Αναπαραγωγή ιών σε κυτταρικά συστήματα. Στάδια αναπαραγωγής
Η σχέση μεταξύ του ιού και του κυττάρου ξενιστή μπορεί να αναπτυχθεί με διαφορετικούς τρόπους. Συμβατικά, αυτές οι σχέσεις μπορούν να περιοριστούν σε τρεις τύπους.
Παραγωγική μόλυνση:Ο κύκλος αναπαραγωγής του ιού στο κύτταρο ξενιστή τελειώνει με το σχηματισμό μιας νέας, πολυάριθμης γενιάς ιών, που συνήθως συνοδεύεται από το θάνατο του κυττάρου ξενιστή.
Λοίμωξη από έκτρωσησυμβαίνει όταν ο κύκλος αναπαραγωγής του ιού στο κύτταρο ξενιστή διακόπτεται ξαφνικά. Το κύτταρο ξενιστής διατηρεί τη ζωτική του δραστηριότητα.
Virogenyχαρακτηρίζεται από την ενσωμάτωση (ενσωμάτωση) του ιικού νουκλεϊκού οξέος στο γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή, η οποία στη συνέχεια οδηγεί σε σύγχρονη αντιγραφή του DNA του κυττάρου και του ιικού νουκλεϊκού οξέος. Το κύτταρο-ξενιστής συνεχίζει να ζει.
Οι ιοί αναπαράγονται με την αναπαραγωγή τους στο κύτταρο ξενιστή. Ο κύκλος αναπαραγωγής είναι μια διαδικασία υποταγής των κυτταρικών μηχανισμών σε ξένες ιογενείς πληροφορίες.
Λειτουργικά, τα ιικά ένζυμα μπορούν να χωριστούν σε 2 ομάδες: ένζυμα που διευκολύνουν τη διείσδυση του ιικού νουκλεϊκού οξέος στο κύτταρο και την απελευθέρωση των ιοσωμάτων που προκύπτουν στο περιβάλλον και ένζυμα που εμπλέκονται στις διαδικασίες μεταγραφής και αντιγραφής του ιικού νουκλεϊκού οξέος.
Κύκλος αναπαραγωγήςμπορεί να χωριστεί σε ξεχωριστά στάδια.
Στάδιο 1 - χημειορόφηση ιών στην επιφάνεια του κυττάρου ξενιστή
Η χημειορόφηση είναι δυνατή μόνο εάν το κύτταρο φέρει στην επιφάνειά του ευαίσθητους υποδοχείς που είναι συμπληρωματικοί με τους υποδοχείς ενός δεδομένου ιού. Στα ζωικά και ανθρώπινα κύτταρα, η λειτουργία των υποδοχέων για τους πικόρνο- και τους αρβοϊούς εκτελείται από λιποπρωτεΐνες, και για μυξο- και παραμυξοϊούς και αδενοϊούς - βλεννοπρωτεΐνες.
Σε απλούς ιούς, οι υποδοχείς είναι μοναδικοί συνδυασμοί πρωτεϊνικών υπομονάδων που βρίσκονται στην επιφάνεια του καψιδίου. Σε πιο πολύπλοκους ιούς, η λειτουργία των υποδοχέων εκτελείται από υπερκαψιδικές εκβολές με τη μορφή ακίδων ή λαχνών.
Στάδιο 2 – διείσδυση του ιού στο κύτταρο ξενιστή.
Οι τρόποι με τους οποίους οι ιοί εισέρχονται σε ένα κύτταρο μπορεί να είναι διαφορετικοί. Θεωρείται ότι πολλοί ιοί εισέρχονται στα κύτταρα πινοκυττάρωση, ή viropexis. Κατά τη διάρκεια της πινοκυττάρωσης, στην περιοχή της χημειορρόφησης του ιού, η κυτταρική μεμβράνη σχηματίζει μια διήθηση και καταπίνει τον ιό. Ως μέρος του πινοκυτταρικού κενοτόπου, ο ιός εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα.
Ορισμένοι ιοί εισέρχονται στα κύτταρα μέσω της σύντηξης κυτταρικών και ιικών μεμβρανών.
Η διείσδυση του DNA του φάγου σε ένα βακτηριακό κύτταρο συμβαίνει λόγω της μερικής καταστροφής της κυτταρικής μεμβράνης από τη λυσοζύμη του φάγου και της συσταλτικής αντίδρασης του υπολείμματος του φάγου.
Στάδιο 3 - αποπρωτεϊνοποίηση του ιού.
Η διαδικασία αποπρωτεϊνοποίησης του ιού περιλαμβάνει την απελευθέρωση του νουκλεϊκού οξέος του από τις πρωτεΐνες καψιδίου. Μόλις το ιικό νουκλεϊκό οξύ απελευθερωθεί από τις πρωτεΐνες καψιδίου, αρχίζει η λεγόμενη λανθάνουσα περίοδος - η περίοδος έκλειψη. Υποτίθεται ότι κατά την περίοδο της έκλειψης, το ιικό νουκλεϊκό οξύ περνά μέσα από το κυτταρόπλασμα του κυττάρου στην περιοχή του πυρήνα.
Στάδιο 4 – σύνθεση συστατικών του ιού.
Το σύνολο των διαδικασιών σε αυτό το στάδιο μπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια:
Το πρώτο στάδιο είναι προπαρασκευαστικό. Έχει δύο στόχους: να καταστείλει τη λειτουργία του γενετικού μηχανισμού του κυττάρου, να σταματήσει τη σύνθεση κυτταρικών πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων, να μεταφέρει τη συσκευή πρωτεϊνοσύνθεσης του κυττάρου υπό τον έλεγχο του γονιδιώματος του ιού. προετοιμασία συνθηκών για την αντιγραφή του νουκλεϊκού οξέος και τη σύνθεση πρωτεϊνών καψιδίου του ιού.
Το δεύτερο στάδιο είναι η αντιγραφή του νουκλεϊκού οξέος του ιού. Οι γονιδιωματικοί ιοί με δίκλωνο DNA χαρακτηρίζονται από τον ίδιο τρόπο πραγματοποίησης γενετικών πληροφοριών με άλλους ζωντανούς οργανισμούς. Η διαδικασία αντιγραφής του DNA προηγείται από μεταγραφή mRNA. Το αγγελιαφόρο RNA του ιού μεταφράζεται από τα ριβοσώματα του κυττάρου και οι πρώιμες ειδικές για τον ιό πρωτεΐνες συντίθενται στο πολυσωμάτιο ιού χρησιμοποιώντας τη μήτρα mRNA.
Μόλις συντεθούν οι πρώιμες ειδικές για τον ιό πρωτεΐνες, αρχίζει η διαδικασία αντιγραφής του DNA του ιού. Η αντιγραφή του δίκλωνου DNA του ιού ακολουθεί την αρχή της αντιγραφής του DNA των κυτταρικών οργανισμών με ημι-συντηρητικό τρόπο.
Η διαδικασία αντιγραφής μονόκλωνου DNA ξεκινά με τη σύνθεση του συμπληρωματικού του ζεύγους. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα δίκλωνο κυκλικό γονικό DNA.
Η μελέτη του μηχανισμού αντιγραφής των γονιδιωματικών ιών RNA ξεκίνησε το 1961, όταν ανακαλύφθηκαν γονιδιωματικοί φάγοι RNA.
Στους γονιδιωματικούς ιούς RNA, το μόριο RNA είναι και το γενετικό υλικό και εκτελεί τις λειτουργίες του mRNA και του DNA.
Το 1970, το ένζυμο εξαρτώμενο από RNA πολυμεράση DNA ανακαλύφθηκε σε ιούς RNA μονοκυττάρου, υποδεικνύοντας την παρουσία μιας διαδικασίας αντίστροφης μεταγραφής. Αργότερα αποδείχθηκε ότι οι ογκογόνοι ιοί RNA έχουν μια μήτρα του RNA τους με τη συμμετοχή εξαρτώμενων από το RNA
Το αντίγραφο DNA μεταγράφεται από πολυμεράση DNA που περιέχεται στο ιοσωμάτιο. Το αντίγραφο του DNA αλλάζει από μονόκλωνο σε αναδιπλασιαζόμενη δίκλωνη μορφή, η οποία εξασφαλίζει την αντιγραφή του RNA του ιού και τη σύνθεση των απαραίτητων ενζύμων.
Το τρίτο στάδιο είναι η σύνθεση πρωτεϊνών καψιδίου.
Αυτή η διαδικασία υστερεί χρονικά από τη διαδικασία αντιγραφής του ιικού νουκλεϊκού οξέος και ξεκινά όταν ο αναδιπλασιασμός είναι σε πλήρη εξέλιξη. Η σύνθεση των πρωτεϊνών καψιδίου συμβαίνει τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα του κυττάρου. Το ειδικό για τον ιό mRNA μεταφράζεται από τα κυτταρικά ριβοσώματα και η σύνθεση των πρόδρομων πρωτεϊνών λαμβάνει χώρα στο πολυσωμάτιο του ιού. Από αυτό το «ταμείο» πρόδρομων πρωτεϊνών, σχηματίζονται οι πρωτεΐνες καψιδίου του ιού.
Στάδιο 5 – συναρμολόγηση ιοσωμάτων ή μορφογένεση του ιού.
Σε απλά οργανωμένους ιούς, οι πρωτεϊνικές υπομονάδες του καψιδίου βρίσκονται σε μια αυστηρά διατεταγμένη σύνδεση γύρω από το νουκλεϊκό οξύ. Στους σύνθετους ιούς, οι κυτταρικές δομές —πυρηνικές και κυτταροπλασματικές μεμβράνες— συμμετέχουν επίσης στη διαδικασία της συναρμολόγησης του ιού.
Στάδιο 6 – έξοδος του ιού από το κύτταρο.
Αυτή η διαδικασία εκτελείται διαφορετικά για διαφορετικούς ιούς. Η απελευθέρωση των γονιδιωματικών φάγων του DNA συμβαίνει όταν το κύτταρο λύεται πλήρως από τη λυσοζύμη του φάγου. Πολύπλοκα οργανωμένοι ανθρώπινοι και ζωικοί ιοί εγκαταλείπουν το κύτταρο με ένα τμήμα του κυτταροπλάσματος εκκολαπτόμενοι μέσω της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και του περιβλήματος, αποκτώντας ταυτόχρονα ένα υπερκαψίδιο. Συχνά, η απελευθέρωση ιών από το κύτταρο διευκολύνεται από την πέψη του από τα φαγοκύτταρα του αίματος. Οι φυτικοί ιοί μπορούν να περάσουν από κύτταρο σε κύτταρο μέσω μεσοκυττάριων συνδέσεων - πλασμοδεσμάτων.
Τις περισσότερες φορές, ο κύκλος αναπαραγωγής του ιού τελειώνει με μια παραγωγική λοίμωξη - το σχηματισμό ενός μεγάλου πληθυσμού (100-200) πλήρους ιοσωμάτων, που συνήθως συνοδεύεται από το θάνατο του ξενιστή.
Ταξινόμηση, ταξινόμηση
ΠΑΡΑΜΥΞΟΙΟΙ
Παραμυξοϊοί (οικογένεια Paramyxoviridae από lat. παρά - περίπου, μύξα - βλέννα) - μια οικογένεια ιών RNA. Η οικογένεια περιέχει ιούς του αναπνευστικού συγκυτίου, της ιλαράς, της παρωτίτιδας και της παραγρίπης, που μεταδίδονται μέσω του αναπνευστικού μηχανισμού. Μέχρι πρόσφατα, η οικογένεια Paramyxoviridae, σύμφωνα με τη γενικά αποδεκτή ταξινόμηση των ιών, περιελάμβανε τρία γένη: Paramyxovirus, Morbillivirus, Pneumovirus. Όμως πρόσφατα έγιναν αλλαγές στην ταξινόμηση.
Οικογένεια Paramyxoviridaeχωρισμένο σε δύο υποοικογένειες, ο αριθμός των γενών αυξήθηκε:
1. Υποοικογένεια Paramyxovirinae περιλαμβάνει τον τοκετό Ρασπιροϊός(προηγούμενο όνομα - Paramyxovirus), MorbillivirusΚαι Ρουμπουλαϊός(νέο γένος)
2. Υποοικογένεια Pneumovirinae περιέχει γένη ΠνευμοϊόςΚαι Μεταπνευμοϊός.
2. Μορφολογία, μέγεθος, χαρακτηριστικά γονιδιώματος
Δομή Virion.Όλα τα μέλη της οικογένειας Paramyxoviridae έχουν παρόμοια δομή. Αυτός είναι ένας σύνθετος ιός γονιδιώματος RNA μεγάλου μεγέθους. Ο τυπικός εκπρόσωπος είναι ο ιός Sendai (είναι παθογόνος για ποντίκια) και η υπερδομή των παραμυξοϊών συζητείται χρησιμοποιώντας αυτό το παράδειγμα (Εικ. 5). Το virion έχει στρογγυλό σχήμα, η διάμετρός του είναι 150-300 nm. Εξωτερικά υπάρχει ένα λιποπρωτεϊνικό υπερκαψίδιο με πολλές ράχες δύο τύπων στην επιφάνεια (Εικ. 4). Από το εσωτερικό, ένα στρώμα πρωτεΐνης μήτρας Μ βρίσκεται δίπλα στο υπερκαψίδιο. Στο κεντρικό τμήμα του βιριόντος υπάρχει ένας κλώνος νουκλεοκαψιδίου (RNP) με ελικοειδή τύπο συμμετρίας, κουλουριασμένος σε χαλαρή σφαίρα.
Ρύζι. 4 Σχήμα παραμυξοϊού Εικ. 5 Ηλεκτρονόγραμμα του ιού Sendai
Γονιδίωμααντιπροσωπεύεται από ένα μεγάλο γραμμικό μονόκλωνο μόριο μείον RNA που κωδικοποιεί 7 πρωτεΐνες. Μεταξύ αυτών είναι η κύρια καψιδική πρωτεΐνη NP, πρωτεΐνες του συμπλόκου πολυμεράσης L και P, η μη δομική πρωτεΐνη C (όλες αυτές αποτελούν μέρος του νουκλεοκαψιδίου), καθώς και η πρωτεΐνη Μ και οι επιφανειακές γλυκοπρωτεΐνες. Αυτές είναι οι πρωτεΐνες προσκόλλησης και η πρωτεΐνη σύντηξης (F-protein). Οι πρωτεΐνες προσκόλλησης σχηματίζουν έναν τύπο σπονδυλικής στήλης και η πρωτεΐνη F σχηματίζει έναν άλλο τύπο σπονδυλικής στήλης. Σε διαφορετικούς παραμυξοϊούς, οι πρωτεΐνες προσκόλλησης αντιπροσωπεύονται από: ΗΝ (αιμοσυγκολλητίνη-νευραμινιδάση), Η (αιμαγλουτινίνη) ή G-πρωτεΐνη.
Παραγρίπη.Με βάση τα αντιγόνα των ιικών πρωτεϊνών HN, NP, F, διακρίνονται 4 κύριοι ορότυποι των ιών της παραγρίπης. Οι τύποι 1, 2, 3 διασταυρώνονται με αντισώματα κατά του ιού της παρωτίτιδας. Ο ιός τύπου 4 είναι διαφορετικός και έχει 2 υποτύπους (επομένως, υποτίθεται ότι υπάρχουν 5 τύποι ιών παραγρίπης). Όλοι οι ιοί της παραγρίππης έχουν πρωτεΐνη ΗΝ και επομένως εμφανίζουν δραστηριότητα αιμοσυγκόλλησης και νευραμινιδάσης. Οι τύποι 1 και 2 του ιού της παραγρίπης συγκολλούν τα ερυθροκύτταρα του κοτόπουλου, ο ιός της παραγρίππης 3 συγκολλεί μόνο τα ερυθροκύτταρα του ινδικού χοιριδίου.
Ο παραμυξοϊός (Εικ. 5) δεσμεύει τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου (HN, H, ή G) στην κυτταρική επιφάνεια (1). Η πρωτεΐνη F εξασφαλίζει τη σύντηξη του περιβλήματος του ιού με την πλασματική μεμβράνη του κυττάρου, χωρίς το σχηματισμό ενδοσωμάτων. Η αντιγραφή του γονιδιώματος είναι παρόμοια με την αντιγραφή των γονιδιωματικών ιών μείον RNA: η RNA πολυμεράση εισάγεται στο κύτταρο με το νουκλεοκαψίδιο του ιού. Το γονιδίωμα μεταγράφεται σε μεμονωμένα mRNA (2) για κάθε πρωτεΐνη και σε ένα πλήρες συν πρότυπο (3) για το γονιδιωματικό RNA. Νέα γονιδιώματα αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες L-, P- και NP, σχηματίζοντας νουκλεοκαψίδια. Η συντιθέμενη πρωτεΐνη μήτρας μετακινείται στο εσωτερικό στρώμα της κυτταρικής μεμβράνης. Οι πρόδρομοι γλυκοπρωτεΐνες της σπονδυλικής στήλης συντίθενται σε ριβοσώματα που σχετίζονται με μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου (ER). Είναι γλυκοζυλιωμένα, κινούνται μέσω της συσκευής ER και Golgi (AG), ενσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη. Το νουκλεοκαψίδιο συνδέεται με την πρωτεΐνη μήτρας και την τροποποιημένη με γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνη (υπερκαψίδιο). Τα ιούς φεύγουν από το κύτταρο με (4) εκβλάστηση.
Ρύζι. 5 Αναπαραγωγή παραμυξοϊών
Οι παραμυξοϊοί έχουν την ικανότητα, χρησιμοποιώντας την πρωτεΐνη F, να μετακινούνται σε γειτονικά κύτταρα, προκαλώντας τη σύντηξή τους. Σε αυτή την περίπτωση, σχηματίζονται πολυπύρηνα γιγαντιαία κύτταρα - συγκυτία (συμπλάστες). Αυτός ο μηχανισμός επιτρέπει στους ιούς να εξαπλωθούν απευθείας από κύτταρο σε κύτταρο, αποφεύγοντας τη δράση των αντισωμάτων που εξουδετερώνουν τους ιούς. Η ικανότητα σχηματισμού συμπλαστικών είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα των παραμυξοϊών.
Επιλογή από τη βάση δεδομένων: Απαντήσεις σε ερωτήσεις σχετικά με το BJD test.docx, IIST - ερωτήσεις 2018 answers.docx, Ερωτήσεις δοκιμών για self-study.docx, θέματα θεωρίας διαχείρισης.docx, ερωτήσεις DKB για το exam.docx, 30 απαντήσεις σε ερωτήσεις σχετικά με τη λειτουργία pdf, Test questions.docx, tests, ερωτήσεις 8РЯ.doc, Test ερωτήσεις και εργασίες με απαντήσεις για πρόσβαση σε υπολογιστή, Business και επιστημονικά θέματα. Ερωτήσεις για το τεστ.doc.ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟ
Ερωτήσεις ελέγχου:
1. Αναπαραγωγή γονιδιωματικών ιών DNA: κύρια στάδια, χαρακτηριστικά αναπαραγωγής……………………………………………………………………………………. 3
2. Σημάδια αναπαραγωγής του ιού σε ζωντανά συστήματα: πειραματόζωα, έμβρυα κοτόπουλου, κυτταροκαλλιέργειες………………………………………………………………16
3. Εργασία ..................................................... .................................................... .......... ...20
Παραπομπές …………………………… ... ………………… ........... 25
1. Αναπαραγωγή γονιδιωματικών ιών DNA: κύρια στάδια, χαρακτηριστικά αναπαραγωγής
Αναπαραγωγή ιών
Η διαδικασία αναπαραγωγής του ιού μπορεί να χωριστεί σε δύο φάσεις. Η πρώτη φάση καλύπτει τα γεγονότα που οδηγούν στην προσρόφηση και είσοδο του ιού στο κύτταρο, την απελευθέρωση του εσωτερικού συστατικού του και την τροποποίησή του με τέτοιο τρόπο ώστε να είναι ικανό να προκαλέσει μόλυνση. Κατά συνέπεια, η πρώτη φάση περιλαμβάνει τρία στάδια: 1) προσρόφηση του ιού στα κύτταρα. 2) διείσδυση του ιού στα κύτταρα. 3) απογύμνωση του ιού στο κύτταρο. Αυτά τα στάδια στοχεύουν στη διασφάλιση της παροχής του ιού στις κατάλληλες κυτταρικές δομές και της απελευθέρωσης του εσωτερικού του συστατικού από τις προστατευτικές του μεμβράνες. Μόλις επιτευχθεί αυτός ο στόχος, ξεκινά η δεύτερη φάση αναπαραγωγής, κατά την οποία εκφράζεται το γονιδίωμα του ιού. Αυτή η φάση περιλαμβάνει τα στάδια: 1) μεταγραφή, 2) μετάφραση αγγελιαφόρου RNA, 3) αντιγραφή γονιδιώματος, 4) συναρμολόγηση ιικών συστατικών. Το τελικό στάδιο της αναπαραγωγής είναι η απελευθέρωση του ιού από το κύτταρο.
Η πρώτη φάση της αναπαραγωγής.
Ι. Προσρόφηση ιοσωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια.
Η αλληλεπίδραση ενός ιού με ένα κύτταρο ξεκινά με τη διαδικασία της προσρόφησης, δηλαδή την προσκόλληση ιικών σωματιδίων στην επιφάνεια του κυττάρου. Η διαδικασία προσρόφησης είναι δυνατή με την παρουσία κατάλληλων υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια και «αναγνώρισης» ουσιών στην επιφάνεια του ιού. Οι πολύ αρχικές διεργασίες προσρόφησης είναι μη ειδικής φύσης και μπορεί να βασίζονται στην ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση θετικά και αρνητικά φορτισμένων ομάδων στην επιφάνεια του ιού και του κυττάρου. Ωστόσο, η αναγνώριση των κυτταρικών υποδοχέων από τις ιικές πρωτεΐνες, που οδηγεί στη σύνδεση του ιικού σωματιδίου στο κύτταρο, είναι μια εξαιρετικά ειδική διαδικασία. Οι πρωτεΐνες στην επιφάνεια του ιού που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες ομάδες στην πλασματική μεμβράνη του κυττάρου και προκαλούν το σωματίδιο του ιού να προσκολληθεί σε αυτές ονομάζονται πρωτεΐνες προσκόλλησης.
Οι ιοί χρησιμοποιούν υποδοχείς που έχουν σχεδιαστεί για να περνούν στο κύτταρο ουσίες απαραίτητες για τη ζωή του: θρεπτικά συστατικά, ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες κ.λπ. Οι υποδοχείς μπορεί να έχουν διαφορετική χημική φύση και να είναι πρωτεΐνες, το συστατικό υδατάνθρακα των πρωτεϊνών και τα λιπίδια, τα λιπίδια. Οι υποδοχείς για τους ιούς της γρίπης και τους παραμυξοϊούς είναι το σιαλικό οξύ στη σύνθεση γλυκοπρωτεϊνών και γλυκολιπιδίων (γαγγλιοσίδες), για ραβδοϊούς και ρεοϊούς - επίσης ένα συστατικό υδατάνθρακα στη σύνθεση πρωτεϊνών και λιπιδίων, για picornaviruses και αδενοϊούς - πρωτεΐνες, για ορισμένους ιούς - lipids . Ειδικοί υποδοχείς παίζουν ρόλο όχι μόνο στην προσκόλληση του ιικού σωματιδίου στην κυτταρική επιφάνεια. Καθορίζουν την περαιτέρω μοίρα του ιικού σωματιδίου, την ενδοκυτταρική μεταφορά και παράδοση του σε ορισμένες περιοχές του κυτταροπλάσματος και του πυρήνα, όπου ο ιός είναι σε θέση να ξεκινήσει τη μολυσματική διαδικασία. Ο ιός μπορεί επίσης να προσκολληθεί σε μη ειδικούς υποδοχείς και ακόμη και να διεισδύσει στο κύτταρο, αλλά μόνο η προσκόλληση σε έναν συγκεκριμένο υποδοχέα θα οδηγήσει σε μόλυνση.
Η προσκόλληση του ιικού σωματιδίου στην κυτταρική επιφάνεια λαμβάνει χώρα αρχικά μέσω του σχηματισμού ενός μόνο δεσμού μεταξύ του ιικού σωματιδίου και του υποδοχέα. Ωστόσο, μια τέτοια προσκόλληση είναι εύθραυστη και το ιικό σωματίδιο μπορεί εύκολα να ξεκολλήσει από την επιφάνεια του κυττάρου - αναστρέψιμη προσρόφηση. Προκειμένου να συμβεί μη αναστρέψιμη προσρόφηση, πρέπει να εμφανιστούν πολλαπλοί δεσμοί μεταξύ του ιικού σωματιδίου και πολλών μορίων υποδοχέα, δηλαδή, πρέπει να συμβεί σταθερή πολυσθενής σύνδεση. Ο αριθμός των μορίων κυτταρικού υποδοχέα στις θέσεις προσρόφησης μπορεί να φτάσει έως και τις 3000. Η σταθερή δέσμευση του ιικού σωματιδίου στην κυτταρική επιφάνεια ως αποτέλεσμα της πολυσθενούς σύνδεσης συμβαίνει λόγω της δυνατότητας ελεύθερης κίνησης των μορίων υποδοχέα στη λιπιδική διπλοστοιβάδα της πλασματικής μεμβράνης , η οποία καθορίζεται από την κινητικότητα, τη «ρευστότητα» του στρώματος πρωτεΐνης-λιπιδίου. Η αύξηση της ρευστότητας των λιπιδίων είναι ένα από τα πρώτα γεγονότα στην αλληλεπίδραση ενός ιού με ένα κύτταρο, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό πεδίων υποδοχέα στη θέση επαφής του ιού με την κυτταρική επιφάνεια και σταθερή σύνδεση του ιικού σωματιδίου στο προκύπτουσες ομάδες.
Ο αριθμός των ειδικών υποδοχέων στην κυτταρική επιφάνεια κυμαίνεται μεταξύ 104 και 105 ανά κύτταρο. Οι υποδοχείς για ορισμένους ιούς μπορούν να υπάρχουν μόνο σε ένα περιορισμένο σύνολο κυττάρων-ξενιστών και αυτό μπορεί να καθορίσει την ευαισθησία του σώματος σε έναν δεδομένο ιό. Για παράδειγμα, οι πικορναϊοί προσροφούνται μόνο σε κύτταρα πρωτευόντων. Οι υποδοχείς για άλλους ιούς, αντίθετα, αντιπροσωπεύονται ευρέως στην επιφάνεια κυττάρων διαφόρων ειδών, όπως, για παράδειγμα, υποδοχείς για ορθομυξοϊούς και παραμυξοϊούς, οι οποίοι είναι ενώσεις που περιέχουν σιαλύλιο. Επομένως, αυτοί οι ιοί έχουν ένα σχετικά ευρύ φάσμα κυττάρων στα οποία μπορεί να συμβεί προσρόφηση ιικών σωματιδίων. Τα κύτταρα ενός εξαιρετικά μεγάλου εύρους ξενιστών διαθέτουν υποδοχείς για έναν αριθμό τογαϊών: αυτοί οι ιοί μπορούν να προσροφήσουν και να μολύνουν κύτταρα τόσο των σπονδυλωτών όσο και των ασπόνδυλων.
II. Διείσδυση του ιού στο κύτταρο.
Ιστορικά, υπήρχε μια ιδέα δύο εναλλακτικών μηχανισμών για τη διείσδυση ζωικών ιών στα κύτταρα - με ιορόπεξις (ενδοκυττάρωση) και με τη σύντηξη ιικών και κυτταρικών μεμβρανών. Ωστόσο, και οι δύο αυτοί μηχανισμοί δεν αποκλείουν, αλλά αλληλοσυμπληρώνονται.
Ο όρος «viropexis» σημαίνει ότι το ιικό σωματίδιο εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα ως αποτέλεσμα της διείσδυσης ενός τμήματος της πλασματικής μεμβράνης και του σχηματισμού ενός κενοτοπίου που περιέχει το ιικό σωματίδιο.
Ενδοκυττάρωση υποδοχέα. Το Viropexis είναι μια ειδική περίπτωση ενδοκυττάρωσης υποδοχέα ή προσρόφησης. Αυτή η διαδικασία είναι ένας κοινός μηχανισμός μέσω του οποίου εισέρχονται στο κύτταρο θρεπτικές και ρυθμιστικές πρωτεΐνες, ορμόνες, λιποπρωτεΐνες και άλλες ουσίες από το εξωκυττάριο υγρό. Η ενδοκυττάρωση των υποδοχέων εμφανίζεται σε εξειδικευμένες περιοχές της πλασματικής μεμβράνης, όπου υπάρχουν ειδικές κοιλότητες καλυμμένες στην κυτταροπλασματική πλευρά με μια ειδική πρωτεΐνη μεγάλου μοριακού βάρους - την κλαθρίνη. Στο κάτω μέρος του λάκκου υπάρχουν συγκεκριμένοι υποδοχείς. Οι κοιλότητες επιτρέπουν την ταχεία διείσδυση και το σχηματισμό ενδοκυτταρικών κενοτοπίων επικαλυμμένων με κλαθρίνη. Ο χρόνος ημιζωής διείσδυσης της ουσίας στο κύτταρο με αυτόν τον μηχανισμό δεν υπερβαίνει τα 10 λεπτά από τη στιγμή της προσρόφησης. Ο αριθμός των κενοτοπίων που σχηματίζονται σε ένα λεπτό αγγίζει περισσότερα από 2000. Έτσι, η ενδοκύττωση των υποδοχέων είναι ένας καλά συντονισμένος μηχανισμός που εξασφαλίζει την ταχεία διείσδυση ξένων ουσιών στο κύτταρο.
Τα επικαλυμμένα κενοτόπια συντήκονται με άλλα, μεγαλύτερα κυτταροπλασματικά κενοτόπια, σχηματίζοντας υποδοχείς που περιέχουν υποδοχείς αλλά όχι κλαθρίνη, η οποία με τη σειρά της συντήκεται με λυσοσώματα. Με αυτόν τον τρόπο, οι πρωτεΐνες που εισέρχονται στο κύτταρο μεταφέρονται συνήθως στα λυσοσώματα, όπου διασπώνται σε αμινοξέα. μπορούν να παρακάμψουν τα λυσοσώματα και να συσσωρευτούν σε άλλα μέρη του κυττάρου σε μη αποικοδομημένη μορφή. Μια εναλλακτική λύση στην ενδοκυττάρωση των υποδοχέων είναι η υγρή ενδοκυττάρωση, όταν η κολπίτιδα δεν συμβαίνει σε εξειδικευμένες περιοχές της μεμβράνης. Οι περισσότεροι ζωικοί ιοί με περίβλημα και χωρίς περίβλημα εισέρχονται στο κύτταρο μέσω του μηχανισμού της ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων. Η ενδοκυττάρωση διασφαλίζει την ενδοκυτταρική μεταφορά του ιικού σωματιδίου μέσα στο ενδοκυτταρικό κενοτόπιο, αφού το κενοτόπιο μπορεί να κινηθεί προς οποιαδήποτε κατεύθυνση και να συγχωνευθεί με τις κυτταρικές μεμβράνες (συμπεριλαμβανομένης της πυρηνικής μεμβράνης), απελευθερώνοντας το ιικό σωματίδιο στις αντίστοιχες ενδοκυτταρικές θέσεις. Με αυτόν τον τρόπο, για παράδειγμα, οι πυρηνικοί ιοί εισέρχονται στον πυρήνα και οι ρεοϊοί εισέρχονται στα λυσοσώματα. Ωστόσο, τα ιικά σωματίδια που έχουν εισέλθει στο κύτταρο βρίσκονται μέσα στο κενοτόπιο και διαχωρίζονται από το κυτταρόπλασμα με τα τοιχώματά του. Πρέπει να περάσουν από διάφορα στάδια για να προκαλέσουν μια μολυσματική διαδικασία.
Σύντηξη ιικών και κυτταρικών μεμβρανών. Προκειμένου το εσωτερικό συστατικό του ιού να περάσει από την κυτταρική μεμβράνη, ο ιός χρησιμοποιεί έναν μηχανισμό σύντηξης μεμβράνης. Στους ιούς με περίβλημα, η σύντηξη προκαλείται από μια σημειακή αλληλεπίδραση της ιικής πρωτεΐνης σύντηξης με τα λιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης, ως αποτέλεσμα της οποίας ο φάκελος της ιικής λιποπρωτεΐνης ενσωματώνεται στην κυτταρική μεμβράνη και το εσωτερικό συστατικό του ιού εμφανίζεται στην άλλη πλευρά. Σε ιούς χωρίς περίβλημα, μία από τις επιφανειακές πρωτεΐνες αλληλεπιδρά επίσης με τα λιπίδια των κυτταρικών μεμβρανών, προκαλώντας το εσωτερικό συστατικό να περάσει μέσα από τη μεμβράνη. Οι περισσότεροι ζωικοί ιοί εισέρχονται στο κυτταρόπλασμα από το υποδοχέα.
Εάν κατά τη διάρκεια της ενδοκυττάρωσης το ιικό σωματίδιο είναι παθητικός επιβάτης, τότε κατά τη σύντηξη γίνεται ενεργός συμμετέχων στη διαδικασία. Η πρωτεΐνη σύντηξης είναι μια από τις επιφανειακές πρωτεΐνες της. Μέχρι σήμερα, αυτή η πρωτεΐνη έχει ταυτοποιηθεί μόνο σε παραμυξοϊούς και ορθομυξοϊούς. Στους παραμυξοϊούς, αυτή η πρωτεΐνη (πρωτεΐνη P) είναι μία από τις δύο γλυκοπρωτεΐνες που βρίσκονται στην επιφάνεια του ιικού σωματιδίου. Η λειτουργία της πρωτεΐνης σύντηξης στον ιό της γρίπης εκτελείται από τη μικρή αιμοσυγκολλητική υπομονάδα.
Οι παραμυξοϊοί προκαλούν σύντηξη μεμβράνης σε ουδέτερο pH και το εσωτερικό συστατικό αυτών των ιών μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο απευθείας μέσω της πλασματικής μεμβράνης. Ωστόσο, οι περισσότεροι ιοί με περίβλημα και χωρίς περίβλημα προκαλούν σύντηξη μεμβράνης μόνο σε χαμηλές τιμές pH, μεταξύ 5,0 και 5,75. Εάν προστεθούν στα κύτταρα ασθενείς βάσεις (χλωριούχο αμμώνιο, χλωροκίνη κ.λπ.), οι οποίες αυξάνουν το pH στα ενδοκυτταρικά κενοτόπια στο 6,0, δεν λαμβάνει χώρα σύντηξη μεμβράνης, ιικά σωματίδια παραμένουν στα κενοτόπια και η μολυσματική διαδικασία δεν εμφανίζεται. Η αυστηρή εξάρτηση της σύντηξης μεμβράνης από τις τιμές του pH οφείλεται σε διαμορφωτικές αλλαγές στις πρωτεΐνες σύντηξης του ιού.
Το λυσόσωμα έχει πάντα χαμηλή τιμή pH (4,9). Στο ενδοκυτταρικό κενοτόπιο (receptosome), η οξίνιση δημιουργείται από μια εξαρτώμενη από το ATP «αντλία πρωτονίων» στην κυτταρική επιφάνεια κατά τη διάρκεια του σχηματισμού ενός επικαλυμμένου κενοτοπίου. Η οξίνιση του ενδοκυτταρικού κενοτόπου έχει μεγάλη σημασία για τους φυσιολογικούς συνδέτες που εισέρχονται στο κύτταρο, καθώς ένα χαμηλό pH προάγει τη διάσπαση του συνδέτη από τον υποδοχέα και την ανακύκλωση των υποδοχέων.
Ο ίδιος μηχανισμός που αποτελεί τη βάση της σύντηξης ιικών και κυτταρικών μεμβρανών καθορίζει την επαγόμενη από τον ιό αιμόλυση και τη σύντηξη των πλασματικών μεμβρανών των γειτονικών κυττάρων με το σχηματισμό πολυπύρηνων κυττάρων, συμπλαστικών και συγκυτίων. Οι ιοί προκαλούν δύο τύπους κυτταρικής σύντηξης: 1) «σύντηξη από το εξωτερικό» και 2) «σύντηξη από μέσα». Η «σύντηξη από έξω» εμφανίζεται σε υψηλή πολλαπλότητα μόλυνσης και ανιχνεύεται μέσα στις πρώτες ώρες μετά τη μόλυνση. Αυτός ο τύπος σύντηξης, που περιγράφεται για τους παραμυξοϊούς, προκαλείται από πρωτεΐνες του ιού που μολύνει και δεν απαιτεί ενδοκυτταρική σύνθεση ιικών συστατικών. Αντίθετα, η «σύντηξη από μέσα» συμβαίνει σε χαμηλή πολλαπλότητα μόλυνσης, ανιχνεύεται σε σχετικά αργά στάδια της μολυσματικής διαδικασίας και προκαλείται από νεοσυντιθέμενες ιικές πρωτεΐνες. Η «σύντηξη από μέσα» περιγράφεται για πολλούς ιούς: ιούς έρπητα, ογκοϊούς, παθογόνα αργών λοιμώξεων κ.λπ. Αυτός ο τύπος σύντηξης προκαλείται από τις ίδιες ιικές γλυκοπρωτεΐνες που διασφαλίζουν τη διείσδυση του ιού στο κύτταρο.
III. Γδύσιμο - αποπρωτεϊνοποίηση του ιού
Τα ιικά σωματίδια που έχουν εισέλθει στο κύτταρο πρέπει να γδύνονται για να προκαλέσουν μολυσματική διαδικασία. Ο σκοπός του γδύσιμο είναι να αφαιρεθούν οι προστατευτικές μεμβράνες του ιού που εμποδίζουν την έκφραση του ιικού γονιδιώματος. Ως αποτέλεσμα του γδύσιμο, απελευθερώνεται το εσωτερικό συστατικό του ιού, το οποίο μπορεί να προκαλέσει μολυσματική διαδικασία. Το γδύσιμο συνοδεύεται από μια σειρά χαρακτηριστικών χαρακτηριστικών: ως αποτέλεσμα της αποσύνθεσης του ιικού σωματιδίου, η μολυσματική δραστηριότητα εξαφανίζεται, σε ορισμένες περιπτώσεις εμφανίζεται ευαισθησία στις νουκλεάσες, εμφανίζεται αντίσταση στην εξουδετερωτική δράση των αντισωμάτων και χάνεται η φωτοευαισθησία όταν χρησιμοποιείται ένας αριθμός των ναρκωτικών.
Τα τελικά προϊόντα του ξεγυμνώματος είναι πυρήνες, νουκλεοκαψίδια ή νουκλεϊκά οξέα. Για έναν αριθμό ιών, έχει αποδειχθεί ότι το προϊόν αποδέσμευσης δεν είναι γυμνά νουκλεϊκά οξέα, αλλά νουκλεϊκά οξέα που σχετίζονται με την εσωτερική ιική πρωτεΐνη. Για παράδειγμα, το τελικό προϊόν των πικορναϊών είναι το RNA, ομοιοπολικά συνδεδεμένο με την πρωτεΐνη VPg το τελικό προϊόν των αδενοϊών είναι το DNA, ομοιοπολικά συνδεδεμένο με μία από τις εσωτερικές ιικές πρωτεΐνες.
Σε ορισμένες περιπτώσεις, η ικανότητα των ιών να προκαλούν μια μολυσματική διεργασία καθορίζεται από τη δυνατότητα αποδέσμευσής τους στο κύτταρο ενός δεδομένου συστήματος. Έτσι, αυτό το στάδιο είναι ένα από τα στάδια που περιορίζουν τη μόλυνση.
Η απομάκρυνση ενός αριθμού ιών συμβαίνει σε εξειδικευμένες περιοχές μέσα στο κύτταρο (λυσοσώματα, δομές της συσκευής Golgi, περιπυρηνικός χώρος, πυρηνικοί πόροι στην πυρηνική μεμβράνη). Όταν η ιική και η κυτταρική μεμβράνη συγχωνεύονται, η διείσδυση στο κύτταρο συνδυάζεται με το γδύσιμο.
Το ξεγύμνωμα και η ενδοκυτταρική μεταφορά είναι αλληλένδετες διαδικασίες: εάν διαταραχθεί η σωστή ενδοκυτταρική μεταφορά στις θέσεις αποδέσμευσης, το σωματίδιο του ιού εισέρχεται στο λυσόσωμα και καταστρέφεται από τα λυσοσωμικά ένζυμα.
Δεύτερη φάση αναπαραγωγής .
Ι. Μεταγραφή.
Η μεταγραφή πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας ένα ειδικό ένζυμο - RNA πολυμεράση, το οποίο δεσμεύει τα νουκλεοτίδια σχηματίζοντας γέφυρες 3-5' φωσφοδιεστέρα. Αυτή η δέσμευση λαμβάνει χώρα μόνο παρουσία προτύπου DNA.
Τα προϊόντα της μεταγραφής στο κύτταρο είναι το mRNA. Το ίδιο το κυτταρικό DNA, που είναι ο φορέας της γενετικής πληροφορίας, δεν μπορεί να προγραμματίσει άμεσα την πρωτεϊνοσύνθεση. Η μεταφορά της γενετικής πληροφορίας από το DNA στα ριβοσώματα πραγματοποιείται από έναν αγγελιοφόρο RNA. Αυτή είναι η βάση του κεντρικού δόγματος της μοριακής βιολογίας, το οποίο εκφράζεται με τον ακόλουθο τύπο:
DNA - μεταγραφή - RNA - μετάφραση - πρωτεΐνη,
όπου τα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση μεταφοράς της γενετικής πληροφορίας.
Εφαρμογή γενετικής πληροφορίας σε ιούς. Η στρατηγική του ιικού γονιδιώματος σε σχέση με τη σύνθεση mRNA είναι διαφορετική για διαφορετικούς ιούς. Στους ιούς DNA, το mRNA συντίθεται στο εκμαγείο ενός από τους κλώνους του DNA. Ο τύπος για τη μεταφορά γενετικών πληροφοριών είναι ο ίδιος όπως σε ένα κελί:
DNA - μεταγραφή - RNA - μετάφραση - πρωτεΐνη.
Οι ιοί DNA που αναπαράγονται στον πυρήνα χρησιμοποιούν κυτταρική πολυμεράση για μεταγραφή. Αυτοί οι ιοί περιλαμβάνουν παποβαϊούς, αδενοϊούς και ιούς έρπητα. Οι ιοί DNA που αναπαράγονται στο κυτταρόπλασμα δεν μπορούν να χρησιμοποιήσουν το κυτταρικό ένζυμο που βρίσκεται στον πυρήνα. Η μεταγραφή του γονιδιώματός τους πραγματοποιείται από ένα ειδικό για τον ιό ένζυμο - DNA πολυμεράση, το οποίο διεισδύει στο κύτταρο ως μέρος του ιού. Αυτοί οι ιοί περιλαμβάνουν τους ιούς της ευλογιάς και τους ιριδοϊούς.
Ένζυμα που μεταγράφουν το γονιδίωμα του ιού. Μεταγραφή ενός αριθμού ιών που περιέχουν DNA - παποβαϊούς, αδενοϊούς, ιούς έρπητα, παρβοϊούς, ιούς ηπαδναίου. Πραγματοποιείται στον πυρήνα του κυττάρου και σε αυτή τη διαδικασία χρησιμοποιούνται ευρέως οι μηχανισμοί κυτταρικής μεταγραφής - ένζυμα μεταγραφής και περαιτέρω τροποποίηση των μεταγραφών. Η μεταγραφή αυτών των ιών πραγματοποιείται από την κυτταρική RNA πολυμεράση II, ένα ένζυμο που μεταγράφει το κυτταρικό γονιδίωμα. Ωστόσο, μια ειδική ομάδα μεταγραφών αδενοϊού συντίθεται χρησιμοποιώντας ένα άλλο κυτταρικό ένζυμο - RNA πολυμεράση III. Σε δύο άλλες οικογένειες ζωικών ιών που περιέχουν DNA, των ιών της ευλογιάς και των ιριδοϊών, η μεταγραφή λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν κυτταρικές πολυμεράσες στο κυτταρόπλασμα, η μεταγραφή αυτών των ιών απαιτεί ένα ειδικό ιικό ένζυμο - ιική πολυμεράση RNA. Αυτό το ένζυμο είναι μια δομική ιική πρωτεΐνη.
Κανονισμός μεταγραφής. Η μεταγραφή του ιικού γονιδιώματος ρυθμίζεται αυστηρά σε όλο τον μολυσματικό κύκλο. Η ρύθμιση πραγματοποιείται τόσο με κυτταρικούς όσο και με ειδικούς για ιούς μηχανισμούς. Σε ορισμένους ιούς, κυρίως αυτούς που περιέχουν DNA, υπάρχουν τρεις περίοδοι μεταγραφής - πολύ πρώιμο, πρώιμο και όψιμο. Αυτοί οι ιοί περιλαμβάνουν τους ιούς της ευλογιάς, τους ιούς του έρπητα, τους ιούς παποβάς και τους αδενοϊούς. Ως αποτέλεσμα της εξαιρετικά πρώιμης και πρώιμης μεταγραφής, τα εξαιρετικά πρώιμα και πρώιμα γονίδια διαβάζονται επιλεκτικά για να σχηματίσουν εξαιρετικά πρώιμα ή πρώιμα mRNA. Κατά τη διάρκεια της όψιμης μεταγραφής, διαβάζεται ένα άλλο τμήμα του ιικού γονιδιώματος, τα όψιμα γονίδια, παράγοντας όψιμα mRNAs. Ο αριθμός των όψιμων γονιδίων συνήθως υπερβαίνει τον αριθμό των πρώιμων γονιδίων. Πολλά πολύ πρώιμα γονίδια είναι γονίδια για μη δομικές πρωτεΐνες - ένζυμα και ρυθμιστές μεταγραφής και αντιγραφής του ιικού γονιδιώματος. Αντίθετα, τα όψιμα γονίδια είναι συνήθως γονίδια για δομικές πρωτεΐνες. Τυπικά, η όψιμη μεταγραφή διαβάζει ολόκληρο το γονιδίωμα, αλλά με επικράτηση της όψιμης μεταγραφής γονιδίου.
Ένας παράγοντας που ρυθμίζει τη μεταγραφή στους πυρηνικούς ιούς είναι η μεταφορά των μεταγραφών από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, στη θέση λειτουργίας του mRNA - τα πολυσώματα.
Το προϊόν της εξαιρετικά πρώιμης μεταγραφής των ιών του έρπητα είναι οι Α-πρωτεΐνες. Η λειτουργία ενός ή περισσότερων από αυτά είναι απαραίτητη για τη μεταγραφή της επόμενης ομάδας γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες P. Με τη σειρά τους, οι πρωτεΐνες P ενεργοποιούν τη μεταγραφή της τελευταίας ομάδας όψιμων γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες U. Αυτός ο τύπος ρύθμισης ονομάζεται «καταρράκτης».
II. Αναμετάδοση.
Αυτή είναι η διαδικασία μετάφρασης της γενετικής πληροφορίας που περιέχεται στο mRNA σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία αμινοξέων στις συντιθέμενες ειδικές για τον ιό πρωτεΐνες. Η πρωτεϊνοσύνθεση στο κύτταρο συμβαίνει ως αποτέλεσμα της μετάφρασης του mRNA στα ριβοσώματα. Στα ριβοσώματα, η ροή των πληροφοριών (σε mRNA) συγχωνεύεται με τη ροή των αμινοξέων, τα οποία φέρνουν RNA μεταφοράς (tRNA). Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών tRNA στο κύτταρο. Κάθε αμινοξύ πρέπει να έχει το δικό του tRNA.
Το μόριο tRNA είναι ένα μονόκλωνο RNA με σύνθετη δομή σε σχήμα φύλλου σφενδάμου.
Η σύνδεση ενός συγκεκριμένου tRNA και αμινοξέος πραγματοποιείται από το ένζυμο αμινοακυλοσυνθετάση. Το ένα άκρο του tRNA συνδέεται με το αμινοξύ και το άλλο με τα νουκλεοτίδια του mRNA στο οποίο είναι συμπληρωματικά. Τα τρία νουκλεοτίδια σε ένα mRNA κωδικοποιούν ένα αμινοξύ και ονομάζονται «τριπλή» ή «κωδόνιο» και τα συμπληρωματικά τρία νουκλεοτίδια σε ένα tRNA ονομάζονται «αντικωδόνιο».
Η διαδικασία μεταγραφής αποτελείται από τρεις φάσεις: έναρξη επιμήκυνσης, τερματισμός.
Η έναρξη της μετάφρασης είναι το πιο κρίσιμο στάδιο στη διαδικασία μετάφρασης, που βασίζεται στην αναγνώριση του mRNA από το ριβόσωμα και στη δέσμευσή του στις ειδικές του περιοχές. Το ριβόσωμα αναγνωρίζει το mRNA μέσω ενός καπακιού στο άκρο 5' και ολισθαίνει προς το 3' άκρο μέχρι να φτάσει στο κωδικόνιο έναρξης, το οποίο ξεκινά τη μετάφραση. Σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο, τα κωδικόνια έναρξης είναι κωδικόνια AUG (αδενίνη, ουρακίλη, γουανίνη) που κωδικοποιούν τη μεθειονίνη. Η σύνθεση όλων των πολυπεπτιδικών αλυσίδων ξεκινά με τη μεθειονίνη. Η ειδική αναγνώριση του ιού και του RNA από το ριβόσωμα πραγματοποιείται λόγω ειδικών για τον ιό παραγόντων έναρξης.
Πρώτον, η μικρή ριβοσωμική υπομονάδα συνδέεται με το mRNA. Το σύμπλεγμα mRNA με τη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα ενώνεται με άλλα συστατικά απαραίτητα για την έναρξη της μετάφρασης. Αυτά είναι πολλά πρωτεϊνικά μόρια που ονομάζονται «παράγοντες εκκίνησης». Υπάρχουν τουλάχιστον τρία από αυτά σε ένα προκαρυωτικό κύτταρο και περισσότερα από εννέα σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο. Παράγοντες έναρξης καθορίζουν την αναγνώριση συγκεκριμένων mRNA από το ριβόσωμα. Ως αποτέλεσμα, σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα που είναι απαραίτητο για την έναρξη της μετάφρασης, το οποίο ονομάζεται «σύμπλεγμα έναρξης». Το σύμπλεγμα έναρξης περιλαμβάνει: mRNA; μικρή ριβοσωμική υπομονάδα. αμινοακυλο-tRNA που φέρει ένα αμινοξύ εκκινητή. παράγοντες έναρξης· πολλά μόρια GTP (τριφωσφορική γουανοσίνη).
Στο ριβόσωμα, η ροή των πληροφοριών συγχωνεύεται με τη ροή των αμινοξέων. Η είσοδος του αμινοακυλ-tRNA στο κέντρο Α της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας είναι συνέπεια της αναγνώρισης και το αντικωδικόνιό του αλληλεπιδρά με το κωδικόνιο του mRNA που βρίσκεται στη μικρή ριβοσωμική υπομονάδα. Όταν το mRNA μετακινεί ένα κωδικόνιο, το tRNA μεταφέρεται στο πεπτιδυλικό κέντρο (κέντρο P) και το αμινοξύ του ενώνεται με το αμινοξύ εκκινητή για να σχηματίσει τον πρώτο πεπτιδικό δεσμό. Το tRNA χωρίς αμινοξέα φεύγει από το ριβόσωμα και μπορεί και πάλι να λειτουργήσει στη μεταφορά συγκεκριμένων αμινοξέων. Στη θέση του, ένα νέο tRNA μεταφέρεται από το κέντρο Α στο κέντρο P και σχηματίζεται ένας νέος πεπτιδικός δεσμός. Ένα κενό κωδικόνιο mRNA εμφανίζεται στο κέντρο Α, στο οποίο ενώνεται αμέσως το αντίστοιχο tRNA και νέα αμινοξέα προστίθενται στην αναπτυσσόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα.
Η επιμήκυνση μετάφρασης είναι η διαδικασία επιμήκυνσης, αύξησης της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, με βάση την προσθήκη νέων αμινοξέων χρησιμοποιώντας έναν πεπτιδικό δεσμό. Ο κλώνος mRNA τραβιέται συνεχώς μέσα από το ριβόσωμα και οι γενετικές πληροφορίες που περιέχονται σε αυτό «αποκωδικοποιούνται». Συχνά, το mRNA λειτουργεί ταυτόχρονα σε πολλά ριβοσώματα, καθένα από τα οποία συνθέτει τον ίδιο πολυπεπτιδικό κλώνο που κωδικοποιείται από αυτό το mRNA.
Ο τερματισμός της μετάφρασης συμβαίνει τη στιγμή που το ριβόσωμα φτάνει στο κωδικόνιο τερματισμού στο mRNA (UAA, UGA, UAG). Η μετάφραση σταματά και η πολυπεπτιδική αλυσίδα απελευθερώνεται από το πολυριβόσωμα. Μετά το τέλος της μετάφρασης, τα πολυριβοσώματα διασπώνται σε υπομονάδες, οι οποίες μπορούν να γίνουν μέρος νέων πολυριβοσωμάτων.
Κάθε RNA λειτουργεί σε πολλά ριβοσώματα. Μια ομάδα ριβοσωμάτων που λειτουργούν σε ένα μόνο μόριο mRNA ονομάζεται πολυριβόσωμα ή πολυσωμάτιο. Τα πολυσώματα μπορεί να αποτελούνται από 4-6 έως 20 ή περισσότερα ριβοσώματα.
Τα ειδικά για ιούς πολυσώματα μπορεί να είναι είτε ελεύθερα είτε συνδεδεμένα με μεμβράνη. Οι εσωτερικές πρωτεΐνες συντίθενται συνήθως σε ελεύθερα πολυσώματα.
Δεδομένου ότι το γονιδίωμα ενός ζωικού ιού αντιπροσωπεύεται από ένα μόριο που κωδικοποιεί περισσότερες από μία πρωτεΐνες, οι ιοί αντιμετωπίζουν την ανάγκη να συνθέσουν είτε ένα μακρύ mRNA που κωδικοποιεί ένα γιγαντιαίο πρόδρομο πολυπεπτίδιο, το οποίο στη συνέχεια πρέπει να κοπεί σε συγκεκριμένα σημεία σε λειτουργικά ενεργές πρωτεΐνες, ή βραχέα μονοκιστρονικά mRNA, καθένα από τα οποία κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη. Έτσι, υπάρχουν δύο τρόποι σχηματισμού ιικών πρωτεϊνών:
το πρώτο - το mRNA μεταφράζεται σε ένα γιγάντιο πρόδρομο πολυπεπτίδιο, το οποίο, μετά τη σύνθεση, κόβεται διαδοχικά σε ώριμες λειτουργικά ενεργές πρωτεΐνες.
Δεύτερον, το mRNA μεταφράζεται για να σχηματίσει ώριμες πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες που τροποποιούνται ελαφρώς μόνο μετά τη σύνθεση.
Η πρώτη μέθοδος μετάφρασης είναι χαρακτηριστική των ιών συν-κλώνου που περιέχουν RNA - picornaviruses και togaviruses. Το mRNA τους μεταφράζεται σε μια γιγάντια πολυπεπτιδική αλυσίδα, τη λεγόμενη πολυπρωτεΐνη, η οποία γλιστράει με τη μορφή συνεχούς ταινίας από τον ριβοσωμικό «μεταφορέα» και κόβεται σε μεμονωμένες πρωτεΐνες του απαιτούμενου μεγέθους. Η κοπή ιικών πρωτεϊνών είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων που πραγματοποιείται τόσο από ειδικές για τον ιό όσο και από κυτταρικές πρωτεάσες.
Η δεύτερη μέθοδος σχηματισμού πρωτεΐνης είναι χαρακτηριστική των ιών που περιέχουν DNA και των περισσότερων ιών που περιέχουν RNA. Με αυτή τη μέθοδο συντίθενται βραχέα μονοκιστρονικά mRNA ως αποτέλεσμα επιλεκτικής μεταγραφής μιας περιοχής του γονιδιώματος (γονιδίου). Ωστόσο, αυτοί οι ιοί κάνουν εκτεταμένη χρήση του μετα-μεταφραστικού μηχανισμού κοπής πρωτεϊνών.
Σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο, πολλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των ιικών, υφίστανται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, οι ώριμες, λειτουργικά ενεργές πρωτεΐνες συχνά δεν είναι πανομοιότυπες με τις νεοσυντιθέμενες πρόδρομές τους ουσίες. Οι ευρέως διαδεδομένες μετα-μεταφραστικές ομοιοπολικές τροποποιήσεις περιλαμβάνουν γλυκοζυλίωση, ακυλίωση, μεθυλίωση, σουλφονίωση (σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών), πρωτεολυτική κοπή και, τέλος, φωσφορυλίωση. Ως αποτέλεσμα, αντί για 20 γενετικά κωδικοποιημένα αμινοξέα, απομονώθηκαν περίπου 140 παράγωγα αμινοξέων από διάφορα κύτταρα διαφορετικών οργάνων ευκαρυωτών.
Γλυκοζυλίωση. Οι σύνθετοι ιοί που περιέχουν RNA και DNA περιέχουν πρωτεΐνες που περιέχουν ομοιοπολικά συνδεδεμένες πλευρικές αλυσίδες υδατανθράκων - γλυκοπρωτεΐνες. Οι γλυκοπρωτεΐνες βρίσκονται μέσα σε ιικούς φακέλους και βρίσκονται στην επιφάνεια των ιικών σωματιδίων.
Η γλυκοζυλίωση των πολυπεπτιδίων είναι μια πολύπλοκη διαδικασία πολλαπλών σταδίων, τα πρώτα στάδια της οποίας ξεκινούν ήδη στη διαδικασία της σύνθεσης πολυπεπτιδίων και το πρώτο υπόλειμμα υδατάνθρακα προστίθεται στην πολυπεπτιδική αλυσίδα που δεν έχει φύγει ακόμη από το ριβόσωμα. Τα επόμενα στάδια γλυκοζυλίωσης συμβαίνουν με διαδοχική προσθήκη υπολειμμάτων υδατανθράκων στην υδατανθρακική αλυσίδα κατά τη μεταφορά του πολυπεπτιδίου στην πλασματική μεμβράνη. Τα υπολείμματα υδατανθράκων προστίθενται ένα κάθε φορά και μόνο όταν ξεκινήσει η σύνθεση της ολιγοσακχαριδικής αλυσίδας μεταφέρεται το «μπλοκ». Ο τελικός σχηματισμός της υδατανθρακικής αλυσίδας μπορεί να ολοκληρωθεί στην πλασματική μεμβράνη πριν από τη συναρμολόγηση του ιικού σωματιδίου.
Επιπλέον, η γλυκοζυλίωση επηρεάζει τη μεταφορά, η μεταφορά είναι άρρηκτα συνδεδεμένη για τις γλυκοπρωτεΐνες με τη σταδιακή γλυκοζυλίωση. Μια πειστική απόδειξη αυτού είναι η επίδραση των αναστολέων γλυκοζυλίωσης στην αναπαραγωγή του ιού. καταστέλλουν πλήρως τη μεταφορά πολυπεπτιδίων χωρίς να διακόπτουν ή να αναστέλλουν τη σύνθεσή τους.
Όταν η γλυκοζυλίωση καταστέλλεται από κατάλληλους αναστολείς (αναλόγια σακχάρου όπως η 2-δεοξυγλυκόζη, το αντιβιοτικό τουνικαμυκίνη), η συγκρότηση ιοσωμάτων μυξο-, ραβδο- και α-ιών μπλοκάρεται ή σχηματίζονται μη μολυσματικά ιοσωμάτια των ιών του έρπη και των ογκοϊών .
Σουλφονίωση. Ορισμένες πρωτεΐνες σύνθετων ιών RNA και DNA σουλφονώνονται μετά τη μετάφραση. Τις περισσότερες φορές, οι γλυκοπρωτεΐνες υφίστανται σουλφόνωση και η θειική ομάδα συνδέεται με τα υπολείμματα υδατανθράκων της γλυκοπρωτεΐνης.
Ακυλίωση. Ένας αριθμός γλυκοπρωτεϊνών ιών που περιέχουν σύνθετα RNA (HA2 του ιού της γρίπης, πρωτεΐνη G του ιού της φυσαλιδώδους στοματίτιδας, πρωτεΐνη HN του ιού της νόσου Newcastle, κ.λπ.) περιέχουν ομοιοπολικά συνδεδεμένα 1-2 μόρια λιπαρών οξέων.
Τομή. Πολλές ιικές πρωτεΐνες, και κυρίως γλυκοπρωτεΐνες, αποκτούν λειτουργική δράση μόνο αφού κοπούν σε συγκεκριμένα σημεία από πρωτεολυτικά ένζυμα. Η κοπή συμβαίνει είτε με το σχηματισμό δύο λειτουργικών πρωτεϊνικών υπομονάδων (για παράδειγμα, της μεγάλης και της μικρής υπομονάδας της αιμοσυγκολλητίνης του ιού της γρίπης, δύο γλυκοπρωτεϊνών (Ε2 και Ε3) του ιού Semliki Forest), είτε με το σχηματισμό μιας λειτουργικά ενεργής πρωτεΐνης και ένα ανενεργό ένζυμο, για παράδειγμα, οι πρωτεΐνες F και HN των παραμυξοϊών. Ο τεμαχισμός γίνεται συνήθως από κυτταρικά ένζυμα. Σε πολλούς σύνθετους ζωικούς ιούς που έχουν γλυκοπρωτεΐνες, η κοπή είναι απαραίτητη για το σχηματισμό ενεργών πρωτεϊνών προσκόλλησης και πρωτεϊνών σύντηξης και, επομένως, για να αποκτήσουν οι ιοί την ικανότητα να μολύνουν ένα κύτταρο. Μόνο μετά την αποκοπή αυτών των πρωτεϊνών γίνεται μολυσματικό το σωματίδιο του ιού. Έτσι, μπορούμε να μιλήσουμε για την πρωτεολυτική ενεργοποίηση ενός αριθμού ιών, που πραγματοποιείται με τη χρήση κυτταρικών ενζύμων.
Φωσφορυλίωση. Οι φωσφοπρωτεΐνες περιέχονται σχεδόν σε όλους τους ζωικούς ιούς - RNA - και σε αυτούς που περιέχουν DNA, απλούς και πολύπλοκους στη δομή. Οι πρωτεϊνικές κινάσες βρίσκονται στους περισσότερους ιούς, αλλά η φωσφορυλίωση μπορεί να πραγματοποιηθεί τόσο από ιικά όσο και από κυτταρικά ένζυμα. Τυπικά, οι πρωτεΐνες που σχετίζονται με το γονιδίωμα του ιού και παίζουν ρυθμιστικό ρόλο στην έκφρασή του φωσφορυλιώνονται. Ο μηχανισμός ενεργού δράσης της ιντερφερόνης σχετίζεται με τη διαδικασία της φωσφορυλίωσης.
III. Αντιγραφή.
Η αντιγραφή είναι η σύνθεση μορίων νουκλεϊκού οξέος ομόλογων με το γονιδίωμα. Ο αναδιπλασιασμός του DNA συμβαίνει στο κύτταρο, με αποτέλεσμα το σχηματισμό θυγατρικού δίκλωνου DNA. Ο αναδιπλασιασμός λαμβάνει χώρα σε μη στριμμένα τμήματα του DNA και συμβαίνει ταυτόχρονα και στους δύο κλώνους από το άκρο 5' έως το άκρο 3'.
Επειδή οι δύο κλώνοι του DNA έχουν αντίθετες πολικότητες και η θέση αντιγραφής (το πιρούνι) κινείται προς την ίδια κατεύθυνση, ο ένας κλώνος κατασκευάζεται προς την αντίθετη κατεύθυνση σε χωριστά θραύσματα που ονομάζονται θραύσματα Okazaki (που πήρε το όνομά του από τον επιστήμονα που πρότεινε πρώτος αυτό το μοντέλο). Μετά τη σύνθεση, τα θραύσματα Okazaki "διασταυρώνονται" σε ένα μόνο κλώνο με λιγάση.
Η αντιγραφή του DNA πραγματοποιείται με πολυμεράσες DNA. Για να ξεκινήσει η αντιγραφή, είναι απαραίτητη η προκαταρκτική σύνθεση ενός μικρού τμήματος RNA σε ένα πρότυπο DNA, που ονομάζεται εκκινητής. Η σύνθεση του κλώνου DNA ξεκινά με τον εκκινητή, μετά τον οποίο το RNA απομακρύνεται γρήγορα από την περιοχή ανάπτυξης.
Αντιγραφή ιικού DNA. Η αντιγραφή του γονιδιώματος των ιών που περιέχουν DNA καταλύεται κυρίως από κυτταρικά θραύσματα και ο μηχανισμός του είναι παρόμοιος με τον μηχανισμό αντιγραφής του κυτταρικού DNA.
Κάθε νεοσυντιθέμενο μόριο DNA αποτελείται από έναν γονέα και έναν νεοσυντιθέμενο κλώνο. Αυτός ο μηχανισμός αντιγραφής ονομάζεται ημι-συντηρητικός.
Σε ιούς που περιέχουν κυκλικό δίκλωνο DNA (papovaviruses), κόβεται ένας από τους κλώνους του DNA, γεγονός που οδηγεί σε ξετύλιγμα και αφαίρεση υπερπηνίων σε ένα συγκεκριμένο τμήμα του μορίου.
Το κατώτερο υπερτυλιγμένο τμήμα του μορίου, το μη στριμμένο τμήμα σε μια μεγάλη περιοχή και οι νεοσχηματισμένοι βρόχοι αντιγραφής είναι ορατά.
Κατά την αντιγραφή του μονόκλωνου DNA (οικογένεια παρβοϊών), σχηματίζονται δίκλωνες μορφές, οι οποίες είναι ενδιάμεσες αντιγραφικές μορφές.
Αντιγραφικά συμπλέγματα. Δεδομένου ότι οι προκύπτοντες κλώνοι DNA και RNA παραμένουν συνδεδεμένοι με τη μήτρα για κάποιο χρονικό διάστημα, σχηματίζονται αντιγραφικά σύμπλοκα στο μολυσμένο κύτταρο, στα οποία πραγματοποιείται ολόκληρη η διαδικασία αντιγραφής (και σε ορισμένες περιπτώσεις επίσης η μεταγραφή) του γονιδιώματος. Το αντιγραφικό σύμπλεγμα περιέχει το γονιδίωμα, το ρεπλικάση και τις πρόσφατα συντιθέμενες αλυσίδες νουκλεϊκού οξέος που σχετίζονται με το εκμαγείο. Τα πρόσφατα συντιθέμενα γονιδιωματικά μόρια συνδέονται αμέσως με ιικές πρωτεΐνες, έτσι τα αντιγόνα βρίσκονται σε σύμπλοκα αντιγραφής. Κατά τη διαδικασία αντιγραφής, εμφανίζεται μια μερικώς δίκλωνη δομή με μονόκλωνες «ουρές», ο λεγόμενος αντιγραφικός πρόδρομος.
Τα σύμπλοκα αντιγραφής συνδέονται με κυτταρικές δομές, είτε προϋπάρχουσες είτε επαγόμενες από ιούς. Για παράδειγμα, τα αντιγραφικά σύμπλοκα των picornaviruses συνδέονται με τις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου, των ιών της ευλογιάς - με την κυτταροπλασματική μήτρα, τα αναπαραγόμενα σύμπλοκα των αδενοϊών και των ιών του έρπη στους πυρήνες συνδέονται με νεοσχηματισμένες ινώδεις δομές και σχετίζονται με πυρηνικές μεμβράνες. Σε μολυσμένα κύτταρα, μπορεί να υπάρξει αυξημένος πολλαπλασιασμός κυτταρικών δομών με τις οποίες συνδέονται τα σύμπλοκα αντιγραφής ή ο σχηματισμός τους από προϋπάρχον υλικό. Για παράδειγμα, σε κύτταρα μολυσμένα με πικορναϊούς, εμφανίζεται πολλαπλασιασμός λείων μεμβρανών. Σε κύτταρα μολυσμένα με ρεοϊούς, παρατηρείται συσσώρευση μικροσωληνίσκων. Σε κύτταρα μολυσμένα με ιούς ευλογιάς, εμφανίζεται ο σχηματισμός κυτταροπλασματικής μήτρας.
Στα σύμπλοκα αντιγραφής, ταυτόχρονα με τη σύνθεση γονιδιωματικών μορίων, λαμβάνει χώρα μεταγραφή και συναρμολόγηση νουκλεοκαψιδίων και πυρήνων, και σε ορισμένες λοιμώξεις, ιικά σωματίδια.
Ρύθμιση αντιγραφής. Το νεοσχηματισμένο μόριο γονιδιωματικού RNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί με διάφορους τρόπους. Μπορεί να συσχετιστεί με πρωτεΐνες καψιδίου και να γίνει μέρος του ιού, να χρησιμεύσει ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων γονιδιωματικών μορίων ή για το σχηματισμό mRNA, τέλος, σε ιούς «συν» κλώνου μπορεί να εκτελέσει τις λειτουργίες του mRNA και να συνδεθεί στα ριβοσώματα. Υπάρχουν μηχανισμοί στο κύτταρο που ρυθμίζουν τη χρήση των γονιδιωματικών μορίων. Η ρύθμιση ακολουθεί την αρχή της αυτορρύθμισης και πραγματοποιείται μέσω της αλληλεπίδρασης ιικού RNA και πρωτεϊνών λόγω της δυνατότητας αναγνώρισης πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος και πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Για παράδειγμα, ο ρόλος της τερματικής πρωτεΐνης των picornaviruses είναι να αναστέλλει τη μετάφραση του mRNA και να επιλέγει μόρια για το σχηματισμό ιοσωμάτων. Η πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο 5' άκρο του γονιδιωματικού RNA, με τη σειρά της, αναγνωρίζεται από τις πρωτεΐνες καψιδίου και χρησιμεύει ως σήμα για τη συναρμολόγηση του ιικού σωματιδίου με τη συμμετοχή αυτού του μορίου RNA. Χρησιμοποιώντας την ίδια αρχή, τα μόρια γονιδιωματικού RNA επιλέγονται από ιούς μείον κλώνου. Το μόριο RNA είναι μέρος του βιριόντος ή χρησιμεύει ως πρότυπο για αντιγραφή. Για να το αλλάξετε σε μεταγραφή, πρέπει να υπάρξει απαγόρευση αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος. Η αντιγραφή του DNA του αδενοϊού περιλαμβάνει ένα μόριο πρωτεΐνης που δεσμεύεται στο άκρο του ιικού DNA και είναι απαραίτητο για την έναρξη της αντιγραφής. Έτσι, για να ξεκινήσει η αντιγραφή, είναι απαραίτητη η σύνθεση ιικών πρωτεϊνών: παρουσία αναστολέων πρωτεϊνοσύνθεσης, δεν υπάρχει αλλαγή από τη μεταγραφή στην αντιγραφή.
IV. Συναρμολόγηση ιικών σωματιδίων.
Η σύνθεση των συστατικών των ιικών σωματιδίων στο κύτταρο είναι ξεχωριστή και μπορεί να συμβεί σε διαφορετικές δομές του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος. Οι ιοί που αναπαράγονται σε πυρήνες ονομάζονται συμβατικά πυρηνικοί ιοί. Πρόκειται κυρίως για ιούς που περιέχουν DNA: αδενοϊοί, παποϊοί, παρβοϊοί, ιοί έρπητα.
Οι ιοί που αναπαράγονται στο κυτταρόπλασμα ονομάζονται κυτταροπλασματικοί. Αυτά περιλαμβάνουν τον ιό της ευλογιάς που περιέχει DNA και τους περισσότερους ιούς που περιέχουν RNA, με εξαίρεση τους ορθομυξοϊούς και τους ρετροϊούς. Ωστόσο, αυτή η διαίρεση είναι πολύ σχετική, γιατί στην αναπαραγωγή και των δύο ιών υπάρχουν στάδια που συμβαίνουν στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα, αντίστοιχα.
Μέσα στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, μπορεί επίσης να διαχωριστεί η σύνθεση των ειδικών για τον ιό μορίων. Για παράδειγμα, η σύνθεση ορισμένων πρωτεϊνών πραγματοποιείται σε ελεύθερα πολυσώματα, ενώ άλλες συντίθενται σε πολυσώματα που συνδέονται με τη μεμβράνη. Τα ιικά νουκλεϊκά οξέα συντίθενται σε συνδυασμό με κυτταρικές δομές μακριά από τα πολυσώματα που συνθέτουν ιικές πρωτεΐνες. Με αυτή τη διαχωριστική μέθοδο αναπαραγωγής, ο σχηματισμός ενός ιικού σωματιδίου είναι δυνατός μόνο εάν τα ιικά νουκλεϊκά οξέα και οι πρωτεΐνες έχουν την ικανότητα, σε επαρκή συγκέντρωση, να αναγνωρίζουν το ένα το άλλο στην ποικιλία των κυτταρικών πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων και να συνδέονται αυθόρμητα μεταξύ τους. δηλ. έχουν δυνατότητα αυτοσυναρμολόγησης.
Η αυτοσυναρμολόγηση βασίζεται σε ειδική αναγνώριση πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος και πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, η οποία μπορεί να προκύψει ως αποτέλεσμα υδρόφοβων δεσμών, αλάτων και υδρογόνου, καθώς και στερικής αντιστοίχισης. Η αναγνώριση πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος περιορίζεται σε μια μικρή περιοχή του μορίου νουκλεϊκού οξέος και προσδιορίζεται από μοναδικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων στο μη κωδικοποιητικό τμήμα του ιικού γονιδιώματος. Με αυτή την αναγνώριση μιας περιοχής του γονιδιώματος από πρωτεΐνες ιικού καψιδίου, ξεκινά η διαδικασία συναρμολόγησης του ιικού σωματιδίου. Η προσκόλληση άλλων μορίων πρωτεΐνης πραγματοποιείται λόγω ειδικών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή μη ειδικών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-νουκλεϊκού οξέος.
Λόγω της ποικιλομορφίας της δομής των ζωικών ιών, οι μέθοδοι σχηματισμού ιοσωμάτων ποικίλλουν επίσης, αλλά μπορούν να διατυπωθούν οι ακόλουθες γενικές αρχές συναρμολόγησης:
Σε απλούς ιούς, σχηματίζονται προβιρόνια, τα οποία στη συνέχεια μετατρέπονται σε ιοσωμάτια ως αποτέλεσμα τροποποιήσεων πρωτεΐνης. Για πολύπλοκους ιούς, η συναρμολόγηση πραγματοποιείται σε πολλαπλά στάδια. Πρώτον, σχηματίζονται νουκλεοκαψίδια ή πυρήνες, με τους οποίους αλληλεπιδρούν οι πρωτεΐνες του εξωτερικού κελύφους.
Η συναρμολόγηση πολύπλοκων ιών (με εξαίρεση τη συναρμολόγηση ιών ευλογιάς και ρεοϊών) πραγματοποιείται σε κυτταρικές μεμβράνες. Η συναρμολόγηση πυρηνικών ιών συμβαίνει με τη συμμετοχή πυρηνικών μεμβρανών, η συναρμολόγηση κυτταροπλασματικών ιών - με τη συμμετοχή των μεμβρανών του ενδοπλασματικού δικτύου ή της μεμβράνης πλάσματος, όπου όλα τα συστατικά του ιικού σωματιδίου φτάνουν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο.
Ένας αριθμός πολύπλοκων ιών έχουν ειδικές υδρόφοβες πρωτεΐνες που δρουν ως ενδιάμεσοι μεταξύ των σχηματισμένων νουκλεοκαψιδίων και των ιικών περιβλημάτων. Τέτοιες πρωτεΐνες είναι πρωτεΐνες μήτρας σε έναν αριθμό ιών μείον κλώνων (ορθομυξοϊοί, παραμυξοϊοί, ραβδοϊοί).
Η συγκρότηση νουκλεοκαψιδίων, πυρήνων, προβιριονίων και βιριόντων δεν συμβαίνει στο ενδοκυτταρικό υγρό, αλλά σε προϋπάρχουσες στο κύτταρο ή επαγόμενες από τον ιό («εργοστάσια»).
Οι σύνθετοι ιοί χρησιμοποιούν έναν αριθμό στοιχείων του κυττάρου ξενιστή για να χτίσουν τα σωματίδια τους, για παράδειγμα λιπίδια, μερικά ένζυμα, ιστόνες στο DNA γονιδιωματικό 5V40, ακτίνη σε γονιδιωματικούς ιούς με περίβλημα RNA και ακόμη και ριβοσώματα βρίσκονται σε αρενοϊούς. Τα κυτταρικά μόρια έχουν ορισμένες λειτουργίες στο ιικό σωματίδιο, αλλά η συμπερίληψή τους στο ιοσωμάτιο μπορεί επίσης να είναι συνέπεια τυχαίας μόλυνσης, όπως η συμπερίληψη ενός αριθμού ενζύμων κυτταρικής μεμβράνης ή κυτταρικών νουκλεϊκών οξέων.
Συναρμολόγηση ιών DNA. Υπάρχουν κάποιες διαφορές στη συναρμολόγηση των ιών DNA από τη συναρμολόγηση των ιών RNA. Όπως οι ιοί που περιέχουν RNA, η συναρμολόγηση των ιών που περιέχουν DNA είναι μια διαδικασία πολλαπλών σταδίων με το σχηματισμό ενδιάμεσων μορφών που διαφέρουν από τα ώριμα ιοσωμάτια στη σύνθεση των πολυπεπτιδίων. Το πρώτο στάδιο συναρμολόγησης περιλαμβάνει τη σύνδεση του DNA με εσωτερικές πρωτεΐνες και το σχηματισμό πυρήνων ή νουκλεοκαψιδίων. Σε αυτή την περίπτωση, το DNA συνδυάζεται με προσχηματισμένα «κενά» καψίδια.
Ως αποτέλεσμα της σύνδεσης του DNA με τα καψίδια, εμφανίζεται μια νέα κατηγορία ενδιάμεσων μορφών, που ονομάζονται ελλιπείς μορφές. Εκτός από τις ημιτελείς μορφές με διαφορετική περιεκτικότητα σε DNA, υπάρχει μια άλλη ενδιάμεση μορφή στη μορφογένεση - τα ανώριμα ιοσωμάτια, τα οποία διαφέρουν από τα ώριμα στο ότι περιέχουν μη κομμένα πολυπεπτιδικά πρόδρομα. Έτσι, η μορφογένεση των ιών σχετίζεται στενά με την τροποποίηση (επεξεργασία) των πρωτεϊνών.
Η συναρμολόγηση των πυρηνικών ιών ξεκινά στον πυρήνα, συνήθως σε συνδυασμό με την πυρηνική μεμβράνη. Οι ενδιάμεσες μορφές του ιού του έρπητα που σχηματίζονται στο μπουμπούκι του πυρήνα στον περιπυρηνικό χώρο μέσω της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης και έτσι ο ιός αποκτά ένα περίβλημα, το οποίο είναι παράγωγο της πυρηνικής μεμβράνης. Περαιτέρω ολοκλήρωση και ωρίμανση ιοσωμάτων συμβαίνει στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου και στη συσκευή Golgi, από όπου ο ιός μεταφέρεται ως μέρος των κυτταροπλασματικών κυστιδίων στην κυτταρική επιφάνεια.
Σε μη εκκολαπτόμενους ιούς που περιέχουν λιπίδια - ιούς ευλογιάς, η συναρμολόγηση ιοσωμάτων λαμβάνει χώρα στα ήδη περιγραφέντα κυτταροπλασματικά ιικά «εργοστάσια». Το λιπιδικό περίβλημα των ιών στα «εργοστάσια» σχηματίζεται από κυτταρικά λιπίδια με αυτόνομη αυτοσυναρμολόγηση, επομένως η λιπιδική σύνθεση των φακέλων διαφέρει σημαντικά από τη σύνθεση των λιπιδίων στις κυτταρικές μεμβράνες.
V. Έξοδος ιικών σωματιδίων από το κύτταρο.
Υπάρχουν δύο τρόποι για να βγουν οι απόγονοι του ιού από το κύτταρο:
1) με "έκρηξη"
2) με εκβλάστηση.
Η έξοδος από το κύτταρο με έκρηξη συνδέεται με την καταστροφή του κυττάρου, παραβίαση της ακεραιότητάς του, με αποτέλεσμα τα ώριμα ιικά σωματίδια που βρίσκονται μέσα στο κύτταρο να καταλήγουν στο περιβάλλον. Αυτή η μέθοδος εξόδου από το κύτταρο είναι χαρακτηριστική για ιούς που δεν περιέχουν κέλυφος λιποπρωτεϊνών (picorna-, rheo-, parvo-, papova-, αδενοϊοί). Ωστόσο, ορισμένοι από αυτούς τους ιούς μπορούν να μεταφερθούν στην επιφάνεια του κυττάρου πριν από το θάνατο του κυττάρου. Η έξοδος από τα κύτταρα με εκβλάστηση είναι χαρακτηριστική των ιών που περιέχουν μια μεμβράνη λιποπρωτεΐνης, η οποία είναι παράγωγο των κυτταρικών μεμβρανών. Με αυτή τη μέθοδο, το κύτταρο μπορεί να παραμείνει βιώσιμο για μεγάλο χρονικό διάστημα και να παράγει ιούς απογόνους μέχρι να εξαντληθούν πλήρως οι πόροι του.
Η διαδικασία αναπαραγωγής του ιού μπορεί να χωριστεί σε 2 φάσεις . Η πρώτη φάση περιλαμβάνει 3 στάδια: 1) προσρόφηση του ιού σε ευαίσθητα κύτταρα. 2) διείσδυση του ιού στο κύτταρο. 3) αποπρωτεϊνοποίηση του ιού . Η δεύτερη φάση περιλαμβάνει τα στάδια υλοποίησης του ιικού γονιδιώματος: 1) μεταγραφή, 2) μετάφραση, 3) αντιγραφή, 4) συναρμολόγηση, ωρίμανση ιικών σωματιδίων και 5) έξοδος ιού από το κύτταρο.
Η αλληλεπίδραση ενός ιού με ένα κύτταρο ξεκινά με τη διαδικασία προσρόφησης, δηλαδή με την προσκόλληση του ιού στην κυτταρική επιφάνεια.
Προσρόφησηείναι μια ειδική δέσμευση της πρωτεΐνης ιοσωματίου (αντιυποδοχέας) στη συμπληρωματική δομή της κυτταρικής επιφάνειας - τον κυτταρικό υποδοχέα. Σύμφωνα με τη χημική τους φύση, οι υποδοχείς στους οποίους στερεώνονται οι ιοί ανήκουν σε δύο ομάδες: τη βλεννοπρωτεΐνη και τη λιποπρωτεΐνη. Οι ιοί της γρίπης, η παραγρίππη και οι αδενοϊοί στερεώνονται σε υποδοχείς βλεννοπρωτεϊνών. Εντεροϊοί, ιοί έρπητα, αρβοϊοί προσροφούνται στους υποδοχείς λιποπρωτεϊνών του κυττάρου. Η προσρόφηση λαμβάνει χώρα μόνο παρουσία ορισμένων ηλεκτρολυτών, ιδιαίτερα ιόντων Ca2+, τα οποία εξουδετερώνουν τα υπερβολικά ανιονικά φορτία του ιού και της κυτταρικής επιφάνειας και μειώνουν την ηλεκτροστατική απώθηση. Η προσρόφηση των ιών δεν εξαρτάται από τη θερμοκρασία το αποτέλεσμα της ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης θετικά και αρνητικά φορτισμένων δομών στον επιφανειακό ιό και το κύτταρο, και στη συνέχεια εμφανίζεται μια ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης προσκόλλησης ιοσωμάτων και συγκεκριμένων ομάδων στη πλασματική μεμβράνη του κυττάρου. Οι απλοί ανθρώπινοι και ζωικοί ιοί περιέχουν πρωτεΐνες προσκόλλησης ως μέρος του καψιδίου. Σε σύνθετους ιούς, οι πρωτεΐνες προσκόλλησης αποτελούν μέρος του υπερκαψιδίου. Μπορούν να έχουν τη μορφή νηματίων (ίνες σε αδενοϊούς) ή αιχμές, δομές που μοιάζουν με μανιτάρια σε μυξο-, ρετρό-, ραβδο- και άλλους ιούς. Αρχικά, λαμβάνει χώρα μια μοναδική σύνδεση του ιού με τον υποδοχέα - μια τέτοια προσκόλληση είναι εύθραυστη - η προσρόφηση είναι αναστρέψιμη. Για να συμβεί μη αναστρέψιμη προσρόφηση, πρέπει να εμφανιστούν πολλαπλές συνδέσεις μεταξύ του ιικού υποδοχέα και του κυτταρικού υποδοχέα, δηλαδή, σταθερή πολυσθενής προσκόλληση. Ο αριθμός των ειδικών υποδοχέων στην επιφάνεια ενός κυττάρου είναι 10 4 - 10 5. Υποδοχείς για ορισμένους ιούς, για παράδειγμα, αρβοϊούς. περιέχονται στα κύτταρα τόσο των σπονδυλωτών όσο και των ασπόνδυλων για άλλους ιούς μόνο στα κύτταρα ενός ή περισσότερων ειδών.
Η διείσδυση των ανθρώπινων και ζωικών ιών στα κύτταρα γίνεται με δύο τρόπους: 1) ιορόπεξις (πινοκυττάρωση). 2) σύντηξη του ιικού κελύφους υπερκαψιδίου με την κυτταρική μεμβράνη. Οι βακτηριοφάγοι έχουν τον δικό τους μηχανισμό διείσδυσης, τη λεγόμενη σύριγγα, όταν, ως αποτέλεσμα της συστολής του πρωτεϊνικού προσαρτήματος του φάγου, το νουκλεϊκό οξύ εγχέεται στο κύτταρο.
Η αποπρωτεϊνοποίηση του ιού, η απελευθέρωση της ιικής αιμομής από τα προστατευτικά κελύφη του ιού συμβαίνει είτε με τη βοήθεια ιικών ενζύμων είτε με τη βοήθεια κυτταρικών ενζύμων. Τα τελικά προϊόντα της αποπρωτεϊνοποίησης είναι νουκλεϊκά οξέα ή νουκλεϊκά οξέα που σχετίζονται με την εσωτερική ιική πρωτεΐνη. Στη συνέχεια λαμβάνει χώρα η δεύτερη φάση αναπαραγωγής του ιού, που οδηγεί στη σύνθεση ιικών συστατικών.
Η μεταγραφή είναι η επανεγγραφή πληροφοριών από DNA ή RNA ενός ιού σε mRNA σύμφωνα με τους νόμους του γενετικού κώδικα.
Η μετάφραση είναι η διαδικασία μετάφρασης γενετικών πληροφοριών που περιέχονται στο mRNA σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία αμινοξέων.
Η αντιγραφή είναι η διαδικασία σύνθεσης μορίων νουκλεϊκού οξέος ομόλογων με το γονιδίωμα του ιού.
Η εφαρμογή της γενετικής πληροφορίας σε ιούς που περιέχουν DNA είναι η ίδια όπως και στα κύτταρα:
Μεταγραφή DNA πρωτεΐνη μετάφρασης i-RNA
Μεταγραφή RNA πρωτεΐνη μετάφρασης i-RNA
Οι ιοί με θετικό γονιδίωμα RNA (τογαϊοί, πικορναϊοί) στερούνται μεταγραφής:
πρωτεΐνη μετάφρασης RNA
Οι ρετροϊοί έχουν έναν μοναδικό τρόπο μετάδοσης γενετικών πληροφοριών:
Αντίστροφη μεταγραφή RNA Μεταγραφή DNA πρωτεΐνη μετάφρασης mRNA
Το DNA ενσωματώνεται με το γονιδίωμα του κυττάρου ξενιστή (προϊός).
Αφού το κύτταρο έχει συσσωρεύσει ιικά συστατικά, ξεκινά το τελευταίο στάδιο αναπαραγωγής του ιού: η συναρμολόγηση των ιικών σωματιδίων και η απελευθέρωση ιοσωμάτων από το κύτταρο. Τα ιοσωμάτια εξέρχονται από το κύτταρο με δύο τρόπους: 1) «εκραγώντας» το κύτταρο, με αποτέλεσμα το κύτταρο να καταστραφεί. Αυτή η διαδρομή είναι εγγενής σε απλούς ιούς (picorna-, reo-, papova- και αδενοϊούς), 2) που εξέρχονται από τα κύτταρα με εκβλάστηση. Είναι εγγενές σε ιούς που περιέχουν ένα υπερκαψίδιο. Με αυτή τη μέθοδο, το κύτταρο δεν πεθαίνει αμέσως και μπορεί να παράγει πολλαπλούς ιικούς απογόνους μέχρι να εξαντληθούν οι πόροι του.
Μέθοδοι καλλιέργειας ιών
Για την καλλιέργεια ιών σε εργαστηριακές συνθήκες, χρησιμοποιούνται τα ακόλουθα ζωντανά αντικείμενα: 1) κυτταροκαλλιέργειες (ιστοί, όργανα). 2) έμβρυα κοτόπουλου? 3) πειραματόζωα.
Κυτταρικής καλλιέργειας
Οι πιο συνηθισμένες είναι μονοστρωματικές κυτταρικές καλλιέργειες, οι οποίες μπορούν να χωριστούν σε 1) πρωτογενείς (κυρίως θρυψινοποιημένες), 2) ημισυνεχείς (διπλοειδείς) και 3) συνεχείς.
Από καταγωγήταξινομούνται σε εμβρυϊκούς, όγκους και από ενήλικους οργανισμούς. με μορφογένεση- ινοβλαστική, επιθηλιακή κ.λπ.
Πρωταρχικός Οι κυτταρικές καλλιέργειες είναι κύτταρα οποιουδήποτε ανθρώπινου ή ζωικού ιστού που έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται με τη μορφή μονοστοιβάδας σε πλαστική ή γυάλινη επιφάνεια επικαλυμμένη με ειδικό θρεπτικό μέσο. Η διάρκεια ζωής τέτοιων καλλιεργειών είναι περιορισμένη. Σε κάθε συγκεκριμένη περίπτωση λαμβάνονται από τον ιστό μετά από μηχανική άλεση, επεξεργασία με πρωτεολυτικά ένζυμα και τυποποίηση του αριθμού των κυττάρων. Πρωτογενείς καλλιέργειες που λαμβάνονται από νεφρούς πιθήκου, ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρά, ανθρώπινο αμνίον και έμβρυα κοτόπουλου χρησιμοποιούνται ευρέως για την απομόνωση και τη συσσώρευση ιών, καθώς και για την παραγωγή ιικών εμβολίων.
Ημιδερμάτινο (ή διπλοειδής ) κυτταροκαλλιέργειες - κύτταρα ίδιου τύπου, ικανά να αντέχουν έως και 50-100 διελεύσεις in vitro, διατηρώντας παράλληλα το αρχικό διπλοειδές σύνολο χρωμοσωμάτων τους. Διπλοειδή στελέχη ανθρώπινων εμβρυϊκών ινοβλαστών χρησιμοποιούνται τόσο για τη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων όσο και για την παραγωγή ιικών εμβολίων.
Συνεχής Οι κυτταρικές σειρές χαρακτηρίζονται από πιθανή αθανασία και ετεροπλοειδή καρυότυπο.
Η πηγή των μεταμοσχεύσιμων γραμμών μπορεί να είναι πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες (για παράδειγμα, SOC, PES, BHK-21 - από τα νεφρά συριακών χάμστερ μιας ημέρας· PMS - από το νεφρό ενός ινδικού χοιριδίου, κ.λπ.) μεμονωμένα κύτταρα που δείχνουν τάση για ατελείωτη αναπαραγωγή in vitro. Το σύνολο των αλλαγών που οδηγούν στην εμφάνιση τέτοιων χαρακτηριστικών από τα κύτταρα ονομάζεται μετασχηματισμός και τα κύτταρα συνεχών καλλιεργειών ιστού ονομάζονται μετασχηματισμένα.
Μια άλλη πηγή μεταμοσχεύσιμων κυτταρικών σειρών είναι τα κακοήθη νεοπλάσματα. Σε αυτή την περίπτωση, ο κυτταρικός μετασχηματισμός συμβαίνει in vivo. Οι ακόλουθες σειρές μεταμοσχευμένων κυττάρων χρησιμοποιούνται συχνότερα στην ιολογική πρακτική: HeLa - προέρχεται από καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας. Ner-2 - από καρκίνωμα του λάρυγγα. Detroit-6 - από μετάσταση καρκίνου του πνεύμονα στον μυελό των οστών. RH - από ανθρώπινο νεφρό.
Για την κυτταρική καλλιέργεια απαιτούνται θρεπτικά μέσα, τα οποία, ανάλογα με τον σκοπό τους, χωρίζονται σε μέσα ανάπτυξης και υποστηρικτικά. Τα μέσα ανάπτυξης πρέπει να περιέχουν περισσότερα θρεπτικά συστατικά για να διασφαλιστεί ο ενεργός πολλαπλασιασμός των κυττάρων για να σχηματιστεί μια μονοστιβάδα. Τα μέσα υποστήριξης θα πρέπει να διασφαλίζουν μόνο ότι τα κύτταρα επιβιώνουν σε μια ήδη σχηματισμένη μονοστιβάδα κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού των ιών στο κύτταρο.
Τα τυπικά συνθετικά μέσα, όπως τα συνθετικά μέσα 199 και τα μέσα Eagle, χρησιμοποιούνται ευρέως. Ανεξάρτητα από το σκοπό, όλα τα μέσα κυτταροκαλλιέργειας παρασκευάζονται χρησιμοποιώντας ένα ισορροπημένο διάλυμα άλατος. Τις περισσότερες φορές είναι λύση Hanks. Αναπόσπαστο συστατικό των περισσότερων μέσων ανάπτυξης είναι ο ορός του ζωικού αίματος (μοσχάρι, βοοειδή, άλογο), χωρίς το 5-10% του οποίου δεν λαμβάνει χώρα αναπαραγωγή και σχηματισμός μονοστοιβάδων. Ο ορός δεν περιλαμβάνεται στα μέσα συντήρησης.
Απομόνωση ιών σε κυτταροκαλλιέργειες και μέθοδοι για την ένδειξη τους.
Κατά την απομόνωση ιών από διάφορα μολυσματικά υλικά από έναν ασθενή (αίμα, ούρα, κόπρανα, βλεννώδεις εκκρίσεις, πλύσεις οργάνων), χρησιμοποιούνται κυτταροκαλλιέργειες που είναι πιο ευαίσθητες στον ύποπτο ιό. Για τη μόλυνση, χρησιμοποιούνται καλλιέργειες σε δοκιμαστικούς σωλήνες με καλά ανεπτυγμένη μονοστοιβάδα κυττάρων. Πριν από τη μόλυνση των κυττάρων, το θρεπτικό μέσο αφαιρείται και 0,1-0,2 ml ενός εναιωρήματος του υλικού δοκιμής, προεπεξεργασμένου με αντιβιοτικά για την καταστροφή βακτηρίων και μυκήτων, προστίθεται σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα. Μετά από 30-60 λεπτά. Μετά την επαφή του ιού με τα κύτταρα, η περίσσεια υλικού αφαιρείται, ένα υποστηρικτικό μέσο προστίθεται στον δοκιμαστικό σωλήνα και αφήνεται σε θερμοστάτη μέχρι να ανιχνευθούν σημάδια αναπαραγωγής του ιού.
Ένας δείκτης της παρουσίας ενός ιού σε μολυσμένες κυτταροκαλλιέργειες μπορεί να είναι:
1) η ανάπτυξη ειδικού εκφυλισμού κυττάρων - το κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα του ιού (CPE), το οποίο έχει τρεις κύριους τύπους: στρογγυλό ή μικροκυτταρικό εκφυλισμό. σχηματισμός πολυπύρηνων γιγαντιαίων κυττάρων - συμπλαστών. ανάπτυξη εστιών κυτταρικού πολλαπλασιασμού, που αποτελούνται από πολλά στρώματα κυττάρων.
2) ανίχνευση ενδοκυτταρικών εγκλεισμάτων που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και τους πυρήνες των προσβεβλημένων κυττάρων.
3) θετική αντίδραση αιμοσυγκόλλησης (RHA).
4) θετική αντίδραση αιμοπροσρόφησης (RHAds).
5) φαινόμενο σχηματισμού πλάκας: μια μονοστιβάδα κυττάρων μολυσμένων από ιό καλύπτεται με ένα λεπτό στρώμα άγαρ με την προσθήκη ενός ουδέτερου κόκκινου δείκτη (φόντο - ροζ). Με την παρουσία ενός ιού, σχηματίζονται άχρωμες ζώνες («πλάκες») στο ροζ υπόβαθρο άγαρ στα κύτταρα.
6) απουσία CPD ή GA, μπορεί να πραγματοποιηθεί μια αντίδραση παρεμβολής: η υπό μελέτη καλλιέργεια επαναμολύνεται με τον ιό που προκαλεί CPD. Σε μια θετική περίπτωση, δεν θα υπάρχει CPP (η αντίδραση παρεμβολής είναι θετική). Εάν δεν υπήρχε ιός στο υλικό δοκιμής, παρατηρείται CPE.
Απομόνωση ιών σε έμβρυα κοτόπουλου.
Για ιολογικές μελέτες χρησιμοποιούνται έμβρυα κοτόπουλου ηλικίας 7-12 ημερών.
Πριν από τη μόλυνση, προσδιορίζεται η βιωσιμότητα του εμβρύου. Κατά τη διάρκεια της ωοσκοπίας, τα ζωντανά έμβρυα είναι κινητά και το αγγειακό σχέδιο είναι καθαρά ορατό. Τα όρια του αερόσακου σημειώνονται με απλό μολύβι. Τα έμβρυα κοτόπουλου μολύνονται υπό άσηπτες συνθήκες, χρησιμοποιώντας αποστειρωμένα εργαλεία, μετά από προεπεξεργασία του κελύφους πάνω από τον εναέριο χώρο με ιώδιο και οινόπνευμα.
Οι μέθοδοι για τη μόλυνση των εμβρύων κοτόπουλου μπορεί να είναι διαφορετικές: εφαρμογή του ιού στη χόριο-αλλαντοϊκή μεμβράνη, στην αμνιακή και αλλαντοϊκή κοιλότητα, στον σάκο του κρόκου. Η επιλογή της μεθόδου μόλυνσης εξαρτάται από τις βιολογικές ιδιότητες του ιού που μελετάται.
Η ένδειξη του ιού σε ένα έμβρυο κοτόπουλου γίνεται με το θάνατο του εμβρύου, μια θετική αντίδραση αιμοσυγκόλλησης σε γυαλί με αλλαντοϊκό ή αμνιακό υγρό και από εστιακές βλάβες («πλάκες») στη χοριο-αλλαντοϊκή μεμβράνη.
III. Απομόνωση ιών σε πειραματόζωα.
Τα εργαστηριακά ζώα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την απομόνωση ιών από μολυσματικό υλικό όταν δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν πιο βολικά συστήματα (κυτταρικές καλλιέργειες ή έμβρυα κοτόπουλου). Παίρνουν κυρίως νεογέννητα λευκά ποντίκια, χάμστερ, ινδικά χοιρίδια και νεογνά αρουραίων. Τα ζώα μολύνονται σύμφωνα με την αρχή του κυτταροτροπισμού του ιού: οι πνευμονότροποι ιοί εγχέονται ενδορινικά, οι νευροτροπικοί ιοί - ενδοεγκεφαλικά, οι δερματοτροπικοί ιοί - στο δέρμα.
Η ένδειξη του ιού βασίζεται στην εμφάνιση σημείων ασθένειας στα ζώα, στο θάνατό τους, σε παθομορφολογικές και παθοϊστολογικές αλλαγές σε ιστούς και όργανα, καθώς και σε θετική αντίδραση αιμοσυγκολίωσης με εκχυλίσματα από όργανα.
Δεν πραγματοποιείται με δυαδική σχάση. Πίσω στη δεκαετία του '50 του περασμένου αιώνα, διαπιστώθηκε ότι η αναπαραγωγή πραγματοποιείται με τη μέθοδο της αναπαραγωγής (μετάφραση από τα αγγλικά αναπαραγωγή - δημιουργία αντιγράφου, αναπαραγωγή), δηλαδή με αναπαραγωγή νουκλεϊκών οξέων, καθώς και πρωτεϊνική σύνθεση με επακόλουθη συλλογή βιριόντων. Αυτές οι διεργασίες συμβαίνουν σε διάφορα μέρη του λεγόμενου κυττάρου ξενιστή (για παράδειγμα, στον πυρήνα ή στο κυτταρόπλασμα). Αυτή η αποσυνδεδεμένη μέθοδος αναπαραγωγής του ιού ονομάζεται διαχωριστική. Σε αυτό ακριβώς θα επικεντρωθούμε αναλυτικότερα στο άρθρο μας.
Διαδικασία αναπαραγωγής
Αυτή η διαδικασία έχει τα δικά της χαρακτηριστικά αναπαραγωγής του ιού και χαρακτηρίζεται από μια διαδοχική αλλαγή ορισμένων σταδίων. Ας τα δούμε ξεχωριστά.
Φάσεις
Η αναπαραγωγή του ιού σε ένα κύτταρο λαμβάνει χώρα σε διάφορες φάσεις, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω:
- Η πρώτη φάση είναι η προσρόφηση του ιού, που συζητήθηκε παραπάνω, στην επιφάνεια ενός κυττάρου που είναι ευαίσθητο σε αυτόν τον ιό.
- Το δεύτερο είναι η διείσδυση του ιού στα κύτταρα-ξενιστές από το viropexys.
- Το τρίτο είναι ένα είδος «ξεγυμνώματος» των βιριόντων, η απελευθέρωση νουκλεϊκού οξέος από το καψίδιο και το υπερκαψίδιο. Σε έναν αριθμό ιών, το νουκλεϊκό οξύ εισέρχεται στα κύτταρα με σύντηξη του περιβλήματος του ιού και του κυττάρου ξενιστή. Σε αυτή την περίπτωση, η τρίτη και η δεύτερη φάση συνδυάζονται σε μια ενιαία.
Προσρόφηση
Αυτό το στάδιο της αναπαραγωγής του ιού αναφέρεται στη διείσδυση του ιικού σωματιδίου στα κύτταρα. Η προσρόφηση ξεκινά στην κυτταρική επιφάνεια μέσω της αλληλεπίδρασης κυτταρικών καθώς και ιικών υποδοχέων. Μετάφραση από τα λατινικά, η λέξη "υποδοχείς" σημαίνει "δέκτης". Είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σχηματισμοί που αντιλαμβάνονται ερεθισμούς. Οι υποδοχείς είναι μόρια ή μοριακά σύμπλοκα που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων και είναι επίσης ικανά να αναγνωρίζουν συγκεκριμένες χημικές ομάδες, μόρια ή άλλα κύτταρα και να τα δεσμεύουν. Στα πιο πολύπλοκα ιοσωμάτια, τέτοιοι υποδοχείς βρίσκονται στο εξωτερικό κέλυφος με τη μορφή μιας ακίδας έκφυσης ή λάχνης σε απλά ιοσωμάτια που συνήθως βρίσκονται στην επιφάνεια του καψιδίου.
Ο μηχανισμός προσρόφησης στην επιφάνεια ενός ευαίσθητου κυττάρου βασίζεται στην αλληλεπίδραση των υποδοχέων με τους λεγόμενους συμπληρωματικούς υποδοχείς του κυττάρου «ξενιστή». Οι υποδοχείς του ιού και των κυττάρων είναι ορισμένες συγκεκριμένες δομές που βρίσκονται στην επιφάνεια.
Οι αδενοϊοί και οι μυξοϊοί απορροφώνται απευθείας στους υποδοχείς βλεννοπρωτεϊνών και οι αρβοϊοί και οι πικορναϊοί προσροφούνται σε υποδοχείς λιποπρωτεϊνών.
Στο ιοσωμάτιο του μυξοϊού, η νευραμινιδάση καταστρέφει τον υποδοχέα της βλεννογφοθεΐνης και διασπά τα Ν-ακετυλνεουραμινικά οξέα από τον ολιγοσακχαρίτη, ο οποίος περιέχει γαλακτόζη και γαλακτοζαμίνη. Οι αλληλεπιδράσεις τους σε αυτό το στάδιο είναι αναστρέψιμες, γιατί επηρεάζονται σημαντικά από τη θερμοκρασία, την αντίδραση του περιβάλλοντος και τα συστατικά του άλατος. Η προσρόφηση του βιριόντος εμποδίζεται από την ηπαρίνη και τους θειωμένους πολυσακχαρίτες, οι οποίοι φέρουν αρνητικό φορτίο, αλλά η ανασταλτική τους δράση απομακρύνεται από ορισμένα πολυκαριόντα (εκμολίνη, DEAE-δεξτράνη, θειική πρωταμίνη), τα οποία εξουδετερώνουν το αρνητικό φορτίο από θειικούς πολυσακχαρίτες.
Είσοδος του ιού στο κύτταρο ξενιστή
Η διαδρομή εισαγωγής ενός ιού σε ένα κύτταρο ευαίσθητο σε αυτόν δεν θα είναι πάντα η ίδια. Πολλά ιοσωμάτια μπορούν να διεισδύσουν στα κύτταρα με πινοκύττωση, που στα ελληνικά σημαίνει «πίνω» ή «πίνω». Με αυτή τη μέθοδο, το πινοκυτταρικό κενοτόπιο φαίνεται να έλκει το ιοσωμάτιο απευθείας στο κύτταρο. Άλλα ιοσωμάτια μπορούν να εισέλθουν στο κύτταρο απευθείας μέσω της μεμβράνης του.
Η επαφή του ενζύμου νευραμινιδάσης με κυτταρικές βλεννοπρωτεΐνες προάγει την είσοδο ιοσωμάτων στο κύτταρο μεταξύ των μυξοϊών. Τα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών αποδεικνύουν ότι το DNA και το RNA των ιοσωμάτων δεν διαχωρίζονται από το εξωτερικό κέλυφος, δηλαδή τα ιοσωμάτια διεισδύουν εξ ολοκλήρου στα ευαίσθητα κύτταρα με πινοκύττωση ή ιορόπεξις. Μέχρι σήμερα, αυτό έχει επιβεβαιωθεί για τον ιό της ευλογιάς, τον ιό της δαμαλίτιδας και άλλους ιούς που επιλέγουν τα ζώα ως βιότοπό τους. Αν μιλάμε για φάγους, μολύνουν τα κύτταρα με νουκλεϊκό οξύ. Ο μηχανισμός μόλυνσης βασίζεται στο γεγονός ότι αυτά τα ιοσωμάτια που περιέχονται στα κενοτόπια των κυττάρων υδρολύονται από ένζυμα (λιπάσες, πρωτεάσες), κατά την οποία το DNA απελευθερώνεται από το κέλυφος του φάγου και εισέρχεται στο κύτταρο.
Για τη διεξαγωγή του πειράματος, ένα κύτταρο μολύνθηκε χρησιμοποιώντας νουκλεϊκό οξύ που απομονώθηκε από ορισμένους ιούς και προκλήθηκε ένας πλήρης κύκλος αναπαραγωγής ιοσωμάτων. Ωστόσο, υπό φυσικές συνθήκες, η μόλυνση δεν εμφανίζεται με τη βοήθεια ενός τέτοιου οξέος.
Αποσύνθεση
Το επόμενο στάδιο της αναπαραγωγής του ιού είναι η αποσύνθεση, η οποία είναι η απελευθέρωση της ΝΚ από το καψίδιο και το εξωτερικό κέλυφος. Μετά την είσοδο του ιού στα κύτταρα, το καψίδιο υφίσταται κάποιες αλλαγές, αποκτώντας ευαισθησία στην κυτταρική πρωτεάση, στη συνέχεια καταστρέφεται, απελευθερώνοντας ταυτόχρονα το ΝΚ. Σε ορισμένους βακτηριοφάγους, η ελεύθερη ΝΚ εισέρχεται στα κύτταρα. Ο φυτοπαθογόνος ιός διεισδύει μέσω βλάβης στο κυτταρικό τοίχωμα και στη συνέχεια προσροφάται στον εσωτερικό κυτταρικό υποδοχέα με την ταυτόχρονη απελευθέρωση ΝΚ.
Αντιγραφή RNA και σύνθεση πρωτεϊνών ιών
Το επόμενο στάδιο της αναπαραγωγής του ιού είναι η σύνθεση μιας ειδικής για τον ιό πρωτεΐνης, η οποία λαμβάνει χώρα με τη συμμετοχή των λεγόμενων αγγελιοφόρων RNA (σε ορισμένους ιούς αποτελούν μέρος των ιοσωμάτων και σε ορισμένους συντίθενται μόνο σε μολυσμένα κύτταρα απευθείας στο τη μήτρα DNA ή RNA ιοσωμάτων). Εμφανίζεται αντιγραφή ιού ΝΚ.
Η διαδικασία αναπαραγωγής των ιών RNA ξεκινά μετά την είσοδο νουκλεοπρωτεϊνών στο κύτταρο, όπου σχηματίζονται ιικά πολυσώματα με τη συμπλοκοποίηση του RNA με τα ριβοσώματα. Μετά από αυτό, συντίθενται πρώιμες πρωτεΐνες, οι οποίες περιλαμβάνουν καταστολείς από τον κυτταρικό μεταβολισμό, καθώς και πολυμεράσες RNA, οι οποίες μεταφράζονται με το μητρικό μόριο RNA. Στο κυτταρόπλασμα των μικρότερων ιών ή στον πυρήνα, σχηματίζεται ιικό δίκλωνο RNA συνδυάζοντας τον γονικό συν κλώνο ("+" - κλώνος RNA) με τον νεοσυντιθέμενο, καθώς και τον μείον κλώνο που είναι συμπληρωματικός σε αυτόν (" -” - κλώνος RNA) . Η σύνδεση αυτών των κλώνων νουκλεϊκού οξέος προκαλεί το σχηματισμό μόνο μιας μονόκλωνης δομής RNA, η οποία ονομάζεται αντιγραφική μορφή. Η σύνθεση ιικού RNA πραγματοποιείται με σύμπλοκα αντιγραφής, στα οποία συμμετέχουν η αντιγραφική μορφή του RNA, το ένζυμο πολυμεράσης RNA και τα πολυσώματα.
Υπάρχουν 2 τύποι πολυμερασών RNA. Αυτά περιλαμβάνουν: RNA πολυμεράση Ι, η οποία καταλύει το σχηματισμό της αναδιπλασιαστικής μορφής απευθείας στο εκμαγείο συν-κλώνου, καθώς και RNA πολυμεράση II, η οποία συμμετέχει στη σύνθεση μονόκλωνου ιικού RNA στο εκμαγείο αντιγραφικού τύπου. Η σύνθεση νουκλεϊκών οξέων σε μικρούς ιούς συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα. Όσον αφορά τον ιό της γρίπης, η εσωτερική πρωτεΐνη και το RNA συντίθενται στον πυρήνα. Στη συνέχεια, το RNA απελευθερώνεται από τον πυρήνα και διεισδύει στο κυτταρόπλασμα, όπου, μαζί με τα ριβοσώματα, αρχίζει να συνθέτει την ιική πρωτεΐνη.
Αφού εισέλθουν τα ιοσωμάτια στα κύτταρα, η σύνθεση του νουκλεϊκού οξέος, καθώς και των κυτταρικών πρωτεϊνών, καταστέλλεται. Κατά την αναπαραγωγή σε μια μήτρα, το i-RNA συντίθεται επίσης στον πυρήνα, ο οποίος μεταφέρει πληροφορίες για τη σύνθεση πρωτεϊνών. Ο μηχανισμός της ιικής πρωτεϊνοσύνθεσης πραγματοποιείται στο επίπεδο του κυτταρικού ριβοσώματος και η πηγή κατασκευής θα είναι η δεξαμενή αμινοξέων. Η ενεργοποίηση των αμινοξέων πραγματοποιείται από ένζυμα, με τη βοήθεια του mRNA μεταφέρονται απευθείας στα ριβοσώματα (πολυσώματα), στα οποία βρίσκονται ήδη στο μόριο της συντιθέμενης πρωτεΐνης.
Έτσι, σε μολυσμένα κύτταρα, η σύνθεση νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών βιριόντων πραγματοποιείται ως μέρος ενός αντιγραφικού-μεταγραφικού συμπλέγματος, το οποίο ρυθμίζεται από ένα συγκεκριμένο σύστημα μηχανισμών.
Μορφογένεση ιού
Ο σχηματισμός ιοσωμάτων μπορεί να συμβεί μόνο στην περίπτωση ενός αυστηρά διατεταγμένου συνδυασμού δομικών ιικών πολυπεπτιδίων, καθώς και του ΝΚ τους. Και αυτό διασφαλίζεται από τη λεγόμενη αυτοσυναρμολόγηση μορίων πρωτεΐνης κοντά στο NC.
Σχηματισμός ιού
Ο σχηματισμός ενός βιριόντος συμβαίνει με τη συμμετοχή ορισμένων δομικών συστατικών που αποτελούν το κύτταρο. Οι ιοί του έρπητα, της πολιομυελίτιδας και της δαμαλίτιδας σχηματίζονται στο κυτταρόπλασμα και οι αδενοϊοί σχηματίζονται στον πυρήνα. Η σύνθεση του ιικού RNA, καθώς και ο σχηματισμός του νουκλεοκαψιδίου, συμβαίνει απευθείας στον πυρήνα και η αιμοσυγκολλητίνη σχηματίζεται στο κυτταρόπλασμα. Μετά από αυτό, το νουκλεοκαψίδιο μετακινείται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, στο οποίο σχηματίζεται το περίβλημα του ιού. Το νουκλεοκαψίδιο καλύπτεται εξωτερικά με ιικές πρωτεΐνες και το ιοσωμάτιο περιλαμβάνει αιμοσυγκολλητίνες και νευραμινιδάσες. Έτσι σχηματίζονται οι απόγονοι, για παράδειγμα, ο ιός της γρίπης.
Απελευθέρωση του ιού από το κύτταρο ξενιστή
Τα σωματίδια του ιού απελευθερώνονται από το κύτταρο «ξενιστή» ταυτόχρονα (κατά τη διάρκεια της κυτταρικής καταστροφής) ή σταδιακά (χωρίς καμία κυτταρική καταστροφή).
Με αυτή τη μορφή αναπαράγονται οι ιοί. Τα ιώματα απελευθερώνονται από τα κύτταρα γενικά με δύο τρόπους.
Πρώτη μέθοδος
Η πρώτη μέθοδος συνεπάγεται το εξής: μετά την απόλυτη ωρίμανση των βιριόντων απευθείας μέσα στο κύτταρο, στρογγυλεύονται, σχηματίζονται κενοτόπια εκεί και στη συνέχεια καταστρέφεται η κυτταρική μεμβράνη. Με την ολοκλήρωση αυτών των διεργασιών, τα ιοσωμάτια εξέρχονται όλα ταυτόχρονα και εντελώς από τα κύτταρα (picornaviruses). Αυτή η μέθοδος συνήθως ονομάζεται λυτική.
Δεύτερη μέθοδος
Η δεύτερη μέθοδος περιλαμβάνει τη διαδικασία απελευθέρωσης ιοσωμάτων καθώς ωριμάζουν για 2-6 ώρες στην κυτταροπλασματική μεμβράνη (μυξοϊοί και αρβοϊοί). Η απελευθέρωση των μυξοϊών από το κύτταρο διευκολύνεται από τις νευραμινιδάσες, οι οποίες καταστρέφουν την κυτταρική μεμβράνη. Κατά τη διάρκεια αυτής της μεθόδου, το 75-90% των βιριόντων απελευθερώνεται αυθόρμητα στο μέσο καλλιέργειας και τα κύτταρα σταδιακά πεθαίνουν.