Luminiscencijska mikroskopija. elektronska mikroskopija
U ovom poglavlju bit će razmotreni glavni principi, uređaj, primjena konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (CLSM) na primjeru Leica uređaja. CLSM princip je registracija svjetlosnog toka koji izlazi iz žarišne ravnine leće kada se fokusi poklapaju, tj. dijafragma detektora mora biti postavljena tako da se njegova slika točno podudara s fokusom svjetla koje osvjetljava objekt. Kao izvor osvjetljenja za dobivanje slike koriste se laseri i osjetljivi detektori.
Glavna značajka CLSM-a je mogućnost dobivanja slojevite slike predmeta koji se proučava (na primjer, ćelije) visoke rezolucije i niske razine šuma. To se postiže postupnim skeniranjem objekta fokusiranim snopom svjetlosti iz koherentnog izvora ili stola, uz korištenje specifičnih fluorescentnih sondi i posebnih metoda za ograničavanje svjetlosnih tokova.
Sustavi skeniranja u CLSM-u mogu se klasificirati na sljedeći način.
1. Skeniranje snopa.
A) Sustavi zrcala: jednozrcalni, dvozrcalni, rezonantni magnetoelektrični.
B) Sustavi lakih vlakana: jednovlakno, više vlakana.
C) Skeniranje s lećom:
· piezoelektrično kretanje leće duž osi X, Y;
piezoelektrično kretanje leće duž Z osi.
D) Akustooptički deflektori zraka: dva akustooptička deflektora za skeniranje po X i Y osi.
E) Disk sustavi:
jednostrana spirala jednostrana i dvostrana;
Multispiralna jednostrana i dvostrana.
E) Kombinirani sustavi: akustooptički deflektor duž Y osi i zrcalno skeniranje duž X osi.
2. Stol za skeniranje.
A) Koračni pogon: pozornica za skeniranje s koračnim motorima po X, Y, Z osi.
B) Kombinirani pogon: stupanj za skeniranje s koračnim motorom u X, Y osi i piezoelektričnim pogonom u Z osi.
Riža. 5. Shematski prikaz rada KLSM.
1 - stol za skeniranje; 2 - ispitni uzorak; 3, 7 - leće; 4 - uređaj za skeniranje; 5 - ploča razdjelnika snopa; 6 - snop svjetlosti iz lasera; 8, 12 - slika točaka B i C; 9 - dijafragma igle; 10 - slika točke A u središtu dijafragme igle; 11 - prijemnik zračenja; 13, 15 - sjaj točaka B i C, koje su izvan fokusa leće 3; 14 - sjaj točke A, koja je u fokusu leće 3.
Ekscitacijski svjetlosni tok 6 iz laserskog izvora ulazi kroz ploču za dijeljenje snopa 5, sustav za skeniranje 4 na leću 3 i fokusira se na točku A ravnine ispitnog preparata (na primjer, ćelije) koja je u fokusu . Vjerujemo da su unutarstanične strukture povezane s fluorescentnim sondama i da se točka fokusiranja snopa A može smatrati točkastim izvorom svjetlosti, fluorescentni tok iz kojeg se kroz objektiv 3, razdjelnik snopa 5, objektiv 7 fokusira u ravnini dijafragme igle. 9 ("pinhole") i snimljen fotodetektorom 11 Osvjetljenje ekscitacijskim tokom fragmenata preparata koji leže izvan fokusa leće duž optičke osi (točke B i C) je manje nego u točki A. Stoga je komponenta osvjetljenja mete detektora iz točaka B i C može se značajno smanjiti. Tokovi fluorescencije koji dolaze iz točaka B i C, koje su izvan fokusa, ograničeni su rupicom i ne padaju na detektor, ili njihov mali dio pada. Dakle, pri skeniranju preparata u ravnini XY detektor registrira signal čija je razina određena udaljenošću od ravnine skeniranja duž koordinate Z. Kombinacija fokusa objektiva 3 s ravninom skeniranja i fokusa objektiva 7 s igličastom dijafragmom odražava se u pojmu "konfokalnost". Korak po korak pomicanje ravnine skeniranja duž Z-osi omogućuje dobivanje niza kontrastnih slika sloj po sloj i rekonstrukciju unutarnje trodimenzionalne strukture (3-D) predmeta koji se proučava. Kvaliteta slike, razlučivost u ravnini XY i duž osi Z ovisi o kvaliteti optike, kvaliteti sustava za skeniranje, dimenzijama i točnosti izrade rupice dijafragme, krutosti strukture, učinkovitosti korištenih algoritama za obradu signala i specifičnosti fluorescentne sonde.
Za određivanje prostorne razlučivosti mikroskopa analizira se slika točkastog izvora svjetlosti. Slika točkastog izvora koju oblikuje konvencionalna leća je difrakcijska Airyjeva točka koja se sastoji od svijetle središnje jezgre i slabijih vanjskih prstenova.
Riža. 6. Prozračna difrakcijska točka.
Dva točkasta izvora iste svjetline, udaljenost između kojih je jednaka d , vidljive su kao dvije različite točke ako udaljenost između središta Airyjevih krugova premašuje sljedeću vrijednost:
r A \u003d XY \u003d 0,6 λ / NA,
gdje je r A - polumjer prvog tamnog prstena u Airyjevom krugu, λ je valna duljina izvora svjetlosti u nm, NA je numerička apertura.
Ovaj izraz se naziva Rayleighov kriterij. Određuje rezoluciju mikroskopa u ravnini uzorka (XY). U ovom slučaju, granica razlučivosti određena je prvenstveno valnom prirodom svjetlosti, pa se stoga često pojednostavljuje, uzimajući u obzir NA=1. CLSM snimanje rezultira blagim smanjenjem veličine Airyjeve mrlje. Intenzitet Airyjeve mrlje za standardni mikroskop opada prema zakonu n -2 , gdje je n transverzalni pomak, a za CLSM intenzitet opada kao n -4 . To dovodi do povećanja razlučivosti CLSM-a za 1,5 puta. Za konfokalni mikroskop, Rayleighov kriterij ima oblik:
XY c r \u003d 0,4 λ / NA,
gdje je XY c r rezolucija CLSM-a.
Da biste procijenili prednost CLSM-a, razmotrite instrumentalnu funkciju (struktura Erie točke) i analizirajte snagu razlučivosti mikroskopa u aksijalnom smjeru (Z). 3D Airy točka (distribucija intenziteta) je 3D hardverska funkcija (TAF) koja definira sliku objekta. TAF za konvencionalni mikroskop je stožast, širi se prema gore i dolje od središta, dok je za konfokalni mikroskop eliptičan i manje aksijalno izdužen.
Riža. Slika 7. Prikaz trodimenzionalne instrumentalne funkcije točkastog izvora konvencionalnog mikroskopa - (a) i CLSM - (b).
Rayleighov kriterij također je primjenjiv za određivanje rezolucije mikroskopa u smjeru optičke osi. Za konvencionalni mikroskop, dva točkasta izvora smještena na nekoj udaljenosti duž optičke osi mogu se razlučiti ako su maksimumi njihovih Airyjevih točaka na udaljenosti:
Z r =2 λ/NA 2 ,
gdje je Z r aksijalna rezolucija mikroskopa.
Distribucija energije u Airy spotu za CLSM je uža, a rezolucija u aksijalnom smjeru 1,4 puta veća. Za konfokalni mikroskop, Rayleighov kriterij ima oblik:
Z r c \u003d 1,4 λ / NA 2,
gdje je Z r c aksijalna rezolucija CLSM-a.
Moderni CLSM imaju jednu glavnu prednost - mogućnost dobivanja tankih optičkih presjeka. Sljedeći parametri utječu na kvalitetu slike pri dobivanju tankih optičkih presjeka:
veličina konfokalnog otvora;
Numerička apertura objektiva NA;
indeks loma;
apsorpcija svjetlosti u uzorku.
Smanjenje intenziteta svjetlosti s povećanjem debljine uzorka utječe na razlučivost mikroskopa duž optičke osi z. Razlučivost ovisi o optici mikroskopa i uzorka. Debljina optičkog presjeka u konfokalnom mikroskopu obično je karakterizirana širinom raspodjele na poluvisini vrha intenziteta ∆z 1/2 = 0,65 µm. Ako su uzorak i detektor idealni, ovaj parametar ovisi o numeričkoj aperturi objektiva, valnoj duljini λ i indeksu loma imerzijskog medija n i .
Riža. Slika 8. Ovisnost aksijalne rezolucije mikroskopa ∆z 1/2 o numeričkoj aperturi objektiva.
Kod KLSM-a se ispred detektora postavlja podesiva dijafragma koja mijenja količinu svjetla. Iglene dijafragme dizajnirane su za stvaranje uvjeta za maksimalno ili potpuno filtriranje svjetlosti koja ulazi u ravninu slike iz točaka koje se ne podudaraju sa žarišnom ravninom ili se nalaze u blizini analiziranog elementa objekta u žarišnoj ravnini. Veličina dijafragme igle je konačna, a o njoj ovisi transverzalna rezolucija uređaja, svjetlina osvijetljenih elemenata preparata, pomaknutih u odnosu na žarišnu ravninu duž osi Z, i dubinska oštrina. Veličina dijafragme utječe na debljinu rezultirajućeg dijela. Što je manji otvor, to je debljina presjeka bliža teoretskoj granici (širina distribucije na polovici maksimuma vrha intenziteta), a kod vrlo velikih otvora mogućnost dobivanja tankog presjeka postaje nemoguća.
Kao što je ranije spomenuto, CLSM omogućuje dobivanje optičkog presjeka na znatnoj dubini od površine uzorka, dok je važna točka indeks loma i problem dubine. Prolaz upadne i reflektirane zrake kroz uzorak utječe na kvalitetu slike. Ako su indeksi loma imerzijskog medija i uzorka bliski (učinak razlike u indeksima loma imerzijske tekućine i objekta na pojavu raspršenog svjetla, smanjujući kontrast slike i djelujući kao učinak sferne aberacije), svjetlosni stožac će konvergirati. Ako su indeksi loma različiti, pojavljuje se sferna aberacija.
Riža. 9. Indeksi loma imerzijskog medija i uzorka.
a – formiranje slike imerzijskom lećom bez aberacije; b – sferna aberacija zbog neusklađenosti pokazatelja.
Uz različite indekse loma, svjetlosne zrake koje putuju na različitim udaljenostima od optičke osi nisu fokusirane u jednu točku, što dovodi do gubitka kvalitete slike. Ako je moguće, indekse loma uzorka i objektiva treba uskladiti. Ako se indeksi loma uzorka i imerzijskog medija razlikuju, slika objekta u dubini je zamućena duž optičke osi, a ravnina fokusa se pomiče. Da bi se povećala dubina prodiranja, objektiv mora imati veliku numeričku aperturu, kao što je imerzijski objektiv. Međutim, takve leće imaju malu najveću udaljenost od leće objektiva do žarišne ravnine. Na dubinu prodiranja utječe nehomogenost uzorka, što dovodi do smanjenja intenziteta svjetlosti na velikim dubinama i pojave sjene. U idealnom slučaju, uzorak koji postiže maksimalnu dubinu prodiranja i maksimalnu rezoluciju trebao bi imati indeks loma jednak indeksu loma leće, no radi se o homogenom uzorku, a takvi biološki uzorci ne postoje.
Tijekom skeniranja, KLSM dobiva niz optičkih presjeka s redovito rastućom dubinom od površine uzorka. Za većinu CLSM-ova dobivanje stotina 2D slika traje samo nekoliko minuta. Optička slika se može dobiti na dva načina:
1) dobivanje niza optičkih presjeka u ravnini XY, koji se nalaze na međusobnoj udaljenosti ∆z. Usporedba koordinata središta objekata u različitim dijelovima omogućuje određivanje njihove orijentacije i raspodjele duž duljine.
Riža. 10. Proučavanje trodimenzionalne strukture u ravnini XY.
2) dobivanje određenog broja optičkih presjeka u ravnini XZ, koji se nalaze na udaljenosti ∆y. Ako je uzorak paralelan s ravninom presjeka, tada će njegov presjek u ravnini XZ biti gotovo okrugao; uspoređujući slike u različitim presjecima XZ, moguće je odrediti zakrivljenost predmeta koji se proučava.
Riža. 11. Proučavanje trodimenzionalne strukture u ravnini XZ.
Trodimenzionalna rekonstrukcija proučavanih objekata pomoću CLSM metoda usmjerena je na rješavanje dva problema:
vizualizacija trodimenzionalne slike objekta dobivene "sastavljanjem" njegovih optičkih presjeka;
· kvantitativna analiza unutarnjih struktura objekta.
Do danas postoji dosta proizvođača CLSM-a. Inovacije proizvođača CLSM:
· 2002. Leica je najavila akusto-optički razdjelnik snopa (AOBS), koji omogućuje učinkovito odvajanje ekscitacijske laserske zrake i luminiscencije;
· 2002. Carl Zeiss počinje proizvoditi konfokalni mikroskop LSM 510 META s originalnim fotodetektorom koji istovremeno registrira signal u 32 spektralna kanala;
· 2004. Zeiss stvara LSM 5 Live velike brzine, koji ima brzinu skeniranja 20 puta veću od konvencionalnog CLSM-a;
· Olympus je razvio uređaj s dva skenera, koji omogućuje učinkovitiju upotrebu, primjerice, FRAP tehnike;
· Nikon - stvara kompaktan i jeftin KLSM pojednostavljeni dizajn;
· 2007. Leica je najavila izlazak 4Pi-konfokalnog mikroskopa koji poboljšava aksijalnu rezoluciju za 4 do 7 puta.
Razmotrite uređaj KLSM koji se odnosi na novu, napredniju generaciju uređaja - TCS SP5 tvrtke Leica.
Riža. 12. Višefotonski/konfokalni širokopojasni sustav TCS SP5 (invertirani mikroskop).
Ključni elementi CLSM TCS SP5: AOTF – akustično-optički podesivi filtar, AOBS – akustično-optički razdjelnik snopa, SP-detektor – spektralni fotometarski senzor.
AOTF - Acoustic Optical Adjustable Filter - služi za smanjenje optičke ekspozicije, prilagođava snagu lasera ovisno o uzorku i fluorokromu. Omogućuje odabir željene valne duljine i kontrolu intenziteta pobudnog svjetla. AOTF je električno podesivi filtar koji radi na principu volumetrijske difrakcije svjetlosnog snopa na nehomogenostima indeksa loma. Takve nehomogenosti nastaju kada se ultrazvučni akustični val pobudi u dvolomnim kristalima. Kod anizotropne difrakcije u jednoosnim kristalima postoji minimalna frekvencija ultrazvuka pri kojoj se upadni i ogibni kutovi podudaraju i dolazi do takozvane kolinearne akustooptičke interakcije.
Riža. 13. Akustično-optički podesivi filtar.
AOBS - akusto-optički razdjelnik snopa, je akusto-optički kristal - podesivi refrakcijski uređaj koji radi u obrnutom načinu rada. Što daje korištenje AOBS-a:
1. Za dobivanje jasne slike s niskim šumom potreban je visok stupanj prijenosa svjetlosti. Smanjenje šuma usrednjavanjem slike tijekom mnogih uzastopnih skeniranja nužno dovodi do fotoizbjeljivanja predmeta koji se proučava. Brzina prijenosa svjetlosti AOBS-a je bolja od većine dikroičnih zrcala u cijelom vidljivom spektru. Stoga je potrebno izračunati prosjek za manji broj skeniranja. Kao rezultat toga, lijek će trajati mnogo dulje;
2. Svijetle i jasne slike zahtijevaju prolazak što većeg broja fotona od objekta do detektora, što poboljšava kvalitetu slike. AOBS osigurava registraciju najširih vrpci fluorescencije, odnosno maksimalnog broja fotona;
3. Nisko izbjeljivanje tijekom snimanja važno je za zaštitu uzorka od blijeđenja, a živih objekata od toksičnih produkata fotolize fluorokroma. Krivulje prijenosa svjetlosti AOBS-a imaju vrlo strme padine, što omogućuje snimanje fluorescencije fluorokroma što je moguće bliže njegovom pobudnom pojasu;
4. Bilo koja boja u vidljivom rasponu može se pobuditi, jer se refleksija može individualno prilagoditi;
5. Riješeno je pitanje višeparametarske fluorescencije: može se programirati do osam linija laserske emisije, ostavljajući dovoljno prostora za registraciju fluorescencije, dok se frekvencije podešavaju;
6. Omjer bojila, kao omjer ekscitacije metabolita - uzoraka, na primjer, za Ca 2+, membranski potencijal, pH trebao bi se brzo mijenjati tijekom sekvencijalnog skeniranja. AOBS se prebacuje u nekoliko mikrosekundi;
7. Registracija slike u reflektiranom svjetlu još je jedna mogućnost korištenja. AOBS vam omogućuje individualnu prilagodbu prolaza reflektirane pobudne svjetlosti;
8. Skeniranje ROI (sekvencijalno skeniranje i skeniranje specifičnog područja) također je poboljšano: različiti načini pobude primjenjivi su na različita područja tijekom jednog skeniranja;
9. Velika količina 3D snimaka, u sekvencijalnom načinu rada, ima koristi od brzog prebacivanja uređaja, budući da brzina povećava učinkovitost sustava;
10. Fluorescencijska korelacijska spektroskopija (FCS) zahtijeva nisku pozadinu i slabo raspršenje svjetlosti Samo AOBS učinkovito blokira obližnje linije emisije iz, na primjer, Ar lasera;
11. Spektralno snimanje (Lambda skeniranje) daje točan spektar jer je prijenos svjetlosti AOBS-a "bijeli", što znači da ne unosi promjene u emisijski spektar - što je čest problem kod izvođenja spektralnog skeniranja u sustavu s dikroičnim ogledala;
12. Pravo konfokalno optičko rezanje zahtijeva osvjetljenje točke i snimanje fluorescencije točke. AOBS je prikladan za korištenje s konfokalnim spot skenerima;
13. Višefotonsko ili ultraljubičasto snimanje može se izvoditi paralelno bez pogrešaka ili ograničenja. AOBS ne mijenja ekscitaciju nevidljivih lasera i ne mijenja spektar fluorescencije;
14. Nemoguće je izvršiti pogrešnu operaciju jer se AOBS kontrolira zajedno s kontrolom pogona pomoću AOTF (Akustični optički podesivi filtar). Ako je odabrana linija pobude, tada se AOBS programira u skladu s tim. Operater ne mora donositi odluke - posao se obavlja ispravno i automatski;
15. Nema neusklađenosti, budući da nema pokretnih elemenata svojstvenih bubnjevima filtera i klizačima. Kristal je čvrsto ugrađen, programiranje se vrši elektronički;
16. Nema potrebe za skupom dodatnom opremom kao što su filtarske kocke, klizači dihroičnih zrcala itd. Stoga je cijena tehničke pomoći za ugradnju novih optičkih elemenata znatno niža.
Riža. 14. AOBS - akusto-optički razdjelnik snopa.
SP-Detector je spektralni fotometarski senzor. Svjetlost iz uzorka, koja je zbroj induciranih fluorescentnih spektara, prolazi kroz dijafragmu rupica, koja tvori konfokalni optički presjek. Dalje se uz pomoć prizme ta svjetlost rastavlja u spektar. Pri prolasku kroz prvi detektor svjetlost prolazi kroz uređaj procjepnog fotometra koji se sastoji od dva zatvarača s pogonom. Ovi zatvarači odsijecaju rubove spektra s obje strane raspona i usmjeravaju ih na senzore 2. i 3. reda. Kao rezultat toga, spektar se simultano rastavlja na pet kanala. Kao rezultat toga, kada se koristi SP detektor, bilježi se zračenje različitih boja u uzorku.
Riža. 15. Spektralni detektor SP.
SP detektor omogućuje lambda skeniranje: spektralne slike se skupljaju kako bi se odmah analizirale karakteristike boja uključenih u eksperiment.
4. lipnja 2013Značajan dio znanstvenih istraživanja koja se provode na Biološkom fakultetu Moskovskog državnog sveučilišta, uspješna provedba obrazovnih programa usko povezanih s njima, nezamislivi su bez korištenja najsuvremenije mikroskopske tehnologije. U okviru Razvojnog programa Moskovskog sveučilišta, na Biološkom fakultetu stvoren je međukatedarski laboratorij konfokalne mikroskopije, koji je u potpunosti opremljen potrebnom opremom i učinkovito radi.
Fibroblasti 3T3 na stijenkama matrične makropore
Tekst: Tretjakov Artemij
Što mogu učiniti?
Pomoću konfokalni mikroskop možete dobiti nekoliko slika virtualnih dijelova ćelije ili trodimenzionalni model sastavljen od njih. Takve mogućnosti pruža laser, čija se zraka može fokusirati na bilo koju točku u stanici. Za dobivanje slike objekt mora biti fluorescentno aktivan, odnosno kada laserska zraka pogodi njega (odnosno određene molekule u svom sastavu) mora emitirati svjetlost veće valne duljine od one koja ga pogodi, a koju hvata mikroskop. Slika se gradi samo na temelju ove fluorescencije.
Fotografija
Kako radi?
„Sadašnja razina razvoja temeljnih i primijenjenih interdisciplinarnih znanstvenih istraživanja, kao i zadaće osposobljavanja stručnjaka s interdisciplinarnim kompetencijama, zahtijevaju intenzivan razvoj i modernizaciju materijalno-tehničke baze” (Program razvoja Moskovskog sveučilišta, str. 5;) .
Osim lasera, elektromehanički uređaj uključuje i optički filtar koji propušta lasersku zraku, ali reflektira svjetlost duže valne duljine na dijafragmu koja se naziva “pinhole” (od engl. Pinhole je rupa napravljena iglom, doslov. prijevod savršeno karakterizira pinhole uređaj), koji odsiječe svo nepotrebno pozadinsko svjetlo i time smanjuje ili potpuno negira utjecaj donjih optičkih slojeva na jasnoću slike skeniranog područja ćelije. Da pozadinsko svjetlo nije prekinuto rupom, tada bi se optički slojevi preklapali i smetali promatraču - kao da gleda kroz lišće u daljinu. Iza dijafragme nalazi se fotodetektor koji digitalizira primljene informacije.
Jasno je da je za takvo "spot" skeniranje potrebno vrijeme. Za ubrzanje ovog procesa u konfokalnom sustavu koristi se još jedan modul, nazvan vrteći disk, koji omogućuje dobivanje slike ne jedne točke, već cijele linije u jednom činu rada lasera.
Patent za takav sustav dobio je 1961. profesor MIT-a Marvin Minsky. Njegova aktivna uporaba započela je 80-ih godina prošlog stoljeća, a sada konfokalna mikroskopija doživljava svoj procvat. U Rusiji se prvi mikroskop pojavio 2003. godine, bio je to Axiovert 200M LSM510 Meta. Uslijedili su i drugi, a sada u našoj zemlji postoji nekoliko velikih laboratorija, uključujući međukatedarski laboratorij na Biološkom fakultetu Moskovskog državnog sveučilišta. Laboratorij raspolaže s pet mikroskopa i to: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
Konfokalna mikroskopija postigla je ne samo najveći kontrast i trodimenzionalnost, već je ovladala i četvrtom dimenzijom - vremenom, čime je moguće proučavati promjene koje se događaju u stanicama. U tu je svrhu svaka instalacija opremljena sustavima za održavanje života. Sve to pruža široke mogućnosti istraživačima koji te mogućnosti uspješno koriste.
A budući da je riječ o laboratoriju Biološkog fakulteta Moskovskog državnog sveučilišta, kao primjer treba spomenuti istraživanja koja se provode u ovom laboratoriju.
Svila i mreža
Konfokalna mikroskopija postigla je ne samo najveći kontrast i trodimenzionalnost, već je ovladala i četvrtom dimenzijom - vremenom, čime je moguće proučavati promjene koje se događaju u stanicama.
Jedan od zanimljivih radova je izrada biorazgradivih proteza za obnovu krvnih žila i drugih šupljih organa. Takve tkivno konstruirane konstrukcije izvana predstavljaju, u najjednostavnijim slučajevima, cjevčice ili filmove koji se stavljaju na mjesto oštećenja i tako imaju ulogu “flastera”. Mogu biti izrađene od raznih materijala, uključujući svileni fibroin čahure dudovog svilca. Prednost ovog materijala je što je stabilan i čini fleksibilnu i izdržljivu strukturu proteze. Sama proteza izgleda kao film samo kada se gleda golim okom, zapravo je to matrica - mrežasta višeslojna baza, okvir koji oponaša strukturu živog tkiva. Ova skela pomaže novim stanicama da zauzmu pravilan položaj, osiguravajući njihovu ravnomjernu raspodjelu. Kao rezultat toga, oštećeni zid organa se obnavlja, a okvir koji je postao nepotreban prolazi kroz biorazgradnju. Ali nije tako lako provjeriti koliko su stanice ravnomjerno raspoređene po skeli, kao i žive li dobro u dubokim slojevima matriksa (postoje li poteškoće u izmjeni plinova i izmjeni metaboličkih produkata) i jesu li mijenjaju morfologiju kada prodru u nju, nije tako lako. Upravo je u ovoj fazi korištenje mikroskopa (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) uvelike pojednostavilo zadatak. Uglavnom zbog mogućnosti pregledavanja predmeta bez razaranja, kao i zbog mogućnosti mikroskopa da pogleda unutar matrice do dubine do 600 mikrona.
Fotografija
Sličan rad obavljen je s koštanim tkivom, čija je matrica napravljena od istog fibroina i spidroina, proteina koji se prvobitno nalazio u tijelu pauka i koristio ga za tkanje mreže. U laboratorijskim uvjetima protein uopće ne proizvode pauci, već kvasci, u čiji je genom uveden malo modificirani gen pauka odgovoran za sintezu ovog proteina.
Nije tako jednostavno
No, ako je nastanak oštećenja tkiva jednostavan i razumljiv proces, druge patologije nisu uvijek jasne. A prije početka učinkovitog liječenja i, štoviše, sprječavanja njihovog razvoja, potrebno je otkriti mehanizam njihove pojave. To uključuje aterosklerozu - bolest arterija, zbog koje se lipidi nakupljaju u stijenci žile, odnosno u intimi - njenom unutarnjem sloju, čineći stjenku deblja, što u konačnici može dovesti i do potpunog začepljenja krvnog suda. Brod. Zbog čega ova bolest nastaje, nije sasvim jasno, kao što nije jasno ni kakvu ulogu imaju imunokompetentne stanice, na mjestima čije nakupine ubrzo počinje aterogeneza. Potpuni odgovori na ova pitanja još nisu pronađeni, ali proučavanje aterogeneze se nastavlja, iako je na tu temu mnogo manje publikacija nego na temu tkivno konstruiranih proteza.
Fotografija
Sudbina molekula
Međuzavodni laboratorij za konfokalnu mikroskopiju redovito koristi više od 20 studenata preddiplomskih i diplomskih studija s gotovo 10 odjela.
U gore opisanim studijama uglavnom se prati stanje stanica. Ali mogućnosti konfokalnog mikroskopa nisu ograničene na ovo; on je sasvim sposoban pratiti čak i sudbinu jedne molekule u stanici, sve dok ima fluorescentnu aktivnost. Da bi se to postiglo, molekule se obično označavaju fluorokromima - posebnim bojama koje imaju tu aktivnost. Fluorokromi postoje kao zasebne molekule, a njihovo označavanje sastoji se u kemijskom vezanju fluorokroma na molekulu od interesa za istraživača. Nakon toga tako obilježene molekule ulaze u stanicu i mikroskopom se prati njihova daljnja sudbina. Na taj se način, primjerice, uspoređivala aktivnost i kretanje u stanici ricina i viskumina. Obje tvari su proteinski toksini, obje su biljnog podrijetla i sastoje se od dva dijela - podjedinice, od kojih je jedna odgovorna za vezanje na stanicu i prodiranje unutra, a druga za inaktivaciju ribosoma, što u konačnici dovodi do stanične smrti. Praktična korist opet je povezana s liječenjem druge opasne bolesti - raka. Takvo jasno "odvajanje dužnosti" između podjedinica omogućuje vam da zamijenite prvu podjedinicu, na primjer, s antitijelom. Dobit ćete "imunotoksin" koji djeluje samo na određene stanice na koje će to antitijelo stati. Dva su glavna problema. Prvo: izbor antitijela koje će se približiti stanicama raka i spriječiti prodor toksina u zdrave. I drugo: izbor toksina koji će, kada se pretvori u imunotoksin, ostati visoko učinkovit.
Fotografija: Primarna kultura srčanih stanica novorođenih štakora: A - kontrola, B - tretirani s 20 μM izoproterenola tijekom dana. 1 - bojenje mitohondrija s TMRE; 2 - fazni kontrast. Mjerilo 10 µm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. "Adaptivne promjene u mitohondrijima uzgojenih kardiomiocita novorođenih štakora pod utjecajem izoproterenola". Međunarodna konferencija "Receptori i intracelularna signalizacija" 24.-26. SVIBNJA 2011., Pushchino).
Obrazovanje
Popis radova provedenih pomoću konfokalne mikroskopije može se nastaviti dugo vremena. Učinkovita metoda, koja također omogućuje rad sa živim stanicama, tražena je u gotovo svakom znanstvenom istraživanju. Stoga priprema studenata za rad u ovom laboratoriju ima veliku ulogu. Redovito ga posjećuje više od 20 studenata preddiplomskih i diplomskih studija uključenih u izradu seminarskih, prednastavnih i diplomskih radova.
U objektima rade embriolozi, molekularni biolozi, citolozi, bioinženjeri, imunolozi i zoolozi.
Laboratorij za konfokalnu mikroskopiju osnovan je 2004. godine.
Voditelj laboratorija - izvanredni profesor M.M. Moysenovich
U laboratoriju rade mladi stručnjaci A. A. Ramonova i A. Yu. Arkhipova
Trenutno su u laboratoriju instalirana 2 konfokalna sustava:
- Axiovert 200M s LSM510 META konfokalnim dodatkom (Carl Zeiss, Njemačka)
- Konfokalni laserski sustav za skeniranje proizvođača "NIKON CORPORATION" (Japan) - invertni biomedicinski mikroskop za laboratorijska istraživanja Eclipse s dodacima: s Ti-E stalkom, s TIRF iluminatorom, s A1 konfokalnim modulom i konfokalnim modulom na bazi diska koji se vrti. .
Sve novosti"
Margolin 389s.
Optička mikroskopija koristila je sva dostignuća kako tehnike i tehnologije, tako i informacijske i računalne tehnologije. To je dovelo do značajnog poboljšanja postojeće opreme i metoda njezine uporabe, što je zauzvrat dovelo do pojave novih metoda, posebice konfokalne mikroskopije. Konfokalni mikroskop razlikuje se od klasičnog optičkog mikroskopa po tome što se u svakom trenutku snima slika jedne točke objekta, a skeniranjem (pomicanjem uzorka ili restrukturiranjem optičkog sustava) gradi se potpuna slika. Dakle, princip skenirajuće elektronske mikroskopije implementiran je u osebujnom obliku, koji omogućuje snimanje i obradu signala iz svake pojedine točke proizvoljno dugo vremena.
U klasičnom mikroskopu svjetlost s različitih točaka na uzorku ulazi u fotodetektor. U konfokalnom mikroskopu, kako bi se registriralo svjetlo iz samo jedne točke, mala dijafragma se postavlja iza leće objektiva na način da svjetlost koju emitira analizirana točka prolazi kroz dijafragmu i snima se, a svjetlost iz preostale točke uglavnom zadržava dijafragma, kao što je prikazano na sl. 7.28.
Riža. 7.28. Shema prolaza zraka u konfokalnom optičkom mikroskopu
Još jedna značajka je da iluminator ne stvara ravnomjerno osvjetljenje vidnog polja, već fokusira svjetlost na analiziranu točku. To se može postići postavljanjem drugog sustava za fokusiranje iza uzorka, ali to zahtijeva da uzorak bude proziran. Osim toga, leće objektiva su obično skupe, tako da upotreba drugog sustava fokusiranja za osvjetljenje nije poželjna. Alternativa je korištenje razdjelnika snopa tako da i upadna i reflektirana svjetlost budu fokusirane istom lećom. Takva shema također olakšava prilagodbu.
Razmotrimo sada kako i koliko se kvantitativno mijenja kontrast pri korištenju konfokalne mikroskopije. Budući da svjetlost dvaput prolazi kroz leću u konfokalnom mikroskopu, funkcija zamućenja točke (u daljnjem tekstu PSF) bit će produkt neovisnih vjerojatnosti da će foton pogoditi točku s njezinim koordinatama ili će foton biti registriran iz te točke.
Ako koristite Rayleighov kriterij za rezoluciju, ispada da se rezolucija u konfokalnom mikroskopu povećava, ali ne značajno. Za konfokalni mikroskop imamo izraz za rezoluciju r:
Dok za konvencionalni mikroskop:
Međutim, glavna prednost konfokalnog mikroskopa nije povećanje razlučivosti u smislu Rayleighovog kriterija, već značajno povećanje kontrasta. Konkretno, za konvencionalni PSF u žarišnoj ravnini, omjer amplitude u prvom bočnom maksimumu i amplitude u središtu je 2%, a za konfokalni mikroskop taj će omjer biti 0,04%. Iz toga slijedi da se tamni objekt s intenzitetom, na primjer, 200 puta manjim od svijetlog objekta, ne može detektirati konvencionalnim mikroskopom, iako udaljenost između objekata može biti znatno veća od udaljenosti propisane Rayleighovim kriterijem. . Istodobno, takav objekt treba dobro snimiti u konfokalnom mikroskopu.
Važan parametar je veličina otvora u žarišnoj ravnini zračeće i konvergentne leće. Slika dijafragme u ravnini objekta određuje iz kojih područja svjetlost registrira fotodetektor. Očito je da smanjenje veličine otvora blende dovodi do smanjenja količine propuštene svjetlosti, povećava razinu šuma i, na kraju, može poništiti sve postignute prednosti kontrasta. Stoga se postavlja pitanje optimalnog izbora veličine otvora i razumnog kompromisa.
Otvor blende manji od Airyjeve točke jednostavno dovodi do gubitka intenziteta i ni na koji način ne utječe na rezoluciju. Otvor blende s rupom veličine jedne Airy točke povećava razlučivost leće objektiva. Međutim, dijafragma s veličinom otvora od oko 3 do 5 puta Airy spota čini se najprikladnijim kompromisom. Treba imati na umu da veličina o kojoj se ovdje govori ima značenje veličine slike u ravnini objekta, pa stoga stvarna veličina rupe u dijafragmi ovisi o povećanju leće. Konkretno, kada se koristi leća od 100x, dijafragma s otvorom od 1 mm projicirat će se u ravninu objekta u krug polumjera 10 µm.
Razvoj ideje konfokalne mikroskopije bio je razvoj konfokalnog laserskog skenirajućeg mikroskopa (KJICM), koji je uzrokovan potrebom za osjetljivijim i metrološki rigoroznijim metodama za analizu oblika i prostorne strukture promatranih objekata. Shematski dijagram KLSM-a s glavnim funkcionalnim vezama prikazan je na sl. 7.29.
Glavna značajka CLSM-a je mogućnost sloj-po-sloja snimanja predmeta koji se proučava uz visoku rezoluciju i nisku razinu šuma. To se postiže postupnim skeniranjem objekta fokusiranim snopom svjetlosti iz koherentnog izvora ili pomicanjem pozornice pomoću posebnih fluorescentnih sondi i posebnih metoda za ograničavanje svjetlosnih tokova.
Riža. 7.29. Strukturni dijagram KJICM-a:
1 - stol za skeniranje; 2 - ispitni uzorak; 3, 6 - leće; 4 - uređaj za skeniranje; 5 - ploča za dijeljenje snopa; 7, 9 - igličaste dijafragme; 8 - prijemnik zračenja; 10 - laser; 11 - Upravljački blok; 12 - Računalo; 13 - pogon za skeniranje osi z.
Korištenje dijafragme s rupicama u CLSM-u, čije su dimenzije u skladu s povećanjem mikroskopa i valnom duljinom, omogućuje povećanje rezolucije za više od 10%. Očito je da rezolucija CLSM-a i, sukladno tome, mogućnosti analize finih struktura mogu premašiti slične mogućnosti konvencionalnog mikroskopa za ne više od 40% u uvjetima skeniranja preparata tankim snopom. Razlučivost KLCM ovisi o metodi mikroskopije i osvjetljavanja. Određuje se rezolucija KLCM i optički sustav i elektronički put obrada informacija. Stoga, u dizajnu KLCM-a, njegovih shema, parametara kao što su rezolucija optičkog sustava, koraka skeniranja, karakteristika detektora treba uskladiti, te odabrati optimalne algoritme obrade i odgovarajući softver.
U općem slučaju, dubina polja KLCM-a ovisi o otvoru blende, valnoj duljini, koherenciji izvora svjetlosti i veličini dijafragme igle. Iglasta dijafragma je glavni element dizajna koji razlikuje KLCM od drugih vrsta mikroskopa. Iglene dijafragme dizajnirane su za stvaranje uvjeta za maksimalno ili potpuno filtriranje svjetlosti koja ulazi u ravninu slike iz točaka koje se ne podudaraju sa žarišnom ravninom ili se nalaze u blizini analiziranog elementa objekta u žarišnoj ravnini.
Izbor optimalnog promjera dijafragme igle važan je za dobivanje potrebnih karakteristika instrumenta. Odnosi za procjenu bočne rezolucije i dubinske oštrine KJICM dobiveni su pod pretpostavkom da dijafragma igle ima mali otvor, budući da je svjetleća točka. U stvarnosti, veličina dijafragme igle je konačna i o njoj ovisi poprečna rezolucija uređaja, svjetlina osvijetljenih elemenata preparata, pomaknutih u odnosu na žarišnu ravninu duž osi. z, i dubina polja. S malim promjerima dijafragme igle, svjetlosni tok postaje mali, što smanjuje omjer signala i šuma i smanjuje kontrast. Kod velikih promjera, učinkovitost dijafragme igle je smanjena smanjenjem otvora.
Osnovni koncept
Princip senzora konfokalne točke iz Minskowovog patenta
Načelo konfokalne mikroskopije patentirao je 1957. Marvin Minsky i ima za cilj prevladati neka od ograničenja tradicionalnih širokokutnih fluorescentnih mikroskopa. U konvencionalnom (tj. širokom polju) fluorescentnom mikroskopu, cijeli je uzorak ravnomjerno preplavljen svjetlom iz izvora svjetlosti. Svi dijelovi uzorka na optičkom putu se pobuđuju u isto vrijeme, a rezultirajuća fluorescencija detektira se pomoću fotodetektorskog mikroskopa ili kamera, uključujući veliki nefokusirani pozadinski dio. Nasuprot tome, konfokalni mikroskop koristi točku osvjetljenja (vidi funkciju širenja točke) i sićušnu rupicu u optički konjugiranoj ravnini ispred detektora kako bi isključio signale izvan fokusa - naziv "konfokalni" dolazi od ove konfiguracije. Nakon što se može detektirati svjetlost koju emitira fluorescencija vrlo blizu žarišne ravnine, slika u optičkoj rezoluciji, posebno u smjeru dubine uzorka, mnogo je bolja nego kod mikroskopa širokog polja. Međutim, budući da je većina svjetla iz fluorescentnog uzorka blokirana probodom, ova povećana rezolucija dolazi nauštrb smanjenog intenziteta signala - tako da su često potrebne duge ekspozicije. Kako bi se nadoknadio ovaj pad signala nakon puknuti, intenzitet svjetlosti detektira se pomoću osjetljivog detektora, obično fotomultiplikatorske cijevi (PMT) ili lavinske fotodiode, pretvarajući svjetlosni signal u električni signal koji bilježi računalo.
Čim se jedna po jedna točka u uzorku osvijetli, potrebno je skenirati 2D ili 3D slike preko redovnog rastera (tj. pravokutnog uzorka paralelnih linija skeniranja) u uzorku. Zraka se skenira preko uzorka u horizontalnoj ravnini pomoću jednog ili više (servo upravljanih) oscilirajućih zrcala. Ova metoda skeniranja općenito ima malo kašnjenje reakcije i brzina skeniranja može varirati. Sporo skeniranje daje bolji omjer signala i šuma, što rezultira boljim kontrastom i većom rezolucijom.
Ostvariva debljina žarišne ravnine određena je uglavnom valnom duljinom korištene svjetlosti podijeljenom s numeričkom aperturom tog objektiva, ali također i optičkim svojstvima uzorka. Fino optičko rezanje čini ove vrste mikroskopa posebno dobrima u 3D vizualizaciji i površinskom profiliranju uzoraka.
Uzastopni rezovi čine "Z-skup", koji se može obraditi posebnim softverom za 3D slike ili se kombinira u 2D snop (pretežno se uzima maksimalni intenzitet piksela, druge uobičajene metode uključuju korištenje standardne devijacije ili slaganje piksela).
Konfokalna mikroskopija pruža mogućnost izravnog, neinvazivnog, serijskog optičkog rezanja intaktnih, masnih i živih uzoraka uz minimalnu pripremu uzorka, kao i marginalno poboljšanje lateralne rezolucije. Biološki uzorci često se tretiraju fluorescentnim bojama kako bi odabrani objekti bili vidljivi. Međutim, stvarna koncentracija boje može se održavati niskom kako bi se smanjio poremećaj bioloških sustava: neki instrumenti mogu pratiti pojedinačne fluorescentne molekule. Osim toga, transgene tehnike mogu stvoriti organizme koji proizvode vlastite kimerne fluorescentne molekule (kao što je fuzija GFP-a, zelenog fluorescentnog proteina s proteinom od interesa). Konfokalni mikroskopi rade na principu točkaste ekscitacije u uzorku (difrakcija ograničena točkom) i točkaste detekcije rezultirajućeg fluorescentnog signala. Rupica na detektoru predstavlja fizičku barijeru koja blokira fluorescenciju izvan fokusa. Snima se samo fokus ili središnja točka Airy diska. Rastersko skeniranje uzorka u jednoj točki omogućuje prikupljanje tankih optičkih presjeka jednostavnom promjenom Z-fokusa. Rezultirajuće slike mogu se složiti kako bi se proizvela 3D slika uzorka.
Metode koje se koriste za horizontalno skeniranje
Četiri vrste konfokalnih mikroskopa su komercijalno dostupne:
Konfokalni laserski skenirajući mikroskopi koriste više zrcala (obično 2 ili 3 skeniranja linearno duž x- i y-osi) za skeniranje lasera na uzorku i "descaniranje" slike kroz fiksnu rupicu i detektor.
Prednosti
CLSM se široko koristi u mnogim biološkim znanstvenim disciplinama, od stanične biologije i genetike do mikrobiologije i razvojne biologije. Također se koristi u kvantnoj optici i slikanju nano-kristala i spektroskopiji.
Biologija i medicina
Primjer hrpe konfokalnih mikroskopskih slika koje pokazuju distribuciju aktinskih filamenata kroz stanicu.
Klinički, CLSM se koristi u evaluaciji raznih očnih bolesti, a posebno je koristan za snimanje, kvalitativnu analizu i kvantifikaciju endotelnih stanica u rožnici. Koristi se za lokalizaciju i identifikaciju prisutnosti filamentoznih gljivičnih elemenata u stromi rožnice u slučajevima keratomikoze, omogućujući brzu dijagnozu i time ranu uspostavu definitivne terapije. Istraživanja CLSM tehnika za endoskopske postupke (endomikroskopija) također obećavaju. U farmaceutskoj industriji preporučuje se praćenje procesa proizvodnje tankog filma farmaceutskih oblika kako bi se kontrolirala kvaliteta i ujednačenost distribucije lijeka.
Optika i kristalografija
CLSM se koristi kao mehanizam za pronalaženje podataka u nekim 3D optičkim sustavima za pohranu podataka i pomogao je u određivanju starosti Magdaleninog papirusa.
Varijante i poboljšanje
Poboljšanje aksijalne rezolucije
Funkcija širenja točke je elipsoid točke, nekoliko puta duži od svoje širine. To ograničava aksijalnu rezoluciju mikroskopa. Jedna od metoda za prevladavanje ovoga je 4π mikroskopija, gdje upadna i emitirana svjetlost ili može interferirati s gornjim i donjim dijelom uzorka, kako bi se smanjio volumen elipsoida. Alternativna metoda konfokalna mikroskopija theta. U ovoj tehnici, osvjetljavajući svjetlosni stožac i svjetlo koje se detektira nalaze se pod kutom jedno u odnosu na drugo (najbolji rezultati kada su okomiti). Sjecište dviju funkcija hendikepa daje puno manji efektivni volumen uzorka. Iz toga se razvio jedan zrakoplov za osvjetljavanje mikroskopa. Dodatno, dekonvolucija se može koristiti korištenjem eksperimentalno izvedene funkcije širenja točke za uklanjanje svjetlosti izvan fokusa, poboljšavajući kontrast u aksijalnoj i bočnoj ravnini.
super rezolucija
Postoje konfokalne varijante koje postižu rezoluciju ispod granice difrakcije, kao što je mikroskopija osiromašenom stimuliranom emisijom (STED). Osim ove tehnike, dostupan je širok izbor drugih (nekonfokalnih) metoda super-razlučivosti kao što su dlan, (e) STORM, SIM itd. Svi oni imaju svoje prednosti, poput jednostavnosti korištenja, razlučivosti i potrebe za posebnom opremom, puferom ili fluoroforom.
Niska temperatura
Za snimanje uzoraka na niskim temperaturama korištena su dva glavna pristupa, oba temeljena na arhitekturi konfokalne mikroskopije s laserskim skeniranjem. Jedan pristup je korištenje kriostata kontinuiranog protoka: samo je uzorak na niskoj temperaturi i njegovo optičko adresiranje je kroz prozirni prozor. Drugi mogući pristup je razdvajanje optike (osobito objektivnog mikroskopa) u Dewar kriogenom skladištu. Ovaj drugi pristup, iako glomazniji, jamči bolju mehaničku stabilnost i izbjegava gubitke zbog prozora.
slike
Djelomični profil površine kovanice od 1 eura izmjeren konfokalnom mikroskopijom Nipkow diska.
Podaci o refleksiji za kovanicu od 1 eura.
priča
Početak: 1940.-1957
Prvo konfokalno skeniranje Mikroskop je izradio Marvin Minskow 1955., a patent je prijavljen 1957. Skeniranje točke osvjetljenja u žarišnoj ravnini postignuto je pomicanjem postolja. Nije dostavljeno znanstveno izdanje, niti su sačuvane slike napravljene njime.
Tandem skenirajući mikroskop
Dijagram Petranove tandemske skenirajuće mikroskopije. Dodana je crvena traka koja označava Nipkow disk.
Godine 1960., Čehoslovak Mojmir Petran, Medicinski fakultet Karlovog sveučilišta u Pilsenu razvio je tandemski skenirajući mikroskop, prvu komercijaliziranu konfokalnu mikroskopiju. Tracor-Northern (kasnije NORAN) prodao ga je maloj tvrtki u Čehoslovačkoj i Sjedinjenim Državama, a koristio je rotirajući Nipkow disk za generiranje višestrukih pobuđenja i emisija rupica.
Čehoslovački patent prijavili su 1966. Petran i Milan Hadravský, čehoslovački kolega. Prvu znanstvenu publikaciju s podacima i slikama dobivenim ovim mikroskopom objavili su M. David Egger sa Sveučilišta Yale i Petran u časopisu Science 1967. godine. U bilješci uz ovaj članak spominje se da je Petran dizajnirao mikroskop i nadzirao njegovu izradu, te da je dijelom bio i "fellow" na Yaleu. Drugo izdanje iz 1968. opisalo je teoriju i tehničke detalje instrumenta, a Hadravský i Robert Galambos, voditelj tima na Yaleu, bili su dodatni autori. Godine 1970. izdan je američki patent. Podnesena je 1967.
1969: Prvi konfokalni laserski skenirajući mikroskop
Godine 1969. i 1971., M. David Egger i Paul Davidovits sa Sveučilišta Yale objavili su dva rada koji opisuju prvi konfokalni laser skenirajuća mikroskopija. Bio je to točkasti skener, što znači da je generirana samo jedna točka osvjetljenja. Koristi epi-iluminacijsko-refleksijsku mikroskopiju za promatranje neuralnog tkiva. Helij-neonski laser snage 5 mW valne duljine 633 nm reflektirao je svjetlost od prozirnog zrcala u smjeru mete. Meta je bila jednostavna leća sa žarišnom duljinom od 8,5 mm. Za razliku od svih prethodnih i najnovijih sustava, uzorak je skeniran pomicanjem ove leće (scan target), što dovodi do pomicanja žarišne točke. Reflektirana svjetlost vraćala se u prozirno zrcalo, a emitirani dio je bio usmjeren na drugu leću za detekciju točke, iza koje je bila postavljena cijev fotomultiplikatora. Signal je vizualiziran pomoću CRT osciloskopa, katodna zraka je prenesena istovremeno s metom. Poseban uređaj omogućio je snimanje fotografija polaroidom, od kojih su tri prikazane u publikaciji iz 1971. godine.
Autori razmišljaju o fluorescentnim bojama za in vivo studije. Citiraju Minskyjev patent, zahvaljujući Steveu Baeru, tada doktorandu na Medicinskom fakultetu Albert Einstein u New Yorku gdje je razvio konfokalni linijski skenirajući mikroskop, predložio je korištenje lasera s "Minsky mikroskopom" i zahvaljujući Galambosu, Hadravskom i Petranu za rasprave koje su dovele do razvoja njegovog mikroskopa. Motivacija za njihov razvoj bila je ta da je u tandem skenirajućoj mikroskopiji samo 10 -7 udjela svjetlećeg svjetla uključeno u stvaranje slike u dijelu oka. Stoga kvaliteta slike nije bila dovoljna za većinu bioloških studija.
1977-1985: Spot skeneri s laserima i skeniranje scene
Godine 1977. Colin JR Sheppard i Tony Wilson opisali su konfokalne s epi-laserskim osvjetljenjem, pozornicom za skeniranje i fotomultiplikatorskim cijevima kao detektorima. Pozornica se mogla kretati duž optičke osi (os Z), omogućujući optičke serijske presjeke.
Godine 1979. Fred Brakenhoff i njegovi kolege pokazali su da su teorijske prednosti optičkog rezanja i poboljšanja razlučivosti doista ostvarive u praksi. Godine 1985. ova je skupina prva objavila uvjerljive konfokalne mikroskopske slike koje su mogle odgovoriti na biološka pitanja. Ubrzo nakon toga, mnoge druge skupine počele su koristiti konfokalnu mikroskopiju kako bi odgovorile na znanstvena pitanja koja su još uvijek ostala tajna zbog tehnoloških ograničenja.
Godine 1983. IJ Cox i S. Sheppard iz Oxforda objavili su prvi rad prema kojemu je računalno upravljan konfokalni mikroskop. Prvi komercijalni laserski skenirajući mikroskop, SOM-25 stage-scanner ponudio je Oxford Optoelectronics (nakon nekoliko TAKE okvira koje je kupio BioRad) početkom 1982. Bio je zasnovan na dizajnu Oxford grupe.
Od 1985.: Laserski točkasti skeneri sa skeniranjem zrakom
Sredinom 1980-ih William Bradshaw Amos i John Graham White i kolege koji su radili u Laboratoriju za molekularnu biologiju u Cambridgeu napravili su prvi mikroskop za skeniranje s konfokalnom zrakom. Stalak s uzorkom se ne pomiče, već je osvjetljenje točkasto, što omogućuje brže dobivanje slike: četiri slike u sekundi s po 512 redaka. Međuslike su jako pretjerane, zbog putanje snopa od 1-2 metra, dopušteno je koristiti konvencionalnu iris dijafragmu kao "rupicu", promjera ~ 1 mm. Prve mikrofotografije snimljene su pod dugom ekspozicijom filma prije dodavanja digitalne kamere. Daljnje poboljšanje omogućilo je skaliranje u treningu po prvi put. Zeiss je otprilike u isto vrijeme doveo do komercijalnog CLSM-a koji je distribuirala švedska tvrtka Sarastro. Posao je 1990. kupio Molecular Dynamics, ali je CLSM na kraju ukinut. U Njemačkoj, Heidelberg Instruments, osnovan 1984., razvio je CLSM, koji je izvorno bio namijenjen za industrijske primjene, a ne za biologiju. Ovaj papir je 1990. godine predan tvrtki Leica Lasertechnik. Zeiss je već na tržištu nekonfokalni laserski skenirajući mikroskop s letećim točkama, koji je nadograđen na konfokalni. Izvješće iz 1990. koje navodi "nekog" proizvođača konfokala navodi: Sarastro, Technical Instrument, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-North i Zeiss.
Godine 1989. Fritz Karl Preikschat, sa svojim sinom Ekhardom Preikschat, izumio je skenirajući diodni laserski mikroskop za analizu veličine čestica. On i Ekhard Preikschat suosnivali su Lasentec za komercijalizaciju. Godine 2001. Lasentec je kupio Mettler Toledo (NYSE: MPD). Otprilike deset tisuća sustava instalirano je diljem svijeta, uglavnom u farmaceutskoj industriji, kako bi se osigurala in situ kontrola procesa kristalizacije u velikim sustavima za pročišćavanje.
- Dvofotonska pobudna mikroskopija: Iako koriste odgovarajuću tehnologiju (oba su laserski skenirajući mikroskopi), višefotonski fluorescentni mikroskopi nisu strogo konfokalni mikroskopi. Termin konfokalan proizlazi iz prisutnosti dijafragma V konjugirana žarišna ravnina(konfokalna). Ovaj otvor obično nema u višefotonskim mikroskopima.
- Fluorescencijski mikroskop s potpunom unutarnjom refleksijom (TIRF) oko
konfokalna mikroskopija- Virtualni CLSM (temeljen na Javi)
- animacija i objašnjenje o različitim vrstama mikroskopa, uključujući fluorescentne i konfokalne mikroskope. (Sveučilište Paris Sud)
Osnovni koncepti
Iako se današnji instrumenti značajno razlikuju od najranijih inačica, princip konfokalne slike, koji je uveo Marvin Minsky i patentirao 1957., koristi se u svim modernim konfokalnim mikroskopima. U tradicionalnim mikroskopima širokog polja cijeli se uzorak osvjetljava živinim ili ksenonskim izvorom svjetlosti, a slika se promatra vizualno ili projicira na uređaj za snimanje slike ili fotografski film. Metoda formiranja slike s konfokalnim mikroskopom bitno je drugačija. Osvjetljavanje se postiže skeniranjem cijele površine uzorka s jednom ili više fokusiranih zraka svjetlosti, obično iz izvora laserskog luka. Osvijetljeno područje uzorka fokusira se lećom i zatim skenira pomoću računalno kontroliranog skenera. Niz svjetlosnih zraka iz uzorka detektira se kroz rupicu (ili, u nekim slučajevima, prorez) pomoću fotomultiplikatorske cijevi (PMT), čiji se izlaz pretvara u sliku prikazanu na računalu. Iako se neobojani uzorci mogu promatrati s reflektiranom svjetlošću, obično su označeni jednom ili više fluorescentnih boja.
Metode dobivanja slike
Konfokalna mikroskopija koristi razne tehnike snimanja za ispitivanje velikog broja različitih vrsta uzoraka. Svi se temelje na tehničkoj mogućnosti dobivanja slika visoke razlučivosti, zvanih optički presjeci, u nizu relativno debelih presjeka ili cijelog uzorka (totalna priprema). Optički presjek je osnovni element slike. Same slike dobivene su promatranjem spojenih i obojenih uzoraka u jednostrukim, dvostrukim, trostrukim i viševalnim načinima osvjetljenja, dok će slike formirane različitim tehnikama osvjetljavanja i bojenja biti u međusobnoj preciznoj korelaciji. Moguće je dobiti slike žive stanice i vremenski razmotanu slikovnu sekvencu (registracija slika u zadanom vremenskom intervalu), a metode numeričke obrade slikovnih sekvenci omogućuju stvaranje integrirane cjelovite slike iz niza slika duž z-osi i trodimenzionalne slike uzoraka., kao i prikaz trodimenzionalnih podataka u vremenskom nizu, odnosno četverodimenzionalna slika. U prvim konfokalnim mikroskopima, slike su dobivene korištenjem reflektirane svjetlosti, ali, zapravo, u laserskom skenirajućem konfokalnom mikroskopu, može se koristiti metoda snimanja korištenjem bilo kojeg propuštenog izvora svjetla koji se obično koristi u mikroskopiji.
Stvaranje slike
Postupci pripreme uzorka i snimanja s konfokalnim mikroskopima u osnovi su oni koji su se tijekom godina razvili u konvencionalnoj mikroskopiji širokog polja. U biomedicini, glavna primjena konfokalne mikroskopije je slikanje povezanih ili živih stanica i tkiva, koji su obično obojeni s jednom ili više fluorescentnih oznaka. Postoji velik broj različitih fluorescentnih boja koje se mogu unijeti u relativno jednostavne protokole i koristiti za bojenje specifičnih staničnih organela i struktura. Među velikom raznolikošću dostupnih boja su, na primjer, one boje jezgre, Golgijevog aparata, endoplazmatskog retikuluma, mitohondrija, kao i bojila poput fluorescentnog faloidina, što ukazuje na polimerizirani aktin u stanicama. Bez obzira na metodu pripreme uzorka, glavna prednost konfokalne mikroskopije leži u fleksibilnosti prikaza i analize slike koja proizlazi iz istovremenog prikupljanja više slika i njihove digitalne prezentacije u računalu.
Kritični aspekti konfokalne mikroskopije
Kvantitativno 3D oslikavanje u fluorescentnoj mikroskopiji često je komplicirano artefaktima pripreme uzorka zbog kontroliranih i nekontroliranih eksperimentalnih vrijednosti ili problema s pozicioniranjem i rasporedom mikroskopa. Ovaj članak, koji je napisao dr. James B. Pauly, navodi najčešće čimbenike okoliša koji često zamagljuju rezultate fluorescencije širokog polja i konfokalne mikroskopije. Teme o kojima se raspravlja uključuju laserski sustav, poravnanje optičkih komponenti, povećanje objektiva, artefakte izbjeljivanja, aberacije, ulje za uranjanje, debljinu pokrovnog stakalca, kvantni prinos (kvantna učinkovitost) i okolinu uzorka.
Aberacije u višebojnoj konfokalnoj mikroskopiji
Poboljšanja dizajna pojednostavila su konfokalnu mikroskopiju do točke u kojoj je postala uobičajeni istraživački alat u staničnoj biologiji. Ali kako su konfokalni mikroskopi postajali moćniji, postavljalo se sve više zahtjeva pred njihovu optiku. Zapravo, optičke aberacije koje uzrokuju manje nedostatke slike u mikroskopiji širokog polja mogu biti razorne u konfokalnoj mikroskopiji. Nažalost, strogi optički zahtjevi u konfokalnoj mikroskopiji često su prikriveni optičkim sustavima koji jamče jasnu sliku čak i sa slabim mikroskopom. Proizvođači optike proizvode mnogo različitih mikroskopskih objektiva dizajniranih za posebne primjene. Ovaj članak pokazuje kako kompromisi u dizajnu objektiva utječu na konfokalnu mikroskopiju.
Prikaz u tri boje u konfokalnoj mikroskopiji
Laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSCM) obično se koristi za digitalno snimanje fluorescentnih uzoraka označenih s jednom, dvije i tri oznake. Upotreba crvene, zelene i plave (RGB) boje najinformativnija je za predstavljanje distribucije svjetla do tri fluorescentne oznake stanica, kada se komplementarna boja koristi za svaki relativni položaj i kada slike različitih boja tvore jednu tri - uzorak u boji. U ovom odjeljku pogledat ćemo pojednostavljenu verziju nedavno objavljene metode za dobivanje konfokalnih slika u tri boje pomoću popularnog programa za obradu slika, Adobe Photoshop. Dodatno, raspravlja se o nekoliko primjena za stvaranje trobojnog protokola za prikaz konfokalnih slika. Vrijedno je imati na umu da ove numeričke metode nisu ograničene na LSCM slike i mogu se primijeniti na digitalne slike uvezene u Photoshop iz drugih izvora.
Osnove konfokalne refleksijske mikroskopije
Konfokalna refleksijska mikroskopija može se koristiti za dobivanje dodatnih informacija o uzorku uz relativno malo dodatnog napora jer tehnike zahtijevaju minimalnu pripremu uzorka i ponovno podešavanje opreme. Osim toga, u konfokalnoj reflektirajućoj mikroskopiji informacije o neobojanom tkivu jednako su dostupne kao i podaci dobiveni iz obojenih reflektirajućih uzoraka. Ova se metoda također može kombinirati s uobičajenijim metodama fluorescentnog snimanja. Primjeri novijih primjena su registracija neobojanih stanica u populaciji fluorescentno obojenih stanica i promatranje interakcija između fluorescentno obojenih stanica koje rastu na neprozirnom strukturiranom supstratu.
Galerija konfokalnih slika
Galerija konfokalnih slika Nikon MicroscopyU niz je digitalnih slika snimljenih konfokalnim mikroskopom Nikon PCM-2000 u kombinaciji s uspravnim mikroskopom Eclipse E-600. Niz slika optičkih presjeka u različitim ravninama uzorka dobiven je skeniranjem duž optičke osi mikroskopa. Niz je predstavljen interaktivnom Java aplikacijom koja vam omogućuje automatsko "reproduciranje" niza isječaka ili njihovo pomicanje naprijed-natrag poput slajdova.
Laserska skenirajuća konfokalna mikroskopija
Razvijeno je nekoliko metoda za prevladavanje fenomena slabog kontrasta koji je svojstven prikazivanju debelih uzoraka koji se obično proizvode mikroskopima. Konfokalne i dekonvolucijske tehnike daju znatno bolje slike uzoraka srednje debljine (5 do 15 mikrona). Najdeblji uzorci (20 mikrona ili više) degradiraju se izlaganjem jakom ambijentalnom svjetlu iz područja izvan fokusa i možda se najbolje dobivaju tehnikama konfokalne mikroskopije. U ovom vodiču uzorci se prikazuju kao niz optičkih presjeka duž z-osi pomoću virtualnog konfokalnog mikroskopa.
Refleksijska konfokalna mikroskopija
Uz pomoć ovog vodiča možete ispitati pojedinačne slojeve površine integriranih sklopova. Digitalne slike za navođenje dobivene su korištenjem reflektivnog konfokalnog mikroskopa Nikon Optiphot C200. Za svaku seriju snimljen je slijed optičkih presjeka duž z-osi dok je mikroskop prodirao i fokusirao duboko (s korakom od 1 mikrometra) u mozaik sklopova na površini kristala silicija.
Ključne točke
U usporedbi s tradicionalnom mikroskopijom, konfokalna mikroskopija ima nekoliko prednosti, uključujući malu dubinu prodiranja u uzorak koji se proučava, odsutnost pozadinskog osvjetljenja i mogućnost dobivanja niza optičkih presjeka debelih uzoraka. U biomedicini, glavna primjena konfokalne mikroskopije je slikanje povezanih ili živih stanica i tkiva, koji su obično označeni jednom ili više fluorescentnih oznaka.
Riža. 1. Shema puta zraka u konfokalnoj mikroskopiji
Prilikom snimanja fluorescentnih uzoraka konvencionalnim mikroskopom širokog polja, sekundarni sjaj koji emitira uzorak iz područja izvan proučavanja često ometa oštrinu detalja u fokusu. Ovo je posebno problematično za uzorke deblje od 2 mikrometra. Konfokalna mikroskopija daje blago poboljšanje rezolucije i duž osi i u ravnini; ali upravo je sposobnost isključivanja pozadinskog svjetla koje se pojavljuje u debelim fluorescentno obojenim uzorcima uzrokovala nedavni porast popularnosti ove metode istraživanja. Budući da su relativno jednostavni za rukovanje, većina modernih konfokalnih mikroskopa postala je dio osnovne opreme u mnogim višekorisničkim sustavima za snimanje. Budući da je razlučivost koju postiže laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSCM) nešto bolja od tradicionalnog optičkog mikroskopa širokog polja, ali još uvijek znatno niža od razlučivosti transmisijskog (transmisijskog) elektronskog mikroskopa, to je, u određenom smislu, bio most između dvije najčešće metode istraživanja. Slika 1 prikazuje shematski dijagram prolaska svjetlosti u osnovnom konfokalnom mikroskopu.
U tradicionalnim mikroskopima širokog polja cijeli se uzorak osvjetljava živinim ili ksenonskim izvorom svjetlosti, a slika se promatra vizualno ili projicira na uređaj za slikanje ili fotografski film. Metoda dobivanja slike konfokalnim mikroskopom bitno je drugačija. Uzorak se osvjetljava skeniranjem s jednom ili više fokusiranih zraka, obično laserom (slika 2). Slike dobivene skeniranjem uzorka nazivaju se optički presjeci. Ova terminologija odnosi se na neinvazivnu metodu istraživanja, kada se slike dobivaju pomoću fokusiranog svjetla, a ne fizičkim seciranjem uzorka.
Riža. 2. Širokopoljno i točkasto skeniranje uzoraka
Konfokalna mikroskopija uvelike je pojednostavila pregled živih preparata, omogućila dobivanje podataka u tri dimenzije (z-serije) i unaprijedila proces dobivanja slike višestruko obojenih preparata. Slika 3 uspoređuje konvencionalno fluorescentno oslikavanje s episkopskim konfokalnim iluminatorom za oslikavanje istih područja ukupnog preparata lutke leptira s epitelom obojenim propidijevim jodidom. Očito, impresivno povećanje rezolucije i, kao rezultat toga, oštrina slike jezgri na LSCM slici, zbog isključenja fluorescentnog sjaja izvan fokusa.
Laserski skenirajući konfokalni mikroskop (LSCM)
LSCM je sada najčešća inačica konfokalnih mikroskopa koja se koristi u biomedicini. U uvodu je posebna pažnja posvećena LSCM-u, budući da dizajn i konstrukcija ovih mikroskopa omogućuje rad s njima i korisnicima početnicima. Ostala konstruktivna rješenja zauzela su svoje posebne niše u biologiji. Za bilo koji model ili modifikaciju konfokalnog mikroskopa primjenjuje se većina pravila za pripremu uzoraka, uz manje modifikacije, kao i druge tehnike optičkog rezanja kao što su dekonvolucija i multifotonske tehnike.
Razvoj konfokalne mikroskopije
Vjeruje se da izum konfokalnog mikroskopa pripada Marvinu Minskyju, koji je stvorio radni mikroskop 1955. godine. Razvoj konfokalne mikroskopije uvelike je bio potaknut željom za promatranjem bioloških procesa u živom tkivu (in vivo) (u tijelu), a Minsky si je postavio cilj dobiti sliku neuronske mreže u neobojanom preparatu živog mozga. . Principi konfokalne mikroskopije, koje je iznio Minsky i patentirao 1957., koriste se u svim modernim konfokalnim mikroskopima. Slika 1 objašnjava konfokalni princip, primijenjen na epifluorescentnu mikroskopiju, koji je u osnovi svih modernih konfokalnih sustava koji se koriste u fluorescentnom snimanju. U izvornoj konfiguraciji, Minsky je koristio rupicu (dijafragmu) postavljenu ispred cirkonijevog lučnog izvora svjetlosti koji se koristio kao točkasti izvor svjetlosti.
Riža. 3. Epitel krila leptira
Svjetlost iz točkastog izvora fokusirana je u obliku točke pomoću leće na zadanu žarišnu ravninu u uzorku i, prolazeći kroz nju, fokusirana je drugom lećom na drugu rupicu dijafragme (rupicu) koja je bila u fokusu s prvi (bili su konfokalni, tj. konfokalni). Zrake koje prolaze kroz drugu rupicu pogađaju niskošumnu fotomultiplikatorsku cijev koja generira signal ovisno o svjetlini svjetla koje dolazi iz uzorka. Druga rupica je odsjekla svjetlost iz fotomultiplikatora koja dolazi iz područja iznad ili ispod žarišne ravnine u uzorku. Upotreba prostornog filtriranja za uklanjanje svjetlosti izvan fokusa i odbljeska pri radu s uzorcima debljima od žarišne ravnine ključno je načelo konfokalne mikroskopije. U svojim spisima, Minsky je također opisao reflektirajući mikroskop s jednim objektivom i dikromatskim zrcalom, čiji je dizajn postao temeljem sustava koji se danas koriste.
Za dobivanje slike konfokalnom metodom potrebno je skenirati uzorak svjetlom fokusiranim u točku. U izvornom aparatu koji je sastavio Minsky, snop svjetlosti je bio nepomičan, a sam uzorak kretao se na vibrirajućem postolju. Nepokretnost snopa skeniranja u odnosu na optičku os mikroskopa bila je prednost ove postavke, jer je omogućila uklanjanje većine optičkih nedostataka koji bi mogli iskriviti sliku. Međutim, pri ispitivanju bioloških uzoraka to bi moglo uzrokovati vibracije i izobličenje, što bi u konačnici dovelo do gubitka rezolucije i jasnoće slike. Štoviše, kada se pozornica i uzorak pomiču, nemoguće je izvoditi bilo kakve manipulacije, kao što su, na primjer, mikroinjekcije fluorescentno obojenih stanica.
No, bez obzira na to kako se uzorak skenira, potrebno je dobiti njegovu sliku. A Minskyjev originalni sklop nije stvorio stvarnu sliku, budući da je izlazni signal fotomultiplikatora doveden na dugotrajni osciloskop s naknadnim sjajem koji se koristi u vojsci, a koji nije imao snimač. Minsky je kasnije napisao da neimpresivna kvaliteta njegove slike nije bila posljedica niske rezolucije samog mikroskopa, već zaslona osciloskopa. Sada je jasno da zbog nedostatka tehnologije, Minsky nije mogao u potpunosti demonstrirati puni potencijal konfokalne metode, posebice prilikom snimanja bioloških struktura. Istaknuo je kako je možda upravo to razlog zašto konfokalna mikroskopija nije odmah prihvaćena u vrlo zahtjevnoj zajednici biologa, kojima je kvaliteta dobivenih slika uvijek bila na prvom mjestu. Tada su im na raspolaganju bili svjetlosni mikroskopi s izvrsnom optikom, koji su omogućavali promatranje i fotografiranje živo obojenih histoloških rezova na vrlo osjetljivom filmu u boji. U modernim konfokalnim mikroskopima slike se formiraju iz signala iz fotomultiplikatorske cijevi ili se hvataju digitalnom kamerom s ugrađenim CCD-om, izravno obrađuju računalnim sustavom za slikanje, prikazuju na ekranu visoke rezolucije i na izvrsnom uređaju za dokumentiranje slika . Dijagram modernog laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa prikazan je na slici 4.
Riža. 4. Shema suvremenog laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa
Osnovna optika optičkog mikroskopa nije se temeljito mijenjala desetljećima, budući da je konačna rezolucija instrumenta određena valnom duljinom, objektivom i svojstvima samog uzorka. Boje koje se koriste za poboljšanje kontrasta uzorka i druge tehnike optičke mikroskopije značajno su se poboljšale u posljednjih 20 godina. Uspon i usavršavanje konfokalne metode posljedica je oživljavanja optičke mikroskopije, uzrokovano, umnogome, uspjesima suvremenih tehnologija. Mnoga tehnološka dostignuća koja bi mogla biti korisna u Minskyjevu dizajnu postupno postaju dostupna (uključujući i cijenu) biolozima i drugim mikroskopistima. Među njima, stabilni višefrekventni laseri koji se koriste kao napredni izvori točkastog svjetla, napredna dikromatska zrcala, osjetljivi fotodetektori s niskim šumom, mikroračunala velike brzine s poboljšanim mogućnostima (zbog dostupnosti memorije velikog kapaciteta), sofisticirani softver za slike, visoko- monitori rezolucije i digitalni pisači.Te su se tehnologije razvijale neovisno, a od 1955. postupno su integrirane u konfokalne sustave snimanja. Na primjer, tehnike obrade digitalne slike prvi su uspješno primijenili početkom 1980-ih istraživači Oceanografskog instituta Woods Hole. Koristeći, u njihovoj terminologiji, "video mikroskope," uspjeli su prikazati staničnu strukturu mikrotubula ispod teorijske granice rezolucije optičkog mikroskopa. Očigledno povećanje razlučivosti omogućeno je digitalnim optimiziranjem slika snimljenih visokoosjetljivom super-silicijskom (SIT) video kamerom povezanom s digitalnim procesorom slike. Stanične strukture vizualizirane su pomoću optike diferencijalnog interferencijskog kontrasta (DIC) i daljnje digitalne obrade slike.
Klasifikacija dizajna konfokalnih mikroskopa obično se temelji na metodi skeniranja uzorka. Postoje dvije glavne metode skeniranja: Stage Scan i Illumination Beam Scan; i najmanje dva načina skeniranja snopa. Minskyjev izvorni instrument temeljio se na sustavu za skeniranje pozornice kojeg je pokretao primitivni generator zvučne vilice koji je stvarao sliku prilično sporo. Suvremeni konfokalni uređaji za fazno skeniranje, daleko ispred svojih prototipova, koriste se uglavnom u znanosti o materijalima, na primjer, u proizvodnji mikrokristala. Sustavi koji se temelje na ovom principu nedavno su postali popularni u područjima biomedicine, gdje se provodi analiza DNA na mikrokristalima.
Praktičnija alternativa prikazivanju bioloških sustava je skeniranje zrakom stacionarnog uzorka. Ovo je načelo temelj mnogih mjernih sustava čije je usavršavanje dovelo do pojave danas popularnih istraživačkih mikroskopa. U ovom uvodu ne dotičemo se tehničkih detalja konfokalne mikroskopije, ali, u biti, ona koristi dvije bitno različite metode skeniranja snopom: skeniranje s više snopa i skeniranje s jednim snopom. Jednozračno skeniranje daleko je najčešće, a upravo se ova metoda koristi u LSCM-u. Ovdje se zraka skenira računalno kontroliranim zrcalima koja pokreću galvanometri brzinom od jednog okvira u sekundi. Kako bi se postiglo brže skeniranje, približno pri brzini video kadrova, neki sustavi koriste akusto-optičke uređaje ili oscilirajuća zrcala. Alternativna metoda koristi dvije zrake za skeniranje u gotovo stvarnom vremenu, obično koristeći oblik vrtećeg Nipkow diska. Ovi sustavi rezultat su modifikacije i usavršavanja uparenih (tandem) skenirajućih mikroskopa (TSM), s ciljem stvaranja učinkovitijih modela za oslikavanje fluorescentno obojenih uzoraka. Slika 5 prikazuje takav napredni sustav s dvostrukim Nipkow diskovima i mikrolećama za poboljšanje osjetljivosti na slabo fluorescentno svjetlo u stvarnom vremenu.
Riža. 5. Optički dizajn temeljen na Nipkow diskovima
Do danas postoje dvije alternativne metode za dobivanje optičkih presjeka u konfokalnoj mikroskopiji: metoda dekonvolucije i višefotonska metoda. Tehnički se razlikuju, ali se, kao i konfokalne metode, temelje na tradicionalnoj optičkoj mikroskopiji. Dekonvolucija se temelji na računalnim algoritmima za izračunavanje i uklanjanje informacija koje dolaze prilikom stvaranja slike iz područja izvan fokusa. Ova je tehnika postala vrlo praktična zahvaljujući učinkovitim algoritmima i miniračunalima visokih performansi. Višefotonska mikroskopija koristi isti sustav skeniranja kao LSCM, ali ne zahtijeva rupicu u prijemniku. Nije potrebno jer laser pobuđuje fluorokromsku oznaku samo u žarišnoj točki, čime se isključuje zračenje izvan fokusa. Kada se promatra živo tkivo, ova metoda ima dodatnu prednost smanjenja fotoizbjeljivanja, jer se smanjuje količina energije koju prenosi laserska zraka i apsorbira tkivo uzorka.
Tradicionalni optički mikroskop osnova je na kojoj je izgrađen LSCM. Umjesto volframove ili živine žarulje koristi se laser koji je spojen na osjetljivu fotomultiplikatorsku cijev (PMT) i računalo koje upravlja zrcalima za skeniranje i drugim uređajima za skeniranje, a također olakšava prikupljanje i prezentaciju slika. Primljeni podaci pohranjuju se na digitalni medij i mogu se obrađivati pomoću brojnih programskih paketa, bilo na računalu samog sustava, bilo na nekom drugom.
Prema dizajnu LSCM, osvjetljenje i prijam (registracija) signala ograničeni su na točku na uzorku s granicom difrakcije. Objektivi mikroskopa stavljaju točku osvjetljenja u fokus, a uređaj za skeniranje skenira uzorak tom točkom pod kontrolom računala. Signali iz svjetlećih točaka uzorka ulaze u fotomultiplikator kroz rupicu (ili, u nekim slučajevima, prorez) dijafragme, a PMT izlazni signali se oblikuju u sliku i vizualno reproduciraju pomoću računala. Iako se neobojani uzorci mogu promatrati u reflektiranoj svjetlosti od uzorka, oni su obično obojeni s jednom ili više fluorescentnih boja. Jedan od češćih LSCM-ova, opisan u literaturi oko 1990. godine, razvijen je kao odgovor na temeljni problem s kojim se suočava istraživačka biologija. Mnoge strukture i pojedinačne makromolekule unutar imunofluorescentno obojenih embrija ne mogu se vizualizirati tradicionalnim epifluorescentnim mikroskopom nakon stadija s dvije stanice, budući da volumen embrija ostaje približno isti kako se broj stanica povećava. To znači da se kod gušćeg rasporeda stanica pojačava luminiscencija stanica izvan žarišne ravnine, što dovodi do pogoršanja rezolucije slike.
Riža. 6. Konfiguracija Nikon laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa
Grupa istraživača koja je radila na ovom problemu otkrila je da niti jedan od tada dostupnih konfokalnih sustava ne ispunjava njihove zahtjeve. U to su vrijeme mikroskopi sa pozorničkim skeniranjem bili prespori. Bilo je potrebno otprilike 10 sekundi za stvaranje jedne slike, a instrumenti s više zraka još nisu bili praktični za fluorescentno snimanje. LSCM je osmišljen kako bi ispunio zahtjeve tradicionalne epifluorescentne mikroskopije i, zajedno s ostalima koji su se razvijali u isto vrijeme, postao je prototip složenih sustava koje razne tvrtke sada nude biomedicinskoj zajednici. Primjer sustava koji se danas koristi (Nikon E1000) prikazan je na slici 6.
U posebno dizajniranim uređajima, debljina optičkih presjeka može se mijenjati s promjenom promjera rupice ispred fotodetektora. U usporedbi s drugim dizajnom fiksnih rupica, ova je dodatna značajka iznimno fleksibilna u prikazivanju bioloških struktura. Slika se može povećati bez gubitka razlučivosti smanjenjem skeniranog područja uzorka i stavljanjem skeniranih informacija u niz podataka iste veličine za pohranjivanje i vizualizaciju (slično, promjene povećanja u skenirajućem elektronskom mikroskopu). To daje jednom objektivu interval zumiranja, što može biti izuzetno korisno pri renderiranju rijetkih ili kratkotrajnih događaja koji bi mogli biti propušteni ili izgubljeni prilikom promjene objektiva.
Sa sofisticiranim i fleksibilnim mogućnostima LSCM-a koji je sada komercijalno dostupan po pristupačnim cijenama, konfokalna mikroskopija je eksplodirala posljednjih godina, a mnogi višekorisnički laboratoriji daju prednost ovoj opremi u odnosu na elektronske mikroskope. Prednost konfokalne mikroskopije je relativna lakoća kojom se mogu dobiti visokokvalitetne slike uzoraka pripremljenih za tradicionalnu optičku mikroskopiju, te veliki broj primjena u različitim područjima istraživanja.
Prva generacija LSCM-a dobro je radila s fiksiranim uzorcima, ali nisu mogli kontrolirati svjetlosnu energiju lasera, što je prečesto dovodilo do fatalnog uništenja živog uzorka ako se nisu poduzele ozbiljne mjere opreza. Unatoč tim ograničenjima, slike fiksiranih uzoraka bile su tako visoke kvalitete da su stručnjaci bezuvjetno prihvatili konfokalni pristup. Naredne generacije instrumenata poboljšale su svaki aspekt procesa snimanja. Osim toga, novi uređaji postali su mnogo ergonomičniji i praktičniji za korištenje, tako da je poravnanje, promjena kombinacije filtera, podešavanje snage lasera, napravljeno pomoću računala, postalo puno lakše i brže. Sada je moguće snimati slike s tri fluorokroma istovremeno, a uzastopno s još više. Zahvaljujući poboljšanom i pouzdanijem softveru, bržim računalima, većim kapacitetima diskova i padu cijena RAM-a, obrada slika također je značajno napredovala.
Načini slikanja
Glavna primjena konfokalnog mikroskopa je slikanje debelih uzoraka raznih vrsta. Prednost konfokalne metode proizlazi iz mogućnosti stvaranja slika uzorka kao niza pojedinačnih optičkih presjeka visoke definicije i rezolucije. Koristi nekoliko načina slikanja; svaki od njih temelji se na optičkom presjeku, kao osnovnoj jedinici slike.
Riža. 1. Optički dijelovi označeni s tri oznake
Pojedinačne optičke sekcije
Optički presjek je osnovna jedinica slike u tehnikama konfokalne mikroskopije. Zalijepljeni i obojeni uzorci mogu se slikati pod jednostrukim, dvostrukim, trostrukim i osvjetljenjem s više valnih duljina, pri čemu se uzorci u više boja mogu slikati superponirani jedni na druge (ako se koriste leće s odgovarajućom korekcijom kromatske aberacije). Dodatno poravnanje obično se provodi tehnikama digitalne obrade slike. Većini konfokalnih mikroskopa s laserskim skeniranjem (LSCM) potrebna je približno 1 sekunda za dobivanje optičkog presjeka, iako se obično više optičkih rezova izračunava u prosjeku kako bi se poboljšao omjer signala i šuma. Vrijeme dobivanja slike, naravno, ovisi o dimenzijama piksela slike i brzini rada računala sustava. Za pohranjivanje tipične 8-bitne slike od 768×512 piksela potrebno je oko 0,3 Mb memorije.
Optički presjeci prikazani na slici 1 dobiveni su istovremeno s pobudnim svjetlom tri različite valne duljine (488, 568 i 647 nanometara) korištenjem jednog kripton/argonskog lasera kao izvora zračenja. Kao uzorak prikazan je imaginarni disk krila Drosophile u trećoj dobi, u kojem su označena tri gena uključena u formiranje krila. Tri prikazana gena i odgovarajuće fluorokromne oznake su: (a) vestigialni (fluorescein - 496 nanometara); (b) bez krila (lizamin rodamin - 572 nanometra); i © CiD (cijanin 5 - 649 nanometara). Kombinirana slika triju prostorno predstavljenih domena gena koji tvore krilo nalazi se dolje desno (slika (d)).
Snimanje u zadanom vremenskom intervalu i vizualizacija žive stanice
Proučavanje živih stanica u određenom vremenskom intervalu dobilo je novi zamah zbog porasta rezolucije LSCM-a. Prethodno su proučavanja gibanja staničnih struktura provođena pomoću 16 mm fotografskog filma i intervalometra sa satnim mehanizmom spojenim na kameru, kasnije pomoću videorekordera s vremenskim odmakom, snimača s optičkim diskom ili ploče za digitalizaciju video slike. Sada je uz pomoć LSCM-a moguće dobiti optičke presjeke u određenim, unaprijed postavljenim intervalima u stvarnom vremenu.
Vizualizacija živih tkiva s LSCM-om puno je teža od snimanja povezanih uzoraka i nije uvijek praktična jer uzorak možda neće izdržati uvjete promatranja. Tablica 1 navodi neke čimbenike koje treba uzeti u obzir pri promatranju živih i vezanih stanica pomoću LSCM-a. Neke uzorke jednostavno je fizički nemoguće postaviti na postolje mikroskopa ili neće moći ostati živi na njemu tijekom cijelog perioda promatranja. Fenomen ili struktura koja se istražuje ne mora biti unutar vidnog polja leće. Na primjer, imaginarni krilni diskovi Drosophile razvijaju se preduboko u larvi da bi se mogli promatrati; i jednom secirani, ne mogu se razviti u kulturi. Stoga je danas jedina dostupna metoda promatranja ekspresije gena u tkivima ove vrste seciranje ličinke, vezivanje i bojenje imaginarnih diskova uzetih iz uzoraka u različitim fazama razvoja.
tab. 1. Promatranje vezanih i živih stanica pomoću LSCM-a
Uspješno promatranje i snimanje živih stanica zahtijeva izuzetnu pažnju tijekom cijelog procesa. Održavanje prihvatljivih uvjeta na postolju mikroskopa je imperativ. Oštećenja uzrokovana stanicom pri ozračivanju laserskom zrakom mogu se akumulirati ponovljenim skeniranjem, stoga ovo izlaganje treba biti minimalizirano, potrebno i dovoljno za dobivanje slike. Antioksidansi, kao što je askorbinska kiselina, obično se dodaju u medij kulture kako bi se smanjio kisik koji se oslobađa kada su fluorescentne molekule izložene pobuđujućem svjetlu i pospješili proizvodnju slobodnih radikala koji ubijaju stanice. Obično je potrebno provesti opsežne preliminarne kontrolne eksperimente kako bi se procijenio učinak zračenja na fluorescentno obojene stanice, pažljivo prateći usklađenost svih parametara slike s opažanjem koje se vrši. Nakon probnih slika treba procijeniti održivost živih jedinki. Embriji, na primjer, moraju nastaviti svoj normalan razvoj tijekom cijelog procesa promatranja, tako da se sve anomalije uzrokovane izlaganjem zračenju ili fluorokromima moraju otkriti. Slika 2 prikazuje snimak u određenom vremenskom intervalu embrija Drosophile fluorescentno obojenog zelenim kalcijem. Niz slika prikazuje promjenu u distribuciji fluorescentne svjetlosti tijekom vremena.
Svaki tip stanice zahtijeva vlastite mjere za održavanje njihove održivosti tijekom procesa promatranja. Za neke stanice insekata dovoljno je održavati sobnu temperaturu i imati dovoljno veliki volumen odgovarajućeg medija. Međutim, većina vrsta stanica zahtijeva zagrijavanje postolja, a ponekad i perfuzijske komore kako bi se održala odgovarajuća ravnoteža ugljičnog dioksida tijekom njihovog boravka na postolju. Izbor tipa stanice za koji su uvjeti promatranja pomoću LSCM-a najmanje "neprijateljski" pomoći će u izbjegavanju mnogih eksperimentalnih problema. Poboljšanja modernih konfokalnih instrumenata rezultirala su značajnim smanjenjem mogućih problema. Povećana kvantna učinkovitost, veliki numerički otvor (svjetlina) objektiva i upotreba manje toksičnih staničnih boja učinili su konfokalnu mikroskopiju praktičnom metodom za analizu živih stanica. Potrebno je težiti korištenju lasera manje snage, omogućujući istovremeno što bržu registraciju i obradu slike. Ako se otvor rupice poveća kako bi se ubrzalo dobivanje i registracija slika (u usporedbi s promatranjem neživih uzoraka), naknadna dekonvolucija ponekad može vratiti izgubljenu kvalitetu slike.
Riža. 2. Snimanje u zadanom vremenskom intervalu
Mnogi fiziološki procesi i događaji odvijaju se prebrzo i stoga ih ne može uhvatiti većina LSCM-ova, čija je prosječna brzina snimanja jedna slika u sekundi. LSCM koji koriste akusto-optičke uređaje i dijafragme s prorezima brži su od sustava za skeniranje točka pobuđenim galvanometrom i praktičniji su za fiziološka istraživanja. Ove brže postavke kombiniraju dobru prostornu i vremensku razlučivost, koja može biti do 30 sličica u sekundi pri razlučivosti punog zaslona ili blizu brzine video slike. U sporijim mikroskopima koji skeniraju rupicu, vremenska se razlučivost može povećati samo smanjenjem područja skeniranja uzorka. Ako je potrebna puna prostorna razlučivost, broj sličica mora se smanjiti, što dovodi do gubitka vremenske razlučivosti. Konfokalni sustavi koji koriste skeniranje diskom ili oscilirajućim zrcalom također su sposobni prikazati brze fiziološke procese ili druge prolazne događaje.
Z-serija i 3D prikazi
Z-serija je niz optičkih presjeka uzorka, napravljenih na različitim razinama u ravnini okomitoj na optičku os (z-os). Slike Z-serije dobivaju se usklađivanjem inkrementalnih promjena u finom fokusu mikroskopa, nakon čega slijedi snimanje u svakom koraku. Koračno podešavanje fokusa obično se izvodi računalno kontroliranim koračnim motorom koji mijenja fokus za zadani iznos. Korištenjem računalnog makro programa, može se dobiti i spremiti slika, ponovno fokusirati mikroskop na zadanu dubinu u uzorku, dobiti i spremiti drugu sliku, ponovo fokusirati u novoj ravnini, i tako dalje, sve dok se ne postigne programirani broj slika stečeno.
Željene slike mogu se uzeti iz z-serije dobivene iz odabranog područja uzorka i obraditi posebnim programom za naknadno detaljno ispitivanje specifičnih stanica od interesa. Z-serija se može predstaviti kao fotomontaža slika, kao što je prikazano na slici 3. Ova vrsta kombinacije i prikaza slika, kao i mnoge druge manipulacije slikama, standardni je skup značajki modernih programskih paketa za obradu slika. Slike na slici 3 izbor su iz veće serije s još češćim z-koracima. Zeleni sjaj identificira periferni živčani sustav embrija Drosophile obojenog antitijelom 22C10.
Riža. 3. Z-serije optičkih presjeka
Na temelju niza od nekoliko stotina optičkih presjeka uzorka proizvedenog pomoću LSCM-a, može biti teško dobiti predodžbu o cijelom kompleksu međusobno povezanih struktura. Međutim, z-serija, nakon što je registrirana, idealan je materijal za kasniju 3D prezentaciju uzorka korištenjem volumetrijskih tehnika snimanja. Ovaj se pristup danas naširoko koristi za razjašnjavanje odnosa između strukture i funkcije tkiva u medicini i biologiji. Važno je postaviti ispravan korak z-skena za uzorak, određen korakom motora za promjenu fokusa; u ovom slučaju, slika će odražavati stvarnu dubinu uzorka.
Sve dok uzorak ostaje miran kada se gleda, slike LSCM z-serije bit će izvrsno snimljene i digitalno spremljene, bit će ih relativno lako pretvoriti u 3D prikaz uzorka. Slika 4 uspoređuje jedan optički presjek (a) s projekcijom z-serije (b) i ilustrira vrijednost ove tehnike u vizualizaciji perifernog živčanog sustava embrija Drosophile obilježenog 22C10 protutijelom.
Korak koračnog motora koji postavlja operater mikroskopa povezan je s debljinom optičkog dijela, ali može imati različitu vrijednost. Debljina optičkog presjeka povezana je s debljinom presjeka uzorka promatranog u mikroskopu, a ovisi o objektivu i promjeru rupice. U nekim slučajevima, međutim, korak fokusa može odgovarati debljini optičkog presjeka, a to može dovesti do zabune.
Nakon što se datoteka z-serije primi, šalje se programu za 3D rekonstrukciju posebno dizajniranom za konfokalnu obradu slike. Takvi programi su izuzetno brzi kada se koriste na grafičkim stanicama, ali se mogu uspješno koristiti i na osobnom računalu ili grafičkoj stanici samog konfokalnog mikroskopa, uz dovoljno brz procesor i veliku količinu RAM-a. Uz pomoć ovih programa moguće je kreirati kako zasebne 3D prikaze uzorka, tako i niz prikaza koji se međusobno izmjenjuju, sastavljen od različitih tipova uzorka, što proizvodi efekt rotacije ili druge prostorne transformacije i daje bolja percepcija trodimenzionalnih svojstava uzorka. Program vam omogućuje da mijenjate duljinu, dubinu, vršite volumetrijska mjerenja, kao i interaktivnu promjenu posebnih parametara slike, kao što je prozirnost uzorka, kako biste istaknuli različite strukture na različitim razinama uzorka.
Riža. 4. Optička presjeka i z-serija projekcija
Drugi način predstavljanja niza optičkih presjeka uzetih iz niza slika snimljenih u određenom vremenskom intervalu je trodimenzionalni prikaz u kojem z-os funkcionira kao vremenska os. Ovaj pristup je koristan u vizualizaciji fizioloških promjena kako se organizam razvija. Primjer primjene ove metode bilo je razjašnjenje dinamike promjena koncentracije kalcija tijekom razvoja embrija morskog ježa. Kodiranje bojama optičkih presjeka snimljenih na različitim dubinama jednostavan je način za predstavljanje 3D podataka. U praksi se svakom optičkom presjeku snimljenom na različitim dubinama uzorka dodjeljuje boja (obično crvena, zelena ili plava), a zatim se slike u boji kombiniraju, a željeni učinak postiže se promjenom boja pomoću programa za obradu slike.
4D snimanje
Uz pomoć LKSM-a, dinamički fenomeni koji se manifestiraju u živim tkivima ili tijekom pripreme kultura živih tkiva, a odražavaju se u nizu slika snimljenih u određenom vremenskom intervalu, mogu se prikazati u četverodimenzionalnom obliku, s vremenom kao četvrtim. dimenzija. Z-serije dobivene u pravilnim intervalima su četverodimenzionalni skupovi podataka: tri prostorne dimenzije (x, y i z) i vrijeme kao četvrta, što se može promatrati pomoću 4D preglednika. Takvi programi omogućuju komponiranje i reprodukciju, poput filma, stereoparova snimljenih u različitim vremenskim točkama ili, alternativno, obradu i prezentaciju rekreiranih trodimenzionalnih slika snimljenih u različitim vremenskim točkama, poput izrezanog filma.
X-Z slike
Ako je potrebno dobiti bočni pogled na uzorak, kao što je vertikalni presjek epitelnog sloja, x-z presjek se može napraviti na jedan od dva načina. Pogled sa strane može se dobiti skeniranjem jedne linije uzorka (x-os) na različitim dubinama (z-os), kontroliranjem fokusa pomoću koračnog motora, a zatim kombiniranjem cijelog niza rezova u jednu sliku. Druga metoda je korištenje opcije ravnine rezanja u programu za 3D renderiranje kada se pogled sa strane izdvaja iz postojećeg z-serija optičkih presjeka. Prilikom snimanja epitela leptirovog krila na slici 5, laser je skenirao duž jedne linije (vodoravna crna linija na lijevoj slici) prodirući u uzorak na različitim z-koordinatama ili dubinama. X-z slika prikazana na slici 5 napravljena je i prikazana s konfokalnim sustavom snimanja. Epitel krila sastoji se od dva epitelna sloja, no budući da se intenzitet fluorescentne emisije smanjuje s povećanjem dubine prodiranja laserske zrake u uzorak, jasno se vidi samo gornji sloj.
Riža. 5. Slika u X-Z ravnini
Stvaranje slike u reflektiranoj svjetlosti
Svi rani konfokalni mikroskopi radili su u reflektiranoj ili povratno raspršenoj svjetlosti. Koristeći reflektirano svjetlo, mnogi se uzorci mogu promatrati neobojeni u konfokalnoj mikroskopiji ili se mogu označiti bojama visoke refleksije kao što su mikrokristali imunoglada ili srebrnog halida. Prednost promatranja reflektirane svjetlosti, posebno za živa tkiva, je u tome što se uzorak ne podvrgava fotoizbjeljivanju. Ali neke vrste boja mogu oslabiti lasersku zraku. Još jedan potencijalni problem je da neki mikroskopi mogu doživjeti unutarnje refleksije od optičkih elemenata na optičkom putu zrake. Za verzije LSCM s više zraka i LSCM s procjepnom dijafragmom, problem reflektirane svjetlosti ne postoji, au onim mikroskopima gdje postoji, upotreba polarizatora, vizualizacija područja bez artefakata i odmak od optičke osi pomažu smanjiti problem.
Transmitted Light Imaging
U LSCM-u se može koristiti bilo koji od načina snimanja propuštenim svjetlom koji se obično koristi u mikroskopiji, uključujući fazni kontrast, kontrast diferencijalne interferencije (DIC), tamno polje ili polarizirano svjetlo. Svjetlost koja prolazi kroz uzorak ulazi u prijamnik propuštene svjetlosti, čiji se signal preko optičkog svjetlovoda usmjerava na jedan od fotomultiplikatora u skenerskoj glavi mikroskopa. Slike propuštene svjetlosti i konfokalne epifluorescentne slike mogu se uhvatiti istovremeno korištenjem iste zrake iz iluminatora, osiguravajući njihovu točnu registraciju. Spajanjem ili sintetiziranjem slika pomoću odgovarajućeg softvera može se prikazati točan položaj označenih stanica u tkivu. Neke studije predlažu sljedeći smisleni pristup: kombinirajte nekonfokalnu sliku propuštene svjetlosti s jednom ili više konfokalnih fluorescentnih slika označenih stanica iz istog uzorka. Takav pristup će omogućiti, na primjer, određivanje prostornih i vremenskih aspekata migracije subpopulacije obilježenih stanica unutar populacije neobilježenih stanica tijekom nekoliko sati ili čak godina.
Danas se već naširoko koristi prijemnik u boji propuštene svjetlosti, koji prima odaslane signale u crvenoj, zelenoj i plavoj boji (RGB) za proizvodnju slike u boji u stvarnim bojama, slično onome što se radi u nekim digitalnim kamerama u boji. Takav prijamnik posebno je koristan za patologe koji rutinski promatraju stvarne boje u tkivima u propuštenoj svjetlosti i postavljaju te slike na fluorescentne podatke za analizu.