Vrste interakcija između virusa i stanice. Produktivni tip interakcije virus-stanica

Interakcija viriona sa živom stanicom odvija se u nekoliko faza.

U početno (pripremno) razdoblje Virion se veže za stanicu, prodire u nju, nakon čega se proteinska ljuska viriona uništava, oslobađajući nukleinsku kiselinu.

Dolazak skriveno (latentno) razdoblje virusna infekcija, tijekom koje se nikakvim metodama ne može detektirati prisutnost virusnih čestica u zaraženoj stanici – čini se da matični virion nestaje. Tijekom tog razdoblja virusna nukleinska kiselina koja je ušla u stanicu organizira sintezu virusnih komponenti potomaka, koristeći u tu svrhu enzimski sustav domaćina. Reprodukcijski ciklus završava stvaranjem viriona kćeri i njihovim oslobađanjem iz stanice ( završno razdoblje ).

Jednostavnije bakterije nisu sposobne same uhvatiti čestice iz okoline. Stoga bakteriofagi imaju posebne uređaji za svladavanje gustog bakterijskog zida. Na kraju repa nalazi se poseban enzim koji otapa bakterijsku membranu. Tada se mikroskopski "mišići" repa skupljaju i nukleinska kiselina faga se "ubrizgava" u stanicu, kao da se ubrizgava špricom.

Kao rezultat toga, proteinski omotač faga ostaje na površini stanice, a samo nukleinska kiselina ulazi u stanicu.

Nukleinske kiseline virusa provode program stvaranja novih virusnih potomaka u stanici. To je dokazano originalnim pokusima. Bilo je moguće razdvojiti viruse na njihove sastavne komponente - proteine ​​i nukleinske kiseline. Ispostavilo se da je do infekcije stanica i razmnožavanja virusa došlo tek nakon dodavanja virusne nukleinske kiseline u stanice. Drugim riječima, same nukleinske kiseline virusa mogu uzrokovati razmnožavanje virusa, tj. imaju infektivna svojstva. U drugom eksperimentu, dva su virusa razdvojena na sastavne komponente i zatim "odjenuta": nukleinska kiselina jednog virusa "obučena" je u ljusku drugog. Dobiveni hibridi zarazili su osjetljive stanice. Otkriveno je da su oba "prerušena" virusa sposobna razmnožavati se, a dobiveni potomci uvijek su slični virusu čiju je nukleinsku kiselinu hibrid sadržavao.

Virusna nukleinska kiselina koja je ušla u stanicu kontrolira sve procese reprodukcije virusa. Prvo, prisiljava stanicu da sintetizira takozvane rane proteine, koji suzbijaju vlastiti metabolizam stanice i osiguravaju sintezu nukleinskih kiselina čestica kćeri. Njihov nastanak nastaje kao rezultat samokopiranja roditeljske nukleinske kiseline. Genetske informacije sadržane u nukleinskoj kiselini virusa određuju sastav proteina od kojih se grade čestice kćeri kasnih proteina tzv. U virusima koji sadrže DNA, ove informacije se realiziraju na uobičajeni način za stanicu: informacijska RNA (transkripcija) se sintetizira na DNA, koja kontrolira naknadnu biosintezu proteina (translacija). Nukleinska kiselina mnogih virusa koji sadrže RNA kombinira genetske i informacijske funkcije: RNA je uključena i u replikaciju i u translaciju (u reprodukciji nukleinskih kiselina i proteina virusa). U mnogim virusima, izgradnja proteinskih ljuski i unutarnjeg sadržaja odvija se odvojeno. Stanica "akumulira" pojedinačne dijelove, koji se zatim kombiniraju u virusne čestice. Kada se u zaraženoj stanici nakupi dovoljan broj “praznina” za buduće virusne čestice, počinje svojevrsno sklapanje dijelova (sastavljanje). Ovaj se proces obično događa u blizini stanične membrane koja u njemu sudjeluje. Virusna čestica često sadrži tvari koje

karakterističan za stanicu u kojoj se virus razmnožava. Na primjer, za virus gripe, završna faza formiranja virusne čestice je svojevrsno omotavanje slojem stanične membrane. Odnosno, stanica ne samo da "hrani" i "zalijeva" virus, već ih i "oblači" za rastanak. Posljednji stupanj interakcije između virusa i stanice obično kratko traje. Rezultirajuće punopravne virusne čestice brzo izlaze u vanjsko okruženje. Proizvodnja potomaka u bakteriofagima odvija se na vrlo jedinstven način. Obično je popraćeno otapanjem (lizom) bakterijskih stanica pod djelovanjem posebnog enzima, koji se nakuplja u stanici paralelno s razmnožavanjem faga i dovodi do njegovog uništenja i smrti. Pod mikroskopom možete jasno vidjeti kako se to događa. Ponekad se čini da bakterija eksplodira, u drugim slučajevima se u bakteriji stvara rupa (u sredini ili na jednom od krajeva) kroz koju njen sadržaj istječe. Iz jedne mrtve bakterije može se osloboditi i do nekoliko stotina novih čestica faga. Proces reprodukcije faga se nastavlja sve dok se sve bakterije osjetljive na ovaj fag ne unište. Virusi malih boginja, dječje paralize i encefalitisa također su karakterizirani brzim otpuštanjem stotina, a ponekad i tisuća viriona kćeri u okoliš. Drugi ljudski i životinjski virusi (herpes virus, virus zaušnjaka, reovirus) napuštaju stanice dok sazrijevaju. Ti virusi uspijevaju dovršiti nekoliko ciklusa reprodukcije prije nego što stanice umru, postupno iscrpljujući sintetske resurse stanica i uzrokujući njihovo uništenje. U nekim slučajevima, V. se može akumulirati unutar stanica, tvoreći klastere poput kristala (V. bjesnoće, adenovirusi, itd.), koji se nazivaju inkluzijska tijela.

Uz gripu, bjesnoću, psitakozu, boginje, takva se tijela nalaze u citoplazmi stanica, s proljetno-ljetnim encefalitisom, žutom groznicom, herpesom i poliomijelitisom - u jezgri; U nekim su infekcijama inkluzijska tjelešca nađena i u jezgri i u citoplazmi. Istraživanja posljednjih godina pokazala su da su u velikoj većini slučajeva ove inkluzije kolonije virusa, a njihov nastanak je prirodan u određenoj fazi reprodukcije uzročnika infekcije. Visoka specifičnost intracelularnih inkluzija u virusnim bolestima omogućuje korištenje ovog znaka za dijagnozu. Primjerice, citoplazmatske inkluzije (tzv. Negrijeva tjelešca) koje se nalaze u živčanim stanicama mozga glavni su dokaz bjesnoće, a specifične okrugle ili ovalne tvorevine (tzv. Guarnierijeva tjelešca) koje se nalaze u epitelnim stanicama ukazuju na boginje. Inkluzije su također opisane kod encefalitisa, spinalne paralize, slinavke i šapa i drugih bolesti. Biljni virusi stvaraju vrlo osebujne inkluzije koje imaju kristalni oblik. To jest, reprodukcija virusa događa se na poseban, neusporediv način. Najprije virusne čestice prodiru u stanice i otpuštaju se virusne nukleinske kiseline. Zatim se pripremaju detalji budućih virusnih čestica. Razmnožavanje završava sklapanjem novih virusnih čestica i njihovim oslobađanjem u okoliš. Gubitak bilo kojeg od ovih stadija dovodi do poremećaja normalnog ciklusa i povlači za sobom ili potpunu supresiju reprodukcije V. ili pojavu inferiornog potomstva.

Glavne faze interakcije između virusa i stanice domaćina.

1. Adsorpcija - mehanizam okidača povezan s interakcijom specifičnih receptora virusa i domaćina (u virusu influence - hemaglutinin, u virusu humane imunodeficijencije - glikoprotein gp 120).

2. Prodiranje - fuzijom superkapsida sa staničnom membranom ili endocitozom (pinocitoza).

3. Otpuštanje nukleinske kiseline - ―svlačenje nukleokapsida i aktivacija nukleinske kiseline.

4. Sinteza nukleinskih kiselina i virusnih proteina , tj. podređenosti sustava stanica domaćina i njihovog rada za reprodukciju virusa.

5. Sklop viriona - povezanost repliciranih kopija virusne nukleinske kiseline s kapsidnim proteinom.

6. Izlazak virusnih čestica iz stanice , dobivanje superkapsida od strane virusa s ovojnicom.

Oblici virusne infekcije.

Na razini makroorganizma, glavni oblici virusnih lezija ne razlikuju se bitno od onih koji se opažaju kada su pojedinačne stanice zaražene virusima.

Produktivna virusna infekcija uz stvaranje populacija kćeri i karakterističnih kliničkih manifestacija moguće je samo ako u inficiranom tijelu postoje osjetljive stanice u kojima se odvija reproduktivni ciklus uzročnika. Na primjer, poliomijelitis se može razmnožavati samo u stanicama gastrointestinalnog trakta i središnjeg živčanog sustava primata i ljudi.

Abortivna infekcija razvija se kada patogen prodre u neosjetljive stanice (na primjer, kada virus goveđe leukemije uđe u ljudsko tijelo) ili u stanice koje nisu sposobne osigurati puni reproduktivni ciklus (na primjer, one u G0 fazi staničnog ciklusa). Sposobnost stanica da održavaju reproduktivne procese specifične za virus također potiskuje IFN, čiji je antivirusni učinak usmjeren protiv širokog spektra virusa.

Trajna virusna infekcija događa se tijekom takve interakcije između virusa i zaražene stanice, kada potonja nastavlja obavljati vlastite stanične funkcije. Ako se zaražene stanice dijele, nastaje zaraženi klon. Dakle, povećanje broja zaraženih stanica doprinosi povećanju ukupne populacije patogena u tijelu. Međutim, trajne virusne infekcije obično oštećuju stanične funkcije, što na kraju dovodi do kliničkih manifestacija. Kod ljudi razvoj perzistentnih infekcija u određenoj mjeri ovisi o dobi. Na primjer, intrauterina infekcija virusom ospica rubeole ili citomegalovirusom (CMV) dovodi do vremenski ograničene perzistencije uzročnika. Pojava simptoma povezana je sa sposobnošću fetusa da razvije imunološke odgovore na infektivni agens.

Latentna (skrivena) virusna infekcija . Dok su perzistentne infekcije popraćene stalnim oslobađanjem virusnih populacija kćeri, u latentnim lezijama one se stvaraju sporadično. Reproduktivni ciklus takvih patogena naglo usporava u kasnijim fazama i aktivira se pod utjecajem različitih čimbenika.

Latentne infekcije karakteristične su za većinu herpesvirusa, uzrokujući rekurentne i obično neprogresivne bolesti.

Inaparatne infekcije *od lat. in-, denial, + appareo, be+ praćeni su asimptomatskom cirkulacijom malih količina uzročnika u pojedinim organima. U ovom slučaju, patogen se može identificirati samo posebnim metodama. Ono što razlikuje takve lezije od asimptomatskog nošenja je velika vjerojatnost kliničkih manifestacija. Ovaj izraz se koristi za brojne infekcije kod kojih nema očitih znakova bolesti. U praksi virusnih infekcija kod ljudi često se koristi alternativni izraz "subklinička infekcija". Zapravo, latentne infekcije mogu se smatrati kroničnim infekcijama unutar uređaja, u kojima se uspostavlja ravnoteža između tijela i uzročnika.

Uspavana (kriptogena) virusna infekcija - oblik manifestacije virusne infekcije u kojoj je patogen u neaktivnom stanju u zasebnim žarištima (na primjer, u živčanim ganglijima). Klinički, infekcija se očituje samo kada je tjelesna obrana oštro oslabljena. Na primjer, virus herpesa tipa 3, koji uzrokuje vodene kozice tijekom početne infekcije, ostaje u tijelu cijeli život. Ponavljanje bolesti u obliku herpes zostera moguće je samo s oslabljenim imunološkim statusom (najčešće u starijoj dobi).

Spore virusne infekcije karakteriziran dugim razdobljem inkubacije (mjeseci i godine), tijekom kojeg se uzročnik razmnožava, uzrokujući sve očitije oštećenje tkiva. U početku se uzročnik razmnožava u ograničenoj skupini stanica, ali postupno inficira sve veći broj njih. Bolesti završavaju razvojem teških lezija i smrću bolesnika. Spore virusne infekcije uključuju subakutni sklerozirajući panencefalitis, HIV infekciju itd.

№ 19 Vrste međudjelovanja virusa i stanice. Faze reprodukcije virusa.
Vrste međudjelovanja virusa i stanice. Postoje tri vrste interakcije između virusa i stanice: produktivna, abortivna i integrativna.
Produktivni tip- završava stvaranjem nove generacije viriona i smrću (lizom) inficiranih stanica (citolitički oblik). Neki virusi napuštaju stanice ne uništavajući ih (necitolitički oblik).
Abortivni tip- ne završava stvaranjem novih viriona, budući da je infektivni proces u stanici prekinut u jednoj od faza.
Integrativni tip, ili virogeneze- karakteriziran ugradnjom (integracijom) virusne DNA u obliku provirusa u stanični kromosom i njihovom zajedničkom koegzistencijom (zajednička replikacija).
Reprodukcija virusaprovodi se u nekoliko faza, uzastopno zamjenjujući jedna drugu: adsorpcija virusa na stanici; prodiranje virusa u stanicu; “svlačenje” virusa; biosinteza virusnih komponenti u stanici; stvaranje virusa; oslobađanje virusa iz stanice.
Adsorpcija.Interakcija virusa sa stanicom počinje procesom adsorpcije, tj. pričvršćivanja virusa na površinu stanice. Ovo je vrlo specifičan proces. Virus se adsorbira na određenim područjima stanične membrane - takozvanim receptorima. Stanični receptori mogu imati različitu kemijsku prirodu, predstavljajući proteine, ugljikohidratne komponente proteina i lipida, lipide. Broj specifičnih receptora na površini jedne stanice kreće se od 10 4 do 10 5. Posljedično, deseci pa čak i stotine virusnih čestica mogu se adsorbirati na stanici.
Prodor u stanicu. Postoje dva načina ulaska životinjskih virusa u stanicu: viropeksija i spajanje virusne ovojnice sa staničnom membranom. Kod viropeksije, nakon adsorpcije virusa, dolazi do invaginacije (invaginacije) dijela stanične membrane i stvaranja unutarstanične vakuole koja sadrži virusnu česticu. Vakuola s virusom može se transportirati u bilo kojem smjeru u različite dijelove citoplazme ili stanične jezgre. Proces fuzije provodi jedan od površinskih virusnih proteina kapside ili superkapside ljuske. Čini se da se oba mehanizma prodiranja virusa u stanicu ne isključuju, već se nadopunjuju.
"Traka".Proces "svlačenja" uključuje uklanjanje zaštitnih virusnih ljuski i oslobađanje unutarnje komponente virusa, što može uzrokovati infektivni proces. “Svlačenje” virusa odvija se postupno, u nekoliko faza, u određenim područjima citoplazme ili jezgre stanice, za što stanica koristi skup posebnih enzima. U slučaju prodiranja virusa spajanjem virusne ovojnice sa staničnom membranom, proces prodiranja virusa u stanicu kombinira se s prvom fazom njegovog "svlačenja". Krajnji proizvodi "svlačenja" su jezgra, nukleokapsida ili nukleinska kiselina virusa.
Biosinteza komponenti virusa. Virusna nukleinska kiselina koja je ušla u stanicu nosi genetsku informaciju koja se uspješno natječe s genetskom informacijom stanice. Dezorganizira funkcioniranje staničnih sustava, potiskuje vlastiti metabolizam stanice i tjera je da sintetizira nove virusne proteine ​​i nukleinske kiseline koje se koriste za izgradnju virusnog potomstva.
Implementacija genetske informacije virusa provodi se u skladu s procesima transkripcije, translacije i replikacije.
Formiranje (sastavljanje) virusa. Sintetizirane virusne nukleinske kiseline i proteini imaju sposobnost specifičnog "prepoznavanja" jedni drugih i, ako je njihova koncentracija dovoljna, spontano se spajaju kao rezultat hidrofobnih, solnih i vodikovih veza.
Postoje sljedeća opća načela za sastavljanje virusa s različitim strukturama:
1. Nastanak virusa je višefazni proces uz nastanak međuoblika;
2. Sastavljanje jednostavno raspoređenih virusa uključuje interakciju molekula virusne nukleinske kiseline s kapsidnim proteinima i stvaranje nukleokapsida (na primjer, polio virusi). U složenim virusima najprije nastaju nukleokapsidi s kojima stupaju u interakciju proteini superkapsidne ljuske (na primjer, virusi influence);
3. Stvaranje virusa ne događa se u unutarstaničnoj tekućini, već na jezgri ili citoplazmatskim membranama stanice;
4. Složeno organizirani virusi tijekom procesa nastanka uključuju komponente stanice domaćina (lipide, ugljikohidrate).
Izlazak virusa iz stanice. Postoje dva glavna tipa oslobađanja virusnog potomstva iz stanice. Prvi tip - eksplozivni - karakterizira istovremeno oslobađanje velikog broja virusa. U tom slučaju stanica brzo umire. Ova metoda izlaza tipična je za viruse koji nemaju superkapsidnu ljusku. Druga vrsta je pupanje. Karakterističan je za viruse koji imaju superkapsidnu ovojnicu. U završnoj fazi sastavljanja, nukleokapside složenih virusa fiksiraju se na staničnoj plazma membrani, modificiranoj virusnim proteinima, i postupno je izvlače. Kao rezultat izbočenja nastaje "pupoljak" koji sadrži nukleokapsid. “Pupoljak” se tada odvaja od stanice. Stoga se vanjski omotač ovih virusa formira dok izlaze iz stanice. Ovim mehanizmom stanica može proizvoditi virus dulje vrijeme, održavajući u određenoj mjeri svoje osnovne funkcije.
Vrijeme potrebno za završetak punog ciklusa reprodukcije virusa varira od 5-6 sati (virusi gripe, boginja itd.) do nekoliko dana (virusi ospica, adenovirusi itd.). Rezultirajući virusi sposobni su zaraziti nove stanice i u njima proći kroz gore spomenuti ciklus razmnožavanja.

Proces reprodukcije virusa može se grubo podijeliti u 2 faze . Prva faza uključuje 3 faze: 1) adsorpcija virusa na osjetljive stanice; 2) prodiranje virusa u stanicu; 3) deproteinizacija virusa . Druga faza uključuje faze implementacije virusnog genoma: 1) transkripcija, 2) translacija, 3) replikacija, 4) sklapanje, sazrijevanje virusnih čestica i 5) izlazak virusa iz stanice.

Interakcija virusa sa stanicom počinje procesom adsorpcije, tj. pričvršćivanjem virusa na površinu stanice.

Adsorpcija je specifično vezanje proteina viriona (antireceptora) na komplementarnu strukturu površine stanice – stanični receptor. Prema svojoj kemijskoj prirodi, receptori na koje su virusi fiksirani pripadaju dvije skupine: mukoproteinski i lipoproteinski. Virusi influence, parainfluence i adenovirusi fiksirani su na mukoproteinske receptore. Enterovirusi, herpes virusi, arbovirusi adsorbirani su na lipoproteinske receptore stanice. Adsorpcija se događa samo u prisutnosti određenih elektrolita, posebice iona Ca2+, koji neutraliziraju višak anionskih naboja virusa i površine stanice te smanjuju elektrostatsko odbijanje. Adsorpcija virusa malo ovisi o temperaturi. Početni procesi adsorpcije su nespecifične prirode i rezultat je elektrostatske interakcije pozitivno i negativno nabijenih struktura na površini virusa i stanice, a potom dolazi do specifične interakcije između proteina za pričvršćivanje viriona i specifičnih skupina na plazma membrani stanice. Jednostavni ljudski i životinjski virusi sadrže pričvrsne proteine ​​kao dio kapside. U složenim virusima, pričvrsni proteini su dio superkapsida. Mogu biti u obliku filamenata (vlakna kod adenovirusa), ili šiljaka, gljivastih struktura kod myxo-, retro-, rhabdo- i drugih virusa. U početku dolazi do jedne veze viriona s receptorom - takvo pričvršćivanje je krhko - adsorpcija je reverzibilna. Da bi došlo do ireverzibilne adsorpcije, moraju se pojaviti višestruke veze između virusnog receptora i staničnog receptora, tj. stabilno viševalentno pričvršćivanje. Broj specifičnih receptora na površini jedne stanice je 10 4 -10 5. Receptori za neke viruse, na primjer, arboviruse. nalaze se na stanicama i kralježnjaka i beskralješnjaka; za ostale viruse samo na stanicama jedne ili više vrsta.

Prodiranje ljudskih i životinjskih virusa u stanice odvija se na dva načina: 1) viropeksijom (pinocitozom); 2) spajanje virusne superkapsidne ljuske sa staničnom membranom. Bakteriofagi imaju vlastiti mehanizam prodiranja, takozvanu špricu, kada se, kao rezultat kontrakcije proteinskog dodatka faga, nukleinska kiselina ubrizgava u stanicu.

Deproteinizacija virusa, oslobađanje virusnog hemoma iz virusnih zaštitnih ljuski događa se ili uz pomoć virusnih enzima ili uz pomoć staničnih enzima. Krajnji proizvodi deproteinizacije su nukleinske kiseline ili nukleinske kiseline povezane s unutarnjim virusnim proteinom. Zatim se odvija druga faza virusne reprodukcije, koja dovodi do sinteze virusnih komponenti.

Transkripcija je prepisivanje informacija iz DNA ili RNA virusa u mRNA prema zakonima genetskog koda.

Translacija je proces prevođenja genetske informacije sadržane u mRNA u određeni niz aminokiselina.

Replikacija je proces sinteze molekula nukleinske kiseline homolognih virusnom genomu.

Implementacija genetske informacije u virusima koji sadrže DNA ista je kao u stanicama:

Transkripcija DNA mRNA translacijski protein

RNA transkripcija i-RNA translacijski protein

Virusi s pozitivnim RNA genomom (togavirusi, pikornavirusi) nemaju transkripciju:

Translacija RNA proteina

Retrovirusi imaju jedinstven način prijenosa genetskih informacija:

RNA reverzna transkripcija DNA transkripcija mRNA translacijski protein

DNK se integrira u genom stanice domaćina (provirus).

Nakon što je stanica nakupila virusne komponente, počinje posljednja faza virusne reprodukcije: sklapanje virusnih čestica i oslobađanje viriona iz stanice. Virioni izlaze iz stanice na dva načina: 1) “eksplodiranjem” stanice, pri čemu se stanica uništava. Ovaj put je svojstven jednostavnim virusima (picorna-, reo-, papova- i adenovirusi), 2) izlaz iz stanica pupanjem. Svojstveno virusima koji sadrže superkapsid. Ovom metodom stanica ne umire odmah i može proizvesti više virusnih potomaka dok se njezini resursi ne potroše.

Metode uzgoja virusa

Za uzgoj virusa u laboratorijskim uvjetima koriste se sljedeći živi objekti: 1) stanične kulture (tkiva, organi); 2) pileći embriji; 3) laboratorijske životinje.

Kultura stanica

Najčešće su jednoslojne kulture stanica koje se mogu podijeliti na 1) primarne (prvenstveno tripsinizirane), 2) polukontinuirane (diploidne) i 3) kontinuirane.

Po porijeklu dijele se na embrionalne, tumorske i iz odraslih organizama; morfogenezom- fibroblastični, epitelni itd.

Primarni Stanične kulture su stanice bilo kojeg ljudskog ili životinjskog tkiva koje imaju sposobnost rasta u obliku monosloja na plastičnoj ili staklenoj površini obloženoj posebnom hranjivom podlogom. Životni vijek takvih usjeva je ograničen. U svakom konkretnom slučaju dobivaju se iz tkiva nakon mehaničkog mljevenja, tretmana proteolitičkim enzimima i standardizacije broja stanica. Primarne kulture dobivene iz bubrega majmuna, bubrega ljudskog embrija, ljudskog amniona i pilećih embrija naširoko se koriste za izolaciju i nakupljanje virusa, kao i za proizvodnju virusnih cjepiva.

Polukožna (ili diploidan ) stanične kulture - stanice istog tipa, sposobne izdržati do 50-100 prolaza in vitro, zadržavajući svoj izvorni diploidni set kromosoma. Diploidni sojevi fibroblasta ljudskog embrija koriste se i za dijagnozu virusnih infekcija i u proizvodnji virusnih cjepiva.

Stalan stanične linije karakteriziraju potencijalna besmrtnost i heteroploidni kariotip.

Izvor transplantabilnih linija mogu biti primarne stanične kulture (npr. SOC, PES, BHK-21 - iz bubrega jednodnevnih sirijskih hrčaka; PMS - iz bubrega zamorca itd.) pojedinačne stanice koji pokazuju sklonost beskonačnom razmnožavanju in vitro. Skup promjena koje dovode do pojave takvih obilježja stanica naziva se transformacija, a stanice kontinuiranih kultura tkiva nazivaju se transformiranim.

Drugi izvor transplantabilnih staničnih linija su maligne neoplazme. U ovom slučaju, transformacija stanica događa se in vivo. U virološkoj praksi najčešće se koriste sljedeće linije transplantiranih stanica: HeLa - dobivene iz karcinoma vrata maternice; Ner-2 - od karcinoma grkljana; Detroit-6 - od metastaza raka pluća do koštane srži; RH - iz ljudskog bubrega.

Za uzgoj stanica potrebne su hranjive podloge koje se prema namjeni dijele na podloge za rast i podloge. Medij za rast mora sadržavati više hranjivih tvari kako bi se osigurala aktivna proliferacija stanica za stvaranje monosloja. Potporni medij trebao bi osigurati samo preživljavanje stanica u već formiranom jednosloju tijekom razmnožavanja virusa u stanici.

Standardni sintetički mediji, kao što su sintetski mediji 199 i Eagleovi mediji, naširoko se koriste. Bez obzira na namjenu, svi mediji za kulturu stanica formulirani su pomoću uravnotežene otopine soli. Najčešće je to Hanksovo rješenje. Sastavni dio većine podloga za uzgoj je serum životinjske krvi (teletina, goveda, konja), bez čijeg 5-10% ne dolazi do reprodukcije stanica i stvaranja monosloja. Serum nije uključen u medije za održavanje.

Izolacija virusa u kulturama stanica i metode njihove indikacije.

Pri izolaciji virusa iz raznih infektivnih materijala bolesnika (krv, urin, feces, sluzni iscjedak, ispiranja organa) koriste se stanične kulture koje su najosjetljivije na suspektni virus. Za infekciju se koriste kulture u epruvetama s dobro razvijenim monoslojem stanica. Prije inficiranja stanica uklanja se hranjivi medij i u svaku epruvetu dodaje 0,1-0,2 ml suspenzije ispitivanog materijala prethodno tretiranog antibioticima za uništavanje bakterija i gljivica. Nakon 30-60 min. Nakon kontakta virusa sa stanicama, uklanja se višak materijala, u epruvetu se dodaje potporni medij i ostavlja u termostatu dok se ne otkriju znakovi replikacije virusa.

Indikator prisutnosti virusa u zaraženim kulturama stanica može biti:

1) razvoj specifične stanične degeneracije - citopatski učinak virusa (CPE), koji ima tri glavne vrste: okrugla ili mala degeneracija stanica; stvaranje višejezgrenih divovskih stanica - simplasta; razvoj žarišta stanične proliferacije, koji se sastoji od nekoliko slojeva stanica;

2) otkrivanje intracelularnih inkluzija smještenih u citoplazmi i jezgri zahvaćenih stanica;

3) pozitivna reakcija hamaglutinacije (RHA);

4) pozitivna hemadsorpcijska reakcija (RHAds);

5) fenomen stvaranja plaka: monosloj stanica zaraženih virusom prekriva se tankim slojem agara uz dodatak neutralnog crvenog indikatora (pozadina - ružičasta). U prisutnosti virusa, na podlozi ružičastog agara u stanicama stvaraju se bezbojne zone (“plakovi”).

6) u odsutnosti CPD-a ili GA-a može se izvesti interferencijska reakcija: kultura koja se proučava ponovno je zaražena virusom koji uzrokuje CPD. U pozitivnom slučaju neće biti CPP (reakcija interferencije je pozitivna). Ako u ispitivanom materijalu nije bilo virusa, promatra se CPE.

Izolacija virusa u pilećim zamecima.

Za virološke studije koriste se pileći embriji stari 7-12 dana.

Prije infekcije utvrđuje se sposobnost preživljavanja embrija. Tijekom ovoskopiranja, živi embriji su pokretni i jasno je vidljiv vaskularni uzorak. Granice zračne vrećice označene su jednostavnom olovkom. Pileći embriji se inficiraju u aseptičnim uvjetima, sterilnim instrumentima, nakon prethodnog tretiranja ljuske iznad zračnog prostora jodom i alkoholom.

Metode zaraze pilećih embrija mogu biti različite: nanošenje virusa na korion-alantoičnu membranu, u amnionsku i alantoičnu šupljinu, u žumanjčanu vrećicu. Izbor metode infekcije ovisi o biološkim svojstvima virusa koji se proučava.

Indikacija virusa u kokošjem embriju je smrt embrija, pozitivna reakcija hemaglutinacije na staklu s alantoičkom ili amnionskom tekućinom i žarišne lezije ("plakovi") na korionsko-alantoisnoj membrani.

III. Izolacija virusa u laboratorijskim životinjama.

Laboratorijske životinje mogu se koristiti za izolaciju virusa iz zaraznog materijala kada se ne mogu koristiti prikladniji sustavi (stanične kulture ili pileći embriji). Uzimaju uglavnom tek rođene bijele miševe, hrčke, zamorce i štakore. Životinje se inficiraju prema principu citotropizma virusa: pneumotropni virusi se ubrizgavaju intranazalno, neurotropni virusi - intracerebralno, dermatotropni virusi - na kožu.

Indikacija virusa temelji se na pojavi znakova bolesti kod životinja, njihovom uginuću, patomorfološkim i patohistološkim promjenama u tkivima i organima, kao i pozitivnoj reakciji hemaglotinacije s ekstraktima iz organa.

Apstraktni virusi

Virusi igraju veliku ulogu u ljudskom životu. Oni su uzročnici niza opasnih bolesti - velikih boginja, hepatitisa, encefalitisa, rubeole, bjesnoće, gripe itd.

Godine 1892. ruski znanstvenik D.I. Ivanovsky je opisao neobična svojstva uzročnika bolesti duhana - mozaika duhana. Ovaj patogen je prošao kroz bakterijske filtre i, štoviše, nije rastao na umjetnim hranjivim medijima. Tako bi zdrave biljke duhana mogle biti zaražene bezstaničnim filtratom iz soka bolesne biljke.

Koliko godina kasnije otkriven je uzročnik slinavke i šapa koji je prošao i kroz bakterijske filtere.

Godine 1898. Beijerinck je skovao novu riječ "virus" (od latinske riječi otrov) kako bi ukazao na zaraznu prirodu određenih filtriranih biljnih tekućina.

Godine 1917. F. d'Herrel otkrio je bakteriofag - virus koji inficira bakterije. Međutim, dugo je vrijeme struktura virusa ostala misterij znanstvenicima. Zato su virusi bili među prvim objektima koji su ispitivani pod elektronskim mikroskopom odmah nakon otkrića 30-ih godina prošlog stoljeća.

Razlike između virusa i drugih organizama:

1. Virusi su najmanji organizmi (u prosjeku su 50 puta manje od bakterija), ne mogu se vidjeti svjetlosnim mikroskopom. 30-300 nm.

2. Virusi nemaju staničnu strukturu. Ako staničnu strukturu smatramo obaveznim znakom života, tada virusi nisu živi. Međutim, posjeduju genetski materijal i sposobni su za samoreprodukciju. Postoji pretpostavka da su virusi genetski materijal koji je jednom pobjegao iz stanice i zadržao sposobnost reprodukcije kada se vratio u staničnu okolinu.

3. Virusi se mogu razmnožavati samo unutar žive stanice i nisu neovisni organizmi.

4. Virusi se sastoje od jedne male molekule nukleinske kiseline (DNA ili RNA) i okruženi su proteinskom ovojnicom

5. Za razliku od staničnih organizama, virusi ne mogu sami sintetizirati proteine. Virus u stanicu unosi samo svoju nukleinsku kiselinu, koja isključuje DNK domaćina i daje stanici naredbu da sintetizira potrebne proteine ​​(za sastavljanje i oslobađanje novih kopija virusa).

Struktura virusa

Virusna čestica, koja se također naziva virion, sastoji se od nukleinske kiseline (DNA ili RNA) okružene proteinskom ovojnicom. Ova ljuska se zove kapsida. Kapsida se sastoji od podjedinica - kapsomeri. Kapsid s nukleinskom kiselinom – nukleokapsida- može biti gola ili imati dodatnu školjku ( virusi gripe i herpesa).

Najjednostavniji virusi, poput virusa duhanskog mozaika, imaju samo proteinski kapsid. Struktura virusa bradavica i adenovirusa slična je..

Virusne čestice mogu biti štapićaste ili filamentozne, ili mogu imati oblik poliedra.

Interakcija virus-stanica

1. Prepoznavanje virusom svoje stanice. U pravilu, ulasku virusa prethodi njegovo vezanje na poseban receptorski protein na površini stanice.

2. Adsorpcija – pričvršćivanje viriona na površinu stanice. Vezanje se provodi pomoću posebnih proteina na površini virusne čestice, koji prepoznaju odgovarajući receptor na površini stanice. Kao ključ u bravu.

3. Prodor kroz membranu. Dio membrane na koji se virus pričvrstio uronjen je u citoplazmu i pretvara se u vakuolu, koja se zatim može spojiti s jezgrom.

4. “Svlačenje” - oslobađanje od kapside. Javlja se ili na površini stanice ili kao rezultat razaranja kapside od strane staničnih enzima u citoplazmi.

5. Kopiranje (reduplikacija) virusne nukleinske kiseline.

6. Sinteza virusnih proteina.

7. Sklapanje viriona u jezgri ili citoplazmi.

8. Izlazak viriona iz stanice. Kod nekih virusa to se događa "eksplozijom", uslijed čega se narušava cjelovitost stanice i ona umire. Drugi se virusi oslobađaju na način koji podsjeća na pupanje. U tom slučaju stanice domaćina mogu dugo zadržati svoju održivost. Virioni se oslobađaju iz stanice različitim brzinama. U nekim vrstama infekcija, virioni mogu ostati u stanici dosta dugo, a da je ne unište.

Virusi bakterija

Virusi koji napadaju bakterije , nazivaju se bakteriofagi ili jednostavno fagi.

Građa bakteriofaga uglavnom proučavan na primjeru T-faga Eccherichia coli(kolifag). Kolifag se sastoji od poliedarske glave i repa. Glava se sastoji od kapsomera i sadrži DNK unutra. Rep ima složenu strukturu i sastoji se od šuplje šipke, kontraktilne ovojnice koja ga okružuje i bazalne ploče s bodljama i nitima (potrebne za adsorpciju na stanici domaćinu).

Prodor bakteriofaga u stanicu

Debele stanične stijenke bakterija ne dopuštaju virusu da uđe u citoplazmu, kao kod inficiranja životinjskih stanica. Zbog toga bakteriofag umetne šuplji štapić u stanicu i kroz njega istisne nukleinsku kiselinu koja se nalazi u glavici.

D. I. Ivanovsky otkrio je viruse 1892 postavio je temelje za razvoj virološke znanosti. Njegovom bržem razvoju pridonio je izum elektronskog mikroskopa i razvoj metode uzgoja mikroorganizama u kulturama stanica.

Virologija je trenutno znanost koja se brzo razvija, što je posljedica niza razloga:

Vodeća uloga virusa u ljudskoj infektivnoj patologiji (primjeri - virus influence, HIV virus humane imunodeficijencije, citomegalovirus i drugi herpes virusi) u pozadini gotovo potpunog odsustva specifične kemoterapije;

Korištenje virusa za rješavanje mnogih temeljnih pitanja u biologiji i genetici.

Osnovna svojstva virusa (i plazmida), po čemu se razlikuju od ostatka živog svijeta.

1. Ultramikroskopske dimenzije (mjerene u nanometrima). Veliki virusi (virus malih boginja) mogu doseći veličinu od 300 nm, mali - od 20 do 40 nm. 1mm=1000µm, 1µm=1000nm.

3. Virusi nisu sposobni za rast i binarnu fisiju.

4. Virusi se razmnožavaju tako da se sami razmnožavaju u zaraženoj stanici domaćina koristeći vlastitu genomsku nukleinsku kiselinu.

6. Stanište virusa su žive stanice – bakterije (to su bakterijski virusi ili bakteriofagi), biljne, životinjske i ljudske stanice.

Svi virusi postoje u dva kvalitativno različita oblika: izvanstanični - virion i intracelularni - virus. Taksonomija ovih predstavnika mikrokozmosa temelji se na karakteristikama viriona - završnoj fazi razvoja virusa.

Građa (morfologija) virusa

1. Genom virusa tvore nukleinske kiseline, predstavljene jednolančanim molekulama RNA (u većini RNA virusa) ili dvolančanim molekulama DNA (u većini virusa DNA).

2. Kapsid- proteinski omotač u koji je upakirana genomska nukleinska kiselina. Kapsida se sastoji od identičnih proteinskih podjedinica - kapsomeri. Postoje dva načina pakiranja kapsomera u kapsidu - spiralni (spiralni virusi) i kubični (sferični virusi).

Sa spiralnom simetrijom proteinske podjedinice raspoređene su spiralno, a između njih je, također spiralno, položena genomska nukleinska kiselina (filamentozni virusi). S kubnom vrstom simetrije virioni mogu biti u obliku poliedara, najčešće - dvadesetohedra - Ikosaedri.

3. Jednostavno dizajnirani virusi imaju samo nukleokapsida, tj. kompleks genoma s kapsidom naziva se "goli".

4. Drugi virusi imaju dodatnu ovojnicu nalik membrani na vrhu kapside, koju virus dobiva u trenutku izlaska iz stanice domaćina - superkapsida. Takvi se virusi nazivaju "odjeveni".

Osim virusa, postoje još jednostavnije organizirani oblici uzročnika sposobnih za prijenos - plazmidi, viroidi i prioni.

Glavne faze interakcije između virusa i stanice domaćina

1. Adsorpcija je mehanizam okidača povezan s interakcijom specifično receptore virusa i domaćina (kod virusa influence - hemaglutinin, kod virusa humane imunodeficijencije - glikoprotein gp 120).

2. Penetracija – srastanjem superkapsida sa staničnom membranom ili endocitozom (pinocitoza).

3. Oslobađanje nukleinskih kiselina - “svlačenje” nukleokapsida i aktivacija nukleinske kiseline.

4. Sinteza nukleinskih kiselina i virusnih proteina, odnosno podređivanje sustava stanica domaćina i njihovog rada za reprodukciju virusa.

5. Sklapanje viriona - povezivanje repliciranih kopija virusne nukleinske kiseline s kapsidnim proteinom.

6. Izlazak virusnih čestica iz stanice, stjecanje superkapsida od strane virusa s ovojnicom.

Ishodi interakcije između virusa i stanica domaćina

1. Proces pobačaja- kada se stanice oslobode od virusa:

Kada se zarazi neispravan virus za čiju je replikaciju potreban pomoćni virus, neovisna replikacija ovih virusa je nemoguća (tzv. virusoidi). Na primjer, delta (D) virus hepatitisa može se replicirati samo u prisutnosti virusa hepatitisa B, njegov Hbs - antigen, adeno-povezan virus - u prisutnosti adenovirusa);

Kada virus zarazi stanice koje su genetski neosjetljive na njega;

Kada su osjetljive stanice zaražene virusom u nedopuštenim uvjetima.

2. Produktivni proces- replikacija (proizvodnja) virusa:

- smrt (liza) stanica(citopatski učinak) - rezultat intenzivnog razmnožavanja i stvaranja velikog broja virusnih čestica - karakterističan rezultat produktivnog procesa uzrokovanog virusima visoke citopatogenosti. Citopatski učinak na stanične kulture za mnoge je viruse prilično prepoznatljive specifične prirode;

- stabilna interakcija, koji ne dovodi do smrti stanice (perzistentne i latentne infekcije) – tzv virusna transformacija stanice.

3. Integrativni proces- integracija virusnog genoma s genomom stanice domaćina. Ovo je posebna verzija proizvodnog procesa slična stabilnoj interakciji. Virus se replicira zajedno s genomom stanice domaćina i može dugo ostati latentan. Samo se DNK virusi mogu integrirati u DNK genom domaćina (princip "DNK u DNK"). Jedini RNA virusi koji se mogu integrirati u genom stanice domaćina su retrovirusi koji za to imaju poseban mehanizam. Osobitost njihove reprodukcije je sinteza DNA provirusa na temelju genomske RNA pomoću enzima reverzne transkriptaze, nakon čega slijedi integracija DNA u genom domaćina.

Osnovne metode uzgoja virusa

1. U tijelu laboratorijskih životinja.

2. Kod pilećih embrija.

3. U kulturama stanica – glavna metoda.

Vrste staničnih kultura

1. Primarne (tripsinizirane) kulture- fibroblasti pilećih embrija (CHF), ljudski fibroblasti (CHF), stanice bubrega raznih životinja i dr. Primarne kulture dobivaju se iz stanica različitih tkiva, najčešće drobljenjem i tripsinizacijom, a koriste se jednokratno, tj. uvijek je potrebno imati odgovarajuće organe ili tkiva.

2. Diploidne stanične linije prikladni za ponovnu disperziju i rast, obično ne više od 20 prolaza (gube svoja izvorna svojstva).

3. Međusobno povezani vodovi(heteroploidne kulture), sposobne za ponovnu disperziju i transplantaciju, tj. višestruke pasaže, najprikladnije su u virološkom radu - npr. tumorske stanične linije Hela, Hep itd.

Posebne hranjive podloge za stanične kulture

Koriste se različite sintetičke virološke hranjive podloge složenog sastava, uključujući veliki skup različitih faktora rasta - podloga 199, Igla, Hanksova otopina, hidrolizat laktalbumina. U medije se dodaju pH stabilizatori (Hepes), krvni serum raznih vrsta (fetalni teleći serum smatra se najučinkovitijim), L-cistein i L-glutamin.

Ovisno o funkcionalnoj namjeni okoliša, može postojati visina(s visokim udjelom krvnog seruma) - koriste se za uzgoj staničnih kultura prije dodavanja virusnih uzoraka, te podupirući(s manjim sadržajem seruma ili bez seruma) - za održavanje staničnih kultura zaraženih virusom.

Detektivne manifestacije virusne infekcije staničnih kultura

1. Citopatski učinak.

2. Identifikacija inkluzijskih tijela.

3. Detekcija virusa fluorescentnim protutijelima (MFA), elektronskom mikroskopijom, autoradiografijom.

4. Test boja. Uobičajena boja korištenog medija za kulturu, koji sadrži fenol crveno kao pH indikator, u optimalnim uvjetima kulture stanica (pH oko 7,2) je crvena. Proliferacija stanica mijenja pH i, sukladno tome, boju medija iz crvene u žutu zbog pomaka pH na kiselu stranu. Kad se virusi umnože u staničnim kulturama, dolazi do lize stanica, a pH i boja medija se ne mijenjaju.

5. Dokazivanje virusnog hemaglutinina - hemadsorpcija, hemaglutinacija.

6. Plak metoda (stvaranje plaka). Kao rezultat citolitičkog učinka mnogih virusa na stanične kulture nastaju zone masovne stanične smrti. Identificiraju se plakovi - virusne “stanično-negativne” kolonije.

Nomenklatura virusa.

Ime obitelji virusa završava na "viridae", rod - "virus", obično se koriste posebni nazivi za vrstu, na primjer, virus rubeole, virus humane imunodeficijencije - HIV, virus humane parainfluence tipa 1 itd.

Bakterijski virusi (bakteriofagi)

Prirodno stanište faga je bakterijska stanica, pa su fagi rasprostranjeni posvuda (npr. u otpadnim vodama). Fagi imaju biološke karakteristike koje su karakteristične i za druge viruse.

Morfološki najčešći tip faga karakterizira prisutnost glave - ikozaedra, procesa (repa) sa spiralnom simetrijom (često ima šuplju šipku i kontraktilnu ovojnicu), bodlji i nastavaka (filamenti), tj. izgledom pomalo podsjeća na spermatozoid.

Interakcija faga sa stanicom (bakterijom) je strogo specifična, tj. bakteriofagi mogu zaraziti samo određene vrste i fagotipovi bakterije.

Glavne faze interakcije između faga i bakterije

1. Adsorpcija (interakcija specifičnih receptora).

2. Uvođenje virusne DNA (injekcija faga) provodi se liziranjem dijela stanične stijenke tvarima kao što je lizozim, skupljanjem ovojnice, guranjem repne šipke kroz citoplazmatsku membranu u stanicu i ubrizgavanjem DNA u citoplazmu. .

3. Razmnožavanje faga.

4. Izlazak populacija kćeri.

Osnovna svojstva faga

razlikovati virulentni fagi, sposoban izazvati produktivan oblik procesa, i umjereni fagi, uzrokujući reduktivnu fagnu infekciju (redukcija faga). U potonjem slučaju, genom faga u stanici se ne replicira, već se uvodi (integrira) u kromosom stanice domaćina (DNA u DNA), fag se pretvara u prophage Ovaj proces se zove lizogenija. Ako uvođenjem faga u kromosom bakterijske stanice ona dobije nove nasljedne karakteristike, ovaj oblik bakterijske varijabilnosti naziva se lizogena (fagna) konverzija. Bakterijska stanica koja u svom genomu nosi profage naziva se lizogena, budući da profage, ako je poremećena sinteza posebnog represorskog proteina, može prijeći u litički razvojni ciklus i uzrokovati produktivnu infekciju s lizom bakterije.

Umjereni fagi važni su u razmjeni genetskog materijala između bakterija - u transdukciji(jedan od oblika genetske razmjene). Na primjer, samo uzročnik difterije ima sposobnost stvaranja egzotoksina, u čiji je kromosom integriran umjereni profage nositelj operon tox, odgovoran za sintezu egzotoksina difterije. Toks umjerenog faga uzrokuje lizogenu konverziju netoksogenog bacila difterije u toksigenski.

Prema spektru djelovanja na bakterije fagi se dijele na:

Polivalentni (liziraju blisko povezane bakterije, poput salmonele);

Monovalentni (liziraju bakterije jedne vrste);

Tipski specifični (liziraju samo određene fagne produkte patogena).

Na čvrstim podlogama fagi se češće detektiraju spot testom (stvaranje negativne mrlje tijekom rasta kolonije) ili metodom agar sloja (Gracia titracija).

Praktična primjena bakteriofaga.

1. Za identifikaciju (određivanje fagotipa).

2. Za profilaksu faga (zaustavljanje izbijanja).

3. Za terapiju fagom (liječenje disbakterioze).

4. Procijeniti sanitarno stanje okoliša i epidemiološku analizu.