Reprodukcija virusa u staničnim sustavima. Faze reprodukcije

Odnos virusa sa stanicom domaćina može se razviti na različite načine. Konvencionalno se ti odnosi mogu svesti na tri vrste.

Produktivna infekcija: ciklus razmnožavanja virusa u stanici domaćina završava nastankom nove, brojne generacije virusa, obično praćene smrću stanice domaćina.

Abortivna infekcija nastaje kada se ciklus reprodukcije virusa u stanici domaćina naglo prekine. Stanica domaćina zadržava svoju vitalnu aktivnost.

Virogenija karakteriziran integracijom (ugradnjom) virusne nukleinske kiseline u genom stanice domaćina, što potom dovodi do sinkrone replikacije stanične DNA i nukleinske kiseline virusa. Stanica domaćin nastavlja živjeti.

Razmnožavanje virusa odvija se njihovim razmnožavanjem u stanici domaćina. Reprodukcijski ciklus je proces podređivanja staničnih mehanizama stranim virusnim informacijama.

Funkcionalno, virusne enzime možemo podijeliti u 2 skupine: enzime koji olakšavaju prodiranje virusne nukleinske kiseline u stanicu i oslobađanje nastalih viriona u okoliš te enzime koji sudjeluju u procesima transkripcije i replikacije virusne nukleinske kiseline. .

ciklus reprodukcije mogu se podijeliti u zasebne faze.

1. stadij - kemisorpcija virusa na površini stanice domaćina

Kemisorpcija je moguća samo ako stanica na svojoj površini nosi osjetljive receptore koji su komplementarni receptorima danog virusa. U životinjskim i ljudskim stanicama funkciju receptora za pikorno- i arboviruse obavljaju lipoproteini, za mixo- i paramiksoviruse i adenoviruse - mukoproteini.

U jednostavno organiziranim virusima, receptori su jedinstvene kombinacije proteinskih podjedinica smještenih na površini kapside. Kod složenije organiziranih virusa funkciju receptora obavljaju izdanci superkapsida u obliku šiljaka ili resica.

Faza 2 - prodor virusa u stanicu domaćina.

Putevi ulaska virusa u stanicu mogu biti različiti. Pretpostavlja se da mnogi virusi ulaze u stanicu putem pinocitoza, ili viropeksis. Tijekom pinocitoze u području kemisorpcije virusa stanična membrana formira invaginaciju i proguta virus. U sklopu pinocitne vakuole virus ulazi u citoplazmu.

Neki virusi ulaze u stanice spajanjem stanične i virusne membrane.

Prodiranje DNA faga u bakterijsku stanicu događa se zbog djelomičnog razaranja stanične membrane lizozimom faga i kontraktilne reakcije ostatka faga.

Faza 3 - deproteinizacija virusa.

Proces deproteinizacije virusa uključuje oslobađanje njegove nukleinske kiseline iz proteina kapside. Čim se virusna nukleinska kiselina oslobodi iz kapsidnih proteina, počinje takozvano latentno razdoblje - razdoblje zasjeniti. Pretpostavlja se da tijekom razdoblja pomrčine virusna nukleinska kiselina prolazi kroz citoplazmu stanice do područja jezgre.

Faza 4 - sinteza komponenti virusa.

Ukupnost procesa ove faze može se podijeliti u tri faze:

Prva faza je pripremna. Omogućuje dva cilja: potisnuti funkcioniranje genetskog aparata stanice, zaustaviti sintezu staničnih proteina i nukleinskih kiselina, prebaciti stanični aparat za sintezu proteina pod kontrolu genoma virusa; pripremiti uvjete za replikaciju nukleinske kiseline i sintezu virusnih kapsidnih proteina.

Druga faza je replikacija nukleinske kiseline virusa. Za dvolančane DNA - genomske viruse tipičan je isti način implementacije genetske informacije kao i za druge žive organizme. Procesu replikacije DNA prethodi transkripcija mRNA. Glasničku RNA virusa prevode ribosomi stanice, a sinteza ranih proteina specifičnih za virus odvija se na polisomu virusa pomoću uzorka mRNA.

Čim se sintetiziraju rani proteini specifični za virus, počinje proces replikacije virusne DNA. Replikacija dvolančane DNA virusa slijedi princip replikacije DNA staničnih organizama na polukonzervativan način.

Proces replikacije jednolančane DNA započinje sintezom njezina komplementarnog para. Rezultat je dvolančana kružna roditeljska DNK.

Proučavanje mehanizma replikacije RNA-genomskih virusa počelo je 1961. godine, kada su otkriveni RNA-genomski fagi.

U RNA genomskim virusima, RNA molekula je i genetski materijal i obavlja funkciju mRNA i DNA.

Godine 1970. enzim RNA-ovisna DNA polimeraza pronađena je u jednostaničnim RNA virusima, što ukazuje na prisutnost procesa obrnute transkripcije. Kasnije je dokazano da u onkogenim RNA virusima, prema njihovoj RNA matrici, uz sudjelovanje RNA-ovisnih
DNA polimeraza sadržana u virionu prepisuje se u kopiju DNA. Kopija DNA iz jednolančanog oblika prelazi u replikativni dvolančani oblik, koji osigurava replikaciju RNK virusa i sintezu potrebnih enzima.

Treća faza je sinteza kapsidnih proteina.

Ovaj proces zaostaje za procesom replikacije virusne nukleinske kiseline i počinje kada je replikacija u punom zamahu. Sinteza kapsidnih proteina odvija se iu jezgri iu citoplazmi stanice. Virus-specifičnu mRNA prevode ribosomi stanice, a prekursorski proteini se sintetiziraju na polisomu virusa. Iz tog "fonda" proteina prekursora nastaju proteini kapside virusa.

Stadij 5 - sklapanje viriona, odnosno morfogeneza virusa.

U jednostavno organiziranim virusima, proteinske podjedinice kapside u strogo uređenom spoju smještene su oko nukleinske kiseline. Kod složeno organiziranih virusa u procesu sastavljanja viriona sudjeluju i stanične strukture, kao što su jezgrene i citoplazmatske membrane.

Faza 6 - oslobađanje virusa iz stanice.

Ovaj proces je različit za različite viruse. Oslobađanje DNA-genomskih faga događa se kada je stanica potpuno lizirana lizozimom faga. Složeni ljudski i životinjski virusi izlaze iz stanice s citoplazmatskom regijom pupanjem kroz citoplazmatsku membranu i ovojnicu, istodobno dobivajući superkapsidu. Često je oslobađanje virusa iz stanice olakšano njegovom probavom u krvnim fagocitima. Biljni virusi iz stanice u stanicu mogu prolaziti kroz međustanične veze – plazmodezme.

Najčešće, ciklus reprodukcije virusa završava produktivnom infekcijom - stvaranjem velike populacije (100-200) punopravnih viriona, što je obično popraćeno smrću domaćina.

Taksonomija, klasifikacija

PARAMIKSOVIRUSI

Paramiksovirusi (porodica Paramyxoviridae od lat. para - oko, myxa - sluz) je obitelj RNA virusa. Familija sadrži respiratorni sincicijski virus, viruse ospica, zaušnjaka, parainfluence koji se prenose respiratornim mehanizmom. Donedavno je obitelj Paramyxoviridae, u skladu s općeprihvaćenom klasifikacijom virusa, uključivala tri roda: Paramyxovirus, Morbillivirus, Pneumovirus. Ali nedavno je klasifikacija promijenjena.

Obitelj Paramyxoviridae podijeljen u dvije podfamilije, povećao je broj rodova:

1. Podfamilija Paramyxovirinae uključuje porod Respirovirus(bivše ime - Paramiksovirus, Morbillivirus I Rubulavirus(novi rod);

2. Podfamilija Pneumovirinae sadrži rodove Pneumovirus I Metapneumovirus.

2. Morfologija, veličina, značajke genoma

Građa viriona. Svi predstavnici obitelji Paramyxoviridae imaju sličnu strukturu. To je složeni RNA genomski virus velike veličine. Tipičan predstavnik je virus Sendai (patogen je za miševe), au ovom primjeru razmatra se ultrastruktura paramiksovirusa (slika 5). Virion ima zaobljeni oblik, njegov promjer je 150-300 nm. Izvana se nalazi lipoproteinska superkapsida s mnogo bodlji dvije vrste na površini (slika 4). S unutarnje strane, sloj matričnog M-proteina nadovezuje se na superkapsid. U središnjem dijelu viriona nalazi se nukleokapsidna nit (RNP) spiralnog tipa simetrije, presavijena u labavu kuglu.

Riža. 4 Shema paramiksovirusa 5 Elektronogram virusa Sendai

Genom Predstavljena je velikom molekulom linearne jednolančane minus RNA koja kodira 7 proteina. Među njima su glavni kapsidni protein NP, proteini kompleksa polimeraze L i P, nestrukturni protein C (svi su dio nukleokapsida), kao i M-protein i površinski glikoproteini. To su pričvrsni proteini i fuzijski protein (F-protein). Pričvrsni proteini tvore jednu vrstu bodlji, dok F-protein tvori drugu vrstu bodlji. Kod različitih paramiksovirusa pričvrsne proteine ​​predstavljaju: HN (hemaglutinin-neuraminidaza), H (hemaglutinin) ili G-protein.

parainfluenca. Prema antigenima virusnih proteina HN, NP, F, razlikuju se 4 glavna serotipa virusa parainfluence. Tipovi 1, 2, 3 križno reagiraju s protutijelima na virus zaušnjaka. Virus tipa 4 je različit i ima 2 podtipa (dakle, pretpostavlja se 5 tipova virusa parainfluence). Svi virusi parainfluence imaju HN - protein i stoga pokazuju hemaglutinirajuću i neuraminidaznu aktivnost. Virus parainfluence 1, tip 2 aglutinira eritrocite pilića, virus parainfluence 3 aglutinira samo eritrocite zamorca.

Paramiksovirus (slika 5) veže se pomoću glikoproteina ovojnice (HN, H ili G) na površinu stanice (1). F-protein osigurava spajanje ovojnice virusa s plazma membranom stanice, bez stvaranja endosoma. Replikacija genoma slična je replikaciji minus RNA genomskih virusa: RNA polimeraza se unosi u stanicu s nukleokapsidom virusa. Genom se transkribira u zasebne mRNA (2) za svaki protein i kompletan plus predložak (3) za genomsku RNA. Novi genomi stupaju u interakciju s L-, P- i NP-proteinima, tvoreći nukleokapside. Sintetizirani matrični protein prelazi u unutarnji sloj stanične membrane. Prekursori glikoproteinskih šiljaka ovojnice sintetiziraju se na ribosomima povezanim s membranama endoplazmatskog retikuluma (ER). Oni su glikozilirani, krećući se kroz ER i Golgijev aparat (AG), integrirajući se u staničnu membranu. Nukleokapsida se veže na protein matriksa i membranu modificiranu glikoproteinom (superkapsid). Virioni izlaze iz stanice (4) pupanjem.

Riža. 5 Reprodukcija paramiksovirusa

Paramiksovirusi imaju sposobnost, uz pomoć F-proteina, proći u susjedne stanice, uzrokujući njihovo spajanje. U tom slučaju nastaju višejezgrene divovske stanice - sincitije (simplasti). Ovaj mehanizam omogućuje virusima da se šire izravno od stanice do stanice, izbjegavajući djelovanje protutijela koja neutraliziraju virus. Sposobnost stvaranja simplasta karakteristična je značajka paramiksovirusa.

Odabir baze: Odgovori na pitanja na testu za BJD.docx , IISiT - pitanja 2018 odgovori.docx , Test pitanja za samostalno učenje.docx , Teorija menadžmenta questions.docx , CST pitanja za ispit.docx , 30 odgovora na pitanja o trčanju.pdf , Test pitanja.docx , testovi, pitanja 8RÂ.doc , Test pitanja i zadaci s odgovorima za pristup računalu , Poslovne i znanstvene teme. Pitanja za test.doc .
SADRŽAJ

Kontrolna pitanja:

1. Reprodukcija DNA-genomskih virusa: glavne faze, značajke reprodukcije……………………………………………………………………………. ..3

2. Znakovi reprodukcije virusa u živim sustavima: laboratorijske životinje, pileći embriji, stanične kulture…………………………………………………………………….. … ……16

3. Zadatak ................................................. ................................................. ..20

Literatura…………………………………………………………...........25

1. Reprodukcija DNA-genomskih virusa: glavne faze, značajke reprodukcije

Reprodukcija virusa

Proces reprodukcije virusa može se uvjetno podijeliti u dvije faze. Prva faza obuhvaća događaje koji dovode do adsorpcije i ulaska virusa u stanicu, otpuštanja njegove unutarnje komponente i njegove modifikacije na način da može izazvati infekciju. Prema tome, prva faza uključuje tri faze: 1) adsorpcija virusa na stanicama; 2) prodiranje virusa u stanice; 3) svlačenje virusa u stanici. Ove faze imaju za cilj osigurati da se virus isporuči u odgovarajuće stanične strukture, a njegova unutarnja komponenta se oslobodi zaštitnih ljuski. Nakon što se postigne ovaj cilj, započinje druga faza reprodukcije tijekom koje dolazi do ekspresije virusnog genoma. Ova faza uključuje sljedeće korake: 1) transkripciju, 2) translaciju messenger RNA, 3) replikaciju genoma, 4) sastavljanje virusnih komponenti. Završna faza reprodukcije je oslobađanje virusa iz stanice.

Prva faza reprodukcije.

I. Adsorpcija viriona na površini stanice.

Interakcija virusa sa stanicom počinje procesom adsorpcije, tj. pričvršćivanja virusnih čestica na površinu stanice. Proces adsorpcije moguć je u prisutnosti odgovarajućih receptora na površini stanice i tvari koje ih "prepoznaju" na površini virusa. Sami početni procesi adsorpcije su nespecifični i mogu se temeljiti na elektrostatskoj interakciji pozitivno i negativno nabijenih skupina na površini virusa i stanice. Međutim, prepoznavanje staničnih receptora od strane virusnih proteina koje dovodi do pričvršćivanja virusne čestice na stanicu vrlo je specifičan proces. Proteini na površini virusa koji prepoznaju specifične skupine na plazma membrani stanice i uzrokuju pričvršćivanje virusne čestice na njih nazivaju se pričvrsni proteini.

Virusi koriste receptore dizajnirane da prođu u stanicu tvari potrebne za njegovu vitalnu aktivnost: hranjive tvari, hormone, čimbenike rasta itd. Receptori mogu imati različitu kemijsku prirodu i predstavljaju proteine, ugljikohidratnu komponentu proteina i lipida, lipide. Receptori za viruse influence i paramiksoviruse su sijalična kiselina u sastavu glikoproteina i glikolipida (gangliozida), za rabdoviruse i reoviruse - također ugljikohidratna komponenta u sastavu proteina i lipida, za pikornaviruse i adenoviruse - proteini, za neke viruse - lipidi. Specifični receptori igraju ulogu ne samo u vezivanju virusne čestice na površinu stanice. Oni određuju daljnju sudbinu virusne čestice, njezin unutarstanični transport i dostavu u određena područja citoplazme i jezgre, gdje virus može započeti infektivni proces. Virus se može vezati na nespecifične receptore i čak ući u stanicu, ali samo vezanje na specifični receptor dovodi do infekcije.

Pričvršćivanje virusne čestice na površinu stanice prvo se događa stvaranjem jednostruke veze između virusne čestice i receptora. Međutim, takvo pričvršćivanje je krhko, a virusna čestica može se lako odvojiti od površine stanice - reverzibilna adsorpcija. Da bi došlo do ireverzibilne adsorpcije, moraju se pojaviti višestruke veze između virusne čestice i mnogih receptorskih molekula, tj. mora doći do stabilnog viševalentnog pričvršćivanja. Broj staničnih receptorskih molekula na adsorpcijskim mjestima može doseći i do 3000. Stabilno vezanje virusne čestice na staničnu površinu kao rezultat viševalentnog pričvršćivanja nastaje zbog mogućnosti slobodnog kretanja receptorskih molekula u lipidnom dvosloju plazma membrane. , što je određeno pokretljivošću, "fluidnošću" proteinsko-lipidnog sloja. Povećanje fluidnosti lipida jedan je od najranijih događaja u interakciji virusa sa stanicom, što rezultira stvaranjem receptorskih polja na mjestu kontakta između virusa i površine stanice i stabilnim pričvršćivanjem virusne čestice na stanicu. rezultirajuće skupine.

Broj specifičnih receptora na površini stanice kreće se između 104 i 105 po stanici. Receptori za brojne viruse mogu biti prisutni samo u ograničenom skupu stanica domaćina, a to može odrediti osjetljivost organizma na određeni virus. Na primjer, pikornavirusi se adsorbiraju samo na stanicama primata. Receptori za druge viruse, naprotiv, široko su prisutni na površini stanica različitih tipova, kao što su receptori za ortomiksoviruse i paramiksoviruse, koji su spojevi koji sadrže sialil. Stoga ovi virusi imaju relativno širok raspon stanica na kojima može doći do adsorpcije virusnih čestica. Receptore za niz togavirusa posjeduju stanice iznimno širokog raspona domaćina: ti virusi mogu adsorbirati i inficirati stanice i kralješnjaka i beskralješnjaka.

II. Ulazak virusa u stanicu.

Povijesno gledano, postojala je ideja o dva alternativna mehanizma za prodor životinjskih virusa u stanicu - viropeksijom (endocitozom) i fuzijom virusne i stanične membrane. Međutim, ova dva mehanizma se ne isključuju, već nadopunjuju.

Izraz "viropeksis" znači da virusna čestica ulazi u citoplazmu kao rezultat invaginacije dijela plazma membrane i formiranja vakuole koja sadrži virusnu česticu.

endocitoza receptora. Viropexis je poseban slučaj receptorske ili adsorpcijske endocitoze. Ovaj proces je uobičajeni mehanizam kojim prehrambeni i regulatorni proteini, hormoni, lipoproteini i druge tvari ulaze u stanicu iz izvanstanične tekućine. Receptorska endocitoza događa se u posebnim područjima plazma membrane, gdje se nalaze posebne jamice koje su sa strane citoplazme prekrivene posebnim proteinom velike molekularne težine - klatrinom. Specifični receptori nalaze se na dnu jame. Jamice omogućuju brzu invaginaciju i stvaranje unutarstaničnih vakuola obloženih klatrinom. Poluvrijeme prodiranja tvari u stanicu ovim mehanizmom ne prelazi 10 min od trenutka adsorpcije. Broj vakuola formiranih u jednoj minuti doseže više od 2000. Dakle, endocitoza receptora je dobro koordinirani mehanizam koji osigurava brzo prodiranje stranih tvari u stanicu.

Obložene vakuole stapaju se s drugim, većim citoplazmatskim vakuolama kako bi formirale receptore koji sadrže receptore, ali ne i klatrin, koji se pak stapaju s lizosomima. Na taj se način proteini koji su ušli u stanicu obično transportiraju do lizosoma, gdje se razgrađuju u aminokiseline; mogu zaobići lizosome i akumulirati u drugim dijelovima stanice u nerazgrađenom obliku. Alternativa receptorskoj endocitozi je tekuća endocitoza, kada se invaginacija ne događa u posebnim područjima membrane. Većina životinjskih virusa s ovojnicom i bez ovojnice ulazi u stanicu mehanizmom receptorske endocitoze. Endocitoza osigurava unutarstanični transport virusne čestice unutar endocitne vakuole, budući da se vakuola može kretati u bilo kojem smjeru i stopiti sa staničnim membranama (uključujući nuklearnu membranu), oslobađajući virusnu česticu na odgovarajućim unutarstaničnim mjestima. Na taj način npr. nuklearni virusi ulaze u jezgru, a reovirusi u lizosome. Međutim, virusne čestice koje su ušle u stanicu dio su vakuole i odvojene su od citoplazme svojim stijenkama. Moraju proći kroz nekoliko faza prije nego što mogu izazvati zarazni proces.

Fuzija virusnih i staničnih membrana. Da bi unutarnja komponenta virusa prošla kroz staničnu membranu, virus koristi mehanizam spajanja membrane. Kod virusa s ovojnicom, fuzija je posljedica točkaste interakcije virusnog fuzijskog proteina s lipidima stanične membrane, uslijed čega se virusna lipoproteinska ovojnica integrira sa staničnim membranom, a unutarnja komponenta virusa nalazi se na njezinoj drugoj strani. U virusima bez ovojnice, jedan od površinskih proteina također stupa u interakciju s lipidima stanične membrane, uzrokujući prolazak unutarnje komponente kroz membranu. Većina životinjskih virusa ulazi u citosol iz receptorosoma.

Ako je tijekom endocitoze virusna čestica pasivni putnik, tada tijekom fuzije postaje aktivni sudionik u procesu. Fuzijski protein jedan je od njegovih površinskih proteina. Do danas je ovaj protein identificiran samo u paramiksovirusima i ortomiksovirusima. U paramiksovirusima, ovaj protein (P-protein) je jedan od dva glikoproteina koji se nalaze na površini virusne čestice. Funkciju fuzijskog proteina u virusu influence obavlja mala hemaglutinirajuća podjedinica.

Paramiksovirusi uzrokuju fuziju membrane pri neutralnom pH, a unutarnja komponenta ovih virusa može ući u stanicu izravno kroz plazma membranu. Međutim, većina virusa s ovojnicom i bez ovojnice uzrokuje spajanje membrane samo pri niskom pH od 5,0 do 5,75. Ako se stanicama dodaju slabe baze (amonijev klorid, klorokin i dr.) koje povećavaju pH na 6,0 u endocitnim vakuolama, ne dolazi do spajanja membrane, virusne čestice ostaju u vakuolama i ne dolazi do infektivnog procesa. Stroga ovisnost membranske fuzije o pH vrijednostima posljedica je konformacijskih promjena u virusnim fuzijskim proteinima.

Lizosom stalno ima nisku pH vrijednost (4,9). U endocitnoj vakuoli (receptosomu), zakiseljavanje stvara ATP-ovisna "protonska pumpa" koja je još uvijek na površini stanice tijekom stvaranja obložene vakuole. Zakiseljavanje endocitne vakuole je od velike važnosti za fiziološke ligande koji prodiru u stanicu, budući da nizak pH potiče disocijaciju liganda od receptora i recikliranje receptora.

Isti mehanizam koji je u osnovi stapanja virusnih i staničnih membrana uzrokuje virusom induciranu hemolizu i fuziju plazma membrana susjednih stanica kako bi se formirale višejezgrene stanice, simplasti i sincicij. Virusi uzrokuju dvije vrste stapanja stanica: 1) "spajanje izvana" i 2) "spajanje iznutra". "Fuzija izvana" javlja se pri visokoj množini infekcije i otkriva se unutar prvih sati nakon infekcije. Ova vrsta fuzije, opisana za paramiksoviruse, posredovana je proteinima inficirajućeg virusa i ne zahtijeva unutarstaničnu sintezu virusnih komponenti. Naprotiv, "fuzija iznutra" događa se pri maloj množini infekcija, nalazi se u relativno kasnim fazama infektivnog procesa, a posljedica je novosintetiziranih virusnih proteina. „Fuzija iznutra“ opisana je za mnoge viruse: herpes viruse, onkoviruse, uzročnike sporih infekcija itd. Ovu vrstu fuzije uzrokuju isti virusni glikoproteini koji osiguravaju prodor virusa u stanicu.

III. Svlačenje - deproteinizacija virusa

Čestice virusa koje su ušle u stanicu moraju se skinuti kako bi izazvale zarazni proces. Smisao svlačenja je uklanjanje virusnih zaštitnih ljuski koje sprječavaju ekspresiju virusnog genoma. Kao rezultat svlačenja, oslobađa se unutarnja komponenta virusa, što može izazvati zarazni proces. Svlačenje je popraćeno nizom karakterističnih značajki: kao rezultat raspadanja virusne čestice, infektivna aktivnost nestaje, u nekim slučajevima pojavljuje se osjetljivost na nukleaze, javlja se otpornost na neutralizirajući učinak protutijela, fotoosjetljivost se gubi pri uporabi niza droge.

Krajnji proizvodi svlačenja su jezgre, nukleokapsidi ili nukleinske kiseline. Za brojne viruse pokazalo se da proizvod skidanja nisu gole nukleinske kiseline, već nukleinske kiseline povezane s unutarnjim virusnim proteinom. Na primjer, krajnji proizvod svlačenja pikornavirusa je RNA kovalentno vezana na VPg protein, krajnji proizvod svlačenja adenovirusa je DNA kovalentno vezana na jedan od unutarnjih virusnih proteina.

U nekim slučajevima, sposobnost virusa da izazovu zarazni proces određena je mogućnošću njihovog svlačenja u stanici ovog sustava. Stoga je ova faza jedna od faza koje ograničavaju infekciju.

Svlačenje brojnih virusa događa se u posebnim područjima unutar stanice (lizosomi, strukture Golgijevog aparata, perinuklearni prostor, nuklearne pore na nuklearnoj membrani). Kada se virusna i stanična membrana spoje, prodiranje u stanicu se kombinira sa svlačenjem.

Svlačenje i unutarstanični transport međusobno su povezani procesi: ako je pravilan unutarstanični transport do mjesta svlačenja poremećen, virusna čestica ulazi u lizosom i uništavaju je lizosomski enzimi.

Druga faza reprodukcije .

I. Prijepis.

Transkripcija se provodi uz pomoć posebnog enzima - RNA polimeraze, koji veže nukleotide tvoreći 3-5´fosfodiesterske mostove. Takvo se vezanje događa samo u prisutnosti DNA predloška.

Produkti transkripcije u stanicama su mRNA. Sama stanična DNA, koja je nositelj genetske informacije, ne može izravno programirati sintezu proteina. Prijenos genetskih informacija s DNA na ribosome provodi glasnička RNA. To je osnova središnje dogme molekularne biologije, koja je izražena sljedećom formulom:

DNA - transkripcija - RNA - translacija - protein,

gdje strelice pokazuju smjer prijenosa genetske informacije.

Implementacija genetske informacije u virusima. Strategija virusnog genoma u odnosu na sintezu mRNA različita je za različite viruse. U virusima koji sadrže DNA, mRNA se sintetizira na kalupu jednog od lanaca DNA. Formula za prijenos genetske informacije ista je kao u stanici:

DNA - transkripcija - RNA - translacija - protein.

Virusi koji sadrže DNA i koji se razmnožavaju u jezgri koriste staničnu polimerazu za transkripciju. Ovi virusi uključuju papovaviruse, adenoviruse, herpes viruse. Virusi koji sadrže DNA i koji se razmnožavaju u citoplazmi ne mogu koristiti stanični enzim koji se nalazi u jezgri. Transkripciju njihovog genoma provodi enzim specifičan za virus - DNA polimeraza, koja ulazi u stanicu kao dio virusa. Ti virusi uključuju poksviruse i iridoviruse.

Enzimi koji prepisuju virusni genom. Transkripcija niza virusa koji sadrže DNA - papovavirusi, adenovirusi, herpes virusi, parvovirusi, hepadnavirusi. Provodi se u staničnoj jezgri, a u tom procesu naširoko se koriste mehanizmi stanične transkripcije - transkripcijski enzimi i daljnja modifikacija transkripata. Transkripciju ovih virusa provodi stanična RNA polimeraza II, enzim koji prepisuje stanični genom. Međutim, posebna skupina transkripata adenovirusa sintetizirana je pomoću drugog staničnog enzima, RNA polimeraze III. U druge dvije obitelji životinjskih virusa koji sadrže DNA, poksvirusa i iridovirusa, transkripcija se događa u citoplazmi. Budući da u citoplazmi nema staničnih polimeraza, za transkripciju ovih virusa potreban je poseban virusni enzim, virusna RNA polimeraza. Ovaj enzim je strukturni virusni protein.

regulacija transkripcije. Transkripcija virusnog genoma je strogo regulirana tijekom infektivnog ciklusa. Regulaciju provode i stanični i virusno specifični mehanizmi. Neki virusi, uglavnom oni koji sadrže DNA, imaju tri razdoblja transkripcije - vrlo rano, rano i kasno. Ovi virusi uključuju boginje, herpes, papovaviruse, adenoviruse. Kao rezultat ultra-rane i rane transkripcije, ultra-rani i rani geni se selektivno čitaju uz stvaranje ultra-ranih ili ranih mRNA. Tijekom kasne transkripcije očitava se još jedan dio virusnog genoma – kasni geni, uz stvaranje kasnih mRNA. Broj kasnih gena obično premašuje broj ranih gena. Mnogi nadrani geni su geni za nestrukturne proteine ​​– enzime i regulatore transkripcije i replikacije virusnog genoma. Nasuprot tome, kasni geni su obično geni za strukturne proteine. Obično se tijekom kasne transkripcije očitava cijeli genom, ali s predominacijom transkripcije kasnih gena.

Faktor regulacije transkripcije kod nuklearnih virusa je transport transkripata iz jezgre u citoplazmu, do mjesta funkcioniranja mRNA – polisoma.

Produkt ultra-rane transkripcije herpes virusa su A-proteini. Funkcija jednog ili više njih neophodna je za transkripciju sljedeće skupine gena koji kodiraju P-proteine. Zauzvrat, P-proteini uključuju transkripciju posljednje skupine kasnih gena koji kodiraju Y-proteine. Ova vrsta regulacije naziva se "kaskadna".

II. Emitiranje.

Ovo je proces prevođenja genetske informacije sadržane u mRNA u specifičnu sekvencu aminokiselina u sintetiziranim proteinima specifičnim za virus. Sinteza proteina u stanici događa se kao rezultat translacije mRNA na ribosome. U ribosomima se protok informacija (u mRNA) stapa s protokom aminokiselina koje donose prijenosnu RNA (tRNA). U stanici postoji veliki izbor tRNA. Svaka aminokiselina mora imati vlastitu tRNA.

Molekula tRNA je jednolančana RNA sa složenom strukturom javorovog lista.

Vezanje specifične tRNA i aminokiseline provodi enzim aminoacil sintetaza. Jedan kraj tRNA veže se za aminokiselinu, a drugi kraj za nukleotide mRNA s kojima su komplementarni. Tri nukleotida na mRNA kodiraju jednu aminokiselinu i nazivaju se "triplet" ili "kodon", dok se tri nukleotida komplementarna kodonu na tRNA nazivaju "antikodon".

Proces transkripcije sastoji se od tri faze: inicijacije elongacije i završetka.

Inicijacija prevođenja najkritičnija je faza u procesu prevođenja, koja se temelji na prepoznavanju mRNA od strane ribosoma i vezanju na njegova specifična mjesta. Ribosom prepoznaje mRNA zahvaljujući "čepu" na 5' kraju i klizi prema 3' kraju dok ne dođe do inicijacijskog kodona od kojeg počinje translacija. U eukariotskoj stanici, inicijacijski kodoni su AUG kodoni (adenin, uracil, guanin), koji kodiraju metionin. Sinteza svih polipeptidnih lanaca počinje metioninom. Specifično prepoznavanje virusa i RNA od strane ribosoma provodi se zbog inicijacijskih čimbenika specifičnih za virus.

Mala ribosomska podjedinica prva se veže na mRNA. Ostale komponente potrebne za početak translacije vezane su za mRNA kompleks s malom ribosomskom podjedinicom. To je nekoliko proteinskih molekula, koje se nazivaju "inicirajući faktori". U prokariotskoj stanici ima ih najmanje tri, a u eukariotskoj više od devet. Inicijatorski čimbenici određuju prepoznavanje specifičnih mRNA od strane ribosoma. Kao rezultat toga nastaje kompleks neophodan za inicijaciju prevođenja, koji se naziva "inicijacijski kompleks". Inicijatorski kompleks uključuje: mRNA; mala ribosomska podjedinica; aminoacil-tRNA koja nosi inicijatorsku aminokiselinu; pokretački čimbenici; nekoliko molekula GTP (gvanozin trifosfat).

U ribosomu je protok informacija spojen s protokom aminokiselina. Ulazak aminoacil-tRNA u A-centar velike ribosomske podjedinice posljedica je prepoznavanja, a njezin antikodon stupa u interakciju s kodonom mRNA koji se nalazi u maloj ribosomskoj podjedinici. Kada mRNA napreduje za jedan kodon, tRNA se prenosi u peptidil centar (P-centar), a njezina aminokiselina se veže na inicijatorsku aminokiselinu kako bi se formirala prva peptidna veza. TRNA oslobođena aminokiselina napušta ribosom i ponovno može djelovati u transportu specifičnih aminokiselina. Umjesto nje, nova tRNA se prenosi iz A-centra u P-centar i stvara se nova peptidna veza. U A-centru se pojavljuje prazan kodon mRNA, na koji se odmah veže odgovarajuća tRNA, a rastućem polipeptidnom lancu dodaju se nove aminokiseline.

Produljenje translacije je proces produljivanja, izgradnje polipeptidnog lanca, koji se temelji na dodavanju novih aminokiselina pomoću peptidne veze. Postoji stalno rastezanje mRNA lanca kroz ribosom i "dekodiranje" genetske informacije ugrađene u njega. Često mRNA djeluje istovremeno na nekoliko ribosoma, od kojih svaki sintetizira isti polipeptidni lanac kodiran ovom mRNA.

Terminacija translacije događa se u trenutku kada ribosom dosegne terminacijski kodon u mRNA (UAA, UGA, UAG). Translacija prestaje i polipeptidni lanac se oslobađa iz poliribosoma. Nakon završetka translacije poliribosomi se raspadaju na podjedinice koje se mogu ugraditi u nove poliribosome.

Svaka RNA funkcionira na nekoliko ribosoma. Skupina ribosoma koji rade na jednoj molekuli mRNA naziva se poliribosom ili polisom. Polisomi se mogu sastojati od 4-6 do 20 ili više ribosoma.

Polisomi specifični za virus mogu biti slobodni ili vezani za membranu. Unutarnji proteini obično se sintetiziraju na slobodnim polisomima, glikoproteini se uvijek sintetiziraju na membranski vezanim polisomima.

Budući da je genom životinjskog virusa predstavljen molekulom koja kodira više od jednog proteina, virusi su suočeni s potrebom da sintetiziraju ili dugu mRNA koja kodira jedan divovski prekursorski polipeptid, koji se zatim mora rezati na određenim točkama u funkcionalno aktivne proteine, ili kratke monocistronske mRNA, od kojih svaka kodira jedan protein. Dakle, postoje dva načina stvaranja virusnih proteina:

prvi - mRNA se prevodi u divovski prekursorski polipeptid, koji se nakon sinteze sekvencijalno reže na zrele funkcionalno aktivne proteine;

drugi - mRNA se prevodi uz stvaranje zrelih proteina ili proteina koji su tek neznatno modificirani nakon sinteze.

Prvi način translacije karakterističan je za viruse plus-lanaca koji sadrže RNA - pikornaviruse i togaviruse. Njihova se mRNA prevodi u divovski polipeptidni lanac, takozvani poliprotein, koji u obliku kontinuirane vrpce klizi s ribosomske "pokretne trake" i reže se na pojedinačne proteine ​​željene veličine. Rezanje virusnih proteina je proces u više koraka koji provode i virusno specifične i stanične proteaze.

Drugi način stvaranja proteina karakterističan je za viruse koji sadrže DNA i većinu virusa koji sadrže RNA. Ovom metodom sintetiziraju se kratke monocistronske mRNA kao rezultat selektivne transkripcije jedne regije genoma (gena). Međutim, ovi virusi u velikoj mjeri koriste mehanizam posttranslacijskog rezanja proteina.

U eukariotskoj stanici mnogi proteini, uključujući virusne, prolaze kroz posttranslacijske modifikacije; zreli funkcionalno aktivni proteini često nisu identični svojim novosintetiziranim prekursorima. Posttranslacijske kovalentne modifikacije kao što su glikozilacija, acilacija, metilacija, sulfonacija (formiranje disulfidnih veza), proteolitičko rezanje i konačno fosforilacija su široko rasprostranjene. Kao rezultat toga, umjesto 20 genetski kodiranih aminokiselina, izolirano je oko 140 derivata aminokiselina iz različitih stanica različitih organa eukariota.

Glikozilacija. Sastav složenih virusa koji sadrže RNA i DNA sadrži proteine ​​koji sadrže kovalentno vezane bočne lance ugljikohidrata - glikoproteine. Glikoproteini se nalaze u sastavu virusnih membrana i nalaze se na površini virusnih čestica.

Glikozilacija polipeptida je složen višefazni proces, čije prve faze počinju već u procesu sinteze polipeptida, a prvi ugljikohidratni ostatak je vezan za polipeptidni lanac koji još nije sišao s ribosoma. Sljedeći stupnjevi glikozilacije javljaju se sekvencijalnim vezanjem ostataka ugljikohidrata na lanac ugljikohidrata tijekom transporta polipeptida do plazma membrane. Ostaci ugljikohidrata se vežu jedan po jedan, a tek kada se pokrene sinteza oligosaharidnog lanca, "blok" se prenosi. Konačna formacija lanca ugljikohidrata može biti dovršena na plazma membrani prije sastavljanja virusne čestice.

Glikozilacija utječe na transport; štoviše, transport je za glikoproteine ​​neraskidivo povezan s postupnom glikozilacijom. Uvjerljiv dokaz za to je učinak inhibitora glikozilacije na reprodukciju virusa; potpuno potiskuju transport polipeptida bez ometanja ili inhibicije njihove sinteze.

Kada se glikozilacija potisne odgovarajućim inhibitorima (analozi šećera kao što je 2-deoksiglikoza, antibiotik tunikamicin), blokira se sklapanje viriona mixo-, rhabdo-, α-virusa ili se stvaraju neinfektivni virioni herpes virusa i onkovirusa.

Sulfoniranje. Neki proteini složenih RNA i DNA virusa su sulfonirani nakon translacije. Najčešće se glikoproteini podvrgavaju sulfonaciji, dok se sulfatna skupina veže na ugljikohidratne ostatke glikoproteina.

Aciliranje. Niz glikoproteina kompleksnih virusa koji sadrže RNA (HA2 virusa influence, G protein virusa vezikularnog stomatitisa, HN protein virusa newcastleske bolesti itd.) sadrži kovalentno povezane 1-2 molekule masnih kiselina.

Rezanje. Mnogi virusni proteini, a prvenstveno glikoproteini, postižu funkcionalnu aktivnost tek nakon što su proteolitičkim enzimima presječeni na određenim točkama. Rezanje se događa ili stvaranjem dviju funkcionalnih proteinskih podjedinica (na primjer, velika i mala podjedinica hemaglutinina virusa influence, dva glikoproteina (E2 i E3) šumskog virusa Semliki), ili stvaranjem jednog funkcionalno aktivnog proteina i neaktivni enzim, na primjer, F i HN proteini paramiksovirusa. Rezanje obično izvode stanični enzimi. U mnogim složenim životinjskim virusima s glikoproteinima, rezanje je neophodno za stvaranje aktivnih pričvrsnih proteina i fuzijskih proteina i, prema tome, da bi virus stekao sposobnost inficiranja stanice. Tek nakon rezanja ovih proteina virusna čestica dobiva infektivnu aktivnost. Dakle, možemo govoriti o proteolitičkoj aktivaciji niza virusa, koja se provodi uz pomoć staničnih enzima.

Fosforilacija. Fosfoproteini su sadržani u gotovo svim životinjskim virusima - RNA - i DNA koji sadrže, jednostavni i složeni. Većina virusa sadrži protein kinaze, ali fosforilaciju mogu izvesti i virusni i stanični enzimi. Obično su proteini povezani s virusnim genomom i imaju regulatornu ulogu u njegovoj ekspresiji fosforilirani. Mehanizam aktivnog djelovanja interferona povezan je s procesom fosforilacije.

III. Replikacija.

Replikacija je sinteza molekula nukleinske kiseline homolognih genomu. Replikacija DNA se događa u stanici, što rezultira stvaranjem dvolančane DNA kćeri. Replikacija se događa na nezapletenim regijama DNA i odvija se istovremeno na oba lanca od 5'-kraja do 3'-kraja.

Budući da su dva lanca DNK suprotnog polariteta, a mjesto replikacije ("rašlje") kreće se u istom smjeru, jedan lanac je izgrađen u suprotnom smjeru od zasebnih fragmenata, koji se nazivaju Okazakijevi fragmenti (po znanstveniku koji je prvi predložio takav model). Nakon sinteze, Okazakijevi fragmenti su "zašiveni" pomoću ligaze u jednu nit.

Replikaciju DNA provode DNA polimeraze. Za početak replikacije potrebna je preliminarna sinteza kratkog dijela RNA na šabloni DNA, koji se naziva početnica. Sinteza DNA lanca počinje sa sjemenom, nakon čega se RNA brzo uklanja s mjesta rasta.

Replikacija virusne DNA. Replikaciju genoma virusa koji sadrže DNA uglavnom kataliziraju stanični fragmenti i njezin je mehanizam sličan replikaciji stanične DNA.

Svaka novosintetizirana molekula DNA sastoji se od jednog roditeljskog i jednog novosintetiziranog lanca. Takav mehanizam replikacije naziva se polukonzervativnim.

Kod virusa koji sadrže cirkularnu dvolančanu DNA (papovavirusi) jedan od lanaca DNA se presijeca, što dovodi do odmotavanja i uklanjanja superzavoja u određenom dijelu molekule.

Vidi se donji superzamotan dio molekule, nezapleteni dio na velikom području i novonastale replikacijske petlje.

Tijekom replikacije jednolančane DNA (obitelj parvovirusa) dolazi do stvaranja dvolančanih oblika koji su intermedijarni replikativni oblici.

replikacijski kompleksi. Budući da dobiveni DNA i RNA lanci još neko vrijeme ostaju povezani s matricom, u zaraženoj stanici nastaju replikativni kompleksi u kojima se odvija cijeli proces replikacije (au nekim slučajevima i transkripcije) genoma. Replikativni kompleks sadrži genom, replikazu i novosintetizirane lance nukleinske kiseline povezane s matricom. Novosintetizirane genomske molekule odmah se povezuju s virusnim proteinima, pa se antigeni nalaze u replikacijskim kompleksima. U procesu replikacije nastaje djelomično dvolančana struktura s jednolančanim “repovima”, tzv. replikativni prekursor.

Replikativni kompleksi povezani su sa staničnim strukturama, bilo već postojećim ili izazvanim virusom. Na primjer, replikativni kompleksi pikornavirusa povezani su s membranama endoplazmatskog retikuluma, poksvirusi povezani su s citoplazmatskim matriksom, replikativni kompleksi adenovirusa i herpes virusa u jezgri povezani su s novonastalim fibroznim strukturama i povezani su s nuklearnim membranama. U zaraženim stanicama može doći do pojačane proliferacije staničnih struktura s kojima su povezani replikacijski kompleksi ili do njihovog stvaranja iz već postojećeg materijala. Na primjer, proliferacija glatke membrane događa se u stanicama zaraženim pikornavirusima. Mikrotubule se nakupljaju u stanicama zaraženim reovirusima; u stanicama zaraženim virusima malih boginja dolazi do stvaranja citoplazmatskog matriksa.

U replikacijskim kompleksima, istovremeno sa sintezom genomskih molekula, dolazi do transkripcije i sklapanja nukleokapsida i jezgri, a kod nekih infekcija i virusnih čestica.

regulacija replikacije. Novostvorena genomska molekula RNA može se koristiti na različite načine. Može se povezati s kapsidnim proteinima i postati dio viriona, poslužiti kao predložak za sintezu novih genomskih molekula ili za stvaranje mRNA, i konačno, u plus-lančanim virusima, može funkcionirati kao mRNA i vezati se na ribosomi. U stanici postoje mehanizmi koji reguliraju korištenje genomskih molekula. Regulacija slijedi princip samoregulacije i ostvaruje se interakcijom virusne RNA i proteina zbog mogućnosti prepoznavanja protein-nukleinska kiselina i protein-protein. Na primjer, uloga terminalnog proteina pikornavirusa je inhibiranje translacije mRNA i odabir molekula za stvaranje viriona. Protein koji se veže na 5' kraj genomske RNA, zauzvrat, prepoznaju proteini kapside i služi kao signal za sastavljanje virusne čestice uz sudjelovanje ove molekule RNA. Po istom principu, genomske RNA molekule su odabrane iz "minus"-lančanih virusa. Molekula RNA je dio viriona ili služi kao predložak za replikaciju. Da bi se prebacilo na transkripciju, mora doći do zabrane interakcije protein-nukleinska kiselina. Replikacija DNA adenovirusa uključuje proteinsku molekulu koja se veže za kraj virusne DNA i potrebna je za pokretanje replikacije. Dakle, sinteza virusnih proteina je neophodna za početak replikacije: u prisutnosti inhibitora sinteze proteina, nema prijelaza s transkripcije na replikaciju.

IV. sklapanje virusnih čestica.

Sinteza komponenti virusnih čestica u stanici je prekinuta i može se odvijati u različitim strukturama jezgre i citoplazme. Virusi koji se razmnožavaju u jezgri nazivaju se nuklearni virusi. To su uglavnom virusi koji sadrže DNA: adenovirusi, papovavirusi, parvovirusi, herpes virusi.

Virusi koji se repliciraju u citoplazmi nazivaju se citoplazmatski. To uključuje virus variole koji sadrži DNA i većinu virusa koji sadrže RNA, s izuzetkom ortomiksovirusa i retrovirusa. Međutim, ova je podjela vrlo relativna, jer u reprodukciji oba virusa postoje faze koje se odvijaju, redom, u citoplazmi i jezgri.

Unutar jezgre i citoplazme, sinteza molekula specifičnih za virus također se može razdvojiti. Tako se, na primjer, sinteza nekih proteina provodi na slobodnim polisomima, a drugi - na polisomima povezanim s membranama. Virusne nukleinske kiseline sintetiziraju se zajedno sa staničnim strukturama daleko od polisoma koji sintetiziraju virusne proteine. Uz takvu disjunktivnu metodu reprodukcije, stvaranje virusne čestice moguće je samo ako su virusne nukleinske kiseline i proteini sposobni, u dovoljnoj koncentraciji, prepoznati jedni druge u nizu staničnih proteina i nukleinskih kiselina i spontano se međusobno kombinirati. , tj. sposobni su se sami sastaviti.

Samosastavljanje se temelji na specifičnom proteinsko-nukleinskom i proteinsko-proteinskom prepoznavanju, koje se može dogoditi kao rezultat hidrofobnih, solnih i vodikovih veza, kao i steričke sukladnosti. Prepoznavanje proteina i nukleinske kiseline ograničeno je na malu regiju molekule nukleinske kiseline i određeno je jedinstvenim nukleotidnim sekvencama u nekodirajućem dijelu virusnog genoma. Ovim prepoznavanjem regije genoma od strane virusnih kapsidnih proteina, započinje proces sastavljanja virusne čestice. Pričvršćivanje preostalih proteinskih molekula provodi se zbog specifičnih interakcija protein-protein ili nespecifičnih interakcija protein-nukleinska kiselina.

Zbog raznolikosti strukture životinjskih virusa, različiti su i načini nastanka viriona, no mogu se formulirati sljedeća opća načela skupa:

U jednostavno uređenim virusima nastaju provirioni koji se potom, kao rezultat modifikacije proteina, pretvaraju u virione. U složenim virusima sastavljanje se provodi u više faza. Prvo se formiraju nukleokapsidi ili jezgre, s kojima bjelančevine vanjskih ljuski međusobno djeluju.

Sklapanje složenih virusa (s iznimkom slaganja virusa malih boginja i reovirusa) odvija se na staničnoj membrani. Sastavljanje nuklearnih virusa odvija se uz sudjelovanje nuklearnih membrana, sastavljanje citoplazmatskih virusa - uz sudjelovanje membrana endoplazmatskog retikuluma ili plazma membrane, gdje sve komponente virusne čestice stižu neovisno jedna o drugoj.

Brojni složeni virusi imaju posebne hidrofobne proteine ​​koji djeluju kao posrednici između formiranih nukleokapsida i virusnih ovojnica. Takvi proteini su proteini matriksa u nizu "minus"-lančanih virusa (ortomiksovirusi, paramiksovirusi, rabdovirusi).

Sklapanje nukleokapsida, jezgri, proviriona i viriona ne događa se u unutarstaničnoj tekućini, već u već postojećim u stanici ili induciranim virusom ("tvornice").

Komplicirani virusi za izgradnju svojih čestica koriste niz elemenata stanice domaćina, primjerice lipide, neke enzime, u DNA-genomskom 5V40 - histone, u RNA-genomskim virusima s ovojnicom - aktin, a kod arenovirusa pronađeni su čak i ribosomi. Stanične molekule imaju određene funkcije u virusnoj čestici, ali njihovo uključivanje u virion također može biti rezultat slučajne kontaminacije, kao što je uključivanje niza enzima stanične membrane ili staničnih nukleinskih kiselina.

Sastavljanje virusa koji sadrže DNA. Postoje neke razlike u sklopu virusa koji sadrže DNA od sklopa virusa koji sadrže RNA. Kao i kod virusa koji sadrže RNA, sklapanje virusa koji sadrže DNA proces je u više koraka s stvaranjem intermedijarnih oblika koji se od zrelih viriona razlikuju po sastavu polipeptida. Prvi korak u sklapanju je povezivanje DNK s unutarnjim proteinima i formiranje jezgri ili nukleokapsida. U ovom slučaju, DNK je povezana s prethodno formiranim "praznim" kapsidama.

Kao rezultat vezanja DNA na kapside, pojavljuje se nova klasa intermedijarnih oblika, koji se nazivaju nepotpuni oblici. Osim nepotpunih oblika s različitim sadržajem DNA, postoji još jedan intermedijarni oblik u morfogenezi - nezreli virioni, koji se od zrelih razlikuju po tome što sadrže nerazrezane polipeptidne prekursore. Dakle, morfogeneza virusa usko je povezana s modifikacijom (obradom) proteina.

Sklapanje nuklearnih virusa počinje u jezgri, obično povezivanjem s nuklearnom membranom. Nastali u jezgri, intermedijarni oblici herpes virusa pupaju u perinuklearni prostor kroz unutarnju jezgrinu membranu, a virus na taj način dobiva ovojnicu koja je derivat jezgrene membrane. Daljnje dovršavanje i sazrijevanje viriona događa se u membranama endoplazmatskog retikuluma iu Golgijevom aparatu, odakle se virus prenosi na površinu stanice kao dio citoplazmatskih vezikula.

Kod nepupajućih virusa koji sadrže lipide – virusa malih boginja, sklapanje viriona događa se u već opisanim citoplazmatskim virusnim “tvornicama”. Lipidna ovojnica virusa u "tvornicama" nastaje od staničnih lipida autonomnom samosastavljanjem, pa se lipidni sastav membrana bitno razlikuje od sastava lipida u staničnoj membrani.

V. Oslobađanje virusnih čestica iz stanice.

Postoje dva načina da virusno potomstvo napusti stanicu:

1) "eksplozijom";

2) pupanjem.

Izlazak iz stanice eksplozijom povezan je s uništavanjem stanice, kršenjem njezinog integriteta, zbog čega zrele virusne čestice unutar stanice završavaju u okolišu. Ovaj način napuštanja stanice svojstven je virusima koji ne sadrže lipoproteinsku membranu (picorna-, reo-, parvo-, papova-, adenovirusi). Međutim, neki od tih virusa mogu se prenijeti na površinu stanice prije stanične smrti. Izlazak iz stanica pupanjem svojstven je virusima koji sadrže lipoproteinsku membranu, koja je derivat stanične membrane. Ovom metodom stanica može dugo ostati sposobna za život i proizvoditi virusno potomstvo dok se njezini resursi potpuno ne potroše.

Proces reprodukcije virusa može se uvjetno podijeliti u 2 faze . Prva faza uključuje 3 faze: 1) adsorpcija virusa na osjetljivim stanicama; 2) prodiranje virusa u stanicu; 3) deproteinizacija virusa . Druga faza uključuje faze realizacije virusnog genoma: 1) transkripcija, 2) translacija, 3) replikacija, 4) sklapanje, sazrijevanje virusnih čestica i 5) otpuštanje virusa iz stanice.

Interakcija virusa sa stanicom počinje procesom adsorpcije, tj. pričvršćivanjem virusa na površinu stanice.

Adsorpcija je specifično vezanje virionskog proteina (antireceptora) na komplementarnu površinsku strukturu stanice – stanični receptor. Po kemijskoj prirodi, receptori na kojima su fiksirani virusi pripadaju dvjema skupinama: mukoproteinima i lipoproteinima. Virusi influence, parainfluence, adenovirusi fiksirani su na mukoproteinske receptore. Enterovirusi, herpes virusi, arbovirusi adsorbirani su na lipoproteinske receptore stanice. Adsorpcija se događa samo u prisutnosti određenih elektrolita, posebice iona Ca2+, koji neutraliziraju višak anionskih naboja virusa i površine stanice te smanjuju elektrostatsko odbijanje virusa i stanice, a zatim dolazi do specifične interakcije pričvrsnog proteina viriona s specifične skupine na plazma membrani stanice. Jednostavni ljudski i životinjski virusi sadrže pričvrsne proteine ​​u kapsidi. U složeno organiziranim virusima, pričvrsni proteini dio su superkapsida. Mogu biti u obliku niti (vlakna kod adenovirusa), ili šiljaka, gljivastih struktura kod mixo-, retro-, rhabdo- i drugih virusa. U početku se javlja jednostruka veza viriona s receptorom - takvo pričvršćivanje je krhko - adsorpcija je reverzibilna. Da bi došlo do ireverzibilne adsorpcije, moraju se pojaviti višestruke veze između receptora virusa i receptora stanice, tj. stabilno viševalentno pričvršćivanje. Broj specifičnih receptora na površini jedne stanice je 10 4 -10 5 . Receptori za neke viruse, kao što su arbovirusi. nalaze se na stanicama kralješnjaka i beskralješnjaka; za ostale viruse samo na stanicama jedne ili više vrsta.

Prodiranje virusa čovjeka i životinja u stanicu odvija se na dva načina: 1) viropeksijom (pinocitozom); 2) spajanje virusne superkapsidne ovojnice sa staničnom membranom. Bakteriofagi imaju vlastiti mehanizam prodiranja, takozvanu štrcaljku, kada se, kao rezultat kontrakcije proteinskog rasta faga, nukleinska kiselina, takoreći, ubrizgava u stanicu.

Deproteinizacija virusa, oslobađanje hemioma virusa iz virusnih zaštitnih ljuski događa se ili uz pomoć virusnih enzima ili uz pomoć staničnih enzima. Krajnji proizvodi deproteinizacije su nukleinske kiseline ili nukleinske kiseline povezane s internim virusnim proteinom. Zatim se odvija druga faza virusne reprodukcije, koja dovodi do sinteze virusnih komponenti.

Transkripcija je prepisivanje informacija iz DNA ili RNA virusa u mRNA prema zakonima genetskog koda.

Translacija je proces prevođenja genetske informacije sadržane u mRNA u određeni niz aminokiselina.

Replikacija je proces sinteze molekula nukleinske kiseline homolognih virusnom genomu.

Implementacija genetske informacije u virusima koji sadrže DNA odvija se na isti način kao u stanicama:

Transkripcija DNA i protein translacije RNA

RNA transkripcija i RNA translacijski protein

Kod virusa s pozitivnim RNA genomom (togavirusi, pikornavirusi) nema transkripcije:

RNA translacijski protein

Retrovirusi imaju jedinstven način prijenosa genetskih informacija:

RNA reverzna transkripcija DNA transkripcija i-RNA translacijski protein

DNA se integrira s genomom stanice domaćina (provirus).

Nakon što je stanica proizvela virusne komponente, počinje posljednja faza virusne reprodukcije, sklapanje virusnih čestica i oslobađanje viriona iz stanice. Oslobađanje viriona iz stanice provodi se na dva načina: 1) "eksplozijom" stanice, uslijed čega dolazi do uništenja stanice. Ovaj put je svojstven jednostavnim virusima (picorna-, reo-, papova- i adenovirusi), 2) izlaz iz stanica pupanjem. Svojstveno virusima koji sadrže superkapsid. Ovom metodom stanica ne umire odmah, može dati više virusnih potomaka dok se njezini resursi ne iscrpe.

Metode kulture virusa

Za uzgoj virusa u laboratorijskim uvjetima koriste se sljedeći živi objekti: 1) stanične kulture (tkiva, organi); 2) pileći embriji; 3) laboratorijske životinje.

Stanične kulture

Najčešće su jednoslojne stanične kulture koje se mogu podijeliti na 1) primarne (prvenstveno tripsinizirane), 2) polutransplantabilne (diploidne) i 3) transplantabilne.

Podrijetlo razvrstavaju se u embrionalne, neoplastične i iz odraslih organizama; morfogenezom- na fibroblastu, epitelu itd.

Primarni stanične kulture su stanice bilo kojeg ljudskog ili životinjskog tkiva koje imaju sposobnost rasta kao monosloj na plastičnoj ili staklenoj površini obloženoj posebnom hranjivom podlogom. Životni vijek takvih usjeva je ograničen. U svakom slučaju, dobiveni su iz tkiva nakon mehaničkog mljevenja, tretmana proteolitičkim enzimima i standardizacije broja stanica. Primarne kulture dobivene iz bubrega majmuna, bubrega ljudskog embrija, ljudskog amniona, pilećih embrija naširoko se koriste za izolaciju i nakupljanje virusa, kao i za proizvodnju virusnih cjepiva.

polutransplantabilan (ili diploidan ) stanične kulture - stanice istog tipa, sposobne izdržati do 50-100 prolaza in vitro, zadržavajući svoj izvorni diploidni set kromosoma. Diploidni sojevi fibroblasta ljudskog embrija koriste se i za dijagnozu virusnih infekcija i u proizvodnji virusnih cjepiva.

presađeni stanične linije karakterizira potencijalna besmrtnost i heteroploidni kariotip.

Izvor presađenih linija mogu biti primarne stanične kulture (npr. SOC, PES, VNK-21 - iz bubrega jednodnevnih sirijskih hrčaka; PMS - iz bubrega zamorca itd.), čije pojedinačne stanice pokazuju sklonost beskrajnom razmnožavanju in vitro. Cjelokupnost promjena koje dovode do pojave takvih obilježja stanica naziva se transformacija, a stanice transplantiranih kultura tkiva nazivaju se transformirane.

Drugi izvor transplantiranih staničnih linija su maligne neoplazme. U ovom slučaju, transformacija stanica događa se in vivo. U virološkoj praksi najčešće se koriste sljedeće linije transplantiranih stanica: HeLa - dobivene iz karcinoma vrata maternice; Ner-2 - od karcinoma grkljana; Detroit-6 - od metastaza raka pluća do koštane srži; RH je iz ljudskog bubrega.

Za uzgoj stanica potrebne su hranjive podloge koje se prema namjeni dijele na rastne i potporne. Sastav medija za rast trebao bi sadržavati više hranjivih tvari kako bi se osigurala aktivna reprodukcija stanica za stvaranje monosloja. Nosivi mediji trebaju osigurati samo preživljavanje stanica u već formiranom monosloju tijekom reprodukcije virusa u stanici.

Standardni sintetički mediji, kao što su Synthetic 199 mediji i Needle mediji, naširoko se koriste. Bez obzira na namjenu, sve hranjive podloge za stanične kulture dizajnirane su na bazi uravnotežene otopine soli. Najčešće je to Hankovo ​​rješenje. Sastavni sastojak većine podloga za uzgoj je krvni serum životinja (tele, bik, konj), bez prisutnosti 5-10% kojeg ne dolazi do razmnožavanja stanica i stvaranja monosloja. Serum nije uključen u medije za održavanje.

Izolacija virusa u kulturama stanica i metode njihove indikacije.

Prilikom izolacije virusa iz različitih zaraznih materijala od bolesnika (krv, urin, izmet, sluzni iscjedak, brisevi s organa) koriste se stanične kulture koje su najosjetljivije na navodni virus. Za infekciju se koriste kulture u epruvetama s dobro razvijenim monoslojem stanica. Prije inficiranja stanica uklanja se hranjivi medij i u svaku epruvetu dodaje 0,1-0,2 ml suspenzije ispitivanog materijala prethodno tretiranog antibioticima za uništavanje bakterija i gljivica. Nakon 30-60 min. kontakt virusa sa stanicama, uklonite višak materijala, dodajte potporni medij u epruvetu i ostavite je u termostatu dok se ne otkriju znakovi razmnožavanja virusa.

Indikator prisutnosti virusa u zaraženim kulturama stanica može biti:

1) razvoj specifične stanične degeneracije - citopatski učinak virusa (CPE), koji ima tri glavne vrste: okrugla ili mala degeneracija stanica; stvaranje višejezgrenih divovskih stanica - simplasta; razvoj žarišta stanične proliferacije, koji se sastoji od nekoliko slojeva stanica;

2) otkrivanje intracelularnih inkluzija smještenih u citoplazmi i jezgri zahvaćenih stanica;

3) pozitivan test hamaglutinacije (RGA);

4) pozitivna hemadsorpcijska reakcija (RGAds);

5) fenomen stvaranja plaka: jednosloj stanica inficiranih virusom prekriva se tankim slojem agara uz dodatak neutralnog crvenog indikatora (ružičasta podloga). U prisutnosti virusa u stanicama nastaju bezbojne zone ("plakovi") na podlozi ružičastog agara.

6) u nedostatku CPE ili GA, može se postaviti reakcija interferencije: kultura koja se proučava ponovno je zaražena virusom koji uzrokuje CPE. U pozitivnom slučaju neće biti CPP (reakcija interferencije je pozitivna). Ako u ispitivanom materijalu nije bilo virusa, promatra se CPE.

Izolacija virusa u pilećim zamecima.

Za virološka istraživanja koriste se pileći embriji stari 7-12 dana.

Prije infekcije odrediti održivost embrija. Kod ovoscopinga, živi embriji su pokretni, vaskularni uzorak je jasno vidljiv. Jednostavnom olovkom označite granice zračne vrećice. Pileći embriji se inficiraju u aseptičnim uvjetima sterilnim instrumentima, prethodno tretirajući ljusku iznad zračnog prostora jodom i alkoholom.

Metode infekcije pilećih embrija mogu biti različite: nanošenje virusa na korionsko-alantoičnu membranu, na amnionsku i alantoičnu šupljinu, na žumanjčanu vrećicu. Izbor metode infekcije ovisi o biološkim svojstvima virusa koji se proučava.

Indikacija virusa u kokošjem embriju je smrt embrija, pozitivan hemaglutinacijski test na staklu s alantoičkom ili amnionskom tekućinom, žarišne lezije ("plakovi") na korionsko-alantoisnoj membrani.

III. Izolacija virusa u laboratorijskim životinjama.

Laboratorijske životinje mogu se koristiti za izolaciju virusa iz zaraznog materijala kada se ne mogu koristiti prikladniji sustavi (stanične kulture ili pileći embriji). Uzimaju uglavnom novorođene bijele miševe, hrčke, zamorce, štakore. Inficirajte životinje prema principu citotropizma virusa: pneumotropni virusi se ubrizgavaju intranazalno, neurotropni - intracerebralni, dermatotropni - na kožu.

Indikacija virusa temelji se na pojavi znakova bolesti kod životinja, njihovom uginuću, patomorfološkim i patohistološkim promjenama u tkivima i organima, kao i pozitivnoj reakciji hemaglutinacije s ekstraktima iz organa.

Ne postiže se binarnom fisijom. Još 50-ih godina prošlog stoljeća utvrđeno je da se reprodukcija odvija metodom reprodukcije (u prijevodu s engleskog reproduce - napraviti kopiju, reproducirati), odnosno reprodukcijom nukleinskih kiselina, kao i sintezom proteina, zatim zbirka viriona. Ti se procesi odvijaju u različitim dijelovima stanice takozvanog domaćina (na primjer, u jezgri ili citoplazmi). Ova nepovezana metoda razmnožavanja virusa naziva se disjunktivnom. To je ono na što ćemo se detaljnije usredotočiti u našem članku.

proces reprodukcije

Ovaj proces ima svoje karakteristike reprodukcije virusa i razlikuje se uzastopnom promjenom nekih faza. Razmotrimo ih odvojeno.

Faze

Reprodukcija virusa u stanici odvija se u nekoliko faza koje su opisane u nastavku:

1. Prva faza je adsorpcija virusa, o čemu smo gore govorili, na površini stanice koja je osjetljiva na ovaj virus.
2. Drugi je prodiranje virusa u stanice domaćina metodom viropeksisa.
3. Treći je svojevrsno "svlačenje" viriona, oslobađanje nukleinske kiseline iz kapside i superkapside. Kod brojnih virusa nukleinska kiselina ulazi u stanice spajanjem virionske ovojnice i stanice domaćina. U ovom slučaju, treća i druga faza se spajaju u jednu.

Adsorpcija

Ova faza reprodukcije virusa odnosi se na prodiranje virusne čestice u stanice. Adsorpcija počinje na površini stanice interakcijom staničnih i virusnih receptora. U prijevodu s latinskog, riječ "receptori" znači "primanje". To su posebne osjetljive formacije koje percipiraju iritacije. Receptori su molekule ili molekularni kompleksi smješteni na površini stanica, a također su sposobni prepoznati specifične kemijske skupine, molekule ili druge stanice te ih vezati. U najsloženijim virionima takvi se receptori nalaze na vanjskoj ljusci u obliku šiljastog izraštaja ili vilusa; u jednostavnim virionima obično se nalaze na površini kapside.

Mehanizam adsorpcije na površini receptivne stanice temelji se na interakciji receptora s takozvanim komplementarnim receptorima stanice "domaćina". Virionski receptori i stanice su neke specifične strukture koje se nalaze na površini.

Adenovirusi i miksovirusi adsorbiraju se izravno na mukoproteinske receptore, dok se arbovirusi i pikornavirusi adsorbiraju na lipoproteinske receptore.

U virionu miksovirusa neuraminidaza uništava mukogfoteinski receptor i cijepa N-acetilneuraminske kiseline od oligosaharida koji sadrži galaktozu i galaktozamin. Njihove su interakcije u ovoj fazi reverzibilne, jer na njih značajno utječu temperatura, reakcija medija i komponente soli. Adsorpciju viriona sprječavaju heparin i sulfatirani polisaharidi, koji nose negativan naboj, ali njihov inhibicijski učinak uklanjaju neki polikarioni (ekmolin, DEAE-dekstran, protamin sulfat), koji neutraliziraju negativni naboj sulfatiranih polisaharida.

Ulazak viriona u stanicu domaćina

Put unošenja virusa u stanicu osjetljivu na njega neće uvijek biti isti. Mnogi virioni mogu ući u stanice putem pinocitoze, što na grčkom znači "piti", "piti". Ovom metodom čini se da pinocitna vakuola uvlači virion izravno u stanicu. Preostali virioni mogu ući u stanicu izravno kroz njezinu membranu.

Kontakt enzima neuraminidaze sa staničnim mukoproteinima potiče ulazak viriona u stanicu među miksovirusima. Rezultati nedavnih studija dokazuju da DNA i RNA viriona nisu odvojene od vanjske ljuske, tj. da virioni u potpunosti prodiru u osjetljive stanice pinocitozom ili viropeksijom. Do danas je to potvrđeno u odnosu na virus velikih boginja, vakciniju, kao i druge viruse koji za svoje stanište biraju životinjske organizme. Govoreći o fagima, oni inficiraju stanice nukleinskom kiselinom. Mehanizam infekcije temelji se na činjenici da se oni virioni koji se nalaze u staničnim vakuolama hidroliziraju enzimima (lipaze, proteaze), pri čemu se DNA oslobađa iz membrane faga i ulazi u stanicu.

Za pokus, stanica je zaražena nukleinskom kiselinom koja je izolirana iz nekih virusa, te je induciran jedan potpuni ciklus reprodukcije viriona. Međutim, u prirodnim uvjetima ne dolazi do infekcije takvom kiselinom.

Raspad

Sljedeća faza reprodukcije virusa je dezintegracija, što je oslobađanje NK iz kapside i vanjske ovojnice. Nakon što virion uđe u stanicu, kapsida prolazi kroz neke promjene, stječe osjetljivost na staničnu proteazu, zatim se uništava, istovremeno oslobađajući NK. Kod nekih bakteriofaga slobodna NA ulazi u stanice. Fitopatogeni virus ulazi kroz oštećenje stanične stijenke, a zatim se adsorbira na interni stanični receptor uz istovremeno oslobađanje NA.

Replikacija RNA i sinteza virusnih proteina

Sljedeća faza virusne reprodukcije je sinteza proteina specifičnog za virus, koji se odvija uz sudjelovanje takozvane glasničke RNA (u nekim virusima oni su dio viriona, au nekima se sintetiziraju samo u zaraženim stanicama izravno na predložak virionske DNA ili RNA). Dolazi do replikacije virusnog NK.

Proces razmnožavanja RNA virusa počinje nakon ulaska nukleoproteina u stanicu, gdje kompleksiranjem RNA s ribosomima nastaju virusni polisomi. Nakon toga se sintetiziraju i rani proteini koji uključuju represore iz staničnog metabolizma, kao i RNA polimeraze koje se prevode s matičnom RNA molekulom. U citoplazmi najmanjih virusa, odnosno u jezgri, virusna dvolančana RNA nastaje kompleksiranjem roditeljskog plus lanca (“+” - RNA lanac) s novosintetiziranim, kao i s njim komplementarnim minus lancem (“- ” - RNA lanac) . Povezivanje ovih niti nukleinske kiseline izaziva stvaranje samo jednolančane strukture RNA, koja se naziva replikativni oblik. Sinteze virusne RNA provode se replikacijskim kompleksima, u kojima sudjeluju replikativni oblik RNA, enzim RNA polimeraza i polisomi.

Postoje 2 vrste RNA polimeraza. To uključuje: RNA polimerazu I, koja katalizira stvaranje replikativnog oblika izravno na šablonu plus-lanca, kao i RNA polimerazu II, koja sudjeluje u sintezi jednolančane virusne RNK na matrici replikacijskog tipa. Sinteza nukleinskih kiselina u malim virusima odvija se u citoplazmi. Što se tiče virusa influence, unutarnji protein i RNA se sintetiziraju u jezgri. RNA se tada oslobađa iz jezgre i prodire u citoplazmu, u kojoj zajedno s ribosomima počinje sintetizirati virusni protein.

Nakon što virioni uđu u stanice, potiskuju sintezu nukleinskih kiselina, kao i staničnih proteina. Tijekom reprodukcije na matrici, u jezgri se sintetizira i mRNA koja nosi informaciju za sintezu proteina. Mehanizam sinteze virusnih proteina provodi se na razini staničnog ribosoma, a izvor izgradnje bit će fond aminokiselina. Aktivaciju aminokiselina provode enzimi, uz pomoć mRNA prenose se izravno u ribosome (polisome), u kojima se već nalaze u sintetiziranoj proteinskoj molekuli.

Dakle, u zaraženim stanicama sinteza nukleinskih kiselina i virionskih proteina odvija se u sklopu replikativno-transkripcijskog kompleksa, koji je reguliran određenim sustavom mehanizama.

Morfogeneza viriona

Stvaranje viriona može se dogoditi samo u slučaju strogo uređene veze strukturnih virusnih polipeptida, kao i njihove NA. A to je osigurano takozvanim samosastavljanjem proteinskih molekula u blizini NC.

Stvaranje viriona

Formiranje viriona događa se uz sudjelovanje nekih strukturnih komponenti koje čine stanicu. Virusi herpesa, dječje paralize i vakcinije nastaju u citoplazmi, a adenovirusi u jezgri. Sinteza virusne RNK, kao i stvaranje nukleokapsida, događa se izravno u jezgri, a hemaglutinin se formira u citoplazmi. Nakon toga nukleokapsida prelazi iz jezgre u citoplazmu u kojoj se odvija stvaranje ovojnice viriona. Nukleokapsid je izvana prekriven virusnim proteinima, a hemaglutinini i neuraminidaza uključeni su u virion. Tako nastaje potomstvo, na primjer, virusa gripe.

Oslobađanje viriona iz stanice domaćina

Virusne čestice se oslobađaju iz stanice "domaćina" istovremeno (tijekom razaranja stanice) ili postupno (bez ikakvog uništenja stanice).

Upravo u tom obliku dolazi do reprodukcije virusa. Virioni se oslobađaju iz stanica, obično na dva načina.

Prva metoda

Prva metoda podrazumijeva sljedeće: nakon apsolutnog sazrijevanja viriona izravno unutar stanice, oni se zaokružuju, tamo se formiraju vakuole, a zatim se uništava i stanična membrana. Po završetku ovih procesa, virioni se oslobađaju svi u isto vrijeme i potpuno iz stanica (pikornavirusi). Ova metoda se naziva litička.

Druga metoda

Druga metoda uključuje otpuštanje viriona dok sazrijevaju 2-6 sati na citoplazmatskoj membrani (miksovirusi i arbovirusi). Izlučivanje miksovirusa iz stanice pospješuje neuraminidaza koja razara staničnu membranu. Tijekom ove metode 75-90% viriona se spontano oslobađa u medij kulture, a stanice postupno umiru.