Microscopía de luminiscencia. Microscopio de electrones
En este capítulo se analizarán los principios fundamentales, el diseño y la aplicación de un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) utilizando dispositivos Leica como ejemplo. El principio de CLSM es el registro del flujo de luz que emana del plano focal de la lente cuando los focos coinciden, es decir, el diafragma detector debe colocarse de modo que su imagen coincida exactamente con el foco de la luz que ilumina el objeto. Se utilizan láseres y detectores sensibles como fuente de luz para obtener una imagen.
La característica principal de CLSM es la capacidad de obtener una imagen capa por capa del objeto en estudio (por ejemplo, una celda) con alta resolución y bajo ruido. Esto se logra escaneando paso a paso un objeto con un haz de luz enfocado desde una fuente o escenario coherente, utilizando sondas fluorescentes específicas y métodos especiales para limitar los flujos de luz.
Los sistemas de escaneo CLSM se pueden clasificar de la siguiente manera.
1. Escaneo de haz.
A) Sistemas de espejos: monoespejo, doble espejo, magnetoeléctricos resonantes.
B) Sistemas de fibra ligera: monofibra, multifibra.
B) Escaneo de lentes:
· movimiento piezoeléctrico de la lente a lo largo de los ejes X, Y;
· movimiento piezoeléctrico de la lente a lo largo del eje Z.
D) Deflectores de haz acústico-óptico: dos deflectores acústico-ópticos para escanear a lo largo de los ejes X e Y.
D) Sistemas de disco:
· una espiral, una cara y dos caras;
· multiespiral de una cara y de doble cara.
E) Sistemas combinados: deflector acústico-óptico en el eje Y y escaneo con espejo en el eje X.
2. Escanear con una mesa.
A) Accionamiento paso a paso: mesa de escaneo con motores paso a paso a lo largo de los ejes X, Y, Z.
B) Accionamiento combinado: platina de escaneo con motor paso a paso en los ejes X, Y y accionamiento piezoeléctrico en el eje Z.
Arroz. 5. Diagrama esquemático del funcionamiento del CLSM.
1 - mesa de escaneo; 2 - muestra de prueba; 3, 7 - lentes; 4 - dispositivo de escaneo; 5 - divisor de haz; 6 - haz de luz del láser; 8, 12 - imagen de los puntos B y C; 9 - diafragma de aguja; 10 - imagen del punto A en el centro del diafragma de la aguja; 11 - receptor de radiación; 13, 15 - brillo de los puntos B y C, ubicados fuera del foco de la lente 3; 14 - resplandor del punto A, ubicado en el foco de la lente 3.
El flujo de luz de excitación 6 de la fuente láser ingresa a través de la placa divisora de haz 5, el sistema de escaneo 4 hacia la lente 3 y se enfoca en el punto A del plano de la muestra de prueba (por ejemplo, una celda), que está enfocado . Creemos que las estructuras intracelulares están asociadas con sondas fluorescentes y el punto de enfoque del haz A puede considerarse como una fuente puntual de luz, cuyo flujo de fluorescencia, a través de la lente 3, la placa divisora del haz 5, la lente 7 se enfoca en el plano del diafragma de aguja 9. (“pinhole”) y registrada por el fotodetector 11. La iluminación por el flujo de excitación de los fragmentos de fármaco que se encuentran fuera del foco de la lente a lo largo del eje óptico (puntos B y C) es menor que en el punto A. En consecuencia, el componente de iluminación del El objetivo del detector desde los puntos B y C se puede reducir significativamente. Los flujos de fluorescencia que salen desenfocados de los puntos B y C están limitados por una membrana estenopeica y no llegan al detector, o una pequeña parte de ellos lo hace. Así, al escanear una preparación en el plano XY El detector registra una señal, cuyo nivel está determinado por la distancia desde el plano de escaneo a lo largo de la coordenada Z. La alineación del enfoque de la lente 3 con el plano de escaneo y el enfoque de la lente 7 con un diafragma de aguja se refleja en el término “confocalidad”. El movimiento paso a paso del plano de escaneo a lo largo del eje Z le permite obtener una serie de imágenes contrastantes capa por capa y reconstruir la estructura tridimensional interna (3-D) del objeto en estudio. Calidad de imagen, resolución en plano XY y a lo largo del eje Z depende de la calidad de la óptica, la calidad de los sistemas de escaneo, el tamaño y la precisión de fabricación del diafragma estenopeico, la rigidez de la estructura, la eficiencia de los algoritmos de procesamiento de señales utilizados y la especificidad del sondas fluorescentes.
Para determinar la resolución espacial del microscopio, se realiza un análisis de imagen de una fuente de luz puntual. La imagen de una fuente puntual formada por una lente convencional es un punto de difracción de Airy que consta de un núcleo central brillante y anillos exteriores más débiles.
Arroz. 6. Punto de difracción aireado.
Dos fuentes puntuales de igual brillo, la distancia entre ellas es d , son visibles como dos puntos diferentes si la distancia entre los centros de los círculos de Airy excede el siguiente valor:
r A = XY =0,6 λ/NA,
donde r A - el radio del primer anillo oscuro en el círculo de Airy, λ es la longitud de onda de la fuente de luz en nm, NA es la apertura numérica.
Esta expresión se llama criterio de Rayleigh. Determina la resolución del microscopio en el plano de muestra (XY). En este caso, el límite de resolución está determinado principalmente por la naturaleza ondulatoria de la luz y, por lo tanto, a menudo se simplifica considerando NA=1. En las imágenes CLSM se produce una ligera disminución en el tamaño de la mancha de Airy. La intensidad del punto de Airy para un microscopio estándar disminuye según la ley n -2, donde n es el desplazamiento transversal, y para CLSM la intensidad disminuye como n -4. Esto conduce a un aumento de la resolución de CLSM en 1,5 veces. Para un microscopio confocal, el criterio de Rayleigh tiene la forma:
XYcr =0,4 λ/NA,
donde XY cr es la resolución del CLSM.
Para evaluar las ventajas de CLSM, consideramos la función instrumental (la estructura de la mancha de Airy) y analizamos la resolución del microscopio en la dirección axial (Z). El punto Airy tridimensional (distribución de intensidad) es una función de hardware tridimensional (THF) que define la imagen de un objeto. El TAF de un microscopio convencional tiene una forma cónica, que se expande hacia arriba y hacia abajo desde el centro, mientras que para un microscopio confocal tiene una forma elíptica y está menos alargado en la dirección axial.
Arroz. 7. Vista de la función tridimensional del hardware de una fuente puntual de un microscopio convencional - (a) y CLSM - (b).
El criterio de Rayleigh también es aplicable para determinar la resolución de un microscopio en la dirección del eje óptico. Para un microscopio convencional, dos fuentes puntuales ubicadas a cierta distancia a lo largo del eje óptico se pueden resolver si los máximos de sus puntos de Airy están a cierta distancia:
Z r =2 λ/NA 2 ,
donde Z r es la resolución axial del microscopio.
La distribución de energía en el punto Airy para CLSM es más estrecha y la resolución en la dirección axial es 1,4 veces mayor. Para un microscopio confocal, el criterio de Rayleigh tiene la forma:
Z r c = 1,4 λ/NA 2 ,
donde Z r c es la resolución axial del CLSM.
Los CLSM modernos tienen una ventaja principal: la capacidad de obtener secciones ópticas delgadas. Los siguientes parámetros afectan la calidad de la imagen al obtener secciones ópticas delgadas:
· tamaño de apertura confocal;
· apertura numérica de la lente NA;
· índice de refracción;
· absorción de luz en la muestra.
La disminución de la intensidad de la luz a medida que aumenta el espesor de la muestra afecta la resolución del microscopio a lo largo del eje óptico Z. La resolución depende de la óptica del microscopio y de la muestra. El espesor de la sección óptica en un microscopio confocal suele caracterizarse por el ancho de la distribución a la mitad de la altura del pico de intensidad ∆z 1/2 = 0,65 μm. Si la muestra y el detector son ideales, este parámetro depende de la apertura numérica del objetivo, la longitud de onda λ y el índice de refracción del medio de inmersión n i .
Arroz. 8. Dependencia de la resolución axial del microscopio ∆z 1/2 de la apertura numérica de la lente.
En CLSM, se coloca un diafragma ajustable frente al detector, que cambia la cantidad de luz. Los diafragmas de aguja están diseñados para crear condiciones para una filtración máxima o completa de la luz que ingresa al plano de formación de la imagen desde puntos que no coinciden con el plano focal o están ubicados junto al elemento analizado del objeto en el plano focal. El tamaño del diafragma de la aguja es finito, y de ello dependen la resolución lateral del dispositivo, el brillo de los elementos iluminados de la muestra desplazados con respecto al plano focal a lo largo del eje Z y la profundidad de campo. El tamaño del diafragma afecta el espesor de la sección resultante. Cuanto menor es la apertura, más cerca está el espesor de la sección del límite teórico (el ancho de la distribución a la mitad de la altura del pico de intensidad), y en aperturas muy grandes la posibilidad de obtener una sección delgada se vuelve imposible.
Como se mencionó anteriormente, CLSM permite obtener una sección transversal óptica a una profundidad significativa de la superficie de la muestra, siendo el punto importante el índice de refracción y la profundidad. El paso del haz incidente y reflejado a través de la muestra afecta la calidad de la imagen. Si los índices de refracción del medio de inmersión y la muestra están cerca (el efecto de la diferencia en los índices de refracción del líquido de inmersión y el objeto sobre la apariencia de luz dispersa, lo que reduce el contraste de la imagen y actúa como un efecto de aberración esférica) , el cono de luz convergerá. Si los índices de refracción difieren, aparece una aberración esférica.
Arroz. 9. Índices de refracción del medio de inmersión y de la muestra.
a – formación de imágenes utilizando una lente de inmersión sin aberración; b – aberración esférica causada por la discrepancia entre los indicadores.
Con diferentes índices de refracción, los rayos de luz que llegan a diferentes distancias del eje óptico no se enfocan en un punto, lo que provoca una pérdida de calidad de la imagen. Si es posible, los índices de refracción de la muestra y el objetivo deben coincidir. Si los índices de refracción de la muestra y el medio de inmersión son diferentes, la imagen del objeto en profundidad se vuelve borrosa a lo largo del eje óptico y el plano de enfoque se desplaza. Para aumentar la profundidad de penetración, la lente debe tener una apertura numérica grande, como una lente de inmersión en aceite. Sin embargo, tales lentes tienen una distancia máxima pequeña desde la lente objetivo hasta el plano focal. La profundidad de penetración se ve afectada por la heterogeneidad de la muestra, lo que conduce a una disminución de la intensidad de la luz a grandes profundidades y a la aparición de una sombra. Idealmente, una muestra para lograr la máxima profundidad de penetración y máxima resolución tendría un índice de refracción igual al de la lente, pero esta es una muestra homogénea y tales muestras biológicas no existen.
Durante el escaneo, el CLSM obtiene una serie de secciones ópticas con profundidades que aumentan regularmente desde la superficie de la muestra. Para la mayoría de los CLSM, adquirir cientos de imágenes 2D sólo lleva unos minutos. Una imagen óptica se puede obtener de dos formas:
1) obtener una secuencia de secciones ópticas en el plano XY ubicadas a una distancia ∆z entre sí. La comparación de las coordenadas de los centros de objetos en diferentes secciones permite determinar su orientación y distribución de longitud.
Arroz. 10. Estudio de estructura tridimensional en el plano XY.
2) obtener una serie de secciones ópticas en el plano XZ ubicadas a una distancia ∆y. Si la muestra es paralela al plano de sección, entonces su sección en el plano XZ será casi circular; comparando imágenes en diferentes secciones XZ se puede determinar la curvatura del objeto en estudio.
Arroz. 11. Estudio de estructura tridimensional en el plano XZ.
La reconstrucción tridimensional de los objetos en estudio mediante métodos CLSM tiene como objetivo resolver dos problemas:
· visualización de una imagen tridimensional de un objeto obtenida “ensamblando” sus secciones ópticas;
· análisis cuantitativo de las estructuras internas de un objeto.
Hoy en día hay bastantes empresas que producen CLSM. Innovaciones de las empresas fabricantes de CLSM:
· 2002 Leica anunció un divisor de haz acústico-óptico (AOBS), que permite una separación eficiente del haz de excitación láser y la luminiscencia;
· 2002 Carl Zeiss comenzó a producir el microscopio confocal LSM 510 META con un fotodetector original que registra simultáneamente señales en 32 canales espectrales;
· 2004 Zeiss crea el LSM 5 Live de alta velocidad, que tiene una velocidad de escaneo 20 veces mayor que un CLSM convencional;
· Olympus ha desarrollado un dispositivo con dos escáneres que permite utilizar de forma más eficaz, por ejemplo, la técnica FRAP;
· Nikon: crea un CLSM compacto y económico con un diseño simplificado;
· 2007 Leica anunció el lanzamiento de un microscopio confocal 4Pi, que mejora la resolución axial entre 4 y 7 veces.
Consideremos un dispositivo CLSM que pertenece a una generación de dispositivos nueva y más avanzada: el TCS SP5 de Leica.
Arroz. 12. Sistema multifotónico/confocal de banda ancha TCS SP5 (microscopio invertido).
Elementos clave de CLSM TCS SP5: AOTF – filtro sintonizable acústico-óptico, AOBS – divisor de haz acústico-óptico, SP-Detector – sensor fotómetro espectral.
AOTF (filtro sintonizable acústico-óptico) sirve para minimizar la exposición óptica y ajusta la potencia del láser según la muestra y el fluorocromo. Le permite seleccionar la longitud de onda requerida y controlar la intensidad de la luz de excitación. AOTF es un filtro sintonizable eléctricamente que funciona según el principio de difracción volumétrica de un haz de luz por falta de homogeneidad del índice de refracción. Estas faltas de homogeneidad surgen cuando se excita una onda acústica ultrasónica en cristales birrefringentes. Con la difracción anisotrópica en cristales uniaxiales, existe una frecuencia de ultrasonido mínima en la que coinciden los ángulos de incidencia y difracción, y se produce la llamada interacción acústico-óptica colineal.
Arroz. 13. Filtro sintonizable acústico-óptico.
AOBS (divisor de haz acústico-óptico) es un cristal acústico-óptico, un dispositivo refractivo sintonizable que funciona en modo inverso. ¿Qué te aporta el uso de AOBS?
1. Para obtener una imagen clara y con poco ruido, se requiere un alto grado de transmisión de luz. La reducción del ruido promediando la imagen a lo largo de muchos escaneos sucesivos conduce necesariamente al fotoblanqueo del objeto que se está estudiando. La transmitancia de luz de AOBS es superior a la de la mayoría de los espejos dicroicos en todo el espectro visible. Por lo tanto, es necesario promediar un número menor de exploraciones. Como resultado, el medicamento durará mucho más;
2. Las imágenes brillantes y claras requieren que pasen tantos fotones como sea posible desde el objeto al detector, lo que mejora la calidad de la imagen. AOBS asegura el registro de las bandas de fluorescencia más amplias posibles, es decir, el número máximo de fotones;
3. Es importante un bajo blanqueamiento durante la adquisición de imágenes para proteger la muestra de la decoloración y los objetos vivos de los productos tóxicos de la fotólisis del fluorocromo. Las curvas de transmisión de luz de AOBS tienen pendientes muy pronunciadas, lo que permite registrar la fluorescencia de un fluorocromo lo más cerca posible de su banda de excitación;
4. Se puede excitar cualquier tinte en el rango visible, ya que el reflejo se puede ajustar individualmente;
5. Se ha resuelto el problema de la fluorescencia multiparamétrica: se pueden programar hasta ocho líneas de emisión láser, dejando suficiente espacio para registrar la fluorescencia, y se pueden ajustar las frecuencias;
6. La proporción de colorantes, así como la proporción de excitación del metabolito: muestras, por ejemplo, para Ca 2+, potencial de membrana, valor de pH, deben cambiar rápidamente durante el escaneo secuencial. AOBS cambia en unos pocos microsegundos;
7. Otra posibilidad de uso es el registro de imágenes con luz reflejada. AOBS permite ajustar individualmente la transmisión de la luz de excitación reflejada;
8. También se ha mejorado el escaneo de ROI (escaneo secuencial y escaneo de área específica): se aplican diferentes modos de excitación a diferentes áreas durante un solo escaneo;
9. Las grabaciones 3D de gran volumen en modo secuencial se benefician de la rápida conmutación de dispositivos, ya que la velocidad aumenta la eficiencia del sistema;
10. La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) requiere un fondo bajo y una dispersión de luz baja. Sólo AOBS bloquea eficazmente las líneas de emisión cercanas, por ejemplo, de láseres de Ar;
11. El registro espectral (escaneo Lambda) proporciona un espectro preciso ya que la transmisión de luz de AOBS es "blanca", lo que significa que no introduce cambios en el espectro de emisión, un problema común al realizar escaneos espectrales en un sistema de espejo dicroico;
12. El verdadero seccionamiento óptico confocal requiere iluminación puntual y detección puntual de fluorescencia. AOBS es adecuado para su uso con dispositivos confocales de escaneo puntual;
13. La obtención de imágenes en modo multifotónico o con excitación ultravioleta se puede realizar en paralelo sin errores ni limitaciones. AOBS no cambia la excitación de los láseres invisibles y no cambia el espectro de fluorescencia;
14. No es posible realizar una operación errónea ya que AOBS se controla junto con el control de excitación mediante AOTF (filtro sintonizable acústico-óptico). Si se selecciona la línea de excitación, entonces el AOBS se programa de acuerdo con ella. El operador no necesita tomar decisiones: el trabajo se realiza de forma correcta y automática;
15. No hay ajuste, ya que no hay elementos móviles inherentes a los tambores de filtro y los controles deslizantes. El cristal está firmemente montado y la programación se realiza electrónicamente;
16. No hay necesidad de costosos equipos adicionales, como cubos de filtro, deslizadores de espejo dicroico, etc. Por tanto, el coste de la asistencia técnica para la instalación de nuevos elementos ópticos es mucho menor.
Arroz. 14. AOBS – divisor de haz acústico-óptico.
SP-Detector – sensor fotómetro espectral. La luz de la muestra, que es la suma de los espectros de fluorescencia inducida, pasa a través de un diafragma estenopeico, que forma una sección óptica confocal. Luego, utilizando un prisma, esta luz se descompone en un espectro. Al pasar por el primer detector, la luz pasa a través de un dispositivo fotómetro de hendidura formado por dos cortinas motorizadas. Estas cortinas cortan los bordes del espectro en ambos lados del rango y los dirigen a los sensores de segundo y tercer orden. Como resultado, el espectro se divide simultáneamente en cinco canales. Como resultado, cuando se utiliza un detector SP, se registra la radiación de varios tintes en la muestra.
Arroz. 15. Detector espectral SP.
El detector SP permite el escaneo lambda: las imágenes espectrales se acumulan para analizar inmediatamente las características de los tintes involucrados en el experimento.
4 de junio de 2013Una parte importante de la investigación científica llevada a cabo en la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú y la implementación exitosa de programas educativos estrechamente relacionados son impensables sin el uso de la tecnología microscópica más moderna. Como parte del Programa de Desarrollo de la Universidad de Moscú, en la Facultad de Biología se creó un laboratorio interdepartamental de microscopía confocal, totalmente equipado con el equipamiento necesario y que funciona de manera eficaz.
Fibroblastos 3T3 en las paredes del macroporo de la matriz.
Texto: Tretyakov Artemy
¿Qué puede hacer?
Mediante el uso microscopio confocal se pueden obtener varias imágenes de secciones virtuales de una célula, o un modelo tridimensional ensamblado a partir de ellas. Estas posibilidades las proporciona un láser, cuyo haz puede enfocarse en cualquier punto de la célula. Para obtener una imagen, el objeto debe ser fluorescentemente activo, es decir, cuando es impactado por un rayo láser, él (o más bien, ciertas moléculas en su composición) debe emitir luz con una longitud de onda más larga que la que incide sobre él, que es capturada por el microscopio. La imagen se construye precisamente a partir de esta fluorescencia.
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¿Como funciona?
“El nivel actual de desarrollo de la investigación científica interdisciplinaria fundamental y aplicada, así como las tareas de formar especialistas con competencias interdisciplinarias, requieren un desarrollo intensivo y una modernización de la base material y técnica” (Programa de Desarrollo de la Universidad de Moscú, p. 5;) .
Además del láser, el dispositivo electrónico-mecánico también incluye un filtro óptico que transmite el rayo láser, pero refleja la luz de longitud de onda más larga sobre un diafragma llamado "pinhole" (del inglés Pinhole, un agujero hecho con un alfiler, traducción literal). caracteriza perfectamente el dispositivo estenopeico), que corta toda la luz de fondo innecesaria y, por lo tanto, reduce o anula por completo la influencia de las capas ópticas subyacentes en la claridad de la visualización del área escaneada de la celda. Si la luz de fondo no fuera cortada por el orificio, las capas ópticas se superpondrían e interferirían con el espectador, como si estuviera mirando a lo lejos a través del follaje. Detrás del diafragma hay un fotodetector que digitaliza la información recibida.
Está claro que este tipo de escaneo “puntual” lleva tiempo. Para acelerar este proceso, el sistema confocal utiliza otro módulo llamado disco giratorio, que permite obtener una imagen no solo de un punto, sino de una línea completa en un solo acto de operación láser.
En 1961, el profesor del MIT Marvin Minsky recibió una patente para dicho sistema. Su uso activo comenzó en los años 80 y ahora la microscopía confocal está experimentando su apogeo. El primer microscopio apareció en Rusia en 2003, fue el Axiovert 200M LSM510 Meta. Otros siguieron, y ahora hay varios laboratorios grandes en nuestro país, incluido el laboratorio interdepartamental de la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú. El laboratorio cuenta con cinco microscopios, entre ellos: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
La microscopía confocal no sólo ha logrado el mayor contraste y tridimensionalidad, sino que también ha dominado la cuarta dimensión: el tiempo, lo que permite estudiar los cambios que ocurren en las células. A estos efectos, cada instalación está dotada de sistemas para mantener su vida útil. Todo esto brinda amplias oportunidades para los investigadores que aprovechan estas oportunidades con éxito.
Y, dado que estamos hablando del laboratorio de la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú, cabe mencionar como ejemplo las investigaciones realizadas en este laboratorio.
Seda y telaraña
La microscopía confocal no sólo ha logrado el mayor contraste y tridimensionalidad, sino que también ha dominado la cuarta dimensión: el tiempo, lo que permite estudiar los cambios que ocurren en las células.
Uno de los trabajos interesantes es la creación de prótesis biodegradables para la restauración de vasos sanguíneos y otros órganos huecos. En los casos más simples, estas estructuras creadas mediante ingeniería tisular parecen tubos o películas que se colocan en el lugar del daño y, por lo tanto, actúan como un "parche". Pueden estar hechos de diferentes materiales, incluida la fibroína de seda procedente de capullos de gusanos de seda. La ventaja de este material es que es estable y forma una estructura de prótesis flexible y duradera. La prótesis en sí parece una película solo cuando se ve a simple vista; de hecho, es una matriz, una base de malla multicapa, un marco que imita la estructura del tejido vivo. Este andamio ayuda a que las nuevas células lleguen a la posición correcta, asegurando su distribución uniforme. Como resultado, la pared del órgano dañado se restaura y el marco innecesario sufre una biodegradación. Pero no es tan fácil comprobar qué tan uniformemente están distribuidas las células por toda la estructura, si viven bien en las capas profundas de la matriz (si hay dificultades en el intercambio de gases y de productos metabólicos) y si cambia de morfología al penetrar en su interior. Fue en esta etapa cuando el uso de un microscopio (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) simplificó enormemente la tarea. Principalmente por la capacidad de examinar un objeto sin destruirlo, así como por la capacidad del microscopio para mirar dentro de la matriz a una profundidad de 600 micrones.
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Un trabajo similar se llevó a cabo con tejido óseo, cuya matriz estaba hecha tanto de la misma fibroína como de espidroína, una proteína descubierta originalmente en el cuerpo de la araña y utilizada por ésta para tejer telas. En condiciones de laboratorio, la proteína no es producida por arañas, sino por levaduras, en cuyo genoma se introduce un gen de araña ligeramente modificado, responsable de la síntesis de esta proteína.
No es tan simple
Pero, si bien la aparición de daño en los tejidos es un proceso simple y comprensible, otras patologías no siempre son claras. Y antes de iniciar un tratamiento eficaz y, sobre todo, prevenir su desarrollo, es necesario conocer el mecanismo de su aparición. Estos incluyen la aterosclerosis, una enfermedad de las arterias como resultado de la cual los lípidos se acumulan en la pared del vaso, o más precisamente, en la íntima, su capa interna, lo que hace que la pared sea más gruesa, lo que en última instancia puede incluso conducir a un bloqueo completo del vaso. . No está del todo claro qué causa esta enfermedad, así como no está claro qué papel desempeñan las células inmunocompetentes, en los lugares donde se acumulan pronto comienza la aterogénesis. Aún no se han encontrado respuestas completas a estas preguntas, pero el estudio de la aterogénesis continúa, aunque hay muchas menos publicaciones sobre este tema que sobre el tema de las prótesis de ingeniería tisular.
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Destinos de las moléculas
El laboratorio interdepartamental de microscopía confocal lo utilizan regularmente en su trabajo más de 20 estudiantes de pregrado y posgrado de casi 10 departamentos.
Los estudios descritos anteriormente monitorean principalmente el estado de las células. Pero las capacidades de un microscopio confocal no se limitan a esto; es bastante capaz de rastrear incluso el destino de una molécula individual en una célula, siempre que tenga actividad fluorescente. Para ello, las moléculas suelen marcarse con fluorocromos, colorantes especiales que tienen esta actividad. Los fluorocromos existen como moléculas individuales y su etiquetado implica unir químicamente el fluorocromo a la molécula de interés para el investigador. Después de esto, estas moléculas marcadas ingresan a la célula y su destino futuro se controla mediante un microscopio. De esta forma se comparó, por ejemplo, la actividad y el movimiento en la célula del ricino y la viscumina. Ambas sustancias son toxinas proteicas, ambas son de origen vegetal y constan de dos partes: subunidades, una de las cuales se encarga de unirse a la célula y penetrar en su interior, y la otra de inactivar el ribosoma, lo que finalmente conduce a la muerte celular. El beneficio práctico está nuevamente asociado con el tratamiento de otra enfermedad peligrosa: el cáncer. Esta clara “separación de responsabilidades” entre subunidades permite sustituir la primera subunidad, por ejemplo, por un anticuerpo. El resultado es una “inmunotoxina” que actúa sólo sobre determinadas células para las que este anticuerpo es adecuado. Hay dos problemas principales. Primero: elegir un anticuerpo que se acerque a las células cancerosas y evite que la toxina penetre en las sanas. Y segundo: elegir una toxina que, una vez convertida en inmunotoxina, siga siendo muy eficaz.
Foto: Cultivo primario de células cardíacas de crías de rata recién nacidas: A - control, B - tratadas con isoproterenol 20 µM durante 24 horas. 1 - Tinción TMRE de mitocondrias; 2 - contraste de fases. Escala de 10 micras. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. “Cambios adaptativos en las mitocondrias de cardiomiocitos cultivados de ratas recién nacidas bajo la influencia del isoproterenol”. Conferencia internacional “Receptores y señalización intracelular” del 24 al 26 de mayo de 2011. Pushchino).
Educación
La lista de trabajos realizados mediante microscopía confocal puede continuar durante mucho tiempo. Este método eficaz, que también permite trabajar con células vivas, es muy solicitado en casi cualquier investigación científica. Y por eso, preparar a los estudiantes para trabajar en este laboratorio juega un papel muy importante. Asisten regularmente más de 20 estudiantes de pregrado y posgrado que participan en trabajos de curso, trabajos previos al curso y trabajos de diploma.
En las instalaciones trabajan embriólogos, biólogos moleculares, citólogos, bioingenieros, inmunólogos y zoólogos.
El Laboratorio de Microscopía Confocal fue fundado en 2004.
Jefe del laboratorio – profesor asociado M.M. Moisenovic
En el laboratorio trabajan los jóvenes especialistas A.A. Ramonova y A.Yu. Arkhipova
Actualmente el laboratorio cuenta con 2 sistemas confocales instalados:
- Axiovert 200M con accesorio confocal LSM510 META (Carl Zeiss, Alemania)
- Sistema de escaneo láser confocal, fabricado por NIKON CORPORATION (Japón): un microscopio médico y biológico invertido para investigación de laboratorio Eclipse con accesorios: con un soporte Ti-E, con un iluminador TIRF, con un módulo confocal A1 y un confocal de disco giratorio módulo.
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Margolina 389p.
La microscopía óptica utilizó todos los logros tanto de la tecnología como de la tecnología, así como las tecnologías de la información y la informática. Esto condujo a mejoras significativas en los equipos y métodos existentes para su uso, lo que, a su vez, condujo a la aparición de nuevos métodos, en particular, la microscopía confocal. Un microscopio confocal se diferencia de un microscopio óptico clásico en que en cada momento se registra una imagen de un punto de un objeto y se construye una imagen completa mediante escaneo (moviendo la muestra o reorganizando el sistema óptico). De este modo, el principio de la microscopía electrónica de barrido se implementa de forma única, lo que permite registrar y procesar la señal de cada punto individual durante el tiempo deseado.
En un microscopio clásico, la luz procedente de varios puntos de la muestra ingresa al fotodetector. En un microscopio confocal, para registrar la luz de un solo punto, se coloca un pequeño diafragma después de la lente objetivo de tal manera que la luz emitida por el punto analizado pasa a través del diafragma y será registrada, y la luz del punto analizado Los puntos restantes están bloqueados principalmente por el diafragma, como se muestra en la Fig. 7.28.
Arroz. 7.28. Esquema de transmisión de haz en un microscopio óptico confocal.
Otra característica es que el iluminador no crea una iluminación uniforme del campo de visión, sino que enfoca la luz en el punto analizado. Esto se puede lograr colocando un segundo sistema de enfoque detrás de la muestra, pero esto requiere que la muestra sea transparente. Además, las lentes de objetivo suelen ser caras, por lo que no es preferible utilizar un segundo sistema de enfoque para la iluminación. Una alternativa es utilizar un divisor de haz para que tanto la luz incidente como la reflejada se enfoquen mediante una única lente. Este esquema también facilita el ajuste.
Consideremos ahora cómo y cómo cambia cuantitativamente el contraste cuando se utiliza microscopía confocal. Dado que la luz pasa dos veces a través de la lente en un microscopio confocal, la función de desenfoque del punto (en adelante PSF) será el producto de las probabilidades independientes de que un fotón golpee un punto con sus coordenadas o que un fotón sea detectado desde este punto.
Si utilizamos el criterio de Rayleigh para la resolución, resulta que la resolución en un microscopio confocal aumenta, pero no significativamente. Para un microscopio confocal tenemos una expresión para resolución r:
Mientras que para un microscopio convencional:
Sin embargo, la principal ventaja de un microscopio confocal no es un aumento de la resolución en el sentido del criterio de Rayleigh, sino un aumento significativo del contraste. En particular, para un PSF convencional en el plano focal, la relación entre la amplitud en el primer lado máximo y la amplitud en el centro es del 2%, y para un microscopio confocal esta relación será del 0,04%. De esto se deduce que un objeto oscuro con una intensidad, por ejemplo, 200 veces menor que la de un objeto brillante, no puede detectarse en un microscopio convencional, aunque la distancia entre objetos puede ser significativamente mayor que la distancia prescrita por el criterio de Rayleigh. . Al mismo tiempo, un objeto de este tipo debe observarse bien en un microscopio confocal.
Un parámetro importante es el tamaño de las aberturas en el plano focal de las lentes irradiadoras y colectoras. La imagen de la apertura en el plano del objeto determina desde qué zonas el fotodetector detecta la luz. Obviamente, reducir el tamaño de la apertura conduce a una disminución en la cantidad de luz transmitida, aumenta el nivel de ruido y, en última instancia, puede anular cualquier beneficio de contraste logrado. Por tanto, surge la pregunta sobre la elección óptima del tamaño de apertura y un compromiso razonable.
Una apertura con una apertura más pequeña que el punto Airy simplemente resulta en una pérdida de intensidad y no tiene ningún efecto en la resolución. Una apertura Airy de punto único permite el máximo uso del poder de resolución de la lente del objetivo. Sin embargo, un diafragma con un tamaño de apertura aproximadamente de 3 a 5 veces mayor que el punto de Airy parece ser el compromiso más adecuado. Debe entenderse que el tamaño analizado aquí se refiere al tamaño de la imagen en el plano del objeto y, por lo tanto, el tamaño real del orificio de apertura depende del aumento de la lente. Específicamente, cuando se utiliza una lente de 100x, una apertura de 1 mm se proyectará en el plano del objeto en un círculo de 10 µm de radio.
El desarrollo de la idea de la microscopía confocal fue el desarrollo de un microscopio de barrido láser confocal (KJICM), que fue causado por la necesidad de métodos más sensibles y metrológicamente rigurosos para analizar la forma y estructura espacial de los objetos observados. En la figura 1 se muestra un diagrama esquemático del CLSM con las principales conexiones funcionales. 7.29.
La característica principal de CLSM es la posibilidad de obtener imágenes capa por capa del objeto en estudio con alta resolución y bajo nivel de ruido. Esto se logra escaneando paso a paso el objeto con un haz de luz enfocado de una fuente coherente o moviendo el escenario usando sondas fluorescentes especiales y métodos especiales para limitar los flujos de luz.
Arroz. 7.29. Diagrama de bloques de KJICM:
1 - mesa de escaneo; 2 - muestra de prueba; 3, 6 - lentes; 4 - dispositivo de escaneo; 5 - placa divisoria de haz; 7, 9 - diafragmas de aguja; 8 - receptor de radiación; 10 - láser; 11 - Bloque de control; 12 - computadora; 13 - unidad de escaneo de ejes z.
El uso de un diafragma estenopeico en CLSM, cuyas dimensiones están coordinadas con el aumento y la longitud de onda del microscopio, permite aumentar la resolución en más de un 10%. Es obvio que la resolución de CLSM y, en consecuencia, las capacidades de análisis de estructuras finas pueden exceder las capacidades similares de un microscopio convencional en no más del 40% en condiciones de escanear una muestra con un haz delgado. La resolución de KLCM depende del método de microscopía y de la iluminación. Se determina la resolución de KLCM Tanto el sistema óptico como el camino electrónico. procesamiento de información. Por lo tanto, en el diseño del KLCM, sus circuitos, se deben coordinar parámetros como la resolución del sistema óptico, el paso de escaneo, las características del detector y se deben seleccionar los algoritmos de procesamiento óptimos y el software apropiado.
En general, la profundidad de campo de KLCM depende de la apertura, la longitud de onda, la coherencia de las fuentes de luz y el tamaño del diafragma del pin. El diafragma de aguja es el principal elemento de diseño que distingue al KLCM de otros tipos de microscopios. Los diafragmas de aguja están diseñados para crear condiciones para una filtración máxima o completa de la luz que ingresa al plano de formación de la imagen desde puntos que no coinciden con el plano focal o están ubicados junto al elemento analizado del objeto en el plano focal.
Seleccionar el diámetro óptimo del diafragma de la aguja es importante para obtener las características requeridas del dispositivo. Las relaciones para estimar la resolución lateral y la profundidad de campo de KJICM se obtienen bajo el supuesto de que el diafragma de aguja tiene una apertura pequeña, siendo un punto luminoso. En realidad, el tamaño del diafragma de la aguja es finito y de ello dependen la resolución transversal del dispositivo y el brillo de los elementos iluminados de la muestra, desplazados con respecto al plano focal a lo largo del eje. z, y profundidad de campo. Con diámetros de diafragma de aguja pequeños, el flujo luminoso se vuelve bajo, lo que reduce la relación señal-ruido y reduce el contraste. En diámetros mayores, la eficacia del diafragma de aguja se reduce al reducir la apertura.
Concepto basico
Principio del sensor de punto confocal de la patente de Minsk
El principio de la microscopía confocal fue patentado en 1957 por Marvin Minsky y busca superar algunas de las limitaciones de los microscopios de fluorescencia de campo amplio tradicionales. En un microscopio de fluorescencia convencional (es decir, de campo amplio), toda la muestra se inunda uniformemente con luz de la fuente de luz. Todas las partes de la muestra en el camino óptico se excitan al mismo tiempo y la fluorescencia resultante se detecta utilizando un microscopio fotodetector o cámaras, incluida la parte grande del fondo desenfocada. Por el contrario, un microscopio confocal utiliza un punto de iluminación (ver función de dispersión de puntos) y un pequeño orificio en un plano ópticamente acoplado en la parte frontal del detector para desenfocar la señal; el nombre "confocal" proviene de esta configuración. Una vez que se puede detectar la luz emitida por fluorescencia muy cerca del plano focal, la imagen con resolución óptica, particularmente en la dirección profunda de la muestra, es mucho mejor que la de los microscopios de campo amplio. Sin embargo, dado que la punción bloquea la mayor parte de la luz fluorescente de la muestra, esta mayor resolución se produce a expensas de una intensidad de señal reducida, por lo que a menudo se requieren exposiciones prolongadas. Para compensar esta caída de señal después punción La intensidad de la luz se detecta mediante un detector sensible, generalmente un tubo fotomultiplicador (PMT) o un fotodiodo de avalancha, que convierte la señal de luz en una señal eléctrica que registra una computadora.
Una vez que se ilumina un punto de la muestra a la vez, es necesario escanear imágenes 2D o 3D sobre una trama regular (es decir, un patrón rectangular de líneas de escaneo paralelas) en la muestra. El haz se escanea a través de la muestra en un plano horizontal utilizando uno o más espejos oscilantes (servocontrolados). Este método de escaneo generalmente tiene un retraso de reacción bajo y la velocidad de escaneo se puede variar. El escaneo lento proporciona una mejor relación señal-ruido, lo que resulta en un mejor contraste y una mayor resolución.
El espesor del plano focal alcanzable está determinado principalmente por la longitud de onda de la luz utilizada, dividida por la apertura numérica de esa lente, pero también por las propiedades ópticas de la muestra. El seccionamiento óptico fino hace que este tipo de microscopios sean particularmente buenos para obtener imágenes en 3D y perfilar superficies de muestras.
Los cortes consecutivos forman una "pila Z", que puede ser procesada por cierto software para crear una imagen 3D, o se combina en una pila 2D (predominantemente se toma la intensidad máxima de píxeles; otros métodos comunes incluyen el uso de estándar desviación o apilamiento de píxeles).
La microscopía confocal proporciona la capacidad de realizar un corte óptico en serie, directo y no invasivo, de muestras intactas, grasas y vivas con una mínima preparación de la muestra y poca mejora en la resolución lateral. Las muestras biológicas suelen tratarse con tintes fluorescentes para hacer visibles los objetos seleccionados. Sin embargo, la concentración real de tinte se puede mantener baja para minimizar la alteración de los sistemas biológicos: algunos instrumentos pueden rastrear moléculas fluorescentes individuales. Además, las técnicas transgénicas pueden crear organismos que produzcan sus propias moléculas quiméricas fluorescentes (como la fusión de GFP, proteína verde fluorescente, con una proteína de interés). Los microscopios confocales funcionan según el principio de excitación puntual en una muestra (difracción limitada a un punto) y detección del punto de señal fluorescente resultante. El orificio del detector proporciona una barrera física que bloquea la fluorescencia desenfocada. Sólo se registra el foco o punto central del disco de Airy. Escanee la muestra en un solo punto, al tiempo que permite recolectar secciones ópticas delgadas simplemente cambiando el enfoque Z. Las imágenes resultantes se pueden apilar para producir una imagen 3D de la muestra.
Métodos utilizados para el escaneo horizontal.
Se encuentran disponibles comercialmente cuatro tipos de microscopios confocales:
Los microscopios confocales de escaneo láser utilizan múltiples espejos (generalmente 2 o 3 escaneos lineales a lo largo de los ejes x e y) para escanear el láser sobre la muestra y "desescanear" la imagen a través de un orificio fijo y un detector.
Beneficios
CLSM se utiliza ampliamente en muchas disciplinas científicas biológicas, desde biología celular y genética hasta microbiología y biología del desarrollo. También se utiliza en óptica cuántica e imágenes y espectroscopia nanocristalinas.
Biología y Medicina
Un ejemplo de una pila de imágenes de microscopía confocal que muestra la distribución de los filamentos de actina en una célula.
Clínicamente, CLSM se utiliza en la evaluación de diversas enfermedades oculares y es particularmente útil para imágenes, análisis cualitativo y cuantificación de células endoteliales en la córnea. Se utiliza para localizar e identificar la presencia de elementos fúngicos filamentosos en el estroma corneal en casos de queratomicosis, permitiendo un diagnóstico rápido y así el establecimiento temprano de una terapia definitiva. La investigación sobre técnicas CLSM para procedimientos endoscópicos (endomicroscopía) también es prometedora. En la industria farmacéutica, se ha recomendado monitorear el proceso de fabricación de películas farmacéuticas delgadas para controlar la calidad y uniformidad de la distribución de los medicamentos.
Óptica y cristalografía
CLSM se utiliza como mecanismo de recuperación de datos en algunos sistemas de almacenamiento de datos ópticos 3D y ha ayudado a determinar la edad del papiro Magdalena.
Opciones y mejora
Resolución axial mejorada
La función de dispersión de puntos es un elipsoide puntual, varias veces más largo que ancho. Esto limita la resolución axial del microscopio. Un método para superar esto es la microscopía 4π, donde la luz incidente y emitida puede interferir tanto con la parte superior como con la inferior de la muestra para reducir el volumen del elipsoide. Técnica alternativa microscopía confocal theta. En esta técnica, el cono de luz iluminador y la luz de detección se colocan formando un ángulo entre sí (los mejores resultados son cuando están perpendiculares). La intersección de dos funciones de desventaja da un volumen de muestra efectivo mucho menor. A partir de esto evolucionó un microscopio de iluminación de un solo plano. Además, la deconvolución se puede utilizar utilizando una función de dispersión de puntos derivada experimentalmente para eliminar la luz desenfocada, mejorando el contraste tanto en el plano axial como en el lateral.
Súper resolución
Existen variantes confocales que logran una resolución por debajo del límite de difracción, como la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED). Además de esta técnica, hay disponible una amplia variedad de otras técnicas de superresolución (no basadas en confocales) como Palm, (e)STORM, tarjetas SIM, etc. Todos tienen sus ventajas, como la facilidad de uso, la resolución y la necesidad de equipo especial, tampón o fluoróforo.
Rendimiento a baja temperatura
Para obtener imágenes de muestras a bajas temperaturas, se han utilizado dos enfoques principales, ambos con arquitecturas basadas en microscopía confocal de barrido láser. Un enfoque es utilizar un criostato de flujo continuo: solo la muestra se mantiene a baja temperatura y se aborda ópticamente a través de una ventana transparente. Otro enfoque posible es colocar parte de la óptica (especialmente un microscopio objetivo) en un matraz Dewar de almacenamiento criogénico. Este segundo planteamiento, aunque más complicado, garantiza una mejor estabilidad mecánica y evita pérdidas por la ventana.
Imágenes
Perfil parcial de la superficie de una moneda de 1 euro, medido mediante microscopía confocal de disco de Nipkow.
Reflexión de datos para moneda de 1 euro.
historia
Inicio: 1940-1957
Primer confocal exploración El microscopio fue construido por Marvin Minskow en 1955 y se presentó una patente en 1957. Se logró escanear un punto de iluminación del plano focal moviendo la platina. No se presentó ninguna publicación científica y no se conservaron imágenes de la misma.
Microscopio de barrido en tándem
Esquema de microscopía de barrido en tándem de Petran. Se agregó una barra roja para indicar el disco de Nipkow.
En 1960, la Facultad de Medicina checoslovaca Mojmir Petran de la Universidad Charles de Pilsen desarrolló el microscopio de barrido en tándem, la primera microscopía confocal comercializada. Tracor-North (más tarde NORAN) lo vendió a una pequeña empresa en Checoslovaquia y Estados Unidos y utilizó un disco giratorio de Nipkow para generar múltiples excitaciones y emisiones de microagujeros.
La patente checoslovaca fue presentada en 1966 por Petran y Milan Hadravský, un colega checoslovaco. La primera publicación científica con datos e imágenes obtenidas con este microscopio se publicó en la revista Science en 1967, cuyo autor fue M. David Egger de la Universidad de Yale y Petran. Una nota a pie de página de este artículo menciona que Petran diseñó el microscopio y supervisó su construcción, y que fue, en parte, "investigador" en la Universidad de Yale. Una segunda edición de 1968 describió la teoría y los detalles técnicos del instrumento y tuvo como autores adicionales a Hadravský y Robert Galambos, líder del grupo en la Universidad de Yale. En 1970 se emitió una patente estadounidense. Fue presentado en 1967.
1969: Primera microscopía de barrido láser confocal.
En 1969 y 1971, M. David Egger y Paul Davidovits de la Universidad de Yale publicaron dos artículos que describen la primera tecnología confocal. láser microscopía de barrido. Este era un punto de escáner, lo que significa que solo se generó una iluminación puntual. Utiliza microscopía de epi-iluminación-reflexión para observar el tejido neural. Un láser de helio-neón de 5 mW con una longitud de onda de 633 nm reflejaba la luz de un espejo translúcido hacia el objetivo. El objetivo era un objetivo sencillo con una distancia focal de 8,5 mm. A diferencia de todos los sistemas anteriores y más recientes, la muestra se escaneó moviendo esta lente (el objetivo de escaneo), lo que hace que el punto focal se mueva. La luz reflejada regresaba al espejo translúcido, la parte transmitida era orientada por otra lente para detectar el punto, detrás del cual se colocaba el tubo fotomultiplicador. La señal se visualizó mediante un osciloscopio CRT y el haz de electrones se transfirió simultáneamente al objetivo. Un dispositivo especial permitió tomar fotografías Polaroid, tres de las cuales aparecieron en una publicación de 1971.
Los autores reflexionan sobre los tintes fluorescentes para estudios in vivo. Citan la patente de Minsky, gracias a Steve Baer, entonces estudiante de doctorado en la Escuela de Medicina Albert Einstein de Nueva York, donde desarrolló un microscopio de barrido lineal confocal, quien propuso utilizar un láser con un "microscopio Minsky" y gracias A Galambos, Hadravsky y Petran por las discusiones que condujeron al desarrollo de su microscopio. La motivación para su desarrollo fue que en la microscopía de barrido en tándem sólo una fracción de 10 -7 de la luz iluminadora interviene en la generación de la imagen en una parte del ojo. Por tanto, la calidad de la imagen no fue suficiente para la mayoría de los estudios biológicos.
1977-1985: Escáneres puntuales con láser y escaneo de escenas.
En 1977, Colin JR Sheppard y Tony Wilson describieron detectores confocales de tubo fotomultiplicador, de etapa de escaneo y iluminados con láser epi. El escenario podría moverse a lo largo del eje óptico (eje Z), permitiendo secciones ópticas en serie.
En 1979, Fred Brakenhoff y sus colegas demostraron que los beneficios teóricos del seccionamiento óptico y la mejora de la resolución eran realmente alcanzables en la práctica. En 1985, este grupo se convirtió en el primero en publicar imágenes convincentes de microscopía confocal que podrían responder preguntas biológicas. Poco después, muchos más grupos comenzaron a utilizar la microscopía confocal para responder preguntas científicas que aún seguían siendo un misterio debido a limitaciones tecnológicas.
En 1983, IJ Cox y S. Sheppard de Oxford publicaron el primer trabajo sobre un microscopio confocal controlado por computadora. El primer microscopio de barrido láser comercial, el escáner de escenario SOM-25, fue ofrecido por Oxford Optoelectronics (tras varias adquisiciones de TAKE-frame por parte de BioRad) a partir de 1982. Se basó en el diseño del grupo Oxford.
Desde 1985: escáneres de puntos láser con escaneo de haz
A mediados de la década de 1980, William Bradshaw Amos y John Graham White y sus colegas que trabajaban en el Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge construyeron el primer microscopio de barrido de haz confocal. La plataforma de muestra no se mueve, sino que ilumina el punto, lo que permite una adquisición de imágenes más rápida: cuatro imágenes por segundo con 512 líneas cada una. Las imágenes intermedias son muy exageradas, debido a que la trayectoria del haz tiene una longitud de 1 a 2 metros, lo que permite el uso de un diafragma de iris convencional como un "orificio", con un diámetro de ~1 mm. Las primeras micrografías se tomaron mediante una exposición prolongada a la película antes de incorporar la cámara digital. Una mejora adicional permitió ampliar la preparación por primera vez. Casi al mismo tiempo, Zeiss dio origen al CLSM comercial distribuido por la empresa sueca Sarastro. La empresa fue adquirida en 1990 por Molecular Dynamics, pero finalmente CLSM fue discontinuada. En Alemania, Heidelberg Instruments, fundada en 1984, desarrolló CLSM, que originalmente estaba destinado a aplicaciones industriales más que a la biología. Este documento fue transferido en 1990 a Leica Lasertechnik. Zeiss ya estaba en el mercado un microscopio de barrido láser de punto volador no confocal, que se actualizó a uno confocal. El informe de 1990 señaló "algunos" fabricantes de confocales enumerados: Sarastro, Technical Instruments, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic y Zeiss.
En 1989, Fritz Karl Preikschat inventó con su hijo Ekhard Preikschat el microscopio de barrido con diodo láser para el análisis del tamaño de partículas. Él y Ekhard Preikschat cofundaron Lasentec para comercializar. En 2001, Lasentec fue adquirida por Mettler Toledo (NYSE: MPD). Se han instalado alrededor de diez mil sistemas en todo el mundo, principalmente en la industria farmacéutica, para proporcionar control in situ del proceso de cristalización en grandes sistemas de purificación.
- Microscopía de excitación de dos fotones: aunque utilizan tecnología adecuada (ambos microscopios de barrido láser), los microscopios de fluorescencia multifotónica no son microscopios estrictamente confocales. Término confocal surge debido a la presencia abertura V plano focal conjugado(confocal). Esta apertura suele faltar en los microscopios multifotónicos.
- Microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) o
microscopia confocal- CLSM virtual (basado en Java)
- Animación y explicación sobre diferentes tipos de microscopios, incluidos los de fluorescencia y los confocales. (Universidad París Sur)
Conceptos básicos
Aunque los instrumentos modernos difieren significativamente de las primeras versiones, el principio de imagen confocal iniciado por Marvin Minsky y patentado en 1957 se utiliza en todos los microscopios confocales modernos. En los microscopios tradicionales de campo amplio, toda la muestra se ilumina con una fuente de luz de mercurio o xenón y la imagen se observa visualmente o se proyecta en un registrador de imágenes o en una película fotográfica. El método de formación de imágenes con un microscopio confocal es fundamentalmente diferente. La iluminación se logra escaneando toda la superficie de la muestra con uno o más haces de luz enfocados, generalmente desde una fuente de arco láser. El área iluminada de la muestra se enfoca con una lente y luego se escanea mediante un dispositivo de escaneo controlado por computadora. La secuencia de rayos de luz de la muestra se detecta a través de un diafragma estenopeico (o en algunos casos, un diafragma hendido) mediante un tubo fotomultiplicador (PMT), cuya salida se convierte en una imagen que se muestra en una computadora. Aunque las muestras sin teñir pueden observarse mediante la luz reflejada en ellas, generalmente están marcadas con uno o más tintes fluorescentes.
Métodos de adquisición de imágenes.
La microscopía confocal utiliza una variedad de técnicas de imágenes para examinar una gran cantidad de tipos diferentes de muestras. Todos ellos se basan en la capacidad técnica de obtener imágenes de alta definición, denominadas secciones ópticas, en una secuencia de secciones relativamente gruesas o de la muestra completa (montaje completo). El corte óptico es el elemento básico de la imagen. Las imágenes en sí se obtienen observando muestras unidas y teñidas en modos de iluminación de longitud de onda única, doble, triple y múltiple, y las imágenes generadas utilizando diferentes técnicas de iluminación y tinción se correlacionarán con precisión entre sí. Es posible obtener imágenes de una célula viva y una secuencia de imágenes desplegadas temporalmente (registro de imágenes en un intervalo de tiempo determinado), y los métodos de procesamiento numérico aplicados a secuencias de imágenes permiten la creación de una imagen completa integrada a partir de una serie de z- imágenes de eje e imágenes tridimensionales de muestras, así como representación de datos tridimensionales en secuencia de tiempo, es decir, una imagen de cuatro dimensiones. Los primeros microscopios confocales obtenían imágenes utilizando luz reflejada, pero, de hecho, un microscopio confocal de barrido láser se puede utilizar para obtener imágenes utilizando cualquier fuente de luz transmitida comúnmente utilizada en microscopía.
Creando una imagen
Los procedimientos para la preparación de muestras y la obtención de imágenes con microscopios confocales son esencialmente los que se han desarrollado a lo largo de los años en la microscopía tradicional de campo amplio. En biomedicina, la principal aplicación de la microscopía confocal es la obtención de imágenes de células y tejidos unidos o vivos, que normalmente se tiñen con una o más etiquetas fluorescentes. Existe una gran cantidad de tintes fluorescentes diferentes que pueden incorporarse en protocolos relativamente simples y usarse para teñir estructuras y orgánulos celulares específicos. Entre la gran variedad de colorantes disponibles se encuentran, por ejemplo, colorantes para el núcleo, el aparato de Golgi, el retículo endoplasmático, las mitocondrias, así como colorantes como la faloidina fluorescente, que indica actina polimerizada en las células. Independientemente del método de preparación de muestras utilizado, la principal ventaja de la microscopía confocal es la flexibilidad en la presentación y análisis de imágenes que resulta de la adquisición simultánea de múltiples imágenes y su presentación digital en una computadora.
Aspectos críticos de la microscopía confocal.
Las imágenes cuantitativas en 3D en microscopía de fluorescencia a menudo se complican por artefactos introducidos durante la preparación de la muestra debido a cantidades experimentales controladas y no controladas o problemas de posicionamiento y diseño del microscopio. Este artículo, escrito por el Dr. James B. Pauley, sistematiza los factores externos más comunes que a menudo oscurecen los resultados obtenidos en fluorescencia de campo amplio y microscopía confocal. Los temas discutidos incluyen el sistema láser, la alineación de componentes ópticos, la ampliación del objetivo, los artefactos de blanqueo, las aberraciones, el aceite de inmersión, el espesor del cubreobjetos, la eficiencia cuántica y el entorno de la muestra.
Aberraciones en microscopía confocal multicolor.
Las mejoras en el diseño han simplificado la microscopía confocal hasta el punto de que se ha convertido en una herramienta común para la investigación en biología celular. Pero a medida que los microscopios confocales se han vuelto más potentes, se han impuesto mayores exigencias a su óptica. De hecho, las aberraciones ópticas que causan defectos menores en la imagen en microscopía de campo amplio pueden tener efectos devastadores en microscopía confocal. Desafortunadamente, los estrictos requisitos ópticos de la microscopía confocal a menudo quedan ocultos por sistemas ópticos que garantizan imágenes nítidas incluso con un microscopio débil. Los fabricantes de óptica producen muchas lentes de microscopio diferentes diseñadas para aplicaciones específicas. Este artículo muestra cómo las compensaciones objetivas afectan la microscopía confocal.
Imágenes de tres colores en microscopía confocal.
Un microscopio confocal de barrido láser (LSCM) se utiliza comúnmente para obtener imágenes digitales de muestras fluorescentes etiquetadas con una, dos y tres etiquetas. El uso de colores rojo, verde y azul (RGB) es más informativo para representar la distribución de la luz de hasta tres marcas de células fluorescentes cuando se utiliza un color complementario para cada posición relativa y cuando las imágenes de diferentes colores forman un único color triple. patrón de color. En esta sección, veremos una versión simplificada de un método publicado recientemente para obtener imágenes confocales de tres colores utilizando el popular programa de procesamiento de imágenes Adobe Photoshop. Además, se analizan varias aplicaciones para crear un protocolo de imágenes de tres colores para la presentación de imágenes confocales. Vale la pena tener en cuenta que estos métodos numéricos no se limitan a imágenes LSCM y se pueden aplicar a imágenes digitales importadas a Photoshop desde otras fuentes.
Conceptos básicos de la microscopía de reflectancia confocal
La microscopía de reflectancia confocal se puede utilizar para obtener información adicional sobre una muestra con relativamente poco esfuerzo adicional porque las técnicas requieren una preparación de muestra y un cambio de equipo mínimos. Además, con la microscopía de reflectancia confocal, la información de tejidos no teñidos está tan fácilmente disponible como los datos obtenidos de muestras teñidas que reflejan la luz. Este método también se puede combinar con técnicas de imágenes de fluorescencia más comunes. Ejemplos de aplicaciones recientes incluyen el registro de células no teñidas dentro de una población de células teñidas con fluorescencia y la observación de interacciones entre células teñidas con fluorescencia que crecen sobre un sustrato estructurado opaco.
Galería de imágenes confocales
La galería de imágenes confocales Nikon MicroscopyU es una secuencia de imágenes digitales obtenidas utilizando un microscopio confocal Nikon PCM-2000 combinado con un microscopio vertical Eclipse E-600. Se obtuvo una secuencia de imágenes de secciones ópticas en diferentes planos de la muestra mediante escaneo a lo largo del eje óptico del microscopio. La secuencia está representada por una aplicación Java interactiva que le permite "reproducir" una serie de cortes automáticamente o desplazarlos hacia adelante y hacia atrás como si fueran diapositivas.
Microscopía confocal de barrido láser.
Se han desarrollado varias técnicas para superar el fenómeno del contraste deficiente inherente a las imágenes de muestras gruesas que suelen producirse con los microscopios. Las técnicas confocales y deconvolución producen imágenes significativamente mejores de muestras de espesor medio (de 5 a 15 micrones). Las imágenes de las muestras más gruesas (20 micrones o más) se degradan por la exposición a una alta luz ambiental procedente de áreas desenfocadas y quizás se obtengan mejor mediante técnicas de microscopía confocal. Con este tutorial, las muestras se presentan como una serie de secciones ópticas a lo largo del eje z utilizando un microscopio confocal virtual.
Microscopía confocal de reflectancia.
Utilice este tutorial para explorar capas superficiales individuales de circuitos integrados. Las imágenes digitales como guía se adquirieron utilizando un microscopio confocal de reflectancia Nikon Optiphot C200. Para cada serie, se registró una secuencia de secciones ópticas a lo largo del eje z a medida que el microscopio penetraba y enfocaba profundamente (en incrementos de 1 micrómetro) el mosaico de circuitos en la superficie del cristal de silicio.
Disposiciones básicas
En comparación con la microscopía tradicional, la microscopía confocal tiene varias ventajas, incluida una profundidad de penetración poco profunda en la muestra en estudio, la ausencia de iluminación de fondo y la capacidad de obtener una serie de secciones ópticas de muestras gruesas. En biomedicina, la principal aplicación de la microscopía confocal es la obtención de imágenes de células y tejidos vivos o unidos, que normalmente están marcados con una o más etiquetas fluorescentes.
Arroz. 1. Esquema de la trayectoria del rayo en microscopía confocal.
Cuando se obtienen imágenes de muestras fluorescentes con un microscopio tradicional de campo amplio, la luminiscencia secundaria emitida por la muestra desde áreas fuera del estudio a menudo afecta la claridad de la imagen de las características enfocadas. Esto es especialmente problemático para espesores de muestra superiores a 2 micrómetros. La microscopía confocal proporciona mejoras modestas tanto en la resolución axial como en el plano; Pero es la capacidad de eliminar la luz de fondo que se produce en muestras de gran espesor teñidas con fluorescencia lo que ha provocado un reciente aumento en la popularidad de este método de investigación. Al ser relativamente fáciles de operar, la mayoría de los microscopios confocales modernos se han convertido en parte del equipo básico en muchos sistemas de imágenes multiusuario. Dado que la resolución lograda por un microscopio confocal de barrido láser (LSCM) es ligeramente mejor que la de un microscopio óptico de campo amplio tradicional, pero aún significativamente menor que la resolución de un microscopio electrónico de transmisión, en cierto sentido, se ha convertido en un puente entre la dos métodos de investigación más comunes. La figura 1 muestra un diagrama esquemático del paso de la luz en un microscopio confocal de configuración básica.
En los microscopios tradicionales de campo amplio, toda la muestra se ilumina con una fuente de luz de mercurio o xenón y la imagen se observa visualmente o se proyecta en un generador de imágenes o en una película fotográfica. El método para obtener una imagen con un microscopio confocal es fundamentalmente diferente. La muestra se ilumina escaneándola con uno o más haces enfocados, generalmente un láser (Figura 2). Las imágenes obtenidas al escanear la muestra se denominan secciones ópticas. Esta terminología se refiere a una técnica de prueba no invasiva en la que las imágenes se obtienen utilizando luz enfocada en lugar de diseccionar físicamente la muestra.
Arroz. 2. Escaneo de muestras de campo amplio y puntual
La microscopía confocal ha simplificado enormemente el estudio de especímenes vivos, permitiendo obtener datos en tres dimensiones (series z) y mejorando el proceso de obtención de imágenes de especímenes con múltiples tinciones. La Figura 3 compara una imagen de fluorescencia episcópica tradicional con una imagen confocal de las mismas secciones de un montaje completo de pupa de mariposa con epitelio teñido con yoduro de propidio. Es evidente un impresionante aumento de la resolución y, como consecuencia, de la nitidez de la imagen de los núcleos en una imagen LSCM, debido a la eliminación de la emisión fluorescente desenfocada.
Microscopio confocal de barrido láser (LSCM)
LSCM es ahora la versión más común de microscopios confocales utilizados en biomedicina. En la introducción se presta especial atención al LSCM, ya que el diseño y la estructura de estos microscopios permiten trabajar con ellos incluso a usuarios novatos. Otras soluciones de diseño han ocupado sus propios nichos especiales en biología. Para cualquier modelo o modificación de un microscopio confocal, se aplican la mayoría de las reglas para la preparación de muestras, con modificaciones menores, al igual que otras técnicas basadas en el seccionamiento óptico, como la deconvolución y las técnicas multifotónicas.
Desarrollo de la microscopía confocal.
La invención del microscopio confocal se atribuye a Marvin Minsky, quien creó un microscopio funcional en 1955. El desarrollo de la microscopía confocal fue impulsado en gran medida por el deseo de observar procesos biológicos en tejido vivo (in vivo), y el objetivo de Minsky era obtener imágenes de la red neuronal en una preparación sin teñir de un cerebro vivo. Los principios de la microscopía confocal, iniciados por Minsky y patentados en 1957, se utilizan en todos los microscopios confocales modernos. La Figura 1 explica el principio confocal, aplicado a la microscopía de epifluorescencia, que forma la base de todos los sistemas confocales modernos utilizados en imágenes de fluorescencia. En la configuración original, Minsky utilizó un orificio (diafragma) colocado frente a una fuente de luz de arco de circonio utilizada como fuente de luz estenopeica.
Arroz. 3. Epitelio del ala de mariposa
La luz de una fuente puntual se enfocó en forma de punto mediante una lente en un plano focal determinado de la muestra y, al pasar a través de él, se enfocó mediante una segunda lente en un segundo orificio (pinhole), que estaba enfocado con el primero (eran cofocales, es decir, confocales). Los rayos que pasaron a través del segundo orificio incidieron en un tubo fotomultiplicador de bajo ruido, que generó una señal dependiendo del brillo de la luz proveniente de la muestra. Un segundo orificio cortó la luz proveniente de regiones por encima o por debajo del plano focal en la muestra del tubo fotomultiplicador. El uso de filtrado espacial para eliminar la luz desenfocada y los destellos cuando se trabaja con muestras más gruesas que el plano focal es un principio clave de la microscopía confocal. En su trabajo, Minsky también describió un microscopio de reflectancia con una sola lente y un espejo dicromático, cuyo diseño se convirtió en la base de los sistemas utilizados hoy en día.
Para obtener una imagen confocal, es necesario escanear la muestra con luz enfocada en un punto. En el dispositivo original, ensamblado por Minsky, el haz de luz estaba estacionario y la muestra misma se movía sobre un escenario vibratorio. La inmovilidad del haz de exploración con respecto al eje óptico del microscopio fue una ventaja de esta instalación, ya que eliminaba la mayoría de los defectos ópticos que podían distorsionar la imagen. Sin embargo, al estudiar muestras biológicas, esto podría provocar fluctuaciones y distorsiones, lo que en última instancia provocaría una pérdida de resolución y claridad de la imagen. Además, al mover la platina y la muestra, es imposible realizar manipulaciones como, por ejemplo, microinyecciones de células teñidas con fluorescencia.
Pero, independientemente del método de escaneo de la muestra, es necesario obtener su imagen. Y el diseño original de Minsky no produjo una imagen real porque la salida del tubo fotomultiplicador se alimentaba a un osciloscopio de larga persistencia utilizado por los militares, que no tenía registrador. Minsky escribió más tarde que la decepcionante calidad de sus imágenes no se debía a la baja resolución del microscopio en sí, sino a la baja resolución de la pantalla del osciloscopio. Ahora está claro que, debido a la falta de tecnología, Minsky no pudo demostrar plenamente todo el potencial del método confocal, especialmente cuando se obtienen imágenes de estructuras biológicas. Señaló que esta puede ser la razón por la que la microscopía confocal no fue aceptada inmediatamente por la muy exigente comunidad de biólogos, para quienes la calidad de las imágenes resultantes siempre fue una prioridad. En aquella época tenían a su disposición microscopios ópticos con una óptica excelente, que les permitían observar y fotografiar secciones histológicas de colores brillantes en películas de color de alta sensibilidad. En los microscopios confocales modernos, las imágenes se generan a partir de señales provenientes de un tubo fotomultiplicador o se capturan mediante una cámara con un dispositivo digital de carga acoplada, se procesan directamente mediante un sistema de imágenes por computadora y se muestran en una pantalla de alta resolución y en un dispositivo de documentación de imágenes de calidad superior. En la Figura 4 se muestra un diagrama de un microscopio confocal de barrido láser moderno.
Arroz. 4. Esquema de un microscopio confocal de barrido láser moderno.
La óptica básica de un microscopio óptico no ha cambiado fundamentalmente durante décadas, ya que la resolución final del instrumento está determinada por la longitud de onda, la lente del objetivo y las propiedades de la propia muestra. Los tintes utilizados para mejorar el contraste de las muestras y otras técnicas de microscopía óptica han mejorado significativamente en los últimos 20 años. El auge y la mejora del método confocal fue consecuencia del resurgimiento de la microscopía óptica, provocado en gran parte por el éxito de las tecnologías modernas. Muchos de los avances tecnológicos que podrían haber beneficiado el diseño de Minsky se están volviendo gradualmente accesibles (y asequibles) para los biólogos y otros microscopistas. Entre ellos, láseres multifrecuencia estables utilizados como fuentes de luz puntuales mejoradas, espejos dicromáticos mejorados, fotodetectores sensibles de bajo ruido, microcomputadoras de alta velocidad con capacidades mejoradas (debido a la disponibilidad de memoria de alta capacidad), software de imágenes sofisticado, monitores de resolución e impresoras digitales.Estas tecnologías se desarrollaron de forma independiente y se han integrado gradualmente en los sistemas de imágenes confocales desde 1955. Por ejemplo, las técnicas de procesamiento de imágenes digitales fueron utilizadas con éxito por primera vez a principios de la década de 1980 por investigadores del Instituto Oceanográfico Woods Hole. Utilizando lo que denominaron “videomicroscopios”, pudieron obtener imágenes de la estructura celular de los microtubos más pequeñas que el límite de resolución teórico de un microscopio óptico. El aparente aumento de la resolución es posible gracias a la optimización digital de las imágenes capturadas por una cámara de vídeo de supersilicio (SIT) de alta sensibilidad acoplada a un procesador de imágenes digitales. Las estructuras celulares se visualizaron utilizando óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) y procesamiento adicional de imágenes digitales.
La clasificación de los diseños de microscopios confocales suele basarse en el método de escaneo de la muestra. Hay dos métodos de escaneo principales: escaneo de escenario y escaneo de haz de iluminación; y al menos dos formas de escanear el haz. El instrumento original de Minsky se basaba en un sistema de escaneo de escenario impulsado por un generador de diapasón primitivo, que producía una imagen con bastante lentitud. Las modernas instalaciones confocales con escaneo escénico, que han ido mucho más allá de sus prototipos, se utilizan principalmente en la ciencia de materiales, por ejemplo, en la producción de microcristales. Los sistemas basados en este principio se han vuelto populares recientemente en los campos biomédicos donde se realizan análisis de ADN en microcristales.
Una alternativa más práctica para obtener imágenes de sistemas biológicos es escanear una muestra estacionaria con un haz. Este principio subyace a muchos sistemas de medición, cuya mejora ha llevado a la aparición de los populares microscopios de investigación actuales. No entramos en los detalles técnicos de la microscopía confocal en esta introducción, pero esencialmente utiliza dos técnicas de escaneo de haz fundamentalmente diferentes: escaneo de haces múltiples y escaneo de haz único. El escaneo de haz único es el más común en la actualidad y es este método el que se utiliza en LSCM. Aquí, el haz se escanea mediante espejos controlados por computadora y accionados por galvanómetros a una velocidad de un cuadro por segundo. Para lograr un escaneo más rápido, aproximadamente a la velocidad de fotogramas del video, algunos sistemas utilizan un dispositivo acústico-óptico o espejos oscilantes. Un método alternativo utiliza dos haces para un escaneo casi en tiempo real, normalmente utilizando una variación de un disco de Nipkow giratorio. Estos sistemas fueron el resultado de la modificación y refinamiento de los microscopios de barrido en tándem (TSM) para crear modelos más eficientes para obtener imágenes de muestras teñidas con fluorescencia. La Figura 5 muestra un sistema tan avanzado con discos Nipkow emparejados y microlentes para mejorar la sensibilidad a la emisión fluorescente tenue para obtener imágenes en tiempo real.
Arroz. 5. Diseño óptico basado en discos de Nipkow.
Hoy en día, en microscopía confocal existen dos métodos alternativos para la obtención de cortes ópticos: el método de deconvolución y el multifotónico. Se diferencian técnicamente, pero al igual que los métodos confocales, se basan en la microscopía óptica tradicional. La deconvolución se basa en algoritmos computacionales para calcular y eliminar la información que proviene de áreas desenfocadas al crear una imagen. Esta técnica se ha vuelto muy conveniente gracias a algoritmos eficientes y minicomputadoras de alto rendimiento. La microscopía multifotónica utiliza el mismo sistema de escaneo que LSCM, pero no requiere un diafragma estenopeico en el receptor. No es necesario, ya que el láser excita la marca de fluorocromo sólo en el punto focal, eliminando así la radiación desenfocada. Al observar tejido vivo, este método tiene ventajas adicionales, a saber: fotoblanqueo reducido, ya que se reduce la cantidad de energía transmitida por el rayo láser y absorbida por el tejido de la muestra.
El microscopio óptico tradicional es la base sobre la que se construye el LSCM. En lugar de una lámpara de tungsteno o mercurio, se utiliza un láser, que está acoplado a un tubo fotomultiplicador sensible (PMT) y una computadora que controla los espejos de escaneo y otros dispositivos de escaneo y facilita la recopilación y presentación de imágenes. Los datos obtenidos se almacenan en soporte digital y pueden procesarse mediante numerosos paquetes de software, ya sea en el ordenador del propio sistema o en algún otro.
Según el diseño del LSCM, la iluminación y la recepción (registro) de la señal están limitadas a un punto de la muestra con un límite de difracción. Las lentes del microscopio enfocan el punto de iluminación y el dispositivo de escaneo escanea la muestra con este punto bajo control por computadora. Las señales de los puntos luminosos de la muestra ingresan a un tubo fotomultiplicador a través de un diafragma con un orificio (o en algunos casos una hendidura), y las señales de salida del fotomultiplicador se forman en una imagen y se reproducen visualmente en una computadora. Aunque las muestras sin teñir pueden observarse mediante la luz reflejada por la muestra, normalmente se tiñen con uno o más tintes fluorescentes. Uno de los LSCM más comunes, descrito en la literatura alrededor de 1990, se desarrolló en respuesta a un problema fundamental al que se enfrentaban los investigadores biológicos. Muchas estructuras y macromoléculas individuales dentro de embriones teñidos con inmunofluorescencia no se pueden visualizar con un microscopio de epifluorescencia tradicional después de la etapa de dos células, ya que el volumen del embrión permanece aproximadamente igual a medida que aumenta el número de células. Esto significa que con una disposición más densa de las células, aumenta la luminiscencia de las células fuera del plano focal, lo que conduce a un deterioro de la resolución de la imagen.
Arroz. 6. Configuración del microscopio confocal de escaneo láser Nikon
Un grupo de investigadores que trabajaban en este problema descubrió que ninguno de los sistemas confocales disponibles en ese momento cumplía con sus requisitos. En aquella época, los microscopios de barrido de platina eran demasiado lentos. Se necesitaban aproximadamente 10 segundos para crear una sola imagen y los instrumentos de escaneo multihaz aún no eran prácticos para obtener imágenes de fluorescencia. El LSCM fue diseñado para cumplir con los requisitos de la microscopía de epifluorescencia tradicional y, junto con otros que se estaban desarrollando al mismo tiempo, se convirtió en el prototipo de los complejos sistemas que ahora ofrecen varias empresas a la comunidad biomédica. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de un sistema utilizado actualmente (Nikon E1000).
En dispositivos especialmente diseñados, el grosor de las secciones ópticas puede variar con los cambios en el diámetro del orificio situado delante del fotodetector. En comparación con otros diseños con un tamaño de orificio fijo, esta característica adicional es extremadamente flexible a la hora de obtener imágenes de estructuras biológicas. La imagen se puede ampliar sin pérdida de resolución reduciendo el área escaneada de la muestra y colocando la información escaneada en una matriz de datos del mismo tamaño para su almacenamiento y presentación visual (el aumento cambia de manera similar en un microscopio electrónico de barrido). . Esto le da a una sola lente un intervalo de zoom, lo que puede ser extremadamente útil al visualizar eventos raros o fugaces que podrían pasarse por alto o perderse al cambiar de lente.
Con las capacidades sofisticadas y flexibles del LSCM que ahora se ofrecen comercialmente a precios razonables, la microscopía confocal ha ganado popularidad en los últimos años, y muchos laboratorios multiusuario eligen este equipo en lugar de los microscopios electrónicos. La ventaja de la microscopía confocal es la relativa facilidad con la que se pueden obtener imágenes de alta calidad de muestras preparadas para la microscopía óptica tradicional y una amplia gama de aplicaciones en diversos campos de investigación.
La primera generación de LSCM funcionó bien con muestras fijas, pero no lograron controlar la energía luminosa de los láseres, lo que con demasiada frecuencia resultó en la destrucción fatal de la muestra viva a menos que se tomaran precauciones serias. A pesar de estas limitaciones, las imágenes de las muestras grabadas eran de tan alta calidad que los especialistas aceptaron incondicionalmente el enfoque confocal. Las generaciones posteriores de instrumentos han mejorado todos los aspectos del proceso de obtención de imágenes. Además, los nuevos dispositivos se han vuelto mucho más ergonómicos y fáciles de usar, de modo que los ajustes, el cambio de combinaciones de filtros y el ajuste de la potencia del láser mediante una computadora se han vuelto mucho más fáciles y rápidos. Ahora es posible obtener imágenes con tres fluorocromos simultáneamente e incluso con más en secuencia. Gracias a software mejorado y más confiable, computadoras más rápidas, unidades de disco más grandes y la caída de los precios de los dispositivos de almacenamiento de acceso aleatorio, el procesamiento de imágenes también ha avanzado significativamente.
Modos de imagen
La principal aplicación de un microscopio confocal es la obtención de imágenes de varios tipos de muestras gruesas. La ventaja del método confocal surge de la capacidad de crear imágenes de la muestra como una secuencia de secciones ópticas individuales con alta definición y resolución. En este caso se utilizan varios modos de visualización; Cada uno de ellos se basa en un corte óptico como unidad básica de imagen.
Arroz. 1. Secciones ópticas etiquetadas con tres marcas.
Secciones ópticas individuales
La sección óptica es la unidad de imagen básica en las técnicas de microscopía confocal. Las imágenes de muestras unidas y teñidas se pueden obtener en modos de iluminación de longitud de onda única, doble, triple y múltiple, mientras que las imágenes de muestras multicolores se combinarán entre sí (si se utilizan lentes con corrección de aberración cromática adecuada). El registro adicional generalmente se realiza mediante métodos de procesamiento de imágenes digitales. La mayoría de los microscopios confocales de barrido láser (LSCM) requieren aproximadamente 1 segundo para adquirir una sección óptica, aunque las imágenes de múltiples secciones ópticas generalmente se promedian para mejorar la relación señal-ruido. El tiempo que lleva obtener una imagen, por supuesto, depende del tamaño de píxel de la imagen y de la velocidad de la computadora del sistema. Para almacenar una imagen típica de 8 bits de 768x512 píxeles, se necesitarán aproximadamente 0,3 Mbit de memoria.
Las secciones ópticas que se muestran en la Figura 1 se obtuvieron simultáneamente mediante luz de excitación de tres longitudes de onda diferentes (488, 568 y 647 nanómetros) utilizando un único láser de criptón/argón como fuente de radiación. Como muestra, se presenta el disco imaginal de un ala de Drosophila en el tercer estadio, en el que se marcan tres genes implicados en la formación del ala. Los tres genes presentados y las etiquetas de fluorocromo correspondientes son: (a) vestigial (fluoresceína - 496 nanómetros); (b) sin alas (lisamina rodamina - 572 nanómetros); y © CiD (cianina 5 - 649 nanómetros). En la parte inferior derecha se encuentra una imagen compuesta de los tres dominios genéticos representados espacialmente que forman el ala (imagen (d)).
Grabar en un intervalo de tiempo específico y visualizar una célula viva.
Los estudios de lapso de tiempo de células vivas han ganado un nuevo impulso debido a la mayor resolución de LSCM. Anteriormente, los estudios de los movimientos de las estructuras celulares se realizaban utilizando película fotográfica de 16 mm y un intervalometro con mecanismo de reloj conectado a una cámara, posteriormente utilizando un vídeo con función time-lapse, un grabador de disco óptico o una placa de digitalización de vídeo. . Ahora, utilizando LSCM, es posible obtener secciones ópticas en determinados intervalos preestablecidos en tiempo real.
Obtener imágenes de tejido vivo utilizando LSCM es mucho más difícil que obtener imágenes de muestras unidas y no siempre es práctico porque la muestra puede no soportar las condiciones de visualización. La Tabla 1 resume algunos factores que deben considerarse al observar células vivas y asociadas utilizando LSCM. Algunas muestras son simplemente físicamente imposibles de colocar en la platina del microscopio o no podrán permanecer vivas en él durante todo el período de observación. Es posible que el fenómeno o estructura que se está estudiando no esté dentro del campo de visión de la lente. Por ejemplo, los discos imaginales del ala de Drosophila se desarrollan demasiado profundamente en la larva para ser observados; y después de la disección, no pueden desarrollarse en cultivo. Por lo tanto, hoy en día el único método disponible para observar la expresión génica en tejidos de este tipo es diseccionar la larva, atar y teñir discos imaginales tomados de muestras en diferentes etapas de desarrollo.
Mesa 1. Observación de células vivas y unidas utilizando LSCM
La observación y la obtención de imágenes exitosas de células vivas requieren un cuidado extremo durante todo el proceso y es imprescindible mantener condiciones aceptables en el escenario del microscopio. El daño causado a una célula por la irradiación del rayo láser puede acumularse durante escaneos repetidos, por lo que esta exposición debe mantenerse al mínimo necesario y suficiente para obtener una imagen. Normalmente se añaden antioxidantes, como el ácido ascórbico, al medio de cultivo para reducir el oxígeno liberado cuando las moléculas fluorescentes se irradian con luz de excitación y promover la formación de radicales libres que destruyen las células. Por lo general, es necesario realizar extensos experimentos de control preliminares para evaluar el efecto de la irradiación en células teñidas con fluorescencia, asegurándose cuidadosamente de que todos los parámetros de imagen sean consistentes con las observaciones que se realizan. Después de las imágenes de prueba, se debe evaluar la viabilidad de las muestras vivas. Los embriones, por ejemplo, deben seguir desarrollándose con normalidad durante todo el proceso de observación, por lo que se debe detectar cualquier anomalía provocada por la exposición a la radiación o a los fluorocromos. La Figura 2 muestra una fotografía a intervalos de un embrión de Drosophila teñido con fluorescencia de verde calcio. Una serie de imágenes muestra cambios en la distribución del brillo fluorescente a lo largo del tiempo.
Cada tipo de célula requiere sus propias medidas para mantener su viabilidad durante la observación. Para algunas células de insectos, es suficiente mantener la temperatura ambiente y tener un volumen suficientemente grande de medio adecuado. Sin embargo, la mayoría de los tipos de células requieren un escenario calentado y, a veces, una cámara de perfusión para mantener el equilibrio adecuado de dióxido de carbono mientras se encuentra en el escenario. Seleccionar el tipo de células para las cuales las condiciones de observación utilizando LSCM sean menos "hostiles" ayudará a evitar muchos problemas experimentales. Las mejoras en los instrumentos confocales modernos han dado como resultado una reducción significativa de los problemas potenciales. La mayor eficiencia cuántica, la mayor apertura numérica (brillo) de los objetivos y el uso de tintes celulares menos tóxicos han llevado a que la microscopía confocal se convierta en un método práctico para analizar células vivas. Es necesario esforzarse por utilizar láseres de menor potencia y, al mismo tiempo, permitir que la adquisición y el procesamiento de imágenes se realicen lo más rápido posible. Si se aumenta la apertura del orificio para acelerar la recopilación y grabación de imágenes (en comparación con la observación de muestras no vivas), la deconvolución posterior a veces puede restaurar la calidad de la imagen perdida.
Arroz. 2. Disparar en un intervalo de tiempo determinado
Muchos procesos y eventos fisiológicos ocurren demasiado rápido para ser capturados por la mayoría de los LSCM, que promedian una imagen por segundo para obtener imágenes. Los LSCM que utilizan dispositivos acústico-ópticos y diafragmas hendidos son más rápidos que los sistemas de escaneo puntual excitados por galvanómetro y son más prácticos para estudios fisiológicos. Estas configuraciones más rápidas combinan una buena resolución espacial y temporal, que puede alcanzar los 30 fotogramas por segundo en resolución de pantalla completa, o cerca de la velocidad de la imagen de vídeo. En los microscopios de barrido estenopeicos más lentos, la resolución temporal sólo se puede aumentar reduciendo el área de barrido de la muestra. Si se requiere una resolución espacial completa, se debe reducir la velocidad de cuadros, lo que resulta en una pérdida de resolución temporal. Los sistemas confocales, que utilizan escaneo de disco o espejo oscilante, también son capaces de obtener imágenes de procesos fisiológicos rápidos u otros eventos transitorios.
Serie Z e imágenes 3D
Una serie Z es una secuencia de secciones ópticas de una muestra tomadas en diferentes niveles en un plano perpendicular al eje óptico (eje z). Las imágenes de la serie Z se obtienen haciendo coincidir los cambios paso a paso en el enfoque fino del microscopio y luego adquiriendo una imagen en cada paso. El movimiento de enfoque paso a paso generalmente se realiza mediante un motor paso a paso controlado por computadora, que cambia el enfoque en una cantidad predeterminada. Usando un programa macro de computadora, puede adquirir y guardar una imagen, reenfocar el microscopio a una profundidad específica en la muestra, adquirir y guardar una segunda imagen, reenfocar nuevamente en un nuevo plano, y así sucesivamente hasta que se adquiera el número programado de imágenes. .
Las imágenes deseadas se pueden tomar de la serie z obtenida fotografiando un área seleccionada de la muestra y procesadas mediante un software especial para un examen detallado posterior de células de interés específicas. La serie Z puede considerarse como un fotomontaje de imágenes, como en la Figura 3. Este tipo de combinación y visualización de imágenes, así como muchas otras manipulaciones de imágenes, es una característica estándar de los paquetes de software de manipulación de imágenes modernos. Las imágenes de la Figura 3 son una selección de una serie más grande con pasos z aún más frecuentes. El brillo verde identifica el sistema nervioso periférico de un embrión de Drosophila teñido con el anticuerpo 22C10.
Arroz. 3. Serie Z de secciones ópticas
A partir de una serie de varios cientos de secciones ópticas de una muestra producida por LSCM, puede resultar difícil hacerse una idea de todo el complejo de estructuras interconectadas. Sin embargo, la serie z, una vez registrada, es un material ideal para la posterior representación tridimensional de la muestra mediante técnicas de imagen volumétrica. Este enfoque se utiliza ahora ampliamente para aclarar la relación entre la estructura y función del tejido en medicina y biología. Es importante configurar el paso de escaneo z de muestra correcto determinado por el paso del motor de cambio de enfoque; en este caso, la imagen reflejará la profundidad real de la muestra.
Mientras la muestra permanezca estacionaria mientras se observa, las imágenes de la serie z producidas por el LSCM se grabarán perfectamente y, cuando se almacenen digitalmente, se convertirán con relativa facilidad en una representación 3D de la muestra. La Figura 4 compara una única sección óptica (a) con una proyección de la serie z (b) e ilustra el valor de esta técnica para obtener imágenes del sistema nervioso periférico de un embrión de Drosophila marcado con el anticuerpo 22C10.
El paso del motor paso a paso establecido por el operador del microscopio está relacionado con el espesor de la sección óptica, pero puede tener otros valores. El grosor de la sección óptica está ligado al grosor de la sección de muestra observada a través del microscopio y depende de la lente y del diámetro del diafragma estenopeico. En algunos casos, sin embargo, el paso focal puede ser el mismo que el espesor del corte óptico, y esto puede generar confusión.
Una vez que se recibe el archivo de la serie z, se envía para ser procesado mediante un programa de reconstrucción 3D diseñado específicamente para procesar imágenes confocales. Estos programas son extremadamente rápidos cuando se utilizan en estaciones gráficas, pero también se pueden utilizar con éxito en una computadora personal o en la estación gráfica del propio microscopio confocal, con un procesador suficientemente rápido y una gran RAM. Con estos programas se pueden crear tanto representaciones tridimensionales individuales de una muestra como una secuencia de representaciones que se reemplazan entre sí, compuestas por diferentes tipos de muestra, lo que produce el efecto de rotación u otras transformaciones espaciales y da una mejor percepción de las propiedades tridimensionales de la muestra. El programa le permite variar la longitud, la profundidad, realizar mediciones volumétricas y también cambiar de forma interactiva parámetros especiales de la imagen, como la transparencia de la muestra, para resaltar diferentes estructuras en diferentes niveles de la muestra.
Arroz. 4. Sección óptica y proyección de la serie z.
Otra forma de representar una serie de cortes ópticos tomados de una secuencia de imágenes adquiridas en un intervalo de tiempo determinado es una representación tridimensional en la que el eje z tiene la función del eje del tiempo. Este enfoque es útil para visualizar cambios fisiológicos durante el desarrollo del organismo. Un ejemplo de la aplicación de este método fue aclarar la dinámica de los cambios en la concentración de calcio durante el desarrollo de embriones de erizo de mar. La codificación por colores de secciones ópticas tomadas a diferentes profundidades es una forma sencilla de representar datos 3D. En la práctica, se asigna un color (generalmente rojo, verde o azul) a cada sección óptica tomada a diferentes profundidades de la muestra, y luego se combinan las imágenes en color y se logra el efecto deseado cambiando los colores usando un programa de procesamiento de imágenes.
Imágenes 4D
Con LCSM, los fenómenos dinámicos que ocurren en tejidos vivos o durante la preparación de cultivos de tejidos vivos y se reflejan en una secuencia de imágenes tomadas durante un intervalo de tiempo determinado se pueden representar en cuatro dimensiones, siendo el tiempo la cuarta dimensión. Las series Z, obtenidas a intervalos regulares, son conjuntos de datos de cuatro dimensiones: tres dimensiones espaciales (x, y, z) y el tiempo como cuarta, que se pueden observar utilizando un visor 4D. Estos programas le permiten componer y reproducir pares estéreo tomados en diferentes momentos en el tiempo como una película o, alternativamente, procesar y presentar imágenes tridimensionales reconstruidas tomadas en diferentes momentos en el tiempo, como una película editada.
Imágenes X-Z
Si se desea una vista lateral de la muestra, como una sección vertical a través de la capa epitelial, se puede realizar una sección xz de dos maneras. Se puede obtener una vista lateral escaneando a lo largo de una sola línea de la muestra (eje x) a diferentes profundidades (eje z), controlando el cambio de enfoque con un motor paso a paso y luego combinando toda la serie de cortes en una sola. imagen. Otro método es utilizar la opción de plano de sección en un programa de renderizado 3D, donde la vista lateral se extrae de una serie z existente de cortes ópticos. Al obtener imágenes del epitelio del ala de mariposa en la Figura 5, el láser escaneó a lo largo de una sola línea (la línea negra horizontal en la imagen de la izquierda) que penetra la muestra en diferentes coordenadas z o profundidades. La imagen xz que se muestra en la Figura 5 fue generada y presentada mediante un sistema de imágenes confocal. El epitelio del ala consta de dos capas epiteliales, pero dado que la intensidad de la fluorescencia disminuye al aumentar la profundidad de penetración del rayo láser en la muestra, sólo se visualiza claramente la capa superior.
Arroz. 5. Imagen en el plano X-Z
Crear una imagen con luz reflejada.
Todos los primeros microscopios confocales funcionaban con luz reflejada o retrodispersada. Usando luz reflejada, muchas muestras se pueden observar sin teñir en microscopía confocal, o se pueden etiquetar con tintes altamente reflectantes como microcristales de inmunooro o haluro de plata. Una ventaja de las observaciones con luz reflejada, especialmente para tejidos vivos, es que la muestra no está sujeta a fotoblanqueo. Pero algunos tipos de tintes pueden debilitar el rayo láser. Otro problema potencial es que algunos microscopios pueden experimentar reflejos internos de los elementos ópticos a lo largo de la trayectoria del haz óptico. Para las versiones multihaz de LSCM y LSCM de diafragma hendido, el problema de la luz reflejada no existe, y en aquellos microscopios que sí existen, el uso de polarizadores, imágenes de áreas libres de artefactos y compensación del eje óptico ayudan a reducir el problema.
Imágenes de luz transmitida
Cualquiera de los modos de imágenes de luz transmitida comúnmente utilizados en microscopía se puede utilizar en LFCM, incluido el contraste de fase, el contraste de interferencia diferencial (DIC), el campo oscuro o la luz polarizada. La luz que atraviesa la muestra incide en el receptor de luz transmitida, cuya señal, a través de una guía de luz de fibra óptica, se envía a uno de los fotomultiplicadores del cabezal de exploración del microscopio. Las imágenes de luz transmitida y de epifluorescencia confocal se pueden capturar simultáneamente utilizando el mismo haz de iluminación, lo que garantiza un registro preciso. Al fusionar o sintetizar imágenes utilizando el software adecuado, se puede reflejar la ubicación exacta de las células marcadas en el tejido. Algunos estudios sugieren el siguiente enfoque significativo: combinar una imagen de luz transmitida no confocal con una o más imágenes de fluorescencia confocales de células marcadas de la misma muestra. Este enfoque permitirá, por ejemplo, determinar los aspectos espaciales y temporales de la migración de una subpoblación de células marcadas dentro de una población de células no marcadas durante varias horas o incluso años.
Hoy en día, ya se utiliza ampliamente un receptor de luz transmitida en color, que acepta señales transmitidas en rojo, verde y azul (RGB) para crear una imagen en color verdadero, similar a lo que se hace en algunas cámaras digitales en color. Un receptor de este tipo es especialmente útil para los patólogos, que habitualmente observan colores reales en el tejido bajo luz transmitida y superponen estas imágenes con datos fluorescentes para su análisis.