Microscopie à luminescence. Microscopie électronique

Ce chapitre abordera les principaux principes, la conception et l'application d'un microscope confocal à balayage laser (CLSM) en utilisant les appareils Leica comme exemple. Le principe du CLSM est l'enregistrement du flux lumineux émanant du plan focal de l'objectif lorsque les foyers coïncident, c'est-à-dire que le diaphragme du détecteur doit être positionné de manière à ce que son image coïncide exactement avec le foyer de la lumière éclairant l'objet. Les lasers et les détecteurs sensibles sont utilisés comme source de lumière pour obtenir une image.

La principale caractéristique de CLSM est la capacité d'obtenir une image couche par couche de l'objet étudié (par exemple, une cellule) avec une haute résolution et un faible bruit. Ceci est réalisé en balayant étape par étape un objet avec un faisceau de lumière focalisé provenant d'une source ou d'une scène cohérente, en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques et des méthodes spéciales pour limiter les flux lumineux.

Les systèmes de numérisation CLSM peuvent être classés comme suit.

1. Balayage du faisceau.

A) Systèmes de miroirs : simple miroir, double miroir, magnétoélectrique résonnant.

B) Systèmes à fibres légères : monofibre, multifibre.

B) Balayage par objectif :

· mouvement piézoélectrique de la lentille selon les axes X, Y ;

· mouvement piézoélectrique de la lentille le long de l'axe Z.

D) Déflecteurs de faisceau acousto-optiques : deux déflecteurs acousto-optiques pour le balayage selon les axes X et Y.

D) Systèmes de disques :

· simple spirale, simple face et double face ;

· multispires simple face et double face.

E) Systèmes combinés : déflecteur acousto-optique selon l'axe Y et balayage avec miroir selon l'axe X.

2. Numérisation avec un tableau.

A) Entraînement pas à pas : table de numérisation avec moteurs pas à pas le long des axes X, Y, Z.

B) Entraînement combiné : platine de balayage avec un moteur pas à pas le long des axes X, Y et un entraînement piézoélectrique le long de l'axe Z.

Riz. 5. Schéma de principe du fonctionnement du CLSM.

1 - table de numérisation ; 2 - échantillon d'essai ; 3, 7 - lentilles ; 4 - dispositif de numérisation ; 5 - séparateur de faisceau ; 6 - faisceau de lumière du laser ; 8, 12 - image des points B et C ; 9 - diaphragme à aiguille; 10 - image du point A au centre du diaphragme de l'aiguille ; 11 - récepteur de rayonnement ; 13, 15 - lueur des points B et C, situés à l'extérieur du foyer de la lentille 3 ; 14 - lueur du point A, situé au foyer de la lentille 3.

Le flux lumineux d'excitation 6 provenant de la source laser pénètre à travers la plaque séparatrice de faisceau 5, le système de balayage 4 sur la lentille 3 et est focalisé sur le point A du plan de l'éprouvette (par exemple, une cellule), qui est au point . Nous pensons que les structures intracellulaires sont associées aux sondes fluorescentes et que le point de focalisation du faisceau A peut être considéré comme une source ponctuelle de lumière, le flux de fluorescence à partir duquel à travers la lentille 3, la plaque séparatrice de faisceau 5, la lentille 7 est focalisé dans le plan du diaphragme à aiguille 9. (« sténopé ») et enregistré par le photodétecteur 11. L'éclairage par le flux d'excitation des fragments de médicament se trouvant en dehors du foyer de la lentille le long de l'axe optique (points B et C) est inférieur à celui du point A. Par conséquent, la composante d'éclairage du la cible du détecteur des points B et C peut être considérablement réduite. Les flux de fluorescence émanant des points B et C, flous, sont limités par un diaphragme sténopé et n'atteignent pas le détecteur, ou une petite partie d'entre eux. Ainsi, lors du scanning d'une préparation dans l'avion XY Le détecteur enregistre un signal dont le niveau est déterminé par la distance du plan de balayage le long de la coordonnée Z. L'alignement du foyer de la lentille 3 avec le plan de balayage et le foyer de la lentille 7 avec un diaphragme à aiguille se reflètent dans le terme « confocalité ». Le mouvement pas à pas du plan de balayage le long de l'axe Z permet d'obtenir une série d'images contrastées couche par couche et de reconstruire la structure tridimensionnelle interne (3D) de l'objet étudié. Qualité d'image, résolution dans le plan XY et le long de l'axe Z dépend de la qualité de l'optique, de la qualité des systèmes de balayage, de la taille et de la précision de fabrication du diaphragme sténopé, de la rigidité de la structure, de l'efficacité des algorithmes de traitement du signal utilisés et de la spécificité du sondes fluorescentes.

Pour déterminer la résolution spatiale du microscope, une analyse d’image d’une source lumineuse ponctuelle est effectuée. L'image d'une source ponctuelle formée par une lentille conventionnelle est une tache de diffraction aérienne composée d'un noyau central brillant et d'anneaux extérieurs plus faibles.

Riz. 6. Tache de diffraction aérée.

Deux sources ponctuelles de luminosité égale, la distance entre elles est d , sont visibles comme deux points différents si la distance entre les centres des cercles d'Airy dépasse la valeur suivante :

r A = XY =0,6 λ/NA,

où r UNE - le rayon du premier anneau sombre du cercle d'Airy, λ est la longueur d'onde de la source lumineuse en nm, NA est l'ouverture numérique.

Cette expression est appelée le critère de Rayleigh. Il détermine la résolution du microscope dans le plan échantillon (XY). Dans ce cas, la limite de résolution est déterminée principalement par la nature ondulatoire de la lumière et est donc souvent simplifiée en considérant NA=1. Dans l’imagerie CLSM, il en résulte une légère diminution de la taille de la tache d’Airy. L'intensité de la tache d'Airy pour un microscope standard diminue selon la loi n -2, où n est le déplacement transversal, et pour CLSM l'intensité diminue comme n -4. Cela conduit à une augmentation de la résolution du CLSM de 1,5 fois. Pour un microscope confocal, le critère de Rayleigh a la forme :

XY c r =0,4 λ/NA,

où XY c r est la résolution du CLSM.

Pour évaluer les avantages du CLSM, nous considérons la fonction instrumentale (la structure du spot d'Airy) et analysons la résolution du microscope dans la direction axiale (Z). Le spot Airy tridimensionnel (distribution d'intensité) est une fonction matérielle tridimensionnelle (THF) qui définit l'image d'un objet. Le TAF d'un microscope conventionnel a une forme conique, s'étendant de haut en bas à partir du centre, tandis que pour un microscope confocal, il a une forme elliptique et est moins allongé dans la direction axiale.

Riz. 7. Vue de la fonction matérielle tridimensionnelle d'une source ponctuelle d'un microscope conventionnel - (a) et CLSM - (b).

Le critère de Rayleigh est également applicable pour déterminer la résolution d'un microscope dans la direction de l'axe optique. Pour un microscope conventionnel, deux sources ponctuelles situées à une certaine distance le long de l'axe optique peuvent être résolues si les maxima de leurs spots d'Airy sont éloignés :

Z r =2 λ/NA 2 ,

où Z r est la résolution axiale du microscope.

La distribution d'énergie dans le point Airy pour CLSM est plus étroite et la résolution dans la direction axiale est 1,4 fois plus élevée. Pour un microscope confocal, le critère de Rayleigh a la forme :

Z r c = 1,4 λ/NA 2 ,

où Z r c est la résolution axiale du CLSM.

Les CLSM modernes présentent un avantage principal : la possibilité d'obtenir des sections optiques fines. Les paramètres suivants affectent la qualité de l'image lors de l'obtention de sections optiques fines :

· taille de l'ouverture confocale ;

· ouverture numérique de l'objectif NA ;

· indice de réfraction ;

· absorption de la lumière dans l'échantillon.

La diminution de l'intensité lumineuse à mesure que l'épaisseur de l'échantillon augmente affecte la résolution du microscope le long de l'axe optique Z. La résolution dépend de l'optique du microscope et de l'échantillon. L'épaisseur de la coupe optique dans un microscope confocal est généralement caractérisée par la largeur de la distribution à mi-hauteur du pic d'intensité ∆z 1/2 = 0,65 μm. Si l'échantillon et le détecteur sont idéaux, ce paramètre dépend de l'ouverture numérique de l'objectif, de la longueur d'onde λ et de l'indice de réfraction du milieu d'immersion n i .

Riz. 8. Dépendance de la résolution axiale du microscope ∆z 1/2 sur l'ouverture numérique de l'objectif.

Dans CLSM, un diaphragme réglable est placé devant le détecteur, modifiant la quantité de lumière. Les diaphragmes à aiguille sont conçus pour créer les conditions d'une filtration maximale ou complète de la lumière entrant dans le plan de formation de l'image à partir de points qui ne coïncident pas avec le plan focal ou sont situés à côté de l'élément analysé de l'objet dans le plan focal. La taille du diaphragme de l'aiguille est finie et la résolution latérale de l'appareil, la luminosité des éléments éclairés de l'échantillon décalés par rapport au plan focal le long de l'axe Z et la profondeur de champ en dépendent. La taille du diaphragme affecte l'épaisseur de la section résultante. Plus l'ouverture est petite, plus l'épaisseur de section est proche de la limite théorique (la largeur de la distribution à mi-hauteur du pic d'intensité), et à de très grandes ouvertures, la possibilité d'obtenir une section fine devient impossible.

Comme mentionné précédemment, le CLSM permet d'obtenir une section efficace optique à une profondeur significative de la surface de l'échantillon, le point important étant l'indice de réfraction et la question de la profondeur. Le passage du faisceau incident et réfléchi à travers l’échantillon affecte la qualité de l’image. Si les indices de réfraction du milieu d'immersion et de l'échantillon sont proches (effet de la différence des indices de réfraction du liquide d'immersion et de l'objet sur l'apparition de la lumière diffusée, ce qui réduit le contraste de l'image et agit comme un effet d'aberration sphérique) , le cône de lumière convergera. Si les indices de réfraction diffèrent, une aberration sphérique apparaît.

Riz. 9. Indices de réfraction du milieu d'immersion et de l'échantillon.

a – formation d'images à l'aide d'une lentille à immersion sans aberration ; b – aberration sphérique causée par la divergence entre les indicateurs.

Avec des indices de réfraction différents, les rayons lumineux arrivant à différentes distances de l'axe optique ne sont pas focalisés sur un point, ce qui entraîne une perte de qualité d'image. Si possible, les indices de réfraction de l'échantillon et de l'objectif doivent correspondre. Si les indices de réfraction de l'échantillon et du milieu d'immersion sont différents, l'image de l'objet en profondeur est floue le long de l'axe optique et le plan de focalisation est décalé. Pour augmenter la profondeur de pénétration, la lentille doit avoir une grande ouverture numérique, comme une lentille à immersion dans l'huile. Cependant, de telles lentilles ont une petite distance maximale entre l'objectif et le plan focal. La profondeur de pénétration est affectée par l'hétérogénéité de l'échantillon, ce qui entraîne une diminution de l'intensité lumineuse aux grandes profondeurs et l'apparition d'une ombre. Idéalement, un échantillon permettant d'atteindre une profondeur de pénétration maximale et une résolution maximale aurait un indice de réfraction égal à celui de la lentille, mais il s'agit d'un échantillon homogène et de tels échantillons biologiques n'existent pas.

Lors du balayage, le CLSM obtient une série de coupes optiques avec des profondeurs régulièrement croissantes à partir de la surface de l'échantillon. Pour la plupart des CLSM, l’acquisition de centaines d’images 2D ne prend que quelques minutes. Une image optique peut être obtenue de deux manières :

1) obtention d'une séquence de sections optiques dans le plan XY situées à une distance ∆z les unes des autres. La comparaison des coordonnées des centres des objets dans différentes sections permet de déterminer leur orientation et leur répartition en longueur.

Riz. 10. Etude de la structure tridimensionnelle dans le plan XY.

2) obtention d'un nombre de sections optiques dans le plan XZ situées à une distance ∆y. Si l'échantillon est parallèle au plan de coupe, alors sa section dans le plan XZ sera presque circulaire ; en comparant les images dans différentes sections XZ, la courbure de l'objet étudié peut être déterminée.

Riz. 11. Etude de la structure tridimensionnelle dans le plan XZ.

La reconstruction tridimensionnelle des objets étudiés à l'aide des méthodes CLSM vise à résoudre deux problèmes :

· visualisation d'une image tridimensionnelle d'un objet obtenue en « assemblant » ses sections optiques ;

· analyse quantitative des structures internes d'un objet.

Aujourd'hui, de nombreuses entreprises produisent du CLSM. Innovations des entreprises manufacturières CLSM :

· 2002, Leica a annoncé un séparateur de faisceau acousto-optique (AOBS), qui permet une séparation efficace du faisceau d'excitation laser et de la luminescence ;

· 2002 Carl Zeiss a commencé à produire le microscope confocal LSM 510 META avec un photodétecteur original qui enregistre simultanément les signaux dans 32 canaux spectraux ;

· 2004, Zeiss crée le LSM 5 Live à haute vitesse, qui a une vitesse de numérisation 20 fois supérieure à celle d'un CLSM classique ;

· Olympus a développé un appareil doté de deux scanners, qui permet d'utiliser plus efficacement, par exemple, la technique FRAP ;

· Nikon - crée un CLSM compact et peu coûteux avec une conception simplifiée ;

· 2007, Leica a annoncé la sortie d'un microscope confocal 4Pi, améliorant la résolution axiale de 4 à 7 fois.

Considérons un appareil CLSM appartenant à une nouvelle génération d'appareils plus avancée - TCS SP5 de Leica.

Riz. 12. Système haut débit multiphotonique/confocal TCS SP5 (microscope inversé).

Éléments clés du CLSM TCS SP5 : AOTF – filtre accordable acoustique-optique, AOBS – séparateur de faisceau acousto-optique, SP-Detector – capteur photomètre spectral.

AOTF - Acoustic-Optical Tunable Filter - sert à minimiser l'exposition optique et ajuste la puissance du laser en fonction de l'échantillon et du fluorochrome. Vous permet de sélectionner la longueur d'onde requise et de contrôler l'intensité de la lumière d'excitation. L'AOTF est un filtre accordable électriquement qui fonctionne sur le principe de diffraction volumétrique d'un faisceau lumineux par inhomogénéités de l'indice de réfraction. De telles inhomogénéités surviennent lorsqu'une onde acoustique ultrasonore est excitée dans des cristaux biréfringents. Avec la diffraction anisotrope dans les cristaux uniaxiaux, il existe une fréquence ultrasonore minimale à laquelle les angles d'incidence et de diffraction coïncident, et ce que l'on appelle l'interaction acousto-optique colinéaire se produit.

Riz. 13. Filtre accordable acoustique-optique.

AOBS - séparateur de faisceau acousto-optique, est un cristal acousto-optique - un dispositif réfractif accordable fonctionnant en mode inverse. Qu'est-ce que l'utilisation d'AOBS vous apporte :

1. Pour obtenir une image claire et à faible bruit, un degré élevé de transmission de la lumière est requis. Réduire le bruit en faisant la moyenne de l'image sur de nombreux balayages successifs conduit nécessairement à un photoblanchiment de l'objet étudié. La transmission lumineuse de l'AOBS est supérieure à celle de la plupart des miroirs dichroïques sur l'ensemble du spectre visible. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une moyenne sur un plus petit nombre d’analyses. En conséquence, le médicament durera beaucoup plus longtemps ;

2. Les images lumineuses et claires nécessitent autant de photons que possible pour passer de l'objet au détecteur, ce qui améliore la qualité de l'image. L'AOBS assure l'enregistrement des bandes de fluorescence les plus larges possibles, c'est-à-dire le nombre maximum de photons ;

3. Un faible blanchiment pendant l'acquisition de l'image est important pour protéger l'échantillon de la décoloration et les objets vivants des produits toxiques de photolyse des fluorochromes. Les courbes de transmission lumineuse de l'AOBS présentent des pentes très fortes, ce qui permet d'enregistrer la fluorescence d'un fluorochrome au plus près de sa bande d'excitation ;

4. N'importe quel colorant dans la plage visible peut être excité, puisque la réflexion peut être ajustée individuellement ;

5. Le problème de la fluorescence multiparamétrique a été résolu : jusqu'à huit lignes d'émission laser peuvent être programmées, laissant suffisamment d'espace pour l'enregistrement de la fluorescence, tandis que les fréquences peuvent être ajustées ;

6. Le rapport des colorants, ainsi que le rapport d'excitation des métabolites - échantillons, par exemple pour le Ca 2+, le potentiel de membrane, la valeur du pH, devraient changer rapidement au cours d'un balayage séquentiel. AOBS bascule en quelques microsecondes ;

7. L'enregistrement d'images en lumière réfléchie est une autre possibilité d'utilisation. L'AOBS permet d'ajuster individuellement la transmission de la lumière d'excitation réfléchie ;

8. Le balayage ROI (balayage séquentiel et balayage de zone spécifique) est également amélioré : différents modes d'excitation sont applicables à différentes zones au cours d'un seul balayage ;

9. Les enregistrements 3D à grand volume en mode séquentiel bénéficient de dispositifs de commutation rapide, car la vitesse augmente l'efficacité du système ;

10. La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) nécessite un faible fond et une faible diffusion de la lumière. Seul l'AOBS bloque efficacement les raies d'émission proches, par exemple celles des lasers Ar ;

11. L'enregistrement spectral (balayage Lambda) fournit un spectre précis puisque la transmission de la lumière de l'AOBS est « blanche », ce qui signifie qu'elle n'introduit pas de modifications dans le spectre d'émission - un problème courant lors de l'exécution de balayages spectraux sur un système de miroir dichroïque ;

12. Une véritable coupe optique confocale nécessite un éclairage ponctuel et une détection ponctuelle de la fluorescence. L'AOBS peut être utilisé avec des dispositifs confocaux à balayage ponctuel ;

13. L'imagerie en mode multiphotonique ou avec excitation ultraviolette peut être réalisée en parallèle sans erreurs ni limitations. L'AOBS ne modifie pas l'excitation des lasers invisibles et ne modifie pas le spectre de fluorescence ;

14. Il n'est pas possible d'effectuer une opération erronée puisque l'AOBS est contrôlé en conjonction avec le contrôle d'excitation à l'aide de l'AOTF (Acousto-Optical Tunable Filter). Si la ligne d'excitation est sélectionnée, alors l'AOBS est programmé en fonction de celle-ci. L'opérateur n'a pas besoin de prendre de décision - le travail est effectué correctement et automatiquement ;

15. Il n'y a aucun réglage, car il n'y a pas d'éléments mobiles inhérents aux tambours filtrants et aux curseurs. Le cristal est solidement monté et la programmation se fait électroniquement ;

16. Il n'est pas nécessaire d'utiliser des équipements supplémentaires coûteux, tels que des cubes filtrants, des curseurs de miroir dichroïque, etc. Par conséquent, le coût de l’assistance technique pour l’installation de nouveaux éléments optiques est bien inférieur.

Riz. 14. AOBS – séparateur de faisceau acousto-optique.

SP-Detector – capteur photométrique spectral. La lumière provenant de l’échantillon, qui est la somme des spectres de fluorescence induite, traverse un diaphragme à sténopé qui forme une section optique confocale. Ensuite, à l’aide d’un prisme, cette lumière est décomposée en un spectre. Au passage du premier détecteur, la lumière traverse un dispositif photomètre à fente composé de deux rideaux motorisés. Ces rideaux coupent les bords du spectre des deux côtés de la plage et les dirigent vers les capteurs du 2ème et du 3ème ordre. Le spectre est ainsi divisé simultanément en cinq canaux. En conséquence, lors de l’utilisation d’un détecteur SP, le rayonnement de divers colorants présents dans l’échantillon est enregistré.

Riz. 15. Détecteur spectral SP.

Le détecteur SP permet un balayage lambda : des images spectrales sont accumulées pour analyser immédiatement les caractéristiques des colorants impliqués dans l'expérience.

4 juin 2013

Une partie importante de la recherche scientifique menée à la Faculté de biologie de l'Université d'État de Moscou et la mise en œuvre réussie de programmes éducatifs étroitement liés sont impensables sans l'utilisation de la technologie microscopique la plus moderne. Dans le cadre du programme de développement de l'Université de Moscou, un laboratoire interdépartemental de microscopie confocale a été créé à la Faculté de biologie, entièrement équipé du matériel nécessaire et fonctionnant efficacement.

Fibroblastes 3T3 sur les parois du macropore matriciel

Texte : Artemy Tretiakov

Qu'est-ce que ça peut faire?

En utilisant microscope confocal vous pouvez obtenir plusieurs images de sections virtuelles d'une cellule, ou un modèle tridimensionnel assemblé à partir de celles-ci. De telles possibilités sont offertes par un laser dont le faisceau peut être focalisé en n'importe quel point de la cellule. Pour obtenir une image, l'objet doit être fluorescent actif, c'est-à-dire que lorsqu'il est frappé par un faisceau laser, il (ou plutôt certaines molécules qui le composent) doit émettre une lumière d'une longueur d'onde plus longue que celle incidente sur lui, qui est capturée par le microscope. L’image se construit précisément sur la base de cette fluorescence.

Photo

Comment ça marche?

« Le niveau actuel de développement de la recherche scientifique interdisciplinaire fondamentale et appliquée, ainsi que les tâches de formation de spécialistes dotés de compétences interdisciplinaires, nécessitent un développement et une modernisation intensifs de la base matérielle et technique » (Programme de développement de l'Université de Moscou, p. 5 ;) .

En plus du laser, le dispositif électromécanique comprend également un filtre optique qui transmet le faisceau laser, mais réfléchit la lumière de longueur d'onde plus longue sur un diaphragme appelé « sténopé » (de l'anglais Pinhole - un trou fait par une épingle, la traduction littérale caractérise parfaitement le dispositif sténopé), qui coupe toute lumière de fond inutile et réduit ainsi ou annule complètement l'influence des couches optiques sous-jacentes sur la clarté de l'affichage de la zone numérisée de la cellule. Si la lumière de fond n'était pas coupée par le sténopé, les couches optiques se chevaucheraient et interféreraient avec le spectateur, comme s'il regardait au loin à travers le feuillage. Derrière le diaphragme se trouve un photodétecteur qui numérise les informations reçues.

Il est clair qu’une telle analyse « ponctuelle » prend du temps. Pour accélérer ce processus, le système confocal utilise un autre module appelé disque rotatif, qui permet d'obtenir une image non pas d'un point, mais d'une ligne entière en un seul acte d'opération laser.

Un brevet pour un tel système a été déposé en 1961 par le professeur Marvin Minsky du MIT. Son utilisation active a commencé dans les années 80, et aujourd'hui la microscopie confocale connaît son apogée. Le premier microscope est apparu en Russie en 2003, il s'agissait de l'Axiovert 200M LSM510 Meta. D'autres ont suivi, et il existe désormais plusieurs grands laboratoires dans notre pays, dont le laboratoire interministériel de la Faculté de biologie de l'Université d'État de Moscou. Le laboratoire dispose de cinq microscopes, dont : Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

La microscopie confocale a non seulement atteint le contraste et la tridimensionnalité les plus élevés, mais elle a également maîtrisé la quatrième dimension - le temps, permettant ainsi d'étudier les changements se produisant dans les cellules. A ces fins, chaque installation est équipée de systèmes permettant de maintenir leur durée de vie. Tout cela offre de nombreuses opportunités aux chercheurs qui exploitent avec succès ces opportunités.

Et puisque nous parlons du laboratoire de la Faculté de biologie de l’Université d’État de Moscou, il convient de citer à titre d’exemple les recherches menées dans ce laboratoire.

Soie et toile

L'un des travaux intéressants est la création de prothèses biodégradables pour la restauration des vaisseaux sanguins et autres organes creux. Dans les cas les plus simples, ces structures issues de l’ingénierie tissulaire ressemblent à des tubes ou à des films placés sur le site endommagé et agissent ainsi comme un « patch ». Ils peuvent être fabriqués à partir de différents matériaux, notamment de la fibroïne de soie provenant de cocons de vers à soie. L’avantage de ce matériau est qu’il est stable et forme une structure souple et durable de la prothèse. La prothèse elle-même ne ressemble à un film que lorsqu'elle est vue à l'œil nu : en fait, il s'agit d'une matrice - une base multicouche maillée, un cadre qui imite la structure des tissus vivants. Cet échafaudage aide les nouvelles cellules à se mettre dans la bonne position, garantissant ainsi leur répartition uniforme. En conséquence, la paroi de l'organe endommagée est restaurée et la charpente inutile subit une biodégradation. Mais il n'est pas si facile de vérifier dans quelle mesure les cellules sont réparties uniformément dans la charpente, et si elles vivent bien dans les couches profondes de la matrice (s'il y a des difficultés dans les échanges gazeux et l'échange de produits métaboliques), et si elles changer de morphologie en pénétrant à l'intérieur. C’est à ce stade que l’utilisation d’un microscope (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) a grandement simplifié la tâche. Principalement en raison de la capacité d'examiner un objet sans destruction, ainsi que de la capacité du microscope à regarder à l'intérieur de la matrice jusqu'à une profondeur de 600 microns.

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Des travaux similaires ont été réalisés avec du tissu osseux, dont la matrice était constituée à la fois de la même fibroïne et de la spidroïne, une protéine découverte à l'origine dans le corps de l'araignée et utilisée par celle-ci pour tisser des toiles. Dans des conditions de laboratoire, la protéine n'est pas du tout produite par les araignées, mais par la levure, dans le génome de laquelle est introduit un gène d'araignée légèrement modifié, responsable de la synthèse de cette protéine.

Pas si simple

Mais si l’apparition de lésions tissulaires est un processus simple et compréhensible, d’autres pathologies ne sont pas toujours claires. Et avant de commencer un traitement efficace et, surtout, de prévenir leur développement, il est nécessaire de connaître le mécanisme de leur apparition. Il s'agit notamment de l'athérosclérose - une maladie des artères, à la suite de laquelle les lipides s'accumulent dans la paroi vasculaire, ou plus précisément dans l'intima - sa couche interne, rendant la paroi plus épaisse, ce qui peut même conduire à un blocage complet du vaisseau. . La cause de cette maladie n'est pas tout à fait claire, tout comme le rôle joué par les cellules immunocompétentes n'est pas clair. Aux endroits où elles s'accumulent, l'athérogenèse commence bientôt. Des réponses complètes à ces questions n'ont pas encore été trouvées, mais l'étude de l'athérogenèse se poursuit, même s'il existe beaucoup moins de publications sur ce sujet que sur le thème des prothèses issues de l'ingénierie tissulaire.

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Destins des molécules

Le laboratoire interministériel de microscopie confocale est régulièrement utilisé dans ses travaux par plus de 20 étudiants du premier cycle et des cycles supérieurs provenant de près de 10 départements.

Les études décrites ci-dessus surveillent principalement l’état des cellules. Mais les capacités d'un microscope confocal ne se limitent pas à cela : il est tout à fait capable de suivre même le sort d'une molécule individuelle dans une cellule, à condition qu'elle ait une activité fluorescente. Pour ce faire, les molécules sont généralement marquées avec des fluorochromes, des colorants spéciaux qui ont cette activité. Les fluorochromes existent sous forme de molécules individuelles et leur marquage implique la liaison chimique du fluorochrome à la molécule qui intéresse le chercheur. Après cela, ces molécules marquées pénètrent dans la cellule et leur devenir est surveillé à l’aide d’un microscope. Ainsi, par exemple, l'activité et le mouvement de la ricine et de la viscumine dans la cellule ont été comparés. Les deux substances sont des toxines protéiques, toutes deux sont d'origine végétale et se composent de deux parties - des sous-unités, dont l'une est responsable de la liaison à la cellule et de la pénétration à l'intérieur, et l'autre de l'inactivation du ribosome, ce qui conduit finalement à la mort cellulaire. L'avantage pratique est encore une fois associé au traitement d'une autre maladie dangereuse : le cancer. Cette « séparation des responsabilités » claire entre sous-unités permet de remplacer la première sous-unité, par exemple, par un anticorps. Le résultat est une « immunotoxine » qui n’agit que sur certaines cellules auxquelles cet anticorps est adapté. Il y a deux problèmes principaux. Premièrement : choisir un anticorps qui s’approchera des cellules cancéreuses et empêchera la toxine de pénétrer dans les cellules saines. Et deuxièmement : choisir une toxine qui, une fois transformée en immunotoxine, restera très efficace.

Photo: Culture primaire de cellules cardiaques de ratons nouveau-nés : A - contrôle, B - traité avec 20 µM d'isoprotérénol pendant 24 heures. 1 - Coloration TMRE des mitochondries ; Contraste biphasé. Échelle 10 µm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. « Modifications adaptatives dans les mitochondries des cardiomyocytes cultivés de rats nouveau-nés sous l'influence de l'isoprotérénol. » Conférence internationale « Récepteurs et signalisation intracellulaire » 24-26 MAI 2011. Pushchino).

Éducation

La liste des travaux réalisés par microscopie confocale peut être longue. Cette méthode efficace, qui permet également de travailler avec des cellules vivantes, est recherchée dans presque toutes les recherches scientifiques. Et donc préparer les étudiants à travailler dans ce laboratoire joue un rôle énorme. Il accueille régulièrement plus de 20 étudiants du premier cycle et des cycles supérieurs qui suivent des cours, des travaux préparatoires et des travaux menant à un diplôme.

Desembryologistes, des biologistes moléculaires, des cytologues, des bio-ingénieurs, des immunologistes et des zoologistes travaillent dans les installations.

Le Laboratoire de Microscopie Confocale a été fondé en 2004.

Chef du laboratoire – professeur agrégé M.M. Moisenovic

Les jeunes spécialistes A.A. Ramonova et A. Yu. Arkhipova travaillent en laboratoire

Actuellement, le laboratoire dispose de 2 systèmes confocaux installés :

Axiovert 200M avec fixation confocale LSM510 META (Carl Zeiss, Allemagne)
Système de balayage laser confocal, fabriqué par NIKON CORPORATION (Japon) - un microscope médical et biologique inversé pour la recherche en laboratoire Eclipse avec accessoires : avec un support Ti-E, avec un illuminateur TIRF, avec un module confocal A1 et un confocal à disque rotatif module.

Toutes les nouvelles "

Margoline 389p.

La microscopie optique a utilisé toutes les réalisations de la technologie et de la technologie, ainsi que des technologies de l'information et informatiques. Cela a conduit à des améliorations significatives des équipements existants et des méthodes d'utilisation, ce qui a conduit à l'émergence de nouvelles méthodes, en particulier la microscopie confocale. Un microscope confocal diffère d'un microscope optique classique en ce sens qu'à chaque instant, une image d'un point d'un objet est enregistrée et qu'une image complète est construite par balayage (en déplaçant l'échantillon ou en réorganisant le système optique). Ainsi, le principe de la microscopie électronique à balayage est mis en œuvre sous une forme unique, qui permet d'enregistrer et de traiter le signal de chaque point individuel aussi longtemps que souhaité.

Dans un microscope classique, la lumière provenant de différents points de l'échantillon pénètre dans le photodétecteur. Dans un microscope confocal, afin d'enregistrer la lumière d'un seul point, un petit diaphragme est placé après l'objectif de telle sorte que la lumière émise par le point analysé passe à travers le diaphragme et soit enregistrée, et la lumière du point analysé. les points restants sont principalement bloqués par le diaphragme, comme le montre la Fig. 7.28.

Riz. 7.28. Schéma de transmission du faisceau dans un microscope optique confocal

Une autre caractéristique est que l'illuminateur ne crée pas un éclairage uniforme du champ de vision, mais concentre la lumière sur le point analysé. Ceci peut être réalisé en plaçant un deuxième système de focalisation derrière l'échantillon, mais cela nécessite que l'échantillon soit transparent. De plus, les objectifs sont généralement chers, donc l'utilisation d'un deuxième système de mise au point pour l'éclairage n'est guère préférable. Une alternative consiste à utiliser un séparateur de faisceau afin que la lumière incidente et réfléchie soit focalisée par une seule lentille. Ce schéma facilite également l'ajustement.

Voyons maintenant comment et comment quantitativement le contraste change lors de l'utilisation de la microscopie confocale. Puisque la lumière traverse la lentille deux fois dans un microscope confocal, la fonction de flou ponctuel (ci-après notée PSF) sera le produit des probabilités indépendantes qu'un photon frappe un point avec ses coordonnées ou qu'un photon soit détecté à partir de ce point.

Si nous utilisons le critère de résolution de Rayleigh, il s'avère que la résolution dans un microscope confocal augmente, mais pas de manière significative. Pour un microscope confocal nous avons une expression pour la résolution r :

Alors que pour un microscope conventionnel :

Cependant, le principal avantage d’un microscope confocal n’est pas une augmentation de la résolution au sens du critère de Rayleigh, mais une augmentation significative du contraste. En particulier, pour un PSF classique dans le plan focal, le rapport de l'amplitude au premier maximum latéral sur l'amplitude au centre est de 2%, et pour un microscope confocal ce rapport sera de 0,04%. Il s'ensuit qu'un objet faible avec une intensité, par exemple 200 fois inférieure à celle d'un objet brillant, ne peut pas être détecté dans un microscope classique, bien que la distance entre les objets puisse être nettement supérieure à la distance prescrite par le critère de Rayleigh. . Dans le même temps, un tel objet doit être bien enregistré dans un microscope confocal.

Un paramètre important est la taille des ouvertures dans le plan focal des lentilles irradiantes et collectrices. L'image de l'ouverture dans le plan objet détermine à partir de quelles zones la lumière est détectée par le photodétecteur. Évidemment, la réduction de la taille de l’ouverture entraîne une diminution de la quantité de lumière transmise, augmente le niveau de bruit et peut finalement annuler tout avantage de contraste obtenu. Ainsi se pose la question du choix optimal de la taille d’ouverture et d’un compromis raisonnable.

Une ouverture avec une ouverture plus petite que le spot d'Airy entraîne simplement une perte d'intensité et n'a aucun effet sur la résolution. Une ouverture Airy à point unique permet une utilisation maximale du pouvoir de résolution de l'objectif. Cependant, un diaphragme avec une taille d'ouverture environ 3 à 5 fois plus grande que le spot d'Airy semble être le compromis le plus adapté. Il faut comprendre que la taille discutée ici fait référence à la taille de l'image dans le plan objet et que, par conséquent, la taille réelle du trou d'ouverture dépend du grossissement de l'objectif. Plus précisément, lors de l'utilisation d'un objectif 100x, une ouverture de 1 mm se projettera dans le plan objet dans un cercle de 10 µm de rayon.

Le développement de l'idée de la microscopie confocale a été le développement d'un microscope confocal à balayage laser (KJICM), qui a été provoqué par la nécessité de méthodes plus sensibles et métrologiquement rigoureuses pour analyser la forme et la structure spatiale des objets observés. Un diagramme schématique du CLSM avec les principales connexions fonctionnelles est présenté sur la Fig. 7.29.

La principale caractéristique de CLSM est la possibilité d'imagerie couche par couche de l'objet étudié avec une haute résolution et un faible niveau de bruit. Ceci est réalisé en balayant étape par étape l'objet avec un faisceau de lumière focalisé provenant d'une source cohérente ou en déplaçant la scène à l'aide de sondes fluorescentes spéciales et de méthodes spéciales pour limiter les flux lumineux.

Riz. 7.29. Schéma fonctionnel de KJICM :

1 - table de numérisation ; 2 - échantillon de test; 3, 6 - lentilles; 4 - dispositif de numérisation ; 5 - plaque séparatrice de faisceau ; 7, 9 - les diaphragmes à aiguilles ; 8 - récepteur de rayonnement ; 10 -laser ; 11 - Bloc de contrôle ; 12 - ordinateur; 13 - lecteur de balayage d'axe z.

L'utilisation d'un diaphragme sténopé dans le CLSM, dont les dimensions sont coordonnées avec le grossissement et la longueur d'onde du microscope, permet d'augmenter la résolution de plus de 10 %. Il est évident que la résolution du CLSM et, par conséquent, les capacités d'analyse de structures fines peuvent dépasser les capacités similaires d'un microscope conventionnel de pas plus de 40 % dans des conditions de numérisation d'un échantillon avec un faisceau fin. La résolution du KLCM dépend de la méthode de microscopie et de l’éclairage. La résolution KLCM est déterminée à la fois le système optique et le chemin électronique traitement d'informations. Par conséquent, lors de la conception du KLCM, ses circuits, des paramètres tels que la résolution du système optique, l'étape de balayage, les caractéristiques du détecteur doivent être coordonnés et des algorithmes de traitement optimaux et des logiciels appropriés doivent être sélectionnés.

En général, la profondeur de champ du KLCM dépend de l'ouverture, de la longueur d'onde, de la cohérence des sources lumineuses et de la taille du diaphragme à broches. Le diaphragme à aiguille est le principal élément de conception qui distingue le KLCM des autres types de microscopes. Les diaphragmes à aiguille sont conçus pour créer les conditions d'une filtration maximale ou complète de la lumière entrant dans le plan de formation de l'image à partir de points qui ne coïncident pas avec le plan focal ou sont situés à côté de l'élément analysé de l'objet dans le plan focal.

La sélection du diamètre optimal du diaphragme de l’aiguille est importante pour obtenir les caractéristiques requises du dispositif. Les relations permettant d'estimer la résolution latérale et la profondeur de champ du KJICM sont obtenues en supposant que le diaphragme à aiguille a une petite ouverture, étant un point lumineux. En réalité, la taille du diaphragme de l'aiguille est finie et la résolution transversale du dispositif et la luminosité des éléments éclairés de l'échantillon, décalés par rapport au plan focal le long de l'axe, en dépendent z, et la profondeur de champ. Avec de petits diamètres de diaphragme à aiguille, le flux lumineux devient faible, ce qui réduit le rapport signal/bruit et réduit le contraste. Pour les diamètres plus grands, l'efficacité du diaphragme à aiguille est réduite en réduisant l'ouverture.

Concept de base

Principe du capteur confocal du brevet de Minsk

Le principe de la microscopie confocale a été breveté en 1957 par Marvin Minsky et cherche à surmonter certaines des limites des microscopes traditionnels à fluorescence à grand champ. Dans un microscope à fluorescence conventionnel (c'est-à-dire à champ large), l'échantillon entier est inondé uniformément de lumière provenant de la source lumineuse. Toutes les parties de l'échantillon situées dans le trajet optique sont excitées en même temps et la fluorescence résultante est détectée à l'aide d'un microscope photodétecteur ou de caméras, y compris la grande partie d'arrière-plan floue. En revanche, un microscope confocal utilise un point d'éclairage (voir fonction d'étalement des points) et un petit trou dans un plan optiquement couplé à l'avant du détecteur pour défocaliser le signal ; le nom « confocal » vient de cette configuration. Une fois que la lumière émise par fluorescence très proche du plan focal peut être détectée, l'image à résolution optique, notamment dans le sens de la profondeur de l'échantillon, est bien meilleure que celle des microscopes à grand champ. Cependant, étant donné que la majeure partie de la lumière fluorescente de l’échantillon est bloquée par la ponction, cette résolution accrue se fait au détriment d’une intensité réduite du signal – de longues expositions sont donc souvent nécessaires. Pour compenser cette chute de signal après crevaison L'intensité lumineuse est détectée à l'aide d'un détecteur sensible, généralement un tube photomultiplicateur (PMT) ou une photodiode à avalanche, convertissant le signal lumineux en un signal électrique enregistré par un ordinateur.

Une fois qu'un point de l'échantillon est éclairé à la fois, les images 2D ou 3D doivent être numérisées sur une trame régulière (c'est-à-dire un motif rectangulaire de lignes de balayage parallèles) dans l'échantillon. Le faisceau est balayé à travers l'échantillon dans un plan horizontal à l'aide d'un ou plusieurs miroirs oscillants (servocommandés). Cette méthode de numérisation présente généralement un faible délai de réaction et la vitesse de numérisation peut varier. Le balayage lent offre un meilleur rapport signal/bruit, ce qui se traduit par un meilleur contraste et une résolution plus élevée.

L'épaisseur réalisable du plan focal est déterminée principalement par la longueur d'onde de la lumière utilisée, divisée par l'ouverture numérique de cette lentille, mais également par les propriétés optiques de l'échantillon. La coupe optique fine rend ces types de microscopes particulièrement efficaces pour l'imagerie 3D et le profilage de surface des échantillons.

Les tranches consécutives constituent une « pile Z », qui peut soit être traitée par certains logiciels pour créer une image 3D, soit combinée en une pile 2D (l'intensité maximale des pixels est principalement prise ; d'autres méthodes courantes incluent l'utilisation de déviation ou empilement de pixels).

La microscopie confocale offre la possibilité de réaliser des coupes optiques en série directes et non invasives d'échantillons intacts, gras et vivants avec un minimum de préparation d'échantillon et peu d'amélioration de la résolution latérale. Les échantillons biologiques sont souvent traités avec des colorants fluorescents pour rendre visibles les objets sélectionnés. Cependant, la concentration réelle du colorant peut être maintenue faible pour minimiser la perturbation des systèmes biologiques : certains instruments peuvent suivre des molécules fluorescentes individuelles. De plus, les techniques transgéniques peuvent créer des organismes qui produisent leurs propres molécules fluorescentes chimériques (comme la fusion de la GFP, protéine fluorescente verte, avec une protéine d'intérêt). Les microscopes confocaux fonctionnent sur le principe de l'excitation ponctuelle dans un échantillon (diffraction limitée au point) et de la détection du point de signal fluorescent résultant. Le sténopé du détecteur constitue une barrière physique qui bloque la fluorescence floue. Seul le foyer, ou point central du disque Airy, est enregistré. Le raster scanne l'échantillon en un seul point, tout en permettant de collecter de fines sections optiques en changeant simplement la mise au point Z. Les images résultantes peuvent être empilées pour produire une image 3D de l’échantillon.

Méthodes utilisées pour le balayage horizontal

Quatre types de microscopes confocaux sont disponibles dans le commerce :

Les microscopes confocaux à balayage laser utilisent plusieurs miroirs (généralement 2 ou 3 balayages linéaires le long des axes x et y) pour balayer le laser sur l'échantillon et « déscanner » l'image à travers un sténopé et un détecteur fixes.

Avantages

CLSM est largement utilisé dans de nombreuses disciplines scientifiques biologiques, de la biologie cellulaire et de la génétique à la microbiologie et à la biologie du développement. Il est également utilisé en optique quantique, en imagerie et en spectroscopie nanocristalline.

Biologie et médecine

Un exemple d'une pile d'images de microscopie confocale montrant la distribution des filaments d'actine dans une cellule.

Cliniquement, le CLSM est utilisé dans l'évaluation de diverses maladies oculaires et est particulièrement utile pour l'imagerie, l'analyse qualitative et la quantification des cellules endothéliales de la cornée. Il est utilisé pour localiser et identifier la présence d'éléments fongiques filamenteux dans le stroma cornéen en cas de kératomycose, permettant un diagnostic rapide et ainsi la mise en place précoce d'un traitement définitif. La recherche sur les techniques CLSM pour les procédures endoscopiques (endomicroscopie) est également prometteuse. Dans l’industrie pharmaceutique, il a été recommandé de surveiller le processus de fabrication des films pharmaceutiques minces afin de contrôler la qualité et l’uniformité de la distribution des médicaments.

Optique et cristallographie

CLSM est utilisé comme mécanisme de récupération de données dans certains systèmes de stockage de données optiques 3D et a aidé à déterminer l'âge du papyrus de la Madeleine.

Options et amélioration

Résolution axiale améliorée

La fonction d'étalement de points est un ellipsoïde ponctuel, plusieurs fois plus long que large. Cela limite la résolution axiale du microscope. Une méthode pour surmonter ce problème est la microscopie 4π, où la lumière incidente et émise peut interférer avec le haut et le bas de l'échantillon pour réduire le volume de l'ellipsoïde. Technique alternative microscopie confocale thêta. Dans cette technique, le cône de lumière éclairante et la lumière de détection sont positionnés selon un angle l'un par rapport à l'autre (meilleurs résultats lorsqu'ils sont perpendiculaires). L'intersection de deux fonctions de handicap donne un volume d'échantillon effectif beaucoup plus petit. De là est né un microscope à éclairage à plan unique. De plus, la déconvolution peut être utilisée à l’aide d’une fonction d’étalement de points dérivée expérimentalement pour supprimer la lumière floue, améliorant ainsi le contraste dans les plans axiaux et latéraux.

Super résolution

Il existe des variantes confocales qui atteignent une résolution inférieure à la limite de diffraction, comme la microscopie à émission stimulée (STED). Outre cette technique, une grande variété d'autres techniques de super-résolution (non confocales) sont disponibles comme la paume, (e)STORM, les cartes SIM, etc. Ils ont tous leurs avantages, comme la facilité d'utilisation, la résolution et la nécessité d'un équipement spécial, tampon ou fluorophore.

Performances à basse température

Pour l’imagerie d’échantillons à basse température, deux approches principales ont été utilisées, toutes deux basées sur la microscopie confocale à balayage laser. Une approche consiste à utiliser un cryostat à flux continu : seul l'échantillon est conservé à basse température et est adressé optiquement à travers une fenêtre transparente. Une autre approche possible consiste à placer une partie de l'optique (notamment un microscope à objectif) dans un flacon Dewar de stockage cryogénique. Cette seconde approche, bien que plus lourde, garantit une meilleure stabilité mécanique et évite les pertes dues au vitrage.

Images

Profil partiel de la surface d'une pièce de 1 euro, mesuré par microscopie confocale à disque de Nipkow.

Reflet des données pour la pièce de 1 euro.

histoire

Début : 1940-1957

Première confocale balayage Le microscope a été construit par Marvin Minskow en 1955 et un brevet a été déposé en 1957. Le balayage d'un point d'éclairage du plan focal a été réalisé en déplaçant la scène. Aucune publication scientifique n'a été présentée et aucune image n'en a été conservée.

Microscope à balayage tandem

Schéma de la microscopie à balayage tandem de Petran. Une barre rouge a été ajoutée pour indiquer le disque Nipkow.

En 1960, la Faculté de médecine tchécoslovaque Mojmir Petran de l’Université Charles de Pilsen a développé le microscope à balayage Tandem, la première microscopie confocale commercialisée. Il a été vendu à une petite entreprise en Tchécoslovaquie et aux États-Unis par Tracor-North (plus tard NORAN) et utilisait un disque Nipkow rotatif pour générer de multiples excitations et émissions de micro-trous.

Le brevet tchécoslovaque a été déposé en 1966 par Petran et Milan Hadravský, un collègue tchécoslovaque. La première publication scientifique contenant des données et des images obtenues avec ce microscope a été publiée dans la revue Science en 1967, rédigée par M. David Egger de l'Université de Yale et Petran. Une note de bas de page de cet article mentionne que Petran a conçu le microscope et supervisé sa construction, et qu'il était, en partie, « chercheur » à l'Université de Yale. Une deuxième édition de 1968 décrivait la théorie et les détails techniques de l'instrument et avait Hadravský et Robert Galambos, chef de groupe à l'Université de Yale, comme auteurs supplémentaires. Un brevet américain a été délivré en 1970. Elle a été déposée en 1967.

1969 : Première microscopie confocale à balayage laser

En 1969 et 1971, M. David Egger et Paul Davidovits de l'Université de Yale ont publié deux articles décrivant le premier système confocal. laser microscopie à balayage. Il s’agissait d’un spot de scanner, ce qui signifie qu’un seul éclairage ponctuel était généré. Il utilise la microscopie par épi-illumination-réflexion pour observer le tissu neural. Un laser hélium-néon de 5 mW avec une longueur d'onde de 633 nm réfléchissait la lumière d'un miroir translucide vers la cible. L'objectif était un objectif simple avec une distance focale de 8,5 mm. Contrairement à tous les systèmes précédents et les plus récents, l'échantillon a été numérisé en déplaçant cette lentille (la cible de numérisation), ce qui entraîne le déplacement du point focal. La lumière réfléchie revenait vers le miroir translucide, la partie transmise était orientée par une autre lentille vers un point de détection, derrière laquelle était placé le tube photomultiplicateur. Le signal a été visualisé à l'aide d'un oscilloscope CRT ; le faisceau d'électrons a été transféré simultanément vers la cible. Un appareil spécial permettait de prendre des photos Polaroid, dont trois figuraient dans une publication de 1971.

Les auteurs réfléchissent aux colorants fluorescents pour les études in vivo. Ils citent le brevet Minsky, grâce à Steve Baer, alors doctorant à l'école de médecine Albert Einstein de New York, où il a développé un microscope confocal à balayage linéaire, qui a proposé d'utiliser un laser avec un "microscope Minsky" et merci à Galambos, Hadravsky et Petran pour des discussions menant au développement de son microscope. La motivation de leur développement était qu'en microscopie à balayage tandem, seule une fraction de 10 à 7 de la lumière éclairante est impliquée dans la génération de l'image dans une partie de l'œil. Ainsi, la qualité des images n’était pas suffisante pour la plupart des études biologiques.

1977-1985 : Scanners ponctuels avec lasers et numérisation de scènes

En 1977, Colin JR Sheppard et Tony Wilson ont décrit des détecteurs confocaux à éclairage épi-laser, à platine de balayage et à tube photomultiplicateur. La scène pourrait être déplacée le long de l'axe optique (axe Z), permettant des sections optiques en série.

En 1979, Fred Brakenhoff et ses collègues ont montré que les avantages théoriques de la coupe optique et de l'amélioration de la résolution étaient réellement réalisables dans la pratique. En 1985, ce groupe est devenu le premier à publier des images convaincantes de microscopie confocale capables de répondre à des questions biologiques. Peu de temps après, de nombreux autres groupes ont commencé à utiliser la microscopie confocale pour répondre à des questions scientifiques qui restaient encore mystérieuses en raison des limitations technologiques.

En 1983, IJ Cox et S. Sheppard d'Oxford ont publié le premier travail sur un microscope confocal contrôlé par ordinateur. Le premier microscope à balayage laser commercial, le scanner de scène SOM-25, a été proposé par Oxford Optoelectronics (suite à plusieurs acquisitions de cadres TAKE par BioRad) à partir de 1982. Il était basé sur la conception du groupe d'Oxford.

Depuis 1985 : Scanners de points laser avec balayage par faisceau

Au milieu des années 1980, William Bradshaw Amos et John Graham White et leurs collègues travaillant au Laboratoire de biologie moléculaire de Cambridge ont construit le premier microscope à balayage à faisceau confocal. La platine d'échantillonnage ne bouge pas, éclairant plutôt le spot, permettant une acquisition d'image plus rapide : quatre images par seconde avec 512 lignes chacune. Les images intermédiaires sont grandement exagérées, car le trajet du faisceau mesure 1 à 2 mètres de long, ce qui permet d'utiliser un diaphragme à iris conventionnel comme « sténopé », d'un diamètre d'environ 1 mm. Les premières micrographies ont été prises par exposition prolongée sur film avant l'ajout de l'appareil photo numérique. De nouvelles améliorations ont permis de passer à la préparation pour la première fois. Zeiss a donné naissance, à la même époque, au commercial CLSM distribué par la société suédoise Sarastro. L'entreprise a été acquise en 1990 par Molecular Dynamics, mais CLSM a finalement été abandonnée. En Allemagne, Heidelberg Instruments, fondée en 1984, a développé le CLSM, destiné à l'origine à des applications industrielles plutôt qu'à la biologie. Ce document a été transféré en 1990 à Leica Lasertechnik. Zeiss était déjà un microscope à balayage laser à spot volant non confocal sur le marché, qui a été amélioré en un microscope confocal. Le rapport de 1990 mentionnait « certains » confocaux de fabricants répertoriés : Sarastro, Technical Instruments, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic et Zeiss.

En 1989, Fritz Karl Preikschat et son fils Ekhard Preikschat ont inventé le microscope à balayage à diode laser pour l'analyse granulométrique. Lui et Ekhard Preikschat ont co-fondé Lasentec pour commercialiser. En 2001, Lasentec a été rachetée par Mettler Toledo (NYSE : MPD). Environ dix mille systèmes ont été installés dans le monde, principalement dans l'industrie pharmaceutique, pour assurer un contrôle in situ du processus de cristallisation dans les grands systèmes de purification.

Microscopie à excitation biphotonique : Bien qu'ils utilisent une technologie appropriée (tous deux microscopes à balayage laser), les microscopes à fluorescence multiphotonique ne sont pas des microscopes strictement confocaux. Terme confocal survient en raison de la présence ouverture V plan focal conjugué(confocal). Cette ouverture est généralement absente des microscopes multiphotons.
Microscope à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) o
microscopie confocale
- CLSM virtuel (basé sur Java)
- Animation et explication sur différents types de microscopes, dont les microscopes à fluorescence et confocaux. (Université Paris Sud)

La microscopie confocale présente de nombreux avantages par rapport à la microscopie optique traditionnelle, notamment la profondeur de champ réglable, l'exclusion des informations floues qui dégradent l'image et la possibilité d'analyser séquentiellement des sections optiques d'échantillons épais. L'essence de la méthode confocale réside dans l'utilisation du filtrage spatial pour couper la lumière d'une partie de l'échantillon floue (éclairage de fond), lorsque l'épaisseur de l'échantillon est supérieure au plan focal. Ces dernières années ont vu une explosion de la popularité de la microscopie confocale, en partie en raison de la facilité d'obtention d'images de très haute qualité d'échantillons préparés pour la microscopie optique traditionnelle, et en partie en raison du large éventail d'applications dans de nombreux domaines d'intérêt de recherche aujourd'hui. .

Concepts de base

Bien que les instruments modernes diffèrent considérablement des premières versions, le principe d’imagerie confocale mis au point par Marvin Minsky et breveté en 1957 est utilisé dans tous les microscopes confocaux modernes. Dans les microscopes à grand champ traditionnels, l'échantillon entier est éclairé par une source de lumière au mercure ou au xénon, et l'image est soit observée visuellement, soit projetée sur un enregistreur d'images ou un film photographique. La méthode de formation d’images avec un microscope confocal est fondamentalement différente. L'éclairage est réalisé en balayant toute la surface de l'échantillon avec un ou plusieurs faisceaux de lumière focalisés, généralement provenant d'une source d'arc laser. La zone éclairée de l'échantillon est focalisée par une lentille puis numérisée à l'aide d'un appareil de numérisation contrôlé par ordinateur. La séquence de rayons lumineux provenant de l'échantillon est détectée à travers un diaphragme à sténopé (ou dans certains cas un diaphragme à fente) par un tube photomultiplicateur (PMT), dont la sortie est convertie en une image affichée sur un ordinateur. Bien que les spécimens non colorés puissent être observés par la lumière réfléchie par eux, ils sont généralement marqués avec un ou plusieurs colorants fluorescents.

Méthodes d'acquisition d'images

La microscopie confocale utilise diverses techniques d’imagerie pour examiner un grand nombre de types différents d’échantillons. Tous reposent sur la capacité technique à obtenir des images haute définition, appelées coupes optiques, dans une séquence de coupes relativement épaisses ou dans la totalité de l'échantillon (monture entière). La tranche optique est l'élément de base de l'image. Les images elles-mêmes sont obtenues en observant des échantillons liés et colorés dans des modes d'éclairage simples, doubles, triples et multi-longueurs d'onde, et les images générées à l'aide de différentes techniques d'éclairage et de coloration seront corrélées avec précision les unes aux autres. Il est possible d'obtenir des images d'une cellule vivante et une séquence d'images temporellement dépliée (enregistrement des images dans un intervalle de temps donné), et les méthodes de traitement numérique appliquées aux séquences d'images permettent la création d'une image entière intégrée à partir d'une série de z- des images d'axe et des images tridimensionnelles d'échantillons, ainsi qu'une représentation de données tridimensionnelles dans une séquence temporelle, c'est-à-dire une image quadridimensionnelle. Les premiers microscopes confocaux imprimaient à l'aide de la lumière réfléchie, mais en fait, un microscope confocal à balayage laser peut être utilisé pour imager à l'aide de n'importe quelle source de lumière transmise couramment utilisée en microscopie.

Créer une image

Les procédures de préparation et d’imagerie des échantillons avec des microscopes confocaux sont essentiellement celles qui ont été développées au fil des années en microscopie traditionnelle à grand champ. En biomédecine, la principale application de la microscopie confocale est l'imagerie de cellules et de tissus liés ou vivants, qui sont généralement colorés avec un ou plusieurs marqueurs fluorescents. Il existe un grand nombre de colorants fluorescents différents qui peuvent être incorporés dans des protocoles relativement simples et utilisés pour colorer des organites et des structures cellulaires spécifiques. Parmi la grande variété de colorants disponibles, il existe par exemple des colorants pour le noyau, l'appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique, les mitochondries, ainsi que des colorants tels que la phalloïdine fluorescente, qui indique l'actine polymérisée dans les cellules. Quelle que soit la méthode de préparation des échantillons utilisée, le principal avantage de la microscopie confocale réside dans la flexibilité de présentation et d’analyse des images résultant de l’acquisition simultanée de plusieurs images et de leur présentation numérique sur un ordinateur.

Aspects critiques de la microscopie confocale

L’imagerie 3D quantitative en microscopie à fluorescence est souvent compliquée par des artefacts introduits lors de la préparation des échantillons en raison de quantités expérimentales contrôlées et non contrôlées ou de problèmes de positionnement et de disposition du microscope. Cet article, rédigé par le Dr James B. Pauley, systématise les facteurs externes les plus courants qui obscurcissent souvent les résultats obtenus en fluorescence à grand champ et en microscopie confocale. Les sujets abordés incluent le système laser, l'alignement des composants optiques, le grossissement de l'objectif, les artefacts de blanchiment, les aberrations, l'huile d'immersion, l'épaisseur de la lamelle, l'efficacité quantique et l'environnement de l'échantillon.

Aberrations en microscopie confocale multicolore

Les améliorations de conception ont simplifié la microscopie confocale au point qu'elle est devenue un outil courant pour la recherche en biologie cellulaire. Mais à mesure que les microscopes confocaux sont devenus plus puissants, leurs optiques ont été soumises à de plus grandes exigences. En fait, les aberrations optiques qui provoquent des défauts mineurs d’image en microscopie à grand champ peuvent avoir des effets dévastateurs en microscopie confocale. Malheureusement, les exigences optiques strictes de la microscopie confocale sont souvent masquées par des systèmes optiques qui garantissent des images nettes même avec un microscope faible. Les fabricants d'optiques produisent de nombreuses lentilles de microscope différentes conçues pour des applications spécifiques. Cet article montre comment les compromis objectifs impactent la microscopie confocale.

Imagerie tricolore en microscopie confocale

Un microscope confocal à balayage laser (LSCM) est couramment utilisé pour obtenir des images numériques d'échantillons fluorescents étiquetés avec un, deux et trois marqueurs. L'utilisation des couleurs rouge, vert et bleu (RVB) est très informative pour représenter la distribution lumineuse d'un maximum de trois marques de cellules fluorescentes lorsqu'une couleur complémentaire est utilisée pour chaque position relative et lorsque les images de couleurs différentes forment un seul trio. motif de couleur. Dans cette section, nous examinerons une version simplifiée d'une méthode récemment publiée pour obtenir des images confocales tricolores à l'aide du programme de traitement d'image populaire Adobe Photoshop. En outre, plusieurs applications pour la création d’un protocole d’imagerie tricolore pour la présentation d’images confocales sont discutées. Il convient de garder à l’esprit que ces méthodes numériques ne se limitent pas aux images LSCM et peuvent être appliquées aux images numériques importées dans Photoshop à partir d’autres sources.

Bases de la microscopie confocale à réflectance

La microscopie confocale à réflectance peut être utilisée pour obtenir des informations supplémentaires sur un échantillon avec relativement peu d'effort supplémentaire, car les techniques nécessitent une préparation d'échantillon et un changement d'équipement minimes. De plus, avec la microscopie confocale à réflectance, les informations provenant de tissus non colorés sont aussi facilement disponibles que les données obtenues à partir d'échantillons colorés réfléchissant la lumière. Cette méthode peut également être combinée avec des techniques d’imagerie par fluorescence plus courantes. Des exemples d'applications récentes incluent l'enregistrement de cellules non colorées au sein d'une population de cellules colorées par fluorescence et l'observation des interactions entre des cellules colorées par fluorescence se développant sur un substrat structuré opaque.

Galerie d'images confocales

La galerie d'images confocales Nikon MicroscopyU est une séquence d'images numériques obtenues à l'aide d'un microscope confocal Nikon PCM-2000 combiné à un microscope droit Eclipse E-600. Une séquence d'images de coupes optiques dans différents plans de l'échantillon a été obtenue par balayage le long de l'axe optique du microscope. La séquence est représentée par une application Java interactive qui vous permet soit de « lire » automatiquement une série de tranches, soit de les faire défiler d'avant en arrière comme des diapositives.

Microscopie confocale à balayage laser

Plusieurs techniques ont été développées pour surmonter le phénomène de mauvais contraste inhérent aux images de spécimens épais généralement produites par les microscopes. Les techniques confocales et de déconvolution produisent des images nettement meilleures d’échantillons d’épaisseur moyenne (5 à 15 microns). Les images des échantillons les plus épais (20 microns ou plus) sont dégradées par l'exposition à une lumière ambiante élevée provenant de zones floues et sont peut-être mieux obtenues par des techniques de microscopie confocale. À l’aide de ce didacticiel, les échantillons sont présentés sous la forme d’une série de sections optiques le long de l’axe z à l’aide d’un microscope confocal virtuel.

Microscopie confocale par réflectance

Utilisez ce didacticiel pour explorer les couches de surface individuelles des circuits intégrés. Des images numériques à des fins de guidage ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal à réflectance Nikon Optiphot C200. Pour chaque série, une séquence de sections optiques a été enregistrée le long de l'axe z tandis que le microscope pénétrait et se concentrait profondément (par incréments de 1 micromètre) dans la mosaïque de circuits à la surface du cristal de silicium.

Dispositions de base

Par rapport à la microscopie traditionnelle, la microscopie confocale présente plusieurs avantages, notamment une faible profondeur de pénétration dans l'échantillon étudié, l'absence d'éclairage de fond et la possibilité d'obtenir une série de coupes optiques d'échantillons épais. En biomédecine, la principale application de la microscopie confocale est l’imagerie de cellules et de tissus liés ou vivants, qui sont généralement marqués avec une ou plusieurs étiquettes fluorescentes.

Riz. 1. Schéma du trajet des rayons en microscopie confocale

Lors de l’imagerie d’échantillons fluorescents avec un microscope à grand champ traditionnel, la luminescence secondaire émise par l’échantillon depuis des zones extérieures à l’étude affecte souvent la clarté de l’image des éléments mis au point. Ceci est particulièrement problématique pour les épaisseurs d’échantillon supérieures à 2 micromètres. La microscopie confocale apporte des améliorations modestes dans la résolution axiale et dans le plan ; Mais c’est la capacité d’éliminer la lumière de fond qui se produit dans les échantillons de grande épaisseur colorés par fluorescence qui a récemment provoqué un regain de popularité de cette méthode de recherche. Étant relativement faciles à utiliser, la plupart des microscopes confocaux modernes font désormais partie de l’équipement de base de nombreux systèmes d’imagerie multi-utilisateurs. Étant donné que la résolution obtenue par un microscope confocal à balayage laser (LSCM) est légèrement meilleure que celle d'un microscope optique à grand champ traditionnel, mais néanmoins nettement inférieure à la résolution d'un microscope électronique à transmission, il est, en un sens, devenu un pont entre le deux méthodes de recherche les plus courantes. La figure 1 montre un diagramme schématique du passage de la lumière dans un microscope confocal de configuration de base.

Dans les microscopes à grand champ traditionnels, l'échantillon entier est éclairé avec une source de lumière au mercure ou au xénon, et l'image est soit observée visuellement, soit projetée sur un imageur ou un film photographique. La méthode d'obtention d'une image avec un microscope confocal est fondamentalement différente. L'échantillon est éclairé en le balayant avec un ou plusieurs faisceaux focalisés, généralement un laser (Figure 2). Les images obtenues en scannant l'échantillon sont ainsi appelées coupes optiques. Cette terminologie fait référence à une technique de test non invasive dans laquelle les images sont obtenues en utilisant une lumière focalisée plutôt qu'en disséquant physiquement l'échantillon.

Riz. 2. Balayage à champ large et ponctuel des échantillons

La microscopie confocale a grandement simplifié l'étude des spécimens vivants, permettant d'obtenir des données en trois dimensions (série z) et améliorant le processus d'imagerie des spécimens multicolorés. La figure 3 compare une image de fluorescence épiscopique traditionnelle avec une image confocale des mêmes sections d’une monture entière de chrysalide de papillon avec un épithélium coloré à l’iodure de propidium. Une augmentation impressionnante de la résolution et, par conséquent, de la netteté de l'image des noyaux dans une image LSCM est évidente, en raison de l'élimination des émissions fluorescentes floues.

Microscope confocal à balayage laser (LSCM)

Le LSCM est désormais la version la plus courante des microscopes confocaux utilisés en biomédecine. Dans l'introduction, une attention particulière est accordée au LSCM, car la conception et la structure de ces microscopes permettent même aux utilisateurs novices de travailler avec eux. D'autres solutions de conception ont occupé leurs propres niches particulières en biologie. Pour tout modèle ou modification d'un microscope confocal, la plupart des règles de préparation des échantillons s'appliquent, avec des modifications mineures, tout comme d'autres techniques basées sur la coupe optique, telles que les techniques de déconvolution et multiphotoniques.

Développement de la microscopie confocale

L'invention du microscope confocal est attribuée à Marvin Minsky, qui a créé un microscope fonctionnel en 1955. Le développement de la microscopie confocale était en grande partie motivé par le désir d'observer les processus biologiques dans les tissus vivants (in vivo), et l'objectif de Minsky était d'imager le réseau neuronal dans une préparation non colorée d'un cerveau vivant. Les principes de la microscopie confocale, mis au point par Minsky et brevetés en 1957, sont utilisés dans tous les microscopes confocaux modernes. La figure 1 explique le principe confocal, appliqué à la microscopie à épifluorescence, qui constitue la base de tous les systèmes confocaux modernes utilisés en imagerie de fluorescence. Dans la configuration originale, Minsky utilisait un sténopé (diaphragme) placé en face d'une source lumineuse à arc de zirconium utilisée comme source lumineuse à sténopé.

Riz. 3. Épithélium des ailes de papillon

La lumière provenant d'une source ponctuelle était focalisée sous la forme d'un point par une lentille sur un plan focal donné dans l'échantillon et, en le traversant, était focalisée par une deuxième lentille sur un deuxième sténopé (sténopé), qui était au point avec le d’abord (ils étaient cofocaux, c’est-à-dire confocaux). Les faisceaux traversant le deuxième sténopé ont frappé un tube photomultiplicateur à faible bruit, qui a généré un signal en fonction de la luminosité de la lumière provenant de l'échantillon. Un deuxième sténopé coupe la lumière provenant des régions situées au-dessus ou au-dessous du plan focal de l'échantillon provenant du tube photomultiplicateur. L’utilisation du filtrage spatial pour éliminer la lumière floue et les reflets lorsque l’on travaille avec des échantillons plus épais que le plan focal est un principe clé de la microscopie confocale. Dans son ouvrage, Minsky a également décrit un microscope à réflectance doté d'une lentille unique et d'un miroir dichromatique, dont la conception est devenue la base des systèmes utilisés aujourd'hui.

Pour obtenir une image confocale, il est nécessaire de scanner l’échantillon avec une lumière focalisée en un point. Dans l'appareil original, assemblé par Minsky, le faisceau lumineux était stationnaire et l'échantillon lui-même se déplaçait sur une scène vibrante. L'immobilité du faisceau de balayage par rapport à l'axe optique du microscope était un avantage de cette installation, car elle éliminait la plupart des défauts optiques susceptibles de déformer l'image. Cependant, lors de l’étude d’échantillons biologiques, cela pourrait provoquer des fluctuations et des distorsions, conduisant finalement à une perte de résolution et de clarté de l’image. De plus, lors du déplacement de la platine et de l'échantillon, il est impossible d'effectuer des manipulations, comme par exemple des microinjections de cellules colorées par fluorescence.

Mais quelle que soit la méthode de numérisation de l’échantillon, il est nécessaire d’obtenir son image. Et la conception originale de Minsky ne produisait pas d’image réelle car la sortie du tube photomultiplicateur était transmise à un oscilloscope à longue persistance utilisé par l’armée, qui n’avait pas d’enregistreur. Minsky écrivit plus tard que la qualité décevante de ses images n'était pas due à la faible résolution du microscope lui-même, mais à la faible résolution de l'écran de l'oscilloscope. Il est désormais clair qu’en raison d’un manque de technologie, Minsky n’a pas pu démontrer pleinement tout le potentiel de la méthode confocale, notamment lors de l’imagerie des structures biologiques. Il a souligné que c'est peut-être la raison pour laquelle la microscopie confocale n'a pas été immédiatement acceptée par la communauté très exigeante des biologistes, pour qui la qualité des images obtenues a toujours été une priorité. À cette époque, ils disposaient de microscopes optiques dotés d’excellentes optiques, leur permettant d’observer et de photographier des coupes histologiques aux couleurs vives sur des films couleur très sensibles. Dans les microscopes confocaux modernes, les images sont générées à partir de signaux provenant d'un tube photomultiplicateur ou capturés par une caméra numérique à couplage de charge, traitées directement par un système d'imagerie informatique et affichées sur un écran haute résolution et un dispositif de documentation d'images de qualité supérieure. Un schéma d’un microscope confocal à balayage laser moderne est présenté à la figure 4.

Riz. 4. Schéma d'un microscope confocal à balayage laser moderne

L'optique de base d'un microscope optique n'a pas fondamentalement changé depuis des décennies, puisque la résolution finale de l'instrument est déterminée par la longueur d'onde, l'objectif et les propriétés de l'échantillon lui-même. Les colorants utilisés pour améliorer le contraste des échantillons et d'autres techniques de microscopie optique se sont considérablement améliorés au cours des 20 dernières années. L’essor et l’amélioration de la méthode confocale sont une conséquence de la renaissance de la microscopie optique, provoquée en grande partie par le succès des technologies modernes. Bon nombre des avancées technologiques qui auraient pu profiter à la conception de Minsky deviennent progressivement accessibles (et abordables) aux biologistes et autres microscopistes. Parmi eux, des lasers multifréquences stables utilisés comme sources lumineuses ponctuelles améliorées, des miroirs dichromatiques améliorés, des photodétecteurs sensibles à faible bruit, des micro-ordinateurs à grande vitesse dotés de capacités améliorées (en raison de la disponibilité d'une mémoire de grande capacité), des logiciels d'imagerie sophistiqués, des moniteurs de résolution et imprimantes numériques.

Ces technologies se sont développées de manière indépendante et ont été progressivement intégrées aux systèmes d'imagerie confocale depuis 1955. Par exemple, les techniques de traitement d’images numériques ont été utilisées avec succès pour la première fois au début des années 1980 par des chercheurs de l’Institut océanographique de Woods Hole. En utilisant ce qu’ils ont appelé des « microscopes vidéo », ils ont pu obtenir des images de la structure cellulaire de microtubes plus petites que la limite de résolution théorique d’un microscope optique. L'augmentation apparente de la résolution est rendue possible par l'optimisation numérique des images capturées par une caméra vidéo en super-silicium (SIT) haute sensibilité couplée à un processeur d'image numérique. Les structures cellulaires ont été visualisées à l’aide d’optiques à contraste interférentiel différentiel (DIC) et d’un traitement d’image numérique ultérieur.

La classification des modèles de microscopes confocaux est généralement basée sur la méthode de numérisation de l'échantillon. Il existe deux méthodes de balayage principales : le balayage sur scène et le balayage par faisceau d'éclairage ; et au moins deux façons de scanner le faisceau. L'instrument original de Minsky était basé sur un système de balayage de scène piloté par un générateur à diapason primitif, qui produisait une image assez lentement. Les installations confocales modernes à balayage scénique, qui vont bien au-delà de leurs prototypes, sont principalement utilisées dans la science des matériaux, par exemple dans la production de microcristaux. Les systèmes basés sur ce principe sont récemment devenus populaires dans les domaines biomédicaux où l'analyse de l'ADN est réalisée sur des microcristaux.

Une alternative plus pratique pour l’imagerie des systèmes biologiques consiste à scanner un échantillon stationnaire avec un faisceau. Ce principe est à la base de nombreux systèmes de mesure, dont l'amélioration a conduit à l'émergence des microscopes de recherche les plus populaires aujourd'hui. Nous n’entrons pas dans les détails techniques de la microscopie confocale dans cette introduction, mais elle utilise essentiellement deux techniques de balayage par faisceaux fondamentalement différentes : le balayage multifaisceau et le balayage monofaisceau. Le balayage à faisceau unique est le plus courant aujourd'hui, et c'est cette méthode qui est utilisée dans le LSCM. Ici, le faisceau est balayé à l'aide de miroirs commandés par ordinateur et entraînés par des galvanomètres à une vitesse d'une image par seconde. Pour obtenir une numérisation plus rapide, approximativement à la fréquence d'images vidéo, certains systèmes utilisent un dispositif acousto-optique ou des miroirs oscillants. Une méthode alternative utilise deux faisceaux pour un balayage en temps quasi réel, généralement en utilisant une variante d'un disque Nipkow en rotation. Ces systèmes résultent de la modification et du perfectionnement des microscopes à balayage tandem (TSM) pour créer des modèles plus efficaces pour l'imagerie d'échantillons colorés par fluorescence. La figure 5 montre un système aussi avancé avec des disques Nipkow et des microlentilles appariés pour améliorer la sensibilité aux faibles émissions fluorescentes pour l'imagerie en temps réel.

Riz. 5. Conception optique basée sur les disques Nipkow

Aujourd'hui, en microscopie confocale, il existe deux méthodes alternatives pour obtenir des coupes optiques : la méthode de déconvolution et le multiphoton. Elles diffèrent techniquement, mais comme les méthodes confocales, elles sont basées sur la microscopie optique traditionnelle. La déconvolution est basée sur des algorithmes informatiques permettant de calculer et de supprimer les informations provenant des zones floues lors de la création d'une image. Cette technique est devenue très pratique grâce à des algorithmes efficaces et des mini-ordinateurs hautes performances. La microscopie multiphotonique utilise le même système de balayage que le LSCM, mais ne nécessite pas de diaphragme sténopé dans le récepteur. Cela n’est pas nécessaire puisque le laser excite la marque fluorochrome uniquement au point focal, éliminant ainsi le rayonnement flou. Lors de l'observation de tissus vivants, cette méthode présente des avantages supplémentaires, à savoir : un photoblanchiment réduit, puisque la quantité d'énergie transmise par le faisceau laser et absorbée par le tissu de l'échantillon est réduite.

Le microscope optique traditionnel constitue la base sur laquelle est construit le LSCM. Au lieu d'une lampe au tungstène ou au mercure, on utilise un laser couplé à un tube photomultiplicateur sensible (PMT) et à un ordinateur qui contrôle les miroirs de numérisation et autres appareils de numérisation et facilite la collecte et la présentation des images. Les données obtenues sont stockées sur des supports numériques et peuvent être traitées à l'aide de nombreux logiciels, soit sur l'ordinateur du système lui-même, soit sur un autre.

Selon la conception du LSCM, l'éclairage et la réception du signal (enregistrement) sont limités à un point de l'échantillon avec une limite de diffraction. Les lentilles du microscope mettent au point le point d'éclairage et le dispositif de numérisation scanne l'échantillon avec ce point sous le contrôle de l'ordinateur. Les signaux provenant des points lumineux de l'échantillon pénètrent dans un tube photomultiplicateur à travers un diaphragme à sténopé (ou dans certains cas, un diaphragme à fente), et les signaux de sortie du photomultiplicateur sont transformés en une image et reproduits visuellement par un ordinateur. Bien que les échantillons non colorés puissent être observés par la lumière réfléchie par l'échantillon, ils sont généralement colorés avec un ou plusieurs colorants fluorescents. L’un des LSCM les plus courants, décrit dans la littérature vers 1990, a été développé en réponse à un problème fondamental auquel sont confrontés les chercheurs en biologie. De nombreuses structures et macromolécules individuelles au sein des embryons colorés par immunofluorescence ne peuvent pas être visualisées avec un microscope à épifluorescence traditionnel après le stade à deux cellules, car le volume de l'embryon reste à peu près le même à mesure que le nombre de cellules augmente. Cela signifie qu'avec un arrangement de cellules plus dense, la luminescence des cellules situées en dehors du plan focal augmente, ce qui entraîne une détérioration de la résolution de l'image.

Riz. 6. Configuration du microscope confocal à balayage laser Nikon

Un groupe de chercheurs travaillant sur ce problème a constaté qu'aucun des systèmes confocaux disponibles à l'époque ne répondait à leurs exigences. À cette époque, les microscopes à balayage sur scène étaient trop lents. Il fallait environ 10 secondes pour créer une seule image, et les instruments à balayage multifaisceau n'étaient pas encore pratiques pour l'imagerie par fluorescence. Le LSCM a été conçu pour répondre aux exigences de la microscopie à épifluorescence traditionnelle et, avec d'autres développés en même temps, est devenu le prototype des systèmes complexes désormais proposés à la communauté biomédicale par diverses entreprises. Un exemple de système utilisé aujourd'hui (Nikon E1000) est présenté à la figure 6.

Dans les dispositifs spécialement conçus, l'épaisseur des sections optiques peut varier en fonction des changements dans le diamètre du trou d'épingle devant le photodétecteur. Comparée à d’autres modèles dotés d’une taille de trou d’épingle fixe, cette fonctionnalité supplémentaire est extrêmement flexible lors de l’imagerie de structures biologiques. L'image peut être agrandie sans perte de résolution en réduisant la zone numérisée de l'échantillon et en plaçant les informations numérisées dans un tableau de données de même taille pour le stockage et la présentation visuelle (le grossissement change de la même manière dans un microscope électronique à balayage) . Cela donne à un seul objectif un intervalle de zoom, ce qui peut être extrêmement utile lors de la visualisation d'événements rares ou éphémères qui pourraient être manqués ou perdus lors du changement d'objectif.

Grâce aux capacités sophistiquées et flexibles du LSCM désormais proposées dans le commerce à des prix raisonnables, la microscopie confocale a explosé en popularité ces dernières années, de nombreux laboratoires multi-utilisateurs choisissant cet équipement plutôt que les microscopes électroniques. L’avantage de la microscopie confocale réside dans la relative facilité avec laquelle des images de haute qualité d’échantillons préparés pour la microscopie optique traditionnelle peuvent être obtenues et dans un large éventail d’applications dans divers domaines de recherche.

La première génération de LSCM fonctionnait bien avec des échantillons fixes, mais ils ne parvenaient pas à contrôler l’énergie lumineuse des lasers, ce qui entraînait trop souvent la destruction fatale de l’échantillon vivant à moins que de sérieuses précautions ne soient prises. Malgré ces limites, les images des échantillons enregistrés étaient d'une telle qualité que l'approche confocale a été acceptée sans réserve par les spécialistes. Les générations suivantes d’instruments ont amélioré tous les aspects du processus d’imagerie. En plus de cela, les nouveaux appareils sont devenus beaucoup plus ergonomiques et plus faciles à utiliser, de sorte que les réglages, le changement des combinaisons de filtres et le réglage de la puissance du laser à l'aide d'un ordinateur sont devenus beaucoup plus faciles et rapides. Il est désormais possible d’imager avec trois fluorochromes simultanément et avec encore plus en séquence. Grâce à des logiciels améliorés et plus fiables, des ordinateurs plus rapides, des disques durs plus grands et la baisse des prix des périphériques de stockage à accès aléatoire, le traitement des images a également progressé de manière significative.

Modes d'imagerie

La principale application d’un microscope confocal est d’obtenir des images de différents types d’échantillons épais. L’avantage de la méthode confocale réside dans la possibilité de créer des images de l’échantillon sous forme de séquence de sections optiques individuelles avec une définition et une résolution élevées. Dans ce cas, plusieurs modes de visualisation sont utilisés ; Chacun d’eux est basé sur une tranche optique comme unité de base de l’image.

Riz. 1. Sections optiques étiquetées avec trois marques

Sections optiques individuelles

La section optique est l'unité d'imagerie de base dans les techniques de microscopie confocale. Les images d'échantillons liés et colorés peuvent être obtenues dans des modes d'éclairage à longueur d'onde simple, double, triple et multi-longueur d'onde, tandis que les images d'échantillons multicolores seront combinées les unes avec les autres (si des lentilles avec une correction adéquate de l'aberration chromatique sont utilisées). Un enregistrement supplémentaire est généralement effectué à l'aide de méthodes de traitement d'images numériques. La plupart des microscopes confocaux à balayage laser (LSCM) nécessitent environ 1 seconde pour acquérir une section optique, bien que les images de plusieurs sections optiques soient généralement moyennées pour améliorer le rapport signal/bruit. Le temps nécessaire pour obtenir une image dépend bien entendu de la taille des pixels de l’image et de la vitesse de l’ordinateur système. Pour stocker une image 8 bits typique de 768 x 512 pixels, environ 0,3 Mbit de mémoire sera nécessaire.

Les sections optiques représentées sur la figure 1 ont été obtenues simultanément par une lumière d'excitation de trois longueurs d'onde différentes (488, 568 et 647 nanomètres) en utilisant un seul laser krypton/argon comme source de rayonnement. À titre d'échantillon, le disque imaginal d'une aile de drosophile au troisième stade larvaire est présenté, dans lequel trois gènes impliqués dans la formation des ailes sont étiquetés. Les trois gènes présentés et les étiquettes fluorochromes correspondantes sont : (a) vestigiaux (fluorescéine - 496 nanomètres) ; (b) sans ailes (lissamine rhodamine - 572 nanomètres) ; et © CiD (cyanine 5 - 649 nanomètres). Une image composite des trois domaines génétiques représentés spatialement qui forment l'aile est située en bas à droite (image (d)).

Enregistrement à un intervalle de temps spécifié et visualisation d'une cellule vivante

Les études accélérées sur les cellules vivantes ont pris un nouvel élan en raison de la résolution accrue du LSCM. Auparavant, les études des mouvements des structures cellulaires étaient réalisées à l'aide d'un film photographique de 16 mm et d'un intervalomètre doté d'un mécanisme d'horloge relié à une caméra, puis à l'aide d'un magnétoscope doté d'une fonction time-lapse, d'un enregistreur à disque optique ou d'une carte de numérisation vidéo. . Désormais, grâce au LSCM, il est possible d'obtenir des sections optiques à certains intervalles prédéfinis en temps réel.

L’imagerie de tissus vivants à l’aide du LSCM est beaucoup plus difficile que l’imagerie d’échantillons liés et n’est pas toujours pratique car l’échantillon peut ne pas résister aux conditions d’observation. Le tableau 1 résume certains facteurs à prendre en compte lors de l’observation de cellules vivantes et associées à l’aide du LSCM. Certains échantillons sont tout simplement physiquement impossibles à placer sur la platine du microscope, ou ne pourront pas y rester en vie pendant toute la période d'observation. Le phénomène ou la structure étudiée peut ne pas se trouver dans le champ de vision de la lentille. Par exemple, les disques imaginaux des ailes de la drosophile se développent trop profondément dans la larve pour être observés ; et après dissection, ils ne peuvent pas se développer en culture. Par conséquent, aujourd’hui, la seule méthode disponible pour observer l’expression des gènes dans les tissus de ce type consiste à disséquer la larve, à nouer et à colorer les disques imaginaux prélevés sur des échantillons à différents stades de développement.

Tableau 1. Observation des cellules liées et vivantes à l’aide du LSCM

L’observation et l’imagerie réussies de cellules vivantes nécessitent un soin extrême tout au long du processus. Il est indispensable de maintenir des conditions acceptables sur la platine du microscope. Les dommages causés à une cellule par l'irradiation d'un faisceau laser peuvent s'accumuler lors de balayages répétés. Cette exposition doit donc être limitée au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir une image. Des antioxydants, tels que l'acide ascorbique, sont généralement ajoutés au milieu de culture pour réduire l'oxygène libéré lorsque les molécules fluorescentes sont irradiées par une lumière d'excitation et favoriser la formation de radicaux libres destructeurs de cellules. Il est généralement nécessaire de mener des expériences de contrôle préliminaires approfondies pour évaluer l’effet de l’irradiation sur les cellules colorées par fluorescence, en veillant soigneusement à ce que tous les paramètres d’imagerie correspondent aux observations effectuées. Suite aux images de test, la viabilité des spécimens vivants doit être évaluée. Les embryons, par exemple, doivent continuer à se développer normalement tout au long du processus d’observation, de sorte que toute anomalie provoquée par l’exposition aux rayonnements ou aux fluorochromes doit être détectée. La figure 2 montre une photographie accélérée d’un embryon de drosophile coloré par fluorescence au vert calcium. Une série d’images montre les changements dans la distribution de la lueur fluorescente au fil du temps.

Chaque type de cellule nécessite ses propres mesures pour maintenir sa viabilité pendant l'observation. Pour certaines cellules d’insectes, il suffit de maintenir la température ambiante et de disposer d’un volume suffisamment important de milieu approprié. Cependant, la plupart des types de cellules nécessitent une platine chauffée et parfois une chambre de perfusion pour maintenir un bon équilibre en dioxyde de carbone sur la platine. La sélection du type de cellules pour lesquelles les conditions d’observation utilisant le LSCM sont les moins « hostiles » permettra d’éviter de nombreux problèmes expérimentaux. Les améliorations apportées aux instruments confocaux modernes ont entraîné une réduction significative des problèmes potentiels. Une efficacité quantique accrue, une plus grande ouverture numérique (luminosité) des objectifs et l’utilisation de colorants cellulaires moins toxiques ont fait de la microscopie confocale une méthode pratique d’analyse des cellules vivantes. Il est nécessaire de s'efforcer d'utiliser des lasers de moindre puissance, tout en permettant d'effectuer l'acquisition et le traitement des images le plus rapidement possible. Si l’ouverture du sténopé est augmentée pour accélérer la collecte et l’enregistrement des images (par rapport à l’observation d’échantillons non vivants), une déconvolution ultérieure peut parfois restaurer la qualité d’image perdue.

Riz. 2. Prise de vue à un intervalle de temps donné

De nombreux processus et événements physiologiques se produisent trop rapidement pour être capturés par la plupart des LSCM, qui produisent en moyenne une image par seconde pour l'imagerie. Les LSCM utilisant des dispositifs acousto-optiques et des diaphragmes à fente sont plus rapides que les systèmes de balayage ponctuels excités par un galvanomètre et sont plus pratiques pour les études physiologiques. Ces configurations plus rapides combinent une bonne résolution spatiale et temporelle, qui peut atteindre 30 images par seconde en résolution plein écran, soit une vitesse proche de la vitesse de l'image vidéo. Dans les microscopes à balayage à sténopé plus lents, la résolution temporelle ne peut être augmentée qu'en réduisant la zone de balayage de l'échantillon. Si une résolution spatiale complète est requise, la fréquence d'images doit être réduite, ce qui entraîne une perte de résolution temporelle. Les systèmes confocaux, qui utilisent un balayage à disque ou à miroir oscillant, sont également capables d'imager des processus physiologiques rapides ou d'autres événements transitoires.

Série Z et images 3D

Une série Z est une séquence de sections optiques d'un échantillon prélevées à différents niveaux dans un plan perpendiculaire à l'axe optique (axe z). Les images de la série Z sont obtenues en faisant correspondre les modifications étape par étape de la mise au point fine du microscope, puis en acquérant une image à chaque étape. Le mouvement de mise au point étape par étape est généralement effectué par un moteur pas à pas contrôlé par ordinateur, qui modifie la mise au point d'une valeur prédéterminée. À l'aide d'un programme de macro informatique, vous pouvez acquérir et enregistrer une image, recentrer le microscope à une profondeur spécifiée dans l'échantillon, acquérir et enregistrer une deuxième image, recentrer à nouveau dans un nouveau plan, et ainsi de suite jusqu'à ce que le nombre d'images programmé soit acquis. .

Les images souhaitées peuvent être extraites de la série z obtenue en prenant une zone sélectionnée de l'échantillon et traitées par un logiciel spécial pour un examen détaillé ultérieur de cellules d'intérêt spécifiques. La série Z peut être considérée comme un photomontage d'images, comme dans la figure 3. Ce type de combinaison et d'affichage d'images, ainsi que de nombreuses autres manipulations d'images, est une fonctionnalité standard des progiciels modernes de manipulation d'images. Les images de la figure 3 sont une sélection d'une série plus large avec des étapes z encore plus fréquentes. La lueur verte identifie le système nerveux périphérique d’un embryon de drosophile coloré avec l’anticorps 22C10.

Riz. 3. Série Z de sections optiques

À partir d'une série de plusieurs centaines de sections optiques d'un échantillon réalisé par le LSCM, il peut être difficile de se faire une idée de l'ensemble du complexe de structures interconnectées. Cependant, la série Z, une fois enregistrée, constitue un matériau idéal pour une représentation tridimensionnelle ultérieure de l'échantillon à l'aide de techniques d'imagerie volumétrique. Cette approche est désormais largement utilisée pour clarifier la relation entre la structure et la fonction des tissus en médecine et en biologie. Il est important de définir le pas de balayage z d'échantillon correct, déterminé par le pas du moteur de changement de mise au point ; dans ce cas, l'image reflétera la profondeur réelle de l'échantillon.

Tant que l'échantillon reste stationnaire pendant l'observation, les images de la série z produites par le LSCM seront parfaitement enregistrées et, une fois stockées numériquement, elles seront relativement facilement converties en une représentation 3D de l'échantillon. La figure 4 compare une seule coupe optique (a) avec une projection en série z (b) et illustre la valeur de cette technique pour l'imagerie du système nerveux périphérique d'un embryon de drosophile marqué avec l'anticorps 22C10.

Le pas du moteur pas à pas défini par l'opérateur du microscope est lié à l'épaisseur de la section optique, mais peut avoir d'autres valeurs. L'épaisseur de la section optique est liée à l'épaisseur de la section d'échantillon observée au microscope et dépend de la lentille et du diamètre du diaphragme à sténopé. Dans certains cas, cependant, le pas focal peut être le même que l'épaisseur de la tranche optique, ce qui peut prêter à confusion.

Une fois le fichier de la série z reçu, il est envoyé pour être traité par un programme de reconstruction 3D spécialement conçu pour le traitement des images confocales. De tels programmes sont extrêmement rapides lorsqu'ils sont utilisés sur des stations graphiques, mais peuvent également être utilisés avec succès sur un ordinateur personnel ou sur la station graphique du microscope confocal lui-même, doté d'un processeur suffisamment rapide et d'une grande RAM. À l'aide de ces programmes, vous pouvez créer à la fois des représentations tridimensionnelles individuelles d'un échantillon et une séquence de représentations qui se remplacent les unes les autres, composées de différents types d'échantillons, ce qui produit un effet de rotation ou d'autres transformations spatiales et donne une meilleure perception de les propriétés tridimensionnelles de l'échantillon. Le programme vous permet de varier la longueur, la profondeur, d'effectuer des mesures volumétriques et également de modifier de manière interactive des paramètres d'image spéciaux, tels que la transparence de l'échantillon, pour mettre en évidence différentes structures à différents niveaux de l'échantillon.

Riz. 4. Section optique et projection de la série Z

Une autre façon de représenter une série de tranches optiques tirées d'une séquence d'images acquises à un intervalle de temps donné est une représentation tridimensionnelle dans laquelle l'axe z a la fonction de l'axe du temps. Cette approche est utile pour visualiser les changements physiologiques au cours du développement de l’organisme. Un exemple d'application de cette méthode consistait à clarifier la dynamique des changements de concentration en calcium au cours du développement des embryons d'oursins. Le codage couleur des coupes optiques prises à différentes profondeurs est un moyen simple de représenter des données 3D. En pratique, une couleur (généralement rouge, vert ou bleu) est attribuée à chaque section optique prise à différentes profondeurs de l'échantillon, puis les images couleur sont combinées et l'effet souhaité est obtenu en changeant les couleurs à l'aide d'un programme de traitement d'image.

Imagerie 4D

Avec LCSM, les phénomènes dynamiques se produisant dans les tissus vivants ou lors de la préparation de cultures de tissus vivants et reflétés dans une séquence d'images prises sur un intervalle de temps donné peuvent être représentés en quatre dimensions, le temps étant la quatrième dimension. Les séries Z, obtenues à intervalles réguliers, sont des ensembles de données à quatre dimensions : trois dimensions spatiales (x, y et z) et le temps comme quatrième, qui peuvent être observées à l'aide d'une visionneuse 4D. De tels programmes vous permettent de composer et de lire des paires stéréo prises à différents moments dans le temps, comme un film, ou, alternativement, de traiter et de présenter des images tridimensionnelles reconstruites prises à différents moments, comme un film monté.

Images X-Z

Si une vue latérale de l'échantillon est souhaitée, telle qu'une coupe verticale à travers la couche épithéliale, une coupe x-z peut être réalisée de deux manières. Une vue latérale peut être obtenue en balayant le long d'une seule ligne de l'échantillon (axe x) à différentes profondeurs (axe z), en contrôlant le changement de mise au point avec un moteur pas à pas, puis en combinant toute la série de tranches en une seule. image. Une autre méthode consiste à utiliser l'option de plan de section dans un programme de rendu 3D, où la vue latérale est extraite d'une série z existante de tranches optiques. Lors de l’imagerie de l’épithélium des ailes de papillon sur la figure 5, le laser a balayé le long d’une seule ligne (la ligne noire horizontale dans l’image de gauche) pénétrant l’échantillon à différentes coordonnées z ou profondeurs. L'image xz présentée sur la figure 5 a été générée et présentée par un système d'imagerie confocale. L'épithélium de l'aile est constitué de deux couches épithéliales, mais comme l'intensité de la fluorescence diminue avec l'augmentation de la profondeur de pénétration du faisceau laser dans l'échantillon, seule la couche supérieure est clairement visualisée.

Riz. 5. Image dans le plan XZ

Créer une image en lumière réfléchie

Tous les premiers microscopes confocaux fonctionnaient en lumière réfléchie ou rétrodiffusée. En utilisant la lumière réfléchie, de nombreux échantillons peuvent être observés non colorés en microscopie confocale, ou ils peuvent être marqués avec des colorants hautement réfléchissants tels que des microcristaux d'immunoor ou d'halogénure d'argent. Un avantage des observations en lumière réfléchie, en particulier pour les tissus vivants, est que l’échantillon n’est pas soumis au photoblanchiment. Mais certains types de colorants peuvent affaiblir le faisceau laser. Un autre problème potentiel est que certains microscopes peuvent subir des réflexions internes provenant des éléments optiques le long du trajet du faisceau optique. Pour les versions multifaisceaux des LSCM et des LSCM à diaphragme fendu, le problème de la lumière réfléchie n'existe pas, et dans les microscopes qui existent, l'utilisation de polariseurs, l'imagerie de zones sans artefacts et le décalage par rapport à l'axe optique contribuent à réduire le problème.

Imagerie par lumière transmise

N'importe lequel des modes d'imagerie par lumière transmise couramment utilisés en microscopie peut être utilisé en LFCM, notamment le contraste de phase, le contraste interférentiel différentiel (DIC), le champ sombre ou la lumière polarisée. La lumière traversant l'échantillon atteint le récepteur de lumière transmise dont le signal, via un guide de lumière à fibre optique, est envoyé à l'un des photomultiplicateurs de la tête de balayage du microscope. Les images de lumière transmise et d’épifluorescence confocale peuvent être capturées simultanément à l’aide du même faisceau lumineux, garantissant ainsi un enregistrement précis. En fusionnant ou en synthétisant des images à l’aide d’un logiciel approprié, l’emplacement exact des cellules marquées dans le tissu peut être reflété. Certaines études suggèrent l’approche significative suivante : combiner une image de lumière transmise non confocale avec une ou plusieurs images de fluorescence confocale de cellules marquées du même échantillon. Cette approche permettra par exemple de déterminer les aspects spatiaux et temporels de la migration d'une sous-population de cellules marquées au sein d'une population de cellules non marquées sur plusieurs heures, voire plusieurs années.

Aujourd'hui, un récepteur de lumière transmise couleur est déjà largement utilisé, qui accepte les signaux transmis en rouge, vert et bleu (RVB) pour créer une image en vraies couleurs, similaire à ce qui se fait dans certains appareils photo numériques couleur. Un tel récepteur est particulièrement utile pour les pathologistes, qui observent régulièrement les couleurs réelles des tissus sous lumière transmise et superposent ces images avec des données fluorescentes pour analyse.

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