivel a lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp (LSCM) felbontása valamivel jobb, mint a hagyományos széles látómezős optikai mikroszkópé, de még mindig lényegesen alacsonyabb, mint egy transzmissziós elektronmikroszkópé, bizonyos értelemben híd lett a két leggyakoribb kutatási módszer. Az 1. ábra a fény áthaladásának sematikus diagramját mutatja egy alapkonfigurációjú konfokális mikroszkópban.
A hagyományos, széles látószögű mikroszkópokban a teljes mintát higany- vagy xenon fényforrással világítják meg, és a képet vagy vizuálisan figyelik meg, vagy egy képalkotóra vagy fotófilmre vetítik. A konfokális mikroszkóppal történő képkészítés módja alapvetően más. A mintát egy vagy több fókuszált nyalábbal, általában lézerrel történő letapogatással világítják meg (2. ábra). A minta letapogatásával kapott képeket ezért optikai metszeteknek nevezzük. Ez a terminológia egy nem invazív vizsgálati technikára utal, amelyben a képeket fókuszált fénnyel készítik, nem pedig a minta fizikai szétvágásával.
Rizs. 2. A minták széles látószögű és pontszerű szkennelése
A konfokális mikroszkópia nagymértékben leegyszerűsítette az élő példányok vizsgálatát, lehetővé téve a három dimenzióban (z-sorozat) történő adatgyűjtést, és javítva a többszörösen festett minták képalkotási folyamatát. A 3. ábra egy hagyományos episzkopikus fluoreszcenciás képet hasonlít össze egy propidium-jodiddal festett epitéliummal rendelkező pillangó báb ugyanazon szakaszainak konfokális képével. Az LSCM-képen a felbontás és ennek következtében az atommagok képének élessége nyilvánvaló, a fókuszon kívüli fluoreszcens emisszió kiküszöbölése miatt.
Lézer pásztázó konfokális mikroszkóp (LSCM)
Az LSCM ma a biomedicinában használt konfokális mikroszkópok leggyakoribb változata. A bevezetőben kiemelt figyelmet szentelünk az LSCM-nek, mivel ezeknek a mikroszkópoknak a kialakítása és felépítése lehetővé teszi, hogy még a kezdő felhasználók is dolgozhassanak velük. Más tervezési megoldások elfoglalták a maguk különleges réseit a biológiában. A konfokális mikroszkóp bármely modelljére vagy módosítására a minta-előkészítésre vonatkozó szabályok többsége érvényes, kisebb módosításokkal, csakúgy, mint az optikai metszésen alapuló egyéb technikák, például a dekonvolúciós és a többfoton technikák.
A konfokális mikroszkópia fejlesztése
A konfokális mikroszkóp feltalálása Marvin Minsky nevéhez fűződik, aki 1955-ben megalkotta a működő mikroszkópot. A konfokális mikroszkópia fejlesztését nagyrészt az élő szövetekben (in vivo) zajló biológiai folyamatok megfigyelésének vágya vezérelte, Minsky célja pedig az volt, hogy leképezzék az ideghálózatot egy élő agy festetlen preparátumában. A Minsky által úttörő és 1957-ben szabadalmaztatott konfokális mikroszkóp elveit minden modern konfokális mikroszkópban alkalmazzák. Az 1. ábra bemutatja a konfokális elvet az epifluoreszcens mikroszkópiában, amely a fluoreszcens képalkotásban használt összes modern konfokális rendszer alapját képezi. Az eredeti konfigurációban Minsky egy tűlyukat (membránt) használt a cirkónium íves fényforrással szemben, amelyet lyukfényforrásként használtak.
Rizs. 3. Pillangószárny hám
A pontforrásból származó fényt egy lencse pont formájában fókuszálta egy adott fókuszsíkra a mintában, és az azon áthaladva egy második lencsével egy második tűlyukra (pinhole) fókuszált, amely fókuszban volt a mintában. először (kofokálisak voltak, azaz konfokálisak). A második tűlyukon áthaladó sugarak egy alacsony zajszintű fotosokszorozó csövet találtak el, amely a mintából érkező fény fényerősségétől függően jelet generált. Egy második tűlyuk levágta a fénysokszorozó csőből származó mintában a fókuszsík feletti vagy alatti területekről érkező fényt. A konfokális mikroszkópia egyik alapelve a térbeli szűrés alkalmazása a fókuszon kívüli fény és a becsillanás kiküszöbölésére, ha a fókuszsíknál vastagabb mintákkal dolgozunk. Minsky művében egy lencsés, dikromatikus tükörrel ellátott reflexiós mikroszkópot is leírt, amelynek kialakítása a ma használatos rendszerek alapja lett.
Konfokális kép készítéséhez a mintát egy pontra fókuszált fénnyel kell pásztázni. Az eredeti, Minsky által összeállított készülékben a fénysugár álló helyzetben volt, és maga a minta egy vibrációs színpadon mozgott. A pásztázó nyaláb mozdulatlansága a mikroszkóp optikai tengelyéhez képest ennek a telepítésnek az előnye volt, mivel kiküszöbölte a legtöbb optikai hibát, amely torzíthatta a képet. A biológiai minták tanulmányozása során azonban ez ingadozásokat és torzulásokat okozhat, ami végső soron a felbontás és a kép tisztaságának elvesztéséhez vezethet. Ezenkívül a tárgyasztal és a minta mozgatásakor lehetetlen bármilyen manipulációt végrehajtani, például fluoreszcensen festett sejtek mikroinjekcióját.
De a minta szkennelésének módjától függetlenül meg kell szerezni a képét. Minsky eredeti terve pedig nem produkált valódi képet, mert a fénysokszorozó cső kimenetét a katonaság által használt tartós oszcilloszkópba táplálták, amelyben nem volt rögzítő. Minsky később azt írta, hogy képeinek elsöprő minősége nem magának a mikroszkópnak, hanem az oszcilloszkóp kijelzőjének alacsony felbontásának köszönhető. Ma már világos, hogy a technológia hiánya miatt Minsky nem tudta teljes mértékben bemutatni a konfokális módszerben rejlő lehetőségeket, különösen a biológiai struktúrák leképezésekor. Felhívta a figyelmet arra, hogy ez lehet az oka annak, hogy a konfokális mikroszkópiát nem fogadta el azonnal a nagyon igényes biológus közösség, amely számára mindig az elkészült képek minősége volt az elsődleges. Abban az időben kiváló optikájú fénymikroszkópok álltak rendelkezésükre, amelyek lehetővé tették az élénk színű szövettani metszetek megfigyelését és fényképezését rendkívül érzékeny színes filmeken. A modern konfokális mikroszkópokban a képeket fotosokszorozócsőből vagy digitális töltéscsatolt készülékkel rögzített jelekből állítják elő, közvetlenül számítógépes képalkotó rendszerrel dolgozzák fel, és nagy felbontású képernyőn és kiváló minőségű képdokumentációs eszközön jelenítik meg. Egy modern lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp diagramja a 4. ábrán látható.
Rizs. 4. Modern lézer pásztázó konfokális mikroszkóp vázlata
Az optikai mikroszkóp alapvető optikája évtizedek óta nem változott alapvetően, hiszen a műszer végső felbontását a hullámhossz, az objektívlencse és magának a mintának a tulajdonságai határozzák meg. A minták kontrasztjának fokozására használt festékek és más optikai mikroszkópos technikák jelentősen javultak az elmúlt 20 évben. A konfokális módszer térnyerése és továbbfejlesztése az optikai mikroszkópia újjáéledésének következménye volt, amelyet nagyrészt a modern technológiák sikere idézett elő. Számos technológiai fejlesztés, amely a Minsky tervezésének hasznára válhatott, fokozatosan elérhetővé (és megfizethetővé) válik a biológusok és más mikroszkóposok számára. Többek között továbbfejlesztett pontfényforrásként használt stabil többfrekvenciás lézerek, továbbfejlesztett dikromatikus tükrök, érzékeny alacsony zajszintű fotodetektorok, nagy sebességű mikroszámítógépek továbbfejlesztett képességekkel (a nagy kapacitású memória elérhetősége miatt), kifinomult képalkotó szoftverek, nagy felbontású monitorok és digitális nyomtatók.Ezek a technológiák egymástól függetlenül fejlődtek, és 1955 óta fokozatosan integrálódnak a konfokális képalkotó rendszerekbe. Például a digitális képfeldolgozási technikákat először az 1980-as évek elején alkalmazták sikeresen a Woods Hole Oceanográfiai Intézet kutatói. Az általuk „videómikroszkópoknak” nevezett mikrocsövek sejtszerkezetéről egy optikai mikroszkóp elméleti felbontási határánál kisebb képeket tudtak készíteni. A felbontás látszólagos növekedését a digitális képfeldolgozó processzorral összekapcsolt, nagy érzékenységű szuperszilícium (SIT) videokamerával rögzített képek digitális optimalizálása teszi lehetővé. A sejtszerkezeteket differenciális interferencia-kontraszt (DIC) optika és további digitális képfeldolgozás segítségével vizualizáltuk.
A konfokális mikroszkópok besorolása általában a minta letapogatásának módszerén alapul. Két fő szkennelési módszer létezik: színpadi pásztázás és fénysugár pásztázás; és legalább két módja a sugár pásztázásának. Minsky eredeti hangszere egy primitív hangvilla generátor által hajtott színpadi letapogató rendszeren alapult, amely meglehetősen lassan készített képet. A színpadi szkenneléssel ellátott modern konfokális installációkat, amelyek messze túlmutattak prototípusaikon, főként az anyagtudományban, például mikrokristályok előállításában használják. Az ezen az elven alapuló rendszerek az utóbbi időben népszerűvé váltak az orvosbiológiai területeken, ahol mikrokristályokon végeznek DNS-elemzést.
A biológiai rendszerek leképezésének gyakorlatiasabb alternatívája az álló minta nyalábbal történő pásztázása. Ez az elv számos mérőrendszer alapját képezi, amelyek továbbfejlesztése a mai népszerű kutatómikroszkópok megjelenéséhez vezetett. Ebben a bevezetőben nem térünk ki a konfokális mikroszkópia technikai részleteire, de lényegében két, alapvetően eltérő nyaláb-szkennelési technikát alkalmaz: a többsugaras szkennelést és az egysugaras szkennelést. Az egysugaras szkennelés ma a legelterjedtebb, és ezt a módszert alkalmazzák az LSCM-ben. Itt a sugarat számítógéppel vezérelt tükrök segítségével pásztázzák, amelyeket galvanométerek hajtanak meg másodpercenként egy képkocka sebességgel. A gyorsabb letapogatás elérése érdekében, hozzávetőlegesen a videó képkockasebesség mellett, egyes rendszerek akusztikus-optikai eszközt vagy oszcilláló tükröket használnak. Egy alternatív módszer két sugarat használ a közel valós idejű szkenneléshez, általában egy forgó Nipkow-lemez egy változatát használva. Ezek a rendszerek a tandem pásztázó mikroszkópok (TSM) módosításának és finomításának eredményeként jöttek létre, hogy hatékonyabb modelleket hozzanak létre a fluoreszcensen festett minták leképezésére. Az 5. ábra egy ilyen fejlett rendszert mutat be párosított Nipkow-korongokkal és mikrolencsékkel, amelyek javítják a halvány fluoreszcens emisszióra való érzékenységet a valós idejű képalkotáshoz.
Rizs. 5. Nipkow lemezeken alapuló optikai tervezés
Manapság a konfokális mikroszkópiában két alternatív módszer létezik az optikai metszetek előállítására: a dekonvolúciós módszer és a multifoton. Technikailag különböznek egymástól, de a konfokális módszerekhez hasonlóan a hagyományos optikai mikroszkópián alapulnak. A dekonvolúció számítási algoritmusokon alapul, amelyek kiszámítják és eltávolítják a kép létrehozásakor életlen területekről származó információkat. Ez a technika nagyon kényelmessé vált a hatékony algoritmusok és a nagy teljesítményű miniszámítógépek miatt. A többfoton mikroszkópia ugyanazt a pásztázó rendszert használja, mint az LSCM, de nincs szükség lyukmembránra a vevőben. Nincs rá szükség, hiszen a lézer csak a fókuszpontban gerjeszti a fluorokróm jelet, így kiküszöböli az életlen sugárzást. Élő szövetek megfigyelésekor ennek a módszernek további előnyei vannak, nevezetesen: csökken a fényfehérítés, mivel csökken a lézersugár által továbbított és a minta szövete által elnyelt energia mennyisége.
A hagyományos optikai mikroszkóp az LSCM alapja. Volfrám- vagy higanylámpa helyett lézert használnak, amely egy érzékeny fotosokszorozócsőhöz (PMT) és egy számítógéphez kapcsolódik, amely vezérli a szkennelő tükröt és egyéb szkennelő eszközöket, és megkönnyíti a képek összegyűjtését és megjelenítését. A kapott adatokat digitális adathordozón tároljuk, és számos szoftvercsomag segítségével feldolgozhatjuk, akár magán a rendszer számítógépén, akár máson.
Az LSCM kialakítása szerint a megvilágítás és a jelvétel (regisztráció) a mintán egy diffrakciós határértékkel rendelkező pontra korlátozódik. A mikroszkóp lencséi a megvilágítási pontot fókuszba állítják, a leolvasó készülék pedig ezzel a folttal szkenneli a mintát számítógépes vezérléssel. A minta fényfoltjaiból származó jelek egy lyukon (vagy bizonyos esetekben egy résen) keresztül jutnak be a fénysokszorozó csövébe, és a fénysokszorozó kimeneti jelei képpé alakulnak, és egy számítógép vizuálisan reprodukálja. Bár a festetlen minták megfigyelhetők a mintáról visszaverődő fénnyel, általában egy vagy több fluoreszcens festékkel megfestik őket. Az egyik legelterjedtebb LSCM-et, amelyet a szakirodalom 1990 körül ír le, a biológiai kutatók alapvető problémájára válaszul fejlesztették ki. Az immunfluoreszcensen festett embriókban számos struktúra és egyedi makromolekula nem látható hagyományos epifluoreszcens mikroszkóppal a kétsejtes állapot után, mivel az embrió térfogata a sejtek számának növekedésével megközelítőleg változatlan marad. Ez azt jelenti, hogy a cellák sűrűbb elrendezése esetén a fókuszsíkon kívüli sejtekből származó lumineszcencia növekszik, ami a képfelbontás romlásához vezet.
Rizs. 6. Nikon lézer pásztázó konfokális mikroszkóp konfiguráció
A problémán dolgozó kutatók egy csoportja azt találta, hogy az akkoriban rendelkezésre álló konfokális rendszerek egyike sem felelt meg a követelményeknek. Abban az időben a színpadi pásztázó mikroszkópok túl lassúak voltak. Körülbelül 10 másodpercbe telt egyetlen kép létrehozása, és a többsugaras letapogató műszerek még nem voltak alkalmasak fluoreszcens képalkotásra. Az LSCM-et úgy tervezték meg, hogy megfeleljen a hagyományos epifluoreszcens mikroszkópia követelményeinek, és az egyidejűleg kifejlesztett másokkal együtt a különböző vállalatok által az orvosbiológiai közösség számára jelenleg kínált komplex rendszerek prototípusa lett. Egy ma használatos rendszerre (Nikon E1000) látható a 6. ábra.
A speciálisan kialakított eszközökben az optikai szakaszok vastagsága a fotodetektor előtti lyuk átmérőjének változásával változhat. Más, fix lyukmérettel rendelkező kialakításokhoz képest ez a kiegészítő funkció rendkívül rugalmas biológiai struktúrák leképezésekor. A kép felbontásvesztés nélkül nagyítható a minta beolvasott területének csökkentésével, és a beolvasott információt egy azonos méretű adattömbbe helyezve tárolás és vizuális megjelenítés céljából (pásztázó elektronmikroszkópban a nagyítás hasonló módon változik) . Ez egyetlen objektívnek zoom-intervallumot ad, ami rendkívül hasznos lehet olyan ritka vagy múló események megjelenítésénél, amelyek objektívcsere során kimaradhatnak vagy elveszhetnek.
Az LSCM kifinomult és rugalmas képességeivel, amelyeket most már a kereskedelemben is kínálnak, ésszerű áron, a konfokális mikroszkópia az elmúlt években robbanásszerűen népszerűvé vált, és számos többfelhasználós laboratórium választotta ezt a berendezést az elektronmikroszkóp helyett. A konfokális mikroszkópia előnye, hogy a hagyományos optikai mikroszkópiához előkészített mintákról viszonylag könnyen jó minőségű képeket lehet készíteni, és széles körben alkalmazható a különböző kutatási területeken.
Az LSCM-ek első generációja jól működött rögzített mintákkal, de nem tudták szabályozni a lézerek fényenergiáját, ami túl gyakran az élő minta végzetes megsemmisüléséhez vezetett, hacsak nem tettek komoly óvintézkedéseket. E korlátok ellenére a rögzített minták képei olyan jó minőségűek voltak, hogy a konfokális megközelítést a szakemberek feltétel nélkül elfogadták. A műszerek következő generációi a képalkotási folyamat minden aspektusát javították. Ezen túlmenően az új készülékek sokkal ergonomikusabbá és könnyebben kezelhetőbbé váltak, így a beállítások, a szűrőkombinációk cseréje, a lézerteljesítmény számítógép segítségével történő beállítása sokkal könnyebbé és gyorsabbá vált. Mostantól lehetőség van három fluorokrómmal egyidejűleg, és még több fluorokrómmal egymás után. A továbbfejlesztett és megbízhatóbb szoftvereknek, a gyorsabb számítógépeknek, a nagyobb lemezmeghajtóknak és a véletlen elérésű tárolóeszközök csökkenő árának köszönhetően a képfeldolgozás is jelentősen fejlődött.
Képalkotási módok
A konfokális mikroszkóp fő alkalmazása különböző típusú vastag minták képeinek készítése. A konfokális módszer előnye abból fakad, hogy a mintáról nagy felbontású és felbontású, egyedi optikai szakaszok sorozataként lehet képeket készíteni. Ebben az esetben többféle megjelenítési módot használnak; Mindegyik egy optikai szeletre épül, mint a kép alapegységére.
Rizs. 1. Három jelzéssel ellátott optikai szakaszok
Egyedi optikai részek
Az optikai metszet a konfokális mikroszkópos technikák alapvető képalkotó egysége. A kötött és festett minták képei egy-, kettős-, három- és többhullámhosszú megvilágítási módban nyerhetők, míg a többszínű minták képei kombinálódnak egymással (ha megfelelő kromatikus aberráció-korrekcióval rendelkező objektíveket használunk). A kiegészítő regisztráció általában digitális képfeldolgozási módszerekkel történik. A legtöbb lézeres pásztázó konfokális mikroszkóp (LSCM) körülbelül 1 másodpercet vesz igénybe az optikai metszet felvételéhez, bár a több optikai szakasz képét általában átlagolják a jel-zaj arány javítása érdekében. A kép elkészítéséhez szükséges idő természetesen a kép pixelméretétől és a rendszerszámítógép sebességétől függ. Egy tipikus 8 bites, 768x512 pixeles kép tárolásához körülbelül 0,3 Mbit memóriára lesz szükség.
Az 1. ábrán látható optikai metszeteket egyidejűleg három különböző hullámhosszú (488, 568 és 647 nanométeres) gerjesztő fénnyel kaptuk, sugárforrásként egyetlen kripton/argon lézert használva. Példaként bemutatjuk a Drosophila szárnyának a harmadik létkorban lévő képzeletbeli korongját, amelyen három, a szárnyképzésben részt vevő gén van megjelölve. A bemutatott három gén és a megfelelő fluorokróm címkék a következők: (a) vestigialis (fluoreszcein – 496 nanométer); b) szárnyatlan (lisszamin-rodamin - 572 nanométer); és © CiD (cianin 5-649 nanométer). A szárnyat alkotó három térben ábrázolt géndomén összetett képe a jobb alsó sarokban található (d) kép.
Rögzítés meghatározott időintervallumban és egy élő sejt vizualizálása
Az élő sejtek időzített vizsgálata új lendületet kapott az LSCM megnövekedett felbontása miatt. Korábban a sejtes struktúrák mozgásának vizsgálatát 16 mm-es fotófilmmel és kamerához csatlakoztatott óraszerkezetes intervallummérővel, később time-lapse funkcióval rendelkező videorögzítővel, optikai lemezes rögzítővel vagy videó digitalizáló táblával végezték. . Mostantól az LSCM használatával lehetőség van bizonyos, előre beállított időközönként valós időben optikai szakaszok beszerzésére.
Az élő szövetek leképezése LSCM-mel sokkal nehezebb, mint a kötött minták leképezése, és nem mindig praktikus, mert a minta nem biztos, hogy ellenáll a nézési körülményeknek. Az 1. táblázat összefoglal néhány olyan tényezőt, amelyeket figyelembe kell venni az élő és társított sejtek LSCM segítségével történő megfigyelésekor. Egyes mintákat egyszerűen fizikailag lehetetlen a mikroszkóp tárgyasztalára helyezni, vagy nem lesznek képesek életben maradni rajta a teljes megfigyelési időszak alatt. Előfordulhat, hogy a vizsgált jelenség vagy szerkezet nincs a lencse látómezején belül. Például a Drosophila szárny imaginális korongjai túl mélyen fejlődnek a lárvában ahhoz, hogy megfigyelhetők legyenek; a boncolás után pedig nem tudnak kifejlődni a kultúrában. Ezért ma az egyetlen elérhető módszer az ilyen típusú szövetekben a génexpresszió megfigyelésére a lárvák kimetszése, a különböző fejlődési szakaszokban lévő mintákból vett képzeletkorongok megkötése és megfestése.
asztal 1. Kötött és élő sejtek megfigyelése LSCM segítségével
Az élő sejtek sikeres megfigyelése és képalkotása rendkívüli körültekintést igényel a teljes folyamat során. A lézersugaras besugárzás által a sejtben okozott károsodás az ismételt szkennelés során felhalmozódhat, ezért ezt az expozíciót a minimálisra kell csökkenteni, amely szükséges és elegendő a kép elkészítéséhez. Antioxidánsokat, például aszkorbinsavat adnak a táptalajhoz, hogy csökkentsék a fluoreszcens molekulák gerjesztőfénnyel történő besugárzásakor felszabaduló oxigén mennyiségét, és elősegítsék a sejtpusztító szabad gyökök képződését. Általában kiterjedt előzetes kontrollkísérletekre van szükség a besugárzás fluoreszcensen festett sejtekre gyakorolt hatásának értékeléséhez, gondosan ügyelve arra, hogy minden képalkotó paraméter összhangban legyen a megfigyelésekkel. A tesztfelvételeket követően fel kell mérni az élő példányok életképességét. Az embrióknak például a megfigyelési folyamat során is normálisan kell fejlődniük, így a sugárterhelés vagy a fluorokrómok által okozott bármilyen rendellenességet észlelni kell. A 2. ábra egy kalciumzölddel fluoreszcensen megfestett Drosophila embrió időzített fényképét mutatja. Egy képsorozat a fluoreszcens fény eloszlásának időbeli változásait mutatja.
Minden sejttípusnak saját intézkedésre van szüksége, hogy fenntartsa életképességét a megfigyelés során. Egyes rovarsejtek esetében elegendő a szobahőmérséklet fenntartása és elegendő mennyiségű megfelelő táptalaj használata. A legtöbb sejttípus azonban fűtött színpadot és néha perfúziós kamrát igényel a megfelelő szén-dioxid-egyensúly fenntartásához a színpadon. Azon sejttípusok kiválasztása, amelyeknél az LSCM-et használó megfigyelési feltételek a legkevésbé „ellenségesek”, sok kísérleti probléma elkerülésében segít. A modern konfokális műszerek fejlesztése a lehetséges problémák jelentős csökkenését eredményezte. A megnövekedett kvantumhatékonyság, az objektívek nagyobb numerikus apertúrája (fényereje) és a kevésbé mérgező sejtfestékek használata oda vezetett, hogy a konfokális mikroszkópia az élő sejtek elemzésének gyakorlati módszerévé vált. Törekedni kell a kisebb teljesítményű lézerek alkalmazására, ugyanakkor lehetővé kell tenni a képfelvétel és -feldolgozás minél gyorsabb elvégzését. Ha a lyuknyílást megnövelik a képgyűjtés és -rögzítés felgyorsítása érdekében (a nem élő minták megfigyeléséhez képest), a későbbi dekonvolúció néha helyreállíthatja az elveszett képminőséget.
Rizs. 2. Lövés adott időintervallumban
Számos fiziológiai folyamat és esemény túl gyorsan megy végbe ahhoz, hogy a legtöbb LSCM rögzítse azokat, amelyek átlagosan másodpercenként egy képet készítenek a képalkotáshoz. Az akusztikus-optikai eszközöket és résmembránokat használó LSCM-ek gyorsabbak, mint a galvanométerrel gerjesztett pontszkennelő rendszerek, és praktikusabbak az élettani vizsgálatokhoz. Ezek a gyorsabb beállítások egyesítik a jó térbeli és időbeli felbontást, amely teljes képernyős felbontás mellett elérheti a 30 képkocka/másodpercet, vagy közel a videó képsebességet. A lassabb tűlyuk pásztázó mikroszkópokban az időbeli felbontás csak a minta letapogatási területének csökkentésével növelhető. Ha teljes térbeli felbontásra van szükség, csökkenteni kell a képsebességet, ami az időbeli felbontás elvesztését eredményezi. A konfokális rendszerek, amelyek lemezes vagy oszcilláló tükör szkennelést alkalmaznak, képesek gyors fiziológiai folyamatok vagy egyéb tranziens események leképezésére is.
Z-sorozat és 3D képek
A Z-sorozat az optikai tengelyre (z-tengely) merőleges síkban, különböző szinteken vett minta optikai metszete sorozata. A Z-sorozat képei a mikroszkóp finomfókuszálásának lépésről lépésre történő összehangolásával, majd minden lépésnél egy kép felvételével készülnek. A lépésről lépésre történő fókuszmozgatást általában egy számítógép által vezérelt léptetőmotor hajtja végre, amely előre meghatározott mértékben változtatja a fókuszt. Számítógépes makróprogram segítségével beszerezhet és elmenthet egy képet, újrafókuszálhatja a mikroszkópot a minta meghatározott mélységére, beszerezhet és menthet egy második képet, újra fókuszálhat egy új síkra, és így tovább, amíg el nem éri a programozott számú képet. .
A kívánt képeket a minta egy kiválasztott területének felvételével nyert z-sorozatból készíthetjük, és speciális szoftverrel feldolgozhatjuk az adott érdeklődésre számot tartó sejtek későbbi részletes vizsgálatához. A Z-sorozat a képek fotómontázsaként fogható fel, ahogy a 3. ábrán is látható. A képek ilyen típusú kombinációja és megjelenítése, valamint sok más képmanipuláció a modern képmanipulációs szoftvercsomagok standard jellemzője. A 3. ábra képei egy nagyobb sorozatból való válogatás, még gyakoribb z-lépésekkel. A zöld fény a 22C10 antitesttel megfestett Drosophila embrió perifériás idegrendszerét jelzi.
Rizs. 3. Optikai szakaszok Z-sorozata
Az LSCM által előállított minta több száz optikai metszetéből álló sorozatból nehéz lehet képet alkotni az összekapcsolt struktúrák teljes komplexumáról. A z-sorozat azonban, miután regisztrálták, ideális anyag a minta későbbi háromdimenziós ábrázolásához volumetrikus képalkotási technikákkal. Ezt a megközelítést ma már széles körben alkalmazzák a szövetszerkezet és -funkció közötti kapcsolat tisztázására az orvostudományban és a biológiában. Fontos a helyes minta z-scan lépésének beállítása, amelyet a fókuszváltó motor lépése határoz meg; ebben az esetben a kép a minta tényleges mélységét tükrözi.
Amíg a minta mozdulatlan marad megfigyelés közben, az LSCM által előállított z-sorozatú képeket tökéletesen rögzítik, és digitálisan tárolva viszonylag könnyen konvertálhatók a minta 3D-s reprezentációjává. A 4. ábra egyetlen optikai metszetet (a) hasonlít össze egy z-sorozatú vetülettel (b), és szemlélteti ennek a technikának az értékét a 22C10 antitesttel jelölt Drosophila embrió perifériás idegrendszerének leképezésében.
A mikroszkóp kezelője által beállított léptetőmotor-osztás az optikai metszet vastagságához kapcsolódik, de más értékek is lehetnek. Az optikai szakasz vastagsága a mikroszkóppal megfigyelt mintadarab vastagságához van kötve, és függ a lencsétől és a lyukmembrán átmérőjétől. Bizonyos esetekben azonban a fókusztávolság megegyezhet az optikai szelet vastagságával, és ez zavarhoz vezethet.
A z-sorozatú fájl beérkezése után elküldésre kerül egy kifejezetten konfokális képek feldolgozására kialakított 3D-s rekonstrukciós programmal való feldolgozásra. Az ilyen programok grafikus állomásokon használva rendkívül gyorsak, de sikeresen használhatók személyi számítógépen vagy magának a konfokális mikroszkóp grafikus állomásának is, kellően gyors processzorral és nagy RAM-mal. Ezekkel a programokkal létrehozhat egy minta egyedi háromdimenziós reprezentációját és egy egymást helyettesítő reprezentációs sorozatot, amely különböző típusú mintákból áll össze, amely elforgatás vagy más térbeli transzformáció hatását váltja ki, és jobb érzékelést ad a minta háromdimenziós tulajdonságait. A program lehetővé teszi a hossz, a mélység változtatását, a térfogati mérések elvégzését, valamint a speciális képparaméterek, például a minta átlátszóságának interaktív megváltoztatását, hogy a minta különböző szintjein különböző struktúrákat emeljünk ki.
Rizs. 4. Optikai metszet és z-sorozatú vetítés
Egy másik módja annak, hogy egy adott időintervallumban készített képsorozatból vett optikai szeletek sorozatát ábrázoljuk, egy háromdimenziós ábrázolás, amelyben a z tengely az időtengely funkcióját tölti be. Ez a megközelítés hasznos a szervezet fejlődése során bekövetkező fiziológiai változások vizualizálásában. A módszer alkalmazására példa volt a tengeri sün embriók fejlődése során bekövetkező kalciumkoncentráció változásának dinamikájának tisztázása. A különböző mélységben készített optikai metszetek színkódolása egyszerű módja a 3D adatok ábrázolásának. A gyakorlatban a minta különböző mélységeiben készült minden optikai metszethez hozzárendelnek egy-egy színt (általában piros, zöld vagy kék), majd a színes képeket kombinálják, és képfeldolgozó program segítségével a színek változtatásával érik el a kívánt hatást.
4D képalkotás
Az LCSM segítségével az élő szövetekben vagy élő szövettenyészetek készítése során fellépő dinamikus jelenségek, amelyek egy adott időintervallumban készült képsorozatban tükröződnek, négy dimenzióban ábrázolhatók, az idő a negyedik dimenzió. A rendszeres időközönként kapott Z-sorozatok négydimenziós adathalmazok: három térbeli dimenzió (x, y és z) és negyedikként az idő, amelyek 4D-s megtekintővel figyelhetők meg. Az ilyen programok lehetővé teszik különböző időpontokban készült sztereó párok filmként való megkomponálását és lejátszását, vagy különböző időpontokban készített, rekonstruált háromdimenziós képek feldolgozását és bemutatását, mint egy szerkesztett filmet.
X-Z képek
Ha a minta oldalnézete kívánatos, például függőleges metszet a hámrétegen, akkor az x-z metszet kétféleképpen készíthető. Oldalnézetet kaphatunk, ha a minta egyetlen vonala (x tengely) mentén pásztázunk különböző mélységekben (z tengely), a fókusz változását léptetőmotorral vezéreljük, majd a teljes szeletsorozatot egyetlen szeletté egyesítjük. kép. Egy másik módszer a metszetsík opció használata egy 3D-s renderelő programban, ahol az oldalnézetet egy létező z-sorozatú optikai szeletekből nyerik ki. Az 5. ábrán a pillangószárny epitéliumának leképezésekor a lézer egyetlen vonal mentén pásztázott (a bal oldali képen a vízszintes fekete vonal), amely különböző z-koordinátákon vagy mélységekben hatol be a mintába. Az 5. ábrán látható x-z képet konfokális képalkotó rendszerrel állítottuk elő és mutattuk be. A szárnyhám két epiteliális rétegből áll, de mivel a fluoreszcencia intenzitása csökken a lézersugárnak a mintába való behatolási mélységével, csak a felső réteg látható egyértelműen.
Rizs. 5. Kép X-Z síkban
Kép készítése visszavert fényben
Minden korai konfokális mikroszkóp visszavert vagy visszaszórt fényben működött. A visszavert fény segítségével sok minta festetlen konfokális mikroszkóppal megfigyelhető, vagy erősen visszaverő festékekkel, például immunarany vagy ezüsthalogenid mikrokristályokkal jelölhetők. A visszavert fény-megfigyelések előnye, különösen élő szövetek esetében, hogy a mintát nem éri fényfehérítés. De bizonyos típusú festékek gyengíthetik a lézersugarat. Egy másik lehetséges probléma, hogy egyes mikroszkópok belső visszaverődést tapasztalhatnak az optikai elemekről az optikai sugárút mentén. Az LSCM-ek és a résmembrános LSCM-ek többsugaras változatainál a visszavert fény problémája nem áll fenn, és azokban a mikroszkópokban, amelyek igen, a polarizátorok használata, a műtermék-mentes területek leképezése és az optikai tengelytől való eltolás segít a probléma csökkentésében.
Átvitt fény képalkotás
A mikroszkópiában általánosan használt áteresztett fény képalkotási módok bármelyike használható az LFCM-ben, beleértve a fáziskontrasztot, a differenciális interferenciakontrasztot (DIC), a sötét mezőt vagy a polarizált fényt. A mintán áthaladó fény az átbocsátott fényvevőt éri, melynek jele egy száloptikai fényvezetőn keresztül a mikroszkóp pásztázó fejében lévő fotosokszorozók egyikébe kerül. Az áteresztett fény és a konfokális epifluoreszcencia képek egyidejűleg rögzíthetők ugyanazzal a megvilágító sugárral, így biztosítva a pontos regisztrációt. A képek megfelelő szoftverrel történő összevonásával vagy szintetizálásával visszatükrözhető a jelölt sejtek pontos elhelyezkedése a szövetben. Egyes tanulmányok a következő értelmes megközelítést javasolják: egy nem konfokális áteresztő fényképet egy vagy több konfokális fluoreszcencia képpel kombináljunk ugyanabból a mintából, jelölt sejtekről. Ez a megközelítés lehetővé teszi például, hogy meghatározzuk a jelölt sejtek egy alpopulációjának vándorlásának térbeli és időbeli vonatkozásait a jelöletlen sejtek populációján belül több órán vagy akár éveken keresztül.
Manapság már széles körben elterjedt a színes áteresztőfény-vevő, amely a piros, zöld és kék (RGB) színben átvitt jeleket fogadja el, hogy valódi színű képet hozzon létre, hasonlóan néhány digitális színes fényképezőgéphez. Egy ilyen vevő különösen hasznos a patológusok számára, akik rutinszerűen megfigyelik a szövetek tényleges színeit áteresztő fényben, és ezeket a képeket fluoreszcens adatokkal fedik le elemzés céljából.