Μικροσκόπιο φωταύγειας. Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Αυτό το κεφάλαιο θα συζητήσει τις κύριες αρχές, το σχεδιασμό και την εφαρμογή ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ (CLSM) χρησιμοποιώντας συσκευές Leica ως παράδειγμα. Η αρχή του CLSM είναι η καταγραφή της ροής φωτός που εκπέμπεται από το εστιακό επίπεδο του φακού όταν οι εστίες συμπίπτουν, δηλ. το διάφραγμα του ανιχνευτή πρέπει να τοποθετηθεί έτσι ώστε η εικόνα του να συμπίπτει ακριβώς με την εστίαση του φωτός που φωτίζει το αντικείμενο. Τα λέιζερ και οι ευαίσθητοι ανιχνευτές χρησιμοποιούνται ως πηγή φωτός για τη λήψη εικόνας.

Το κύριο χαρακτηριστικό του CLSM είναι η δυνατότητα λήψης εικόνας στρώμα προς στρώμα του υπό μελέτη αντικειμένου (για παράδειγμα, ένα κελί) με υψηλή ανάλυση και χαμηλό θόρυβο. Αυτό επιτυγχάνεται με τη σταδιακή σάρωση ενός αντικειμένου με εστιασμένη δέσμη φωτός από μια συνεκτική πηγή ή βαθμίδα, με τη χρήση ειδικών ανιχνευτών φθορισμού και ειδικών μεθόδων για τον περιορισμό των ροών φωτός.

Τα συστήματα σάρωσης CLSM μπορούν να ταξινομηθούν ως εξής.

1. Σάρωση δέσμης.

Α) Συστήματα καθρέφτη: μονό κάτοπτρο, διπλό κάτοπτρο, συντονισμένο μαγνητοηλεκτρικό.

Β) Συστήματα ελαφρών ινών: μονής ίνας, πολλαπλών ινών.

Β) Σάρωση φακού:

· πιεζοηλεκτρική κίνηση του φακού κατά μήκος των αξόνων X, Y.

· πιεζοηλεκτρική κίνηση του φακού κατά μήκος του άξονα Ζ.

Δ) Ακουστο-οπτικοί εκτροπείς δέσμης: δύο ακουστικο-οπτικοί εκτροπείς για σάρωση κατά μήκος των αξόνων X και Y.

Δ) Συστήματα δίσκων:

· μονής σπείρας, μονής όψης και διπλής όψης.

· πολλαπλών σπιράλ μονής και διπλής όψης.

Ε) Συνδυασμένα συστήματα: ακουστικό-οπτικός εκτροπέας κατά μήκος του άξονα Υ και σάρωση με κάτοπτρο κατά μήκος του άξονα Χ.

2. Σάρωση με τραπέζι.

A) Stepper drive: πίνακας σάρωσης με βηματικούς κινητήρες κατά μήκος των αξόνων X, Y, Z.

Β) Συνδυασμένη κίνηση: στάδιο σάρωσης με βηματικό κινητήρα κατά μήκος των αξόνων X, Y και πιεζοηλεκτρική κίνηση κατά μήκος του άξονα Z.

Ρύζι. 5. Σχηματικό διάγραμμα λειτουργίας του CLSM.

1 - πίνακας σάρωσης. 2 - δείγμα δοκιμής. 3, 7 - φακοί. 4 - συσκευή σάρωσης. 5 - διαχωριστής δέσμης. 6 - δέσμη φωτός από το λέιζερ. 8, 12 - εικόνα των σημείων Β και Γ. 9 - διάφραγμα βελόνας. 10 - εικόνα του σημείου Α στο κέντρο του διαφράγματος της βελόνας. 11 - δέκτης ακτινοβολίας. 13, 15 - λάμψη των σημείων Β και Γ, που βρίσκονται έξω από την εστίαση του φακού 3. 14 - λάμψη του σημείου Α, που βρίσκεται στην εστίαση του φακού 3.

Η φωτεινή ροή διέγερσης 6 από την πηγή λέιζερ εισέρχεται μέσω της πλάκας διαχωρισμού δέσμης 5, του συστήματος σάρωσης 4 στον φακό 3 και εστιάζεται στο σημείο Α του επιπέδου του δείγματος δοκιμής (για παράδειγμα, ένα κελί), το οποίο είναι εστιασμένο . Πιστεύουμε ότι οι ενδοκυτταρικές δομές συνδέονται με φθορίζοντες ανιχνευτές και το σημείο εστίασης δέσμης Α μπορεί να θεωρηθεί ως σημειακή πηγή φωτός, η ροή φθορισμού από την οποία μέσω του φακού 3, της πλάκας διαχωριστή δέσμης 5, του φακού 7 εστιάζεται στο επίπεδο του διαφράγματος βελόνας 9 ("pinhole") και καταγράφηκε από φωτοανιχνευτή 11 Ο φωτισμός από τη ροή διέγερσης των θραυσμάτων φαρμάκου που βρίσκονται έξω από την εστία του φακού κατά μήκος του οπτικού άξονα (σημεία B και C) είναι χαμηλότερος από ό, τι στο σημείο A. Κατά συνέπεια, η συνιστώσα του φωτισμού του ανιχνευτή ο στόχος από τα σημεία Β και Γ μπορεί να μειωθεί σημαντικά. Οι ροές φθορισμού που προέρχονται από τα σημεία Β και Γ, τα οποία βρίσκονται εκτός εστίασης, περιορίζονται από ένα διάφραγμα οπής καρφίτσας και δεν φτάνουν στον ανιχνευτή, ή ένα μικρό μέρος τους φτάνει. Έτσι, κατά τη σάρωση ενός παρασκευάσματος στο αεροπλάνο XYΟ ανιχνευτής καταγράφει ένα σήμα, το επίπεδο του οποίου καθορίζεται από την απόσταση από το επίπεδο σάρωσης κατά μήκος της συντεταγμένης Ζ. Η ευθυγράμμιση της εστίασης του φακού 3 με το επίπεδο σάρωσης και η εστίαση του φακού 7 με ένα διάφραγμα βελόνας αντανακλάται στο. όρος «συγκέντρωση». Η βήμα προς βήμα κίνηση του επιπέδου σάρωσης κατά μήκος του άξονα Z σάς επιτρέπει να λαμβάνετε μια σειρά από αντίθετες εικόνες στρώμα προς στρώμα και να ανακατασκευάσετε την εσωτερική τρισδιάστατη δομή (3-D) του υπό μελέτη αντικειμένου. Ποιότητα εικόνας, ανάλυση εντός επιπέδου XYκαι κατά μήκος του άξονα Ζ εξαρτάται από την ποιότητα των οπτικών, την ποιότητα των συστημάτων σάρωσης, το μέγεθος και την κατασκευαστική ακρίβεια του διαφράγματος της οπής, την ακαμψία της δομής, την αποτελεσματικότητα των αλγορίθμων επεξεργασίας σήματος που χρησιμοποιούνται και την ιδιαιτερότητα του φθορίζοντες ανιχνευτές.

Για να προσδιοριστεί η χωρική ανάλυση του μικροσκοπίου, πραγματοποιείται ανάλυση εικόνας μιας σημειακής πηγής φωτός. Η εικόνα μιας σημειακής πηγής που σχηματίζεται από έναν συμβατικό φακό είναι ένα Αέρινο σημείο περίθλασης που αποτελείται από έναν φωτεινό κεντρικό πυρήνα και πιο αμυδρά εξωτερικούς δακτυλίους.

Ρύζι. 6. Αέρινο σημείο περίθλασης.

Δύο σημειακές πηγές ίσης φωτεινότητας, η απόσταση μεταξύ τους είναι d , είναι ορατά ως δύο διαφορετικά σημεία εάν η απόσταση μεταξύ των κέντρων των κύκλων Airy υπερβαίνει την ακόλουθη τιμή:

r A = XY =0,6 λ/ΝΑ,

όπου r Α - η ακτίνα του πρώτου σκούρου δακτυλίου στον κύκλο Airy, λ είναι το μήκος κύματος της φωτεινής πηγής σε nm, NA είναι το αριθμητικό άνοιγμα.

Αυτή η έκφραση ονομάζεται κριτήριο Rayleigh. Καθορίζει την ανάλυση του μικροσκοπίου στο επίπεδο δείγματος (XY). Σε αυτή την περίπτωση, το όριο ανάλυσης καθορίζεται κυρίως από την κυματική φύση του φωτός, και επομένως συχνά απλοποιείται θεωρώντας NA=1. Στην απεικόνιση CLSM έχει ως αποτέλεσμα μια ελαφρά μείωση του μεγέθους της ευάερης κηλίδας. Η ένταση της Αέρινης κηλίδας για ένα τυπικό μικροσκόπιο μειώνεται σύμφωνα με το νόμο n -2, όπου n είναι η εγκάρσια μετατόπιση και για CLSM η ένταση μειώνεται ως n -4. Αυτό οδηγεί σε αύξηση της ανάλυσης του CLSM κατά 1,5 φορές. Για ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο, το κριτήριο Rayleigh έχει τη μορφή:

XY c r =0,4 λ/ΝΑ,

όπου XY c r είναι η ανάλυση του CLSM.

Για να αξιολογήσουμε τα πλεονεκτήματα του CLSM, εξετάζουμε την οργανική λειτουργία (τη δομή του Airy spot) και αναλύουμε την ανάλυση του μικροσκοπίου στην αξονική διεύθυνση (Z). Το τρισδιάστατο Airy spot (κατανομή έντασης) είναι μια τρισδιάστατη λειτουργία υλικού (THF) που καθορίζει την εικόνα ενός αντικειμένου. Το TAF για ένα συμβατικό μικροσκόπιο έχει κωνικό σχήμα, που εκτείνεται πάνω και κάτω από το κέντρο, ενώ για ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο έχει ελλειπτικό σχήμα και είναι λιγότερο επιμήκη στην αξονική διεύθυνση.

Ρύζι. 7. Άποψη της τρισδιάστατης λειτουργίας υλικού μιας σημειακής πηγής ενός συμβατικού μικροσκοπίου - (α) και CLSM - (β).

Το κριτήριο Rayleigh είναι επίσης εφαρμόσιμο για τον προσδιορισμό της ανάλυσης ενός μικροσκοπίου προς την κατεύθυνση του οπτικού άξονα. Για ένα συμβατικό μικροσκόπιο, δύο σημειακές πηγές που βρίσκονται σε κάποια απόσταση κατά μήκος του οπτικού άξονα μπορούν να επιλυθούν εάν τα μέγιστα των Airy κηλίδων τους βρίσκονται σε απόσταση:

Z r =2 λ/NA 2,

όπου Z r είναι η αξονική ανάλυση του μικροσκοπίου.

Η κατανομή ενέργειας στο Airy spot για CLSM είναι στενότερη και η ανάλυση στην αξονική κατεύθυνση είναι 1,4 φορές μεγαλύτερη. Για ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο, το κριτήριο Rayleigh έχει τη μορφή:

Z r c =1,4 λ/NA 2,

όπου Z r c είναι η αξονική ανάλυση του CLSM.

Τα σύγχρονα CLSM έχουν ένα κύριο πλεονέκτημα - τη δυνατότητα απόκτησης λεπτών οπτικών τμημάτων. Οι ακόλουθες παράμετροι επηρεάζουν την ποιότητα της εικόνας κατά τη λήψη λεπτών οπτικών τμημάτων:

· μέγεθος ομοεστιακού διαφράγματος.

· αριθμητικό διάφραγμα του φακού NA.

· δείκτης διάθλασης;

· απορρόφηση φωτός στο δείγμα.

Η μείωση της έντασης του φωτός καθώς αυξάνεται το πάχος του δείγματος επηρεάζει την ανάλυση του μικροσκοπίου κατά μήκος του οπτικού άξονα Ζ Η ανάλυση εξαρτάται από την οπτική του μικροσκοπίου και του δείγματος. Το πάχος της οπτικής τομής σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο συνήθως χαρακτηρίζεται από το πλάτος της κατανομής στο μισό ύψος της κορυφής έντασης ∆z 1/2 = 0,65 μm. Εάν το δείγμα και ο ανιχνευτής είναι ιδανικοί, αυτή η παράμετρος εξαρτάται από το αριθμητικό άνοιγμα του αντικειμενικού φακού, το μήκος κύματος λ και τον δείκτη διάθλασης του μέσου βύθισης n i .

Ρύζι. 8. Εξάρτηση της αξονικής ανάλυσης του μικροσκοπίου Δz 1/2 από το αριθμητικό άνοιγμα του φακού.

Στο CLSM, ένα ρυθμιζόμενο διάφραγμα τοποθετείται μπροστά από τον ανιχνευτή, αλλάζοντας την ποσότητα φωτός. Τα διαφράγματα βελόνας έχουν σχεδιαστεί για να δημιουργούν συνθήκες για μέγιστη ή πλήρη διήθηση του φωτός που εισέρχεται στο επίπεδο σχηματισμού εικόνας από σημεία που δεν συμπίπτουν με το εστιακό επίπεδο ή βρίσκονται δίπλα στο αναλυόμενο στοιχείο του αντικειμένου στο εστιακό επίπεδο. Το μέγεθος του διαφράγματος της βελόνας είναι πεπερασμένο και η πλευρική ανάλυση της συσκευής, η φωτεινότητα των φωτιζόμενων στοιχείων του δείγματος μετατοπίζεται σε σχέση με το εστιακό επίπεδο κατά μήκος του άξονα Z και το βάθος πεδίου εξαρτώνται από αυτό. Το μέγεθος του διαφράγματος επηρεάζει το πάχος του τμήματος που προκύπτει. Όσο μικρότερο είναι το άνοιγμα, τόσο πιο κοντά είναι το πάχος της τομής στο θεωρητικό όριο (το πλάτος της κατανομής στο μισό ύψος της κορυφής της έντασης) και σε πολύ μεγάλα ανοίγματα η δυνατότητα λήψης μιας λεπτής τομής καθίσταται αδύνατη.

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, το CLSM καθιστά δυνατή τη λήψη μιας οπτικής διατομής σε σημαντικό βάθος από την επιφάνεια του δείγματος, με σημαντικό σημείο να είναι ο δείκτης διάθλασης και το ζήτημα του βάθους. Η διέλευση της προσπίπτουσας και της ανακλώμενης δέσμης μέσω του δείγματος επηρεάζει την ποιότητα της εικόνας. Εάν οι δείκτες διάθλασης του μέσου εμβάπτισης και του δείγματος είναι κοντά (η επίδραση της διαφοράς στους δείκτες διάθλασης του υγρού εμβάπτισης και του αντικειμένου στην εμφάνιση διάσπαρτου φωτός, που μειώνει την αντίθεση της εικόνας και λειτουργεί ως σφαιρικό φαινόμενο εκτροπής) , ο φωτεινός κώνος θα συγκλίνει. Εάν οι δείκτες διάθλασης διαφέρουν, εμφανίζεται σφαιρική εκτροπή.

Ρύζι. 9. Δείκτες διάθλασης του μέσου εμβάπτισης και του δείγματος.

α – Σχηματισμός εικόνας με χρήση φακού εμβάπτισης χωρίς εκτροπή. β – σφαιρική εκτροπή που προκαλείται από την απόκλιση μεταξύ των δεικτών.

Με διαφορετικούς δείκτες διάθλασης, οι ακτίνες φωτός που έρχονται σε διαφορετικές αποστάσεις από τον οπτικό άξονα δεν εστιάζονται σε ένα σημείο, γεγονός που οδηγεί σε απώλεια ποιότητας εικόνας. Εάν είναι δυνατόν, οι δείκτες διάθλασης του δείγματος και του αντικειμενικού φακού θα πρέπει να αντιστοιχίζονται. Εάν οι δείκτες διάθλασης του δείγματος και του μέσου βύθισης είναι διαφορετικοί, η εικόνα του αντικειμένου σε βάθος θαμπώνει κατά μήκος του οπτικού άξονα και το επίπεδο εστίασης μετατοπίζεται. Για να αυξηθεί το βάθος διείσδυσης, ο φακός πρέπει να έχει μεγάλο αριθμητικό διάφραγμα, όπως φακό εμβάπτισης λαδιού. Ωστόσο, τέτοιοι φακοί έχουν μια μικρή μέγιστη απόσταση από τον αντικειμενικό φακό στο εστιακό επίπεδο. Το βάθος διείσδυσης επηρεάζεται από την ετερογένεια του δείγματος, η οποία οδηγεί σε μείωση της έντασης του φωτός σε μεγάλα βάθη και στην εμφάνιση σκιάς. Στην ιδανική περίπτωση, ένα δείγμα για την επίτευξη μέγιστου βάθους διείσδυσης και μέγιστης ανάλυσης θα είχε δείκτη διάθλασης ίσο με αυτόν του φακού, αλλά αυτό είναι ένα ομοιογενές δείγμα και τέτοια βιολογικά δείγματα δεν υπάρχουν.

Κατά τη σάρωση, το CLSM αποκτά μια σειρά οπτικών τμημάτων με τακτικά αυξανόμενα βάθη από την επιφάνεια του δείγματος. Για τα περισσότερα CLSM, η απόκτηση εκατοντάδων εικόνων 2D διαρκεί μόνο λίγα λεπτά. Μια οπτική εικόνα μπορεί να ληφθεί με δύο τρόπους:

1) λήψη μιας ακολουθίας οπτικών τμημάτων στο επίπεδο XY που βρίσκονται σε απόσταση Δz μεταξύ τους. Η σύγκριση των συντεταγμένων των κέντρων των αντικειμένων σε διαφορετικά τμήματα καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό του προσανατολισμού και της κατανομής μήκους τους.

Ρύζι. 10. Μελέτη τρισδιάστατης δομής στο επίπεδο ΧΥ.

2) λήψη ενός αριθμού οπτικών τμημάτων στο επίπεδο XZ που βρίσκεται σε απόσταση Δy. Εάν το δείγμα είναι παράλληλο με το επίπεδο τομής, τότε το τμήμα του στο επίπεδο XZ θα είναι σχεδόν κυκλικό συγκρίνοντας εικόνες σε διαφορετικά τμήματα XZ, μπορεί να προσδιοριστεί η καμπυλότητα του υπό μελέτη αντικειμένου.

Ρύζι. 11. Μελέτη τρισδιάστατης δομής στο επίπεδο ΧΖ.

Η τρισδιάστατη ανακατασκευή των υπό μελέτη αντικειμένων χρησιμοποιώντας μεθόδους CLSM στοχεύει στην επίλυση δύο προβλημάτων:

· οπτικοποίηση μιας τρισδιάστατης εικόνας ενός αντικειμένου που λαμβάνεται με τη «συναρμολόγηση» των οπτικών τμημάτων του.

· ποσοτική ανάλυση των εσωτερικών δομών ενός αντικειμένου.

Σήμερα υπάρχουν πολλές εταιρείες που παράγουν CLSM. Καινοτομίες κατασκευαστικών εταιρειών CLSM:

· 2002 Η Leica ανακοίνωσε έναν ακουστικό-οπτικό διαχωριστή δέσμης (AOBS), ο οποίος επιτρέπει τον αποτελεσματικό διαχωρισμό της δέσμης διέγερσης λέιζερ και της φωταύγειας.

· 2002 Ο Carl Zeiss άρχισε να παράγει το συνεστιακό μικροσκόπιο LSM 510 META με έναν πρωτότυπο φωτοανιχνευτή που καταγράφει ταυτόχρονα σήματα σε 32 φασματικά κανάλια.

· 2004 Η Zeiss δημιουργεί το υψηλής ταχύτητας LSM 5 Live, το οποίο έχει ταχύτητα σάρωσης 20 φορές υψηλότερη από ένα συμβατικό CLSM.

· Η Olympus έχει αναπτύξει μια συσκευή με δύο σαρωτές, η οποία καθιστά δυνατή την αποτελεσματικότερη χρήση, για παράδειγμα, της τεχνικής FRAP.

· Nikon - δημιουργεί ένα συμπαγές και φθηνό CLSM με απλοποιημένο σχεδιασμό.

· 2007 Η Leica ανακοίνωσε την κυκλοφορία ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου 4Pi, βελτιώνοντας την αξονική ανάλυση κατά 4 - 7 φορές.

Ας εξετάσουμε μια συσκευή CLSM που ανήκει σε μια νέα, πιο προηγμένη γενιά συσκευών - TCS SP5 από τη Leica.

Ρύζι. 12. Πολυφωτονικό/συνεστιακό ευρυζωνικό σύστημα TCS SP5 (ανεστραμμένο μικροσκόπιο).

Βασικά στοιχεία του CLSM TCS SP5: AOTF – ακουστικό-οπτικό ρυθμιζόμενο φίλτρο, AOBS – ακουστικό-οπτικός διαχωριστής δέσμης, SP-Detector – αισθητήρας φασματικού φωτομέτρου.

AOTF - Acoustic-Optical Tunable Filter - χρησιμεύει για την ελαχιστοποίηση της οπτικής έκθεσης και προσαρμόζει την ισχύ του λέιζερ ανάλογα με το δείγμα και το φθοριόχρωμο. Σας επιτρέπει να επιλέξετε το απαιτούμενο μήκος κύματος και να ελέγξετε την ένταση του φωτός διέγερσης. Το AOTF είναι ένα ηλεκτρικά συντονιζόμενο φίλτρο που λειτουργεί με βάση την αρχή της ογκομετρικής περίθλασης μιας δέσμης φωτός από ανομοιογένειες του δείκτη διάθλασης. Τέτοιες ανομοιογένειες προκύπτουν όταν ένα υπερηχητικό ακουστικό κύμα διεγείρεται σε κρυστάλλους διπλής διάθλασης. Με την ανισότροπη περίθλαση σε μονοαξονικούς κρυστάλλους, υπάρχει μια ελάχιστη συχνότητα υπερήχων στην οποία συμπίπτουν οι γωνίες πρόσπτωσης και περίθλασης και εμφανίζεται η λεγόμενη συγγραμμική ακουστικο-οπτική αλληλεπίδραση.

Ρύζι. 13. Ακουστικο-οπτικό ρυθμιζόμενο φίλτρο.

Το AOBS - ακουστικό-οπτικός διαχωριστής δέσμης, είναι ένας ακουστικο-οπτικός κρύσταλλος - μια ρυθμιζόμενη διαθλαστική συσκευή που λειτουργεί σε αντίστροφη λειτουργία. Τι σας δίνει η χρήση του AOBS:

1. Για να αποκτήσετε μια καθαρή εικόνα χαμηλού θορύβου, απαιτείται υψηλός βαθμός μετάδοσης φωτός. Η μείωση του θορύβου με τη λήψη του μέσου όρου της εικόνας σε πολλές διαδοχικές σαρώσεις οδηγεί αναγκαστικά σε φωτολεύκανση του αντικειμένου που μελετάται. Η διαπερατότητα φωτός του AOBS είναι ανώτερη από τους περισσότερους διχρωμικούς καθρέφτες σε όλο το ορατό φάσμα. Επομένως, απαιτείται ο μέσος όρος για μικρότερο αριθμό σαρώσεων. Ως αποτέλεσμα, το φάρμακο θα διαρκέσει πολύ περισσότερο.

2. Οι φωτεινές και καθαρές εικόνες απαιτούν όσο το δυνατόν περισσότερα φωτόνια για να περάσουν από το αντικείμενο στον ανιχνευτή, γεγονός που βελτιώνει την ποιότητα της εικόνας. Το AOBS διασφαλίζει την καταγραφή των ευρύτερων δυνατών ζωνών φθορισμού, δηλαδή του μέγιστου αριθμού φωτονίων.

3. Η χαμηλή λεύκανση κατά τη λήψη εικόνας είναι σημαντική για την προστασία του δείγματος από το ξεθώριασμα και τα ζωντανά αντικείμενα από τοξικά προϊόντα φωτόλυσης φθοριοχρωμάτων. Οι καμπύλες μετάδοσης φωτός του AOBS έχουν πολύ απότομες κλίσεις, γεγονός που καθιστά δυνατή την καταγραφή του φθορισμού ενός φθορισμού όσο το δυνατόν πιο κοντά στη ζώνη διέγερσής του.

4. Οποιαδήποτε βαφή στο ορατό εύρος μπορεί να διεγείρεται, καθώς η αντανάκλαση μπορεί να ρυθμιστεί ξεχωριστά.

5. Το ζήτημα του πολυπαραμετρικού φθορισμού έχει επιλυθεί: μπορούν να προγραμματιστούν έως και οκτώ γραμμές εκπομπής λέιζερ, αφήνοντας αρκετό χώρο για την καταγραφή του φθορισμού, ενώ οι συχνότητες μπορούν να ρυθμιστούν.

6. Η αναλογία βαφών, όπως και η αναλογία διέγερσης μεταβολίτη - δείγματα, για παράδειγμα, για Ca 2+, δυναμικό μεμβράνης, τιμή pH, θα πρέπει να αλλάζει γρήγορα κατά τη διαδοχική σάρωση. Το AOBS αλλάζει σε λίγα μικροδευτερόλεπτα.

7. Η καταχώρηση εικόνας στο ανακλώμενο φως είναι μια άλλη δυνατότητα χρήσης. Το AOBS επιτρέπει τη μεμονωμένη προσαρμογή της μετάδοσης του ανακλώμενου φωτός διέγερσης.

8. Η σάρωση ROI (διαδοχική σάρωση και σάρωση συγκεκριμένης περιοχής) έχει επίσης βελτιωθεί: διαφορετικοί τρόποι διέγερσης εφαρμόζονται σε διαφορετικές περιοχές κατά τη διάρκεια μιας μεμονωμένης σάρωσης.

9. Οι εγγραφές 3D μεγάλου όγκου σε διαδοχική λειτουργία επωφελούνται από συσκευές γρήγορης εναλλαγής καθώς η ταχύτητα αυξάνει την απόδοση του συστήματος.

10. Η φασματοσκοπία συσχέτισης φθορισμού (FCS) απαιτεί χαμηλή σκέδαση φόντου και χαμηλού φωτισμού Μόνο το AOBS αποκλείει αποτελεσματικά τις κοντινές γραμμές εκπομπής, για παράδειγμα, από λέιζερ Ar.

11. Η φασματική καταγραφή (σάρωση λάμδα) παρέχει ένα ακριβές φάσμα, καθώς η μετάδοση φωτός του AOBS είναι «λευκή», που σημαίνει ότι δεν εισάγει αλλαγές στο φάσμα εκπομπής - ένα κοινό πρόβλημα κατά την εκτέλεση φασματικών σαρώσεων σε σύστημα διχρωμίας καθρέφτη.

12. Η αληθινή ομοεστιακή οπτική τομή απαιτεί σημαδιακό φωτισμό και ανίχνευση κηλίδων του φθορισμού. Το AOBS είναι κατάλληλο για χρήση με ομοεστιακές συσκευές σάρωσης σημείου.

13. Η απεικόνιση σε λειτουργία πολλαπλών φωτονίων ή με υπεριώδη διέγερση μπορεί να εκτελεστεί παράλληλα χωρίς σφάλματα ή περιορισμούς. Το AOBS δεν αλλάζει τη διέγερση των αόρατων λέιζερ και δεν αλλάζει το φάσμα φθορισμού.

14. Δεν είναι δυνατό να εκτελεστεί λανθασμένη λειτουργία, καθώς το AOBS ελέγχεται σε συνδυασμό με τον έλεγχο διέγερσης χρησιμοποιώντας AOTF (Acousto-Optical Tunable Filter). Εάν επιλεγεί η γραμμή διέγερσης, τότε το AOBS προγραμματίζεται σύμφωνα με αυτήν. Ο χειριστής δεν χρειάζεται να λαμβάνει αποφάσεις - η εργασία εκτελείται σωστά και αυτόματα.

15. Δεν υπάρχει ρύθμιση, καθώς δεν υπάρχουν εγγενή κινούμενα στοιχεία στα τύμπανα φίλτρου και τους ολισθητήρες. Το κρύσταλλο είναι σταθερά τοποθετημένο και ο προγραμματισμός γίνεται ηλεκτρονικά.

16. Δεν χρειάζεται ακριβός πρόσθετος εξοπλισμός, όπως κύβοι φίλτρου, διχρωμικοί ολισθητήρες καθρέφτη κ.λπ. Επομένως, το κόστος της τεχνικής βοήθειας για την εγκατάσταση νέων οπτικών στοιχείων είναι πολύ χαμηλότερο.

Ρύζι. 14. AOBS – ακουστικο-οπτικός διαχωριστής δέσμης.

SP-Detector – αισθητήρας φασματικού φωτόμετρου. Το φως από το δείγμα, που είναι το άθροισμα των επαγόμενων φασμάτων φθορισμού, διέρχεται από ένα διάφραγμα οπής καρφίτσας, το οποίο σχηματίζει μια ομοεστιακή οπτική τομή. Στη συνέχεια, χρησιμοποιώντας ένα πρίσμα, αυτό το φως αποσυντίθεται σε ένα φάσμα. Κατά τη διέλευση του πρώτου ανιχνευτή, το φως περνά μέσα από μια συσκευή φωτομέτρου σχισμής που αποτελείται από δύο μηχανοκίνητες κουρτίνες. Αυτές οι κουρτίνες κόβουν τις άκρες του φάσματος και στις δύο πλευρές της σειράς και τις κατευθύνουν στους αισθητήρες 2ης και 3ης τάξης. Ως αποτέλεσμα, το φάσμα χωρίζεται ταυτόχρονα σε πέντε κανάλια. Ως αποτέλεσμα, όταν χρησιμοποιείται ένας ανιχνευτής SP, καταγράφεται η ακτινοβολία από διάφορες βαφές στο δείγμα.

Ρύζι. 15. Φασματικός ανιχνευτής SP.

Ο ανιχνευτής SP επιτρέπει τη σάρωση λάμδα: συσσωρεύονται φασματικές εικόνες για άμεση ανάλυση των χαρακτηριστικών των χρωστικών που εμπλέκονται στο πείραμα.

4 Ιουνίου 2013

Σημαντικό μέρος της επιστημονικής έρευνας που διεξάγεται στη Βιολογική Σχολή του Κρατικού Πανεπιστημίου της Μόσχας και η επιτυχής εφαρμογή στενά συναφών εκπαιδευτικών προγραμμάτων είναι αδιανόητα χωρίς τη χρήση της πιο σύγχρονης μικροσκοπικής τεχνολογίας. Στο πλαίσιο του Προγράμματος Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου της Μόσχας, δημιουργήθηκε στη Σχολή Βιολογίας ένα διατμηματικό εργαστήριο συνεστιακής μικροσκοπίας, πλήρως εξοπλισμένο με τον απαραίτητο εξοπλισμό και λειτουργεί αποτελεσματικά.

Ινοβλάστες 3Τ3 στα τοιχώματα του μακροπόρου της μήτρας

Κείμενο: Tretyakov Artemy

Τι μπορεί να κάνει?

Με τη χρήση ομοεστιακό μικροσκόπιομπορείτε να αποκτήσετε πολλές εικόνες εικονικών τμημάτων ενός κελιού ή ένα τρισδιάστατο μοντέλο που έχει συναρμολογηθεί από αυτά. Τέτοιες δυνατότητες παρέχονται από ένα λέιζερ, η δέσμη του οποίου μπορεί να εστιαστεί σε οποιοδήποτε σημείο της κυψέλης. Για να ληφθεί μια εικόνα, το αντικείμενο πρέπει να είναι ενεργό φθορισμού, δηλαδή όταν χτυπηθεί από μια δέσμη λέιζερ, αυτό (ή μάλλον ορισμένα μόρια στη σύνθεσή του) πρέπει να εκπέμπει φως με μεγαλύτερο μήκος κύματος από αυτό που προσπίπτει σε αυτό, το οποίο συλλαμβάνεται από το μικροσκόπιο. Η εικόνα χτίζεται ακριβώς με βάση αυτόν τον φθορισμό.

φωτογραφία

Πώς λειτουργεί;

«Το τρέχον επίπεδο ανάπτυξης της θεμελιώδους και εφαρμοσμένης διεπιστημονικής επιστημονικής έρευνας, καθώς και τα καθήκοντα εκπαίδευσης ειδικών με διεπιστημονικές ικανότητες, απαιτούν εντατική ανάπτυξη και εκσυγχρονισμό της υλικοτεχνικής βάσης» (Πρόγραμμα Ανάπτυξης του Πανεπιστημίου της Μόσχας, σελ. 5 ;) .

Εκτός από το λέιζερ, η ηλεκτρονική-μηχανική συσκευή περιλαμβάνει επίσης ένα οπτικό φίλτρο που μεταδίδει τη δέσμη λέιζερ, αλλά αντανακλά φως μεγαλύτερου μήκους κύματος σε ένα διάφραγμα που ονομάζεται "pinhole" (από το αγγλικό Pinhole - μια τρύπα που δημιουργείται από μια ακίδα, η κυριολεκτική μετάφραση χαρακτηρίζει τέλεια τη συσκευή pinhole), η οποία κόβει όλο το περιττό φως φόντου και έτσι μειώνει ή αναιρεί πλήρως την επίδραση των υποκείμενων οπτικών στρωμάτων στην ευκρίνεια της οθόνης της σαρωμένης περιοχής του κελιού. Εάν το φως του φόντου δεν αποκόπηκε από την τρύπα, τα οπτικά στρώματα θα επικαλύπτονταν μεταξύ τους και θα παρενέβαιναν στον θεατή - σαν να κοιτούσε μέσα από το φύλλωμα στην απόσταση. Πίσω από το διάφραγμα υπάρχει ένας φωτοανιχνευτής που ψηφιοποιεί τις λαμβανόμενες πληροφορίες.

Είναι σαφές ότι μια τέτοια «σημειακή» σάρωση απαιτεί χρόνο. Για να επιταχύνει αυτή τη διαδικασία, το σύστημα ομοεστιακής επικοινωνίας χρησιμοποιεί μια άλλη μονάδα που ονομάζεται περιστρεφόμενος δίσκος, η οποία καθιστά δυνατή τη λήψη εικόνας όχι μόνο ενός σημείου, αλλά μιας ολόκληρης γραμμής σε μια πράξη λειτουργίας λέιζερ.

Ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για ένα τέτοιο σύστημα ελήφθη το 1961 από τον καθηγητή του MIT Marvin Minsky. Η ενεργή χρήση του ξεκίνησε τη δεκαετία του '80 και τώρα η ομοεστιακή μικροσκοπία βιώνει την ακμή της. Το πρώτο μικροσκόπιο εμφανίστηκε στη Ρωσία το 2003, ήταν το Axiovert 200M LSM510 Meta. Ακολούθησαν και άλλα και τώρα υπάρχουν αρκετά μεγάλα εργαστήρια στη χώρα μας, συμπεριλαμβανομένου του διατμηματικού εργαστηρίου στη Βιολογική Σχολή του Κρατικού Πανεπιστημίου της Μόσχας. Το εργαστήριο διαθέτει πέντε μικροσκόπια, μεταξύ των οποίων: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

Η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει επιτύχει όχι μόνο την υψηλότερη αντίθεση και τρισδιάστατη, αλλά και την τέταρτη διάσταση - χρόνο, καθιστώντας δυνατή τη μελέτη των αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα. Για τους σκοπούς αυτούς, κάθε εγκατάσταση είναι εξοπλισμένη με συστήματα διατήρησης της ζωής τους. Όλα αυτά παρέχουν άφθονες ευκαιρίες για ερευνητές που χρησιμοποιούν με επιτυχία αυτές τις ευκαιρίες.

Και, καθώς μιλάμε για το εργαστήριο της Βιολογικής Σχολής του Κρατικού Πανεπιστημίου της Μόσχας, η έρευνα που πραγματοποιήθηκε σε αυτό το εργαστήριο θα πρέπει να αναφερθεί ως παραδείγματα.

Μετάξι και ιστός

Η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει επιτύχει όχι μόνο την υψηλότερη αντίθεση και τρισδιάστατη, αλλά και την τέταρτη διάσταση - χρόνο, καθιστώντας δυνατή τη μελέτη των αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα.

Ένα από τα ενδιαφέροντα έργα είναι η δημιουργία βιοαποικοδομήσιμων προθέσεων για την αποκατάσταση των αιμοφόρων αγγείων και άλλων κοίλων οργάνων. Στις απλούστερες περιπτώσεις, τέτοιες δομές κατασκευασμένες από ιστούς μοιάζουν με σωλήνες ή φιλμ που τοποθετούνται στο σημείο της βλάβης και επομένως λειτουργούν ως «μπάλωμα». Μπορούν να κατασκευαστούν από διαφορετικά υλικά, συμπεριλαμβανομένου του ινώδους μεταξιού από κουκούλια μεταξοσκώληκα. Το πλεονέκτημα αυτού του υλικού είναι ότι είναι σταθερό και σχηματίζει μια εύκαμπτη και ανθεκτική δομή της πρόθεσης. Η ίδια η πρόθεση μοιάζει με φιλμ μόνο όταν την βλέπει κανείς με γυμνό μάτι, στην πραγματικότητα, είναι μια μήτρα - μια βάση πολλαπλών στρώσεων, ένα πλαίσιο που μιμείται τη δομή του ζωντανού ιστού. Αυτό το ικρίωμα βοηθά τα νέα κύτταρα να μπουν στη σωστή θέση, διασφαλίζοντας την ομοιόμορφη κατανομή τους. Ως αποτέλεσμα, το κατεστραμμένο τοίχωμα του οργάνου αποκαθίσταται και το περιττό πλαίσιο υφίσταται βιοαποικοδόμηση. Αλλά δεν είναι τόσο εύκολο να ελέγξουμε πόσο ομοιόμορφα είναι κατανεμημένα τα κύτταρα σε όλο το πλαίσιο και αν ζουν καλά στα βαθιά στρώματα της μήτρας (αν υπάρχουν δυσκολίες στην ανταλλαγή αερίων και στην ανταλλαγή μεταβολικών προϊόντων) και αν αλλάζει μορφολογία όταν διεισδύει στο εσωτερικό του. Σε αυτό το στάδιο ήταν που η χρήση μικροσκοπίου (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) απλοποίησε πολύ την εργασία. Κυρίως λόγω της ικανότητας εξέτασης ενός αντικειμένου χωρίς καταστροφή, καθώς και λόγω της ικανότητας του μικροσκοπίου να κοιτάζει μέσα στη μήτρα σε βάθος 600 microns.

φωτογραφία

Παρόμοια εργασία έγινε με οστικό ιστό, η μήτρα του οποίου κατασκευάστηκε τόσο από το ίδιο ινώδες όσο και από τη σπινδροΐνη, μια πρωτεΐνη που ανακαλύφθηκε αρχικά στο σώμα της αράχνης και χρησιμοποιήθηκε από αυτήν για την ύφανση ιστών. Σε εργαστηριακές συνθήκες, η πρωτεΐνη δεν παράγεται καθόλου από αράχνες, αλλά από ζυμομύκητες, στο γονιδίωμα της οποίας εισάγεται ένα ελαφρώς τροποποιημένο γονίδιο αράχνης, υπεύθυνο για τη σύνθεση αυτής της πρωτεΐνης.

Όχι τόσο απλό

Αλλά, εάν η εμφάνιση βλάβης στους ιστούς είναι μια απλή και κατανοητή διαδικασία, άλλες παθολογίες δεν είναι πάντα σαφείς. Και πριν ξεκινήσετε την αποτελεσματική θεραπεία και, ειδικά, αποτρέψετε την ανάπτυξή τους, είναι απαραίτητο να μάθετε τον μηχανισμό εμφάνισής τους. Αυτές περιλαμβάνουν την αθηροσκλήρωση - μια ασθένεια των αρτηριών, ως αποτέλεσμα της οποίας τα λιπίδια συσσωρεύονται στο τοίχωμα του αγγείου, ή ακριβέστερα, στον εσωτερικό χιτώνα - το εσωτερικό του στρώμα, καθιστώντας το τοίχωμα παχύτερο, το οποίο τελικά μπορεί να οδηγήσει ακόμη και σε πλήρη απόφραξη του αγγείου . Το τι προκαλεί αυτή την ασθένεια δεν είναι απολύτως σαφές, όπως δεν είναι ξεκάθαρο και ποιος είναι ο ρόλος που παίζουν τα ανοσοεπαρκή κύτταρα, στα σημεία όπου συσσωρεύονται, σύντομα αρχίζει η αθηρογένεση. Δεν έχουν βρεθεί ακόμη πλήρεις απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα, αλλά η μελέτη της αθηρογένεσης συνεχίζεται, αν και υπάρχουν πολύ λιγότερες δημοσιεύσεις σχετικά με αυτό το θέμα από ό,τι για το θέμα των προθετικών μηχανικών ιστών.

φωτογραφία

Τύχες των μορίων

Το διατμηματικό εργαστήριο συνεστιακής μικροσκοπίας χρησιμοποιείται τακτικά στην εργασία τους από περισσότερους από 20 προπτυχιακούς και μεταπτυχιακούς φοιτητές από σχεδόν 10 τμήματα.

Οι μελέτες που περιγράφονται παραπάνω παρακολουθούν κυρίως την κατάσταση των κυττάρων. Αλλά οι δυνατότητες ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου δεν περιορίζονται σε αυτό, είναι αρκετά ικανό να παρακολουθεί ακόμη και τη μοίρα ενός μεμονωμένου μορίου σε ένα κύτταρο, εφόσον έχει φθορίζουσα δραστηριότητα. Για να γίνει αυτό, τα μόρια συνήθως επισημαίνονται με φθοριόχρωμα - ειδικές βαφές που έχουν αυτή τη δράση. Τα φθορόχρωμα υπάρχουν ως μεμονωμένα μόρια και η επισήμανσή τους περιλαμβάνει τη χημική δέσμευση του φθορίου με το μόριο που ενδιαφέρει τον ερευνητή. Μετά από αυτό, τέτοια επισημασμένα μόρια εισέρχονται στο κύτταρο και η περαιτέρω μοίρα τους παρακολουθείται χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο. Με αυτόν τον τρόπο, για παράδειγμα, συγκρίθηκαν η δραστηριότητα και η κίνηση στο κύτταρο της ρικίνης και της βισκουμίνης. Και οι δύο ουσίες είναι πρωτεϊνικές τοξίνες, και οι δύο είναι φυτικής προέλευσης και αποτελούνται από δύο μέρη - υπομονάδες, η μία από τις οποίες είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση με το κύτταρο και τη διείσδυση στο εσωτερικό και η άλλη για την αδρανοποίηση του ριβοσώματος, που τελικά οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. Το πρακτικό όφελος συνδέεται και πάλι με τη θεραπεία μιας άλλης επικίνδυνης ασθένειας - του καρκίνου. Αυτός ο σαφής «διαχωρισμός των ευθυνών» μεταξύ των υπομονάδων καθιστά δυνατή την αντικατάσταση της πρώτης υπομονάδας, για παράδειγμα, με ένα αντίσωμα. Το αποτέλεσμα είναι μια «ανοσοτοξίνη» που δρα μόνο σε ορισμένα κύτταρα στα οποία είναι κατάλληλο αυτό το αντίσωμα. Υπάρχουν δύο βασικά προβλήματα. Πρώτον: επιλογή αντισώματος που θα πλησιάζει τα καρκινικά κύτταρα και θα εμποδίζει την τοξίνη να διεισδύσει στα υγιή. Και δεύτερο: η επιλογή μιας τοξίνης που, όταν μετατραπεί σε ανοσοτοξίνη, θα παραμείνει εξαιρετικά αποτελεσματική.

φωτογραφία: Πρωτογενής καλλιέργεια καρδιακών κυττάρων νεογέννητων νεογνών επίμυων: Α - έλεγχος, Β - αγωγή με 20 μΜ ισοπροτερενόλης για 24 ώρες. 1 - χρώση TMRE των μιτοχονδρίων. 2 - αντίθεση φάσης. Κλίμακα 10 μm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. “Adaptive changes in mitochondria of cultured cardiomyocytes of newborn rats under the effect of isoproterenol.” Διεθνές συνέδριο “Receptors and intracellular signaling” 24-26 MAY 2011. Pushchino).

Εκπαίδευση

Ο κατάλογος των εργασιών που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ομοεστιακής μικροσκοπίας μπορεί να συνεχιστεί για μεγάλο χρονικό διάστημα. Αυτή η αποτελεσματική μέθοδος, η οποία επιτρέπει επίσης σε κάποιον να εργάζεται με ζωντανά κύτταρα, είναι περιζήτητη σε σχεδόν κάθε επιστημονική έρευνα. Και επομένως, η προετοιμασία των μαθητών να εργαστούν σε αυτό το εργαστήριο παίζει τεράστιο ρόλο. Το παρακολουθούν τακτικά περισσότεροι από 20 προπτυχιακοί και μεταπτυχιακοί φοιτητές που ασχολούνται με εργασίες μαθημάτων, προσχολικές εργασίες και διπλωματικές εργασίες.

Εμβρυολόγοι, μοριακοί βιολόγοι, κυτταρολόγοι, βιομηχανικοί, ανοσολόγοι και ζωολόγοι εργάζονται στις εγκαταστάσεις.

Το Εργαστήριο Συνεστιακής Μικροσκοπίας ιδρύθηκε το 2004.

Υπεύθυνος εργαστηρίου – αναπληρωτής καθηγητής Μ.Μ

Οι νέοι ειδικοί A.A.Ramonova και A.Yu

Επί του παρόντος, το εργαστήριο έχει εγκατεστημένα 2 συνεστιακά συστήματα:

• Axiovert 200M με ομοεστιακό εξάρτημα LSM510 META (Carl Zeiss, Γερμανία)
• Σύστημα σάρωσης λέιζερ ομοεστιακής σάρωσης, κατασκευασμένο από τη NIKON CORPORATION (Ιαπωνία) - ένα ανεστραμμένο ιατρικό και βιολογικό μικροσκόπιο για εργαστηριακή έρευνα Eclipse με αξεσουάρ: με βάση Ti-E, με φωτιστικό TIRF, με ομοεστιακή μονάδα A1 και συνεστιακό δίσκο περιστρεφόμενου μονάδα μέτρησης.

Όλα τα νέα"

Margolin 389p.

Το οπτικό μικροσκόπιο χρησιμοποίησε όλα τα επιτεύγματα τόσο της τεχνολογίας και της τεχνολογίας, όσο και των τεχνολογιών πληροφοριών και υπολογιστών. Αυτό οδήγησε σε σημαντικές βελτιώσεις στον υπάρχοντα εξοπλισμό και τις μεθόδους χρήσης του, οι οποίες, με τη σειρά τους, οδήγησαν στην εμφάνιση νέων μεθόδων, ιδίως της ομοεστιακής μικροσκοπίας. Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο διαφέρει από ένα κλασικό οπτικό μικροσκόπιο στο ότι κάθε στιγμή καταγράφεται μια εικόνα ενός σημείου ενός αντικειμένου και μια πλήρης εικόνα κατασκευάζεται με σάρωση (μετακίνηση του δείγματος ή αναδιάταξη του οπτικού συστήματος). Έτσι, η αρχή της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης εφαρμόζεται σε μια μοναδική μορφή, η οποία καθιστά δυνατή την καταγραφή και επεξεργασία του σήματος από κάθε μεμονωμένο σημείο για όσο χρονικό διάστημα επιθυμείτε.

Σε ένα κλασικό μικροσκόπιο, το φως από διάφορα σημεία του δείγματος εισέρχεται στον φωτοανιχνευτή. Σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο, για να καταγραφεί φως μόνο από ένα σημείο, τοποθετείται ένα μικρό διάφραγμα μετά τον αντικειμενικό φακό με τέτοιο τρόπο ώστε το φως που εκπέμπεται από το αναλυόμενο σημείο να περνά μέσα από το διάφραγμα και να καταγράφεται και το φως από το τα υπόλοιπα σημεία μπλοκάρονται κυρίως από το διάφραγμα, όπως φαίνεται στο Σχ. 7.28.

Ρύζι. 7.28. Σχέδιο μετάδοσης δέσμης σε ομοεστιακό οπτικό μικροσκόπιο

Ένα άλλο χαρακτηριστικό είναι ότι ο φωτιστής δεν δημιουργεί ομοιόμορφο φωτισμό του οπτικού πεδίου, αλλά εστιάζει το φως στο αναλυόμενο σημείο. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με την τοποθέτηση ενός δεύτερου συστήματος εστίασης πίσω από το δείγμα, αλλά αυτό απαιτεί το δείγμα να είναι διαφανές. Επιπλέον, οι αντικειμενικοί φακοί είναι συνήθως ακριβοί, επομένως η χρήση ενός δεύτερου συστήματος εστίασης για φωτισμό είναι μικρής προτίμησης. Μια εναλλακτική λύση είναι η χρήση ενός διαχωριστή δέσμης έτσι ώστε τόσο το προσπίπτον όσο και το ανακλώμενο φως να εστιάζονται από έναν μόνο φακό. Αυτό το σχέδιο διευκολύνει επίσης την προσαρμογή.

Ας εξετάσουμε τώρα πώς και πόσο ποσοτικά αλλάζει η αντίθεση όταν χρησιμοποιείται ομοεστιακή μικροσκοπία. Δεδομένου ότι το φως διέρχεται από τον φακό δύο φορές σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο, η συνάρτηση θολώματος σημείου (εφεξής PSF) θα είναι το γινόμενο των ανεξάρτητων πιθανοτήτων ότι ένα φωτόνιο θα χτυπήσει ένα σημείο με τις συντεταγμένες του ή ένα φωτόνιο θα ανιχνευθεί από αυτό το σημείο.

Εάν χρησιμοποιήσουμε το κριτήριο Rayleigh για την ανάλυση, αποδεικνύεται ότι η ανάλυση σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο αυξάνεται, αλλά όχι σημαντικά. Για ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο έχουμε μια έκφραση για την ανάλυση r:

Ενώ για ένα συμβατικό μικροσκόπιο:

Ωστόσο, το κύριο πλεονέκτημα ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου δεν είναι η αύξηση της ανάλυσης με την έννοια του κριτηρίου Rayleigh, αλλά η σημαντική αύξηση της αντίθεσης. Συγκεκριμένα, για ένα συμβατικό PSF στο εστιακό επίπεδο, ο λόγος του πλάτους στην πρώτη πλευρά μέγιστο προς το πλάτος στο κέντρο είναι 2%, και για ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο ο λόγος αυτός θα είναι 0,04%. Από αυτό προκύπτει ότι ένα αμυδρό αντικείμενο με ένταση, για παράδειγμα, 200 φορές μικρότερη από εκείνη ενός φωτεινού αντικειμένου, δεν μπορεί να ανιχνευθεί σε ένα συμβατικό μικροσκόπιο, αν και η απόσταση μεταξύ των αντικειμένων μπορεί να είναι σημαντικά μεγαλύτερη από την απόσταση που προδιαγράφεται από το κριτήριο Rayleigh . Ταυτόχρονα, ένα τέτοιο αντικείμενο πρέπει να καταγράφεται καλά σε ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Μια σημαντική παράμετρος είναι το μέγεθος των ανοιγμάτων στο εστιακό επίπεδο των φακών ακτινοβολίας και συλλογής. Η εικόνα του διαφράγματος στο επίπεδο του αντικειμένου καθορίζει από ποιες περιοχές ανιχνεύεται το φως από τον φωτοανιχνευτή. Προφανώς, η μείωση του μεγέθους του διαφράγματος οδηγεί σε μείωση της ποσότητας φωτός που μεταδίδεται, αυξάνει το επίπεδο θορύβου και τελικά μπορεί να αναιρέσει τυχόν επιτυγχανόμενα οφέλη αντίθεσης. Έτσι, τίθεται το ερώτημα σχετικά με τη βέλτιστη επιλογή μεγέθους διαφράγματος και έναν εύλογο συμβιβασμό.

Ένα διάφραγμα με μέγεθος οπής μικρότερο από το Airy σημείο απλώς οδηγεί σε απώλεια της έντασης και δεν έχει καμία επίδραση στην ανάλυση. Ένα διάφραγμα Airy ενός σημείου επιτρέπει τη μέγιστη χρήση της ικανότητας ανάλυσης του αντικειμενικού φακού. Ωστόσο, ένα διάφραγμα με μέγεθος ανοίγματος περίπου 3 έως 5 φορές μεγαλύτερο από το Airy spot φαίνεται να είναι ο καταλληλότερος συμβιβασμός. Θα πρέπει να γίνει κατανοητό ότι το μέγεθος που συζητείται εδώ αναφέρεται στο μέγεθος της εικόνας στο επίπεδο του αντικειμένου και επομένως το πραγματικό μέγεθος της οπής του ανοίγματος εξαρτάται από τη μεγέθυνση του φακού. Συγκεκριμένα, όταν χρησιμοποιείτε φακό 100x, ένα διάφραγμα με διάφραγμα 1 mm θα προεξέχει στο επίπεδο του αντικειμένου σε έναν κύκλο ακτίνας 10 μm.

Η ανάπτυξη της ιδέας της ομοεστιακής μικροσκοπίας ήταν η ανάπτυξη ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ (KJICM), το οποίο προκλήθηκε από την ανάγκη για πιο ευαίσθητες και μετρολογικά αυστηρές μεθόδους για την ανάλυση του σχήματος και της χωρικής δομής των παρατηρούμενων αντικειμένων. Ένα σχηματικό διάγραμμα του CLSM με τις κύριες λειτουργικές συνδέσεις φαίνεται στην Εικ. 7.29.

Το κύριο χαρακτηριστικό του CLSM είναι η δυνατότητα απεικόνισης στρώμα προς στρώμα του υπό μελέτη αντικειμένου με υψηλή ανάλυση και χαμηλό επίπεδο θορύβου. Αυτό επιτυγχάνεται με τη σταδιακή σάρωση του αντικειμένου με μια εστιασμένη δέσμη φωτός από μια συνεκτική πηγή ή με τη μετακίνηση της σκηνής χρησιμοποιώντας ειδικούς ανιχνευτές φθορισμού και ειδικές μεθόδους για τον περιορισμό των ροών φωτός.

Ρύζι. 7.29. Μπλοκ διάγραμμα του KJICM:

1 - πίνακας σάρωσης 2 - δείγμα δοκιμής. 3, 6 - Φακοί; 4 - συσκευή σάρωσης? 5 - πλάκα διαχωριστή δοκού. 7, 9 - διαφράγματα βελόνας. 8 - δέκτης ακτινοβολίας. 10 - λέιζερ 11 - Μπλοκ ελέγχου. 12 - υπολογιστή; 13 - μονάδα σάρωσης άξονα z.

Η χρήση διαφράγματος οπής καρφίτσας στο CLSM, οι διαστάσεις του οποίου συντονίζονται με τη μεγέθυνση και το μήκος κύματος του μικροσκοπίου, καθιστά δυνατή την αύξηση της ανάλυσης κατά περισσότερο από 10%. Είναι προφανές ότι η ανάλυση του CLSM και, κατά συνέπεια, οι δυνατότητες ανάλυσης λεπτών δομών μπορούν να υπερβούν τις παρόμοιες δυνατότητες ενός συμβατικού μικροσκοπίου κατά όχι περισσότερο από 40% υπό συνθήκες σάρωσης δείγματος με λεπτή δέσμη. Η ανάλυση του KLCM εξαρτάται από τη μέθοδο μικροσκοπίας και το φωτισμό. Καθορίζεται η ανάλυση KLCM τόσο οπτικό σύστημα όσο και ηλεκτρονική διαδρομήεπεξεργασία πληροφορίας. Επομένως, στο σχεδιασμό του KLCM, τα κυκλώματά του, πρέπει να συντονίζονται παράμετροι όπως η ανάλυση του οπτικού συστήματος, το βήμα σάρωσης, τα χαρακτηριστικά ανιχνευτή και να επιλέγονται βέλτιστοι αλγόριθμοι επεξεργασίας και κατάλληλο λογισμικό.

Γενικά, το βάθος πεδίου του KLCM εξαρτάται από το διάφραγμα, το μήκος κύματος, τη συνοχή των πηγών φωτός και το μέγεθος του διαφράγματος της ακίδας. Το διάφραγμα της βελόνας είναι το κύριο στοιχείο σχεδιασμού που διακρίνει το KLCM από άλλους τύπους μικροσκοπίων. Τα διαφράγματα βελόνας έχουν σχεδιαστεί για να δημιουργούν συνθήκες για μέγιστη ή πλήρη διήθηση του φωτός που εισέρχεται στο επίπεδο σχηματισμού εικόνας από σημεία που δεν συμπίπτουν με το εστιακό επίπεδο ή βρίσκονται δίπλα στο αναλυόμενο στοιχείο του αντικειμένου στο εστιακό επίπεδο.

Η επιλογή της βέλτιστης διαμέτρου διαφράγματος βελόνας είναι σημαντική για την απόκτηση των απαιτούμενων χαρακτηριστικών της συσκευής. Οι σχέσεις για την εκτίμηση της πλευρικής ανάλυσης και του βάθους πεδίου του KJICM λαμβάνονται με την υπόθεση ότι το διάφραγμα της βελόνας έχει μικρό άνοιγμα, που είναι ένα φωτεινό σημείο. Στην πραγματικότητα, το μέγεθος του διαφράγματος της βελόνας είναι πεπερασμένο και η εγκάρσια ανάλυση της συσκευής και η φωτεινότητα των φωτιζόμενων στοιχείων του δείγματος, μετατοπισμένα σε σχέση με το εστιακό επίπεδο κατά μήκος του άξονα, εξαρτώνται από αυτό. z,και βάθος πεδίου. Με μικρές διαμέτρους διαφράγματος βελόνας, η φωτεινή ροή γίνεται χαμηλή, γεγονός που μειώνει την αναλογία σήματος προς θόρυβο και μειώνει την αντίθεση. Σε μεγαλύτερες διαμέτρους, η αποτελεσματικότητα του διαφράγματος της βελόνας μειώνεται με τη μείωση του ανοίγματος.

Βασική ιδέα

Αρχή αισθητήρα συνεστιακού σημείου από την πατέντα του Μινσκ

Η αρχή της ομοεστιακής μικροσκοπίας κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας το 1957 από τον Marvin Minsky και επιδιώκει να ξεπεράσει ορισμένους από τους περιορισμούς των παραδοσιακών μικροσκοπίων φθορισμού ευρέως πεδίου. Σε ένα συμβατικό μικροσκόπιο φθορισμού (δηλαδή ευρέος πεδίου), ολόκληρο το δείγμα πλημμυρίζεται ομοιόμορφα με φως από την πηγή φωτός. Όλα τα μέρη του δείγματος στην οπτική διαδρομή διεγείρονται ταυτόχρονα και ο προκύπτων φθορισμός ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτοανιχνευτή ή κάμερες, συμπεριλαμβανομένου του μεγάλου τμήματος φόντου εκτός εστίασης. Αντίθετα, ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί ένα σημείο φωτισμού (δείτε τη λειτουργία εξάπλωσης σημείου) και μια μικροσκοπική οπή σε ένα οπτικά συζευγμένο επίπεδο στο μπροστινό μέρος του ανιχνευτή για την αποεστίαση του σήματος - το όνομα "confocal" προέρχεται από αυτήν τη διαμόρφωση. Μόλις το φως που εκπέμπεται από τον φθορισμό πολύ κοντά στο εστιακό επίπεδο μπορεί να ανιχνευθεί, η εικόνα σε οπτική ανάλυση, ιδιαίτερα στην κατεύθυνση του βάθους του δείγματος, είναι πολύ καλύτερη από αυτή των μικροσκοπίων ευρέος πεδίου. Ωστόσο, δεδομένου ότι το μεγαλύτερο μέρος του φωτός φθορισμού από το δείγμα εμποδίζεται από τη διάτρηση, αυτή η αυξημένη ανάλυση έρχεται σε βάρος της μειωμένης έντασης του σήματος - επομένως απαιτούνται συχνά μακροχρόνιες εκθέσεις. Για να αντισταθμίσετε αυτή την πτώση σήματος μετά παρακέντησηΗ ένταση του φωτός ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας έναν ευαίσθητο ανιχνευτή, συνήθως έναν σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) ή μια φωτοδίοδο χιονοστιβάδας, μετατρέποντας το φωτεινό σήμα σε ηλεκτρικό σήμα που καταγράφεται από υπολογιστή.

Μόλις ένα σημείο του δείγματος φωτίζεται κάθε φορά, απαιτείται σάρωση εικόνων 2D ή 3D μέσω ενός κανονικού ράστερ (δηλαδή, ενός ορθογώνιου σχεδίου παράλληλων γραμμών σάρωσης) στο δείγμα. Η δέσμη σαρώνεται κατά μήκος του δείγματος σε οριζόντιο επίπεδο χρησιμοποιώντας ένα ή περισσότερα (σερβοελεγχόμενα) ταλαντευόμενα κάτοπτρα. Αυτή η μέθοδος σάρωσης έχει συνήθως χαμηλή καθυστέρηση αντίδρασης και η ταχύτητα σάρωσης μπορεί να ποικίλλει. Η αργή σάρωση παρέχει καλύτερη αναλογία σήματος προς θόρυβο, με αποτέλεσμα καλύτερη αντίθεση και υψηλότερη ανάλυση.

Το πάχος του επιτεύξιμου εστιακού επιπέδου καθορίζεται κυρίως από το μήκος κύματος του φωτός που χρησιμοποιείται, διαιρούμενο με το αριθμητικό άνοιγμα αυτού του φακού, αλλά και από τις οπτικές ιδιότητες του δείγματος. Η λεπτή οπτική τομή καθιστά αυτούς τους τύπους μικροσκοπίων ιδιαίτερα καλούς στην τρισδιάστατη απεικόνιση και το προφίλ επιφάνειας των δειγμάτων.

Οι διαδοχικές φέτες συνθέτουν μια "στοίβα Z", η οποία μπορεί είτε να υποβληθεί σε επεξεργασία από συγκεκριμένο λογισμικό για τη δημιουργία μιας τρισδιάστατης εικόνας είτε να συνδυαστεί σε μια στοίβα 2D (κυρίως λαμβάνεται η μέγιστη ένταση εικονοστοιχείων· άλλες κοινές μέθοδοι περιλαμβάνουν τη χρήση τυπικών απόκλιση ή στοίβαξη εικονοστοιχείων).

Η ομοεστιακή μικροσκοπία παρέχει τη δυνατότητα για άμεση, μη επεμβατική, σειριακή οπτική τομή άθικτων, λίπους και ζωντανών δειγμάτων με ελάχιστη προετοιμασία δείγματος και μικρή βελτίωση στην πλευρική ανάλυση. Τα βιολογικά δείγματα συχνά επεξεργάζονται με φθορίζουσες βαφές για να γίνουν ορατά επιλεγμένα αντικείμενα. Ωστόσο, η πραγματική συγκέντρωση της βαφής μπορεί να διατηρηθεί χαμηλή για να ελαχιστοποιηθεί η διαταραχή στα βιολογικά συστήματα: ορισμένα όργανα μπορούν να παρακολουθούν μεμονωμένα φθορίζοντα μόρια. Επιπλέον, οι διαγονιδιακές τεχνικές μπορούν να δημιουργήσουν οργανισμούς που παράγουν τα δικά τους χιμαιρικά φθορίζοντα μόρια (όπως σύντηξη GFP, πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, με πρωτεΐνη ενδιαφέροντος). Τα ομοεστιακά μικροσκόπια λειτουργούν με βάση την αρχή της σημειακής διέγερσης σε ένα δείγμα (διάθλαση περιορισμένη στο σημείο) και ανίχνευσης του προκύπτοντος σημείου φθορίζοντος σήματος. Η οπή καρφίτσας στον ανιχνευτή παρέχει ένα φυσικό φράγμα που εμποδίζει τον φθορισμό εκτός εστίασης. Μόνο η εστίαση, ή το κεντρικό σημείο του Airy δίσκου, καταγράφεται. Ράστερ σάρωση του δείγματος σε ένα μόνο σημείο, ενώ επιτρέπει τη συλλογή λεπτών οπτικών τμημάτων αλλάζοντας απλώς την εστίαση Z. Οι εικόνες που προκύπτουν μπορούν να στοιβάζονται για να παραχθεί μια τρισδιάστατη εικόνα του δείγματος.

Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για οριζόντια σάρωση

Στο εμπόριο διατίθενται τέσσερις τύποι ομοεστιακών μικροσκοπίων:

Τα ομοεστιακά μικροσκόπια σάρωσης λέιζερ χρησιμοποιούν πολλαπλούς καθρέφτες (συνήθως 2 ή 3 σαρώσεις γραμμικά κατά μήκος των αξόνων x και y) για να σαρώσουν το λέιζερ στο δείγμα και να "αποσαρώσουν" την εικόνα μέσω μιας σταθερής οπής και ανιχνευτή.

Οφέλη

Το CLSM χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς βιολογικούς επιστημονικούς κλάδους, από την κυτταρική βιολογία και τη γενετική μέχρι τη μικροβιολογία και την αναπτυξιακή βιολογία. Χρησιμοποιείται επίσης στην κβαντική οπτική και τη νανοκρυσταλλική απεικόνιση και φασματοσκοπία.

Βιολογία και Ιατρική

Ένα παράδειγμα μιας στοίβας εικόνων ομοεστιακής μικροσκοπίας που δείχνει την κατανομή των νημάτων ακτίνης σε ένα κύτταρο.

Κλινικά, το CLSM χρησιμοποιείται στην αξιολόγηση διαφόρων οφθαλμικών ασθενειών και είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για απεικόνιση, ποιοτική ανάλυση και ποσοτικοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων στον κερατοειδή. Χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό και τον εντοπισμό της παρουσίας νηματοειδών μυκητιακών στοιχείων στο στρώμα του κερατοειδούς σε περιπτώσεις κερατομυκητίασης, επιτρέποντας την ταχεία διάγνωση και άρα την έγκαιρη καθιέρωση οριστικής θεραπείας. Η έρευνα στις τεχνικές CLSM για ενδοσκοπικές επεμβάσεις (ενδομικροσκόπηση) δείχνει επίσης πολλά υποσχόμενη. Στη φαρμακευτική βιομηχανία, έχει προταθεί η παρακολούθηση της διαδικασίας παραγωγής μορφών λεπτών φαρμακευτικών φιλμ για τον έλεγχο της ποιότητας και της ομοιομορφίας της διανομής του φαρμάκου.

Οπτική και κρυσταλλογραφία

Το CLSM χρησιμοποιείται ως μηχανισμός ανάκτησης δεδομένων σε ορισμένα τρισδιάστατα συστήματα αποθήκευσης οπτικών δεδομένων και έχει βοηθήσει στον προσδιορισμό της ηλικίας του παπύρου της Μαγδαληνής.

Επιλογές και βελτίωση

Βελτιωμένη αξονική ανάλυση

Η συνάρτηση διασποράς σημείου είναι ένα ελλειψοειδές σημείο, πολλές φορές όσο είναι πλατύ. Αυτό περιορίζει την αξονική ανάλυση του μικροσκοπίου. Μια μέθοδος για να ξεπεραστεί αυτό είναι η μικροσκοπία 4π, όπου προσπίπτει και εκπέμπεται φως ή μπορεί να παρεμβαίνει τόσο στο πάνω όσο και στο κάτω μέρος του δείγματος για να μειώσει τον όγκο του ελλειψοειδούς. Εναλλακτική τεχνική ομοεστιακή μικροσκοπία θήτα. Σε αυτή την τεχνική, ο κώνος του φωτισμού φωτός και το φως ανίχνευσης τοποθετούνται υπό γωνία μεταξύ τους (καλύτερα αποτελέσματα όταν είναι κάθετα). Η τομή δύο συναρτήσεων χάντικαπ δίνει πολύ μικρότερο αποτελεσματικό όγκο δείγματος. Από αυτό αναπτύχθηκε ένα μικροσκόπιο φωτισμού μονού επιπέδου. Επιπλέον, η αποσυνέλιξη μπορεί να χρησιμοποιηθεί χρησιμοποιώντας μια πειραματικά προερχόμενη λειτουργία εξάπλωσης σημείου για την αφαίρεση του φωτός εκτός εστίασης, βελτιώνοντας την αντίθεση τόσο στο αξονικό όσο και στο πλάγιο επίπεδο.

Σούπερ ανάλυση

Υπάρχουν ομοεστιακές παραλλαγές που επιτυγχάνουν ανάλυση κάτω από το όριο περίθλασης, όπως το μικροσκόπιο εξάντλησης διεγερμένων εκπομπών (STED). Εκτός από αυτήν την τεχνική, είναι διαθέσιμη μια μεγάλη ποικιλία άλλων τεχνικών υπερ-ανάλυσης (μη συνεστιακή) όπως η παλάμη, η (e)STORM, οι κάρτες SIM κ.λπ. Όλα έχουν τα πλεονεκτήματά τους, όπως η ευκολία χρήσης, η ανάλυση και η ανάγκη για ειδικό εξοπλισμό, ρυθμιστικό ή φθοροφόρο.

Απόδοση σε χαμηλή θερμοκρασία

Για την απεικόνιση δειγμάτων σε χαμηλές θερμοκρασίες, έχουν χρησιμοποιηθεί δύο κύριες προσεγγίσεις, και οι δύο αρχιτεκτονικές που βασίζονται σε ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ. Μια προσέγγιση είναι η χρήση κρυοστάτη συνεχούς ροής: μόνο το δείγμα διατηρείται σε χαμηλή θερμοκρασία και διευθυνσιοδοτείται οπτικά μέσω ενός διαφανούς παραθύρου. Μια άλλη πιθανή προσέγγιση είναι η τοποθέτηση μέρους της οπτικής (ειδικά ενός αντικειμενικού μικροσκοπίου) σε μια φιάλη Dewar κρυογονικής αποθήκευσης. Αυτή η δεύτερη προσέγγιση, αν και πιο δυσκίνητη, εγγυάται καλύτερη μηχανική σταθερότητα και αποφεύγει τις απώλειες λόγω του παραθύρου.

εικόνες

Μερικό προφίλ της επιφάνειας ενός κέρματος του 1 Ευρώ, μετρημένο με ομοεστιακή μικροσκοπία δίσκου Nipkow.

Αντανάκλαση δεδομένων για κέρμα 1 ευρώ.

ιστορία

Έναρξη: 1940-1957

Πρώτο συνεστιακό έρευναΤο μικροσκόπιο κατασκευάστηκε από τον Marvin Minskow το 1955 και ένα δίπλωμα ευρεσιτεχνίας κατατέθηκε το 1957. Η σάρωση ενός σημείου φωτισμού εστιακού επιπέδου επιτεύχθηκε μετακινώντας τη σκηνή. Δεν παρουσιάστηκε καμία επιστημονική δημοσίευση και δεν διατηρήθηκαν εικόνες από αυτήν.

Διαδοχικό μικροσκόπιο σάρωσης

Σχέδιο της διαδοχικής μικροσκοπίας σάρωσης Petran. Προστέθηκε μια κόκκινη γραμμή για να υποδείξει τον δίσκο Nipkow.

Το 1960, η Τσεχοσλοβακική Ιατρική Σχολή Mojmir Petran στο Πανεπιστήμιο Charles στο Πίλσεν ανέπτυξε το μικροσκόπιο σάρωσης Tandem, το πρώτο συνεστιακό μικροσκόπιο που διατέθηκε στο εμπόριο. Πωλήθηκε σε μια μικρή εταιρεία στην Τσεχοσλοβακία και στις Ηνωμένες Πολιτείες από την Tracor-North (αργότερα NORAN) και χρησιμοποίησε έναν περιστρεφόμενο δίσκο Nipkow για να δημιουργήσει πολλαπλές διεγέρσεις και εκπομπές μικροοπών.

Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας της Τσεχοσλοβακίας κατατέθηκε το 1966 από τον Petran και τον Milan Hadravský, έναν Τσεχοσλοβάκο συνάδελφο. Η πρώτη επιστημονική δημοσίευση με δεδομένα και εικόνες που ελήφθησαν με αυτό το μικροσκόπιο δημοσιεύτηκε στο περιοδικό Science το 1967, με συγγραφέα τον M. David Egger του Πανεπιστημίου Yale και του Petran. Μια υποσημείωση σε αυτό το άρθρο αναφέρει ότι ο Petran σχεδίασε το μικροσκόπιο και επέβλεπε την κατασκευή του και ότι ήταν, εν μέρει, «ερευνητής» στο Πανεπιστήμιο του Γέιλ. Μια δεύτερη έκδοση από το 1968 περιέγραψε τη θεωρία και τις τεχνικές λεπτομέρειες του οργάνου και είχε ως πρόσθετους συγγραφείς τους Hadravský και Robert Galambos, επικεφαλής της ομάδας στο Πανεπιστήμιο Yale. Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ εκδόθηκε το 1970. Κατατέθηκε το 1967.

1969: Πρώτη ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ

Το 1969 και το 1971, ο M. David Egger και ο Paul Davidovits του Πανεπιστημίου Yale, δημοσίευσαν δύο εργασίες που περιγράφουν την πρώτη συνεστιακή λέιζερμικροσκοπία σάρωσης. Αυτό ήταν ένα σημείο σαρωτή, που σημαίνει ότι δημιουργήθηκε μόνο ένας φωτισμός σημείου. Χρησιμοποιεί μικροσκόπιο επι-φωτισμού-αντανάκλασης για την παρατήρηση του νευρικού ιστού. Ένα λέιζερ ηλίου-νέον 5 mW με μήκος κύματος 633 nm αντανακλούσε το φως από ένα ημιδιαφανές κάτοπτρο προς τον στόχο. Ο στόχος ήταν ένας απλός φακός με εστιακή απόσταση 8,5 mm. Σε αντίθεση με όλα τα προηγούμενα και τα πιο πρόσφατα συστήματα, το δείγμα σαρώθηκε μετακινώντας αυτόν τον φακό (το στόχο σάρωσης), που προκαλεί την κίνηση του εστιακού σημείου. Το ανακλώμενο φως επέστρεψε στον ημιδιαφανή καθρέφτη, το μεταδιδόμενο τμήμα προσανατολίστηκε από έναν άλλο φακό σε ανίχνευση σημείου, πίσω από τον οποίο τοποθετήθηκε ο σωλήνας φωτοπολλαπλασιαστή. Το σήμα απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας έναν παλμογράφο CRT η δέσμη ηλεκτρονίων μεταφέρθηκε ταυτόχρονα στον στόχο. Μια ειδική συσκευή κατέστησε δυνατή τη λήψη φωτογραφιών Polaroid, τρεις από τις οποίες παρουσιάστηκαν σε μια δημοσίευση του 1971.

Οι συγγραφείς αναλογίζονται τις φθορίζουσες βαφές για in vivo μελέτες. Επικαλούνται το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας Minsky, χάρη στον Steve Baer, ​​τότε διδακτορικό φοιτητή στην Ιατρική Σχολή Albert Einstein στη Νέα Υόρκη, όπου ανέπτυξε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης, ο οποίος πρότεινε τη χρήση λέιζερ με «μικροσκόπιο Minsky» και ευχαριστεί στον Γκάλαμπο, τον Χαντράβσκι και τον Πετράν για συζητήσεις που οδήγησαν στην ανάπτυξη του μικροσκοπίου του. Το κίνητρο για την ανάπτυξή τους ήταν ότι στη διαδοχική μικροσκοπία σάρωσης μόνο ένα κλάσμα 10-7 του φωτιστικού φωτός εμπλέκεται στη δημιουργία της εικόνας σε μέρος του ματιού. Έτσι, η ποιότητα της εικόνας δεν ήταν επαρκής για τις περισσότερες βιολογικές μελέτες.

1977-1985: Spot scanners με λέιζερ και σάρωση σκηνής

Το 1977, ο Colin JR Sheppard και ο Tony Wilson περιέγραψαν συνεστιακούς ανιχνευτές σωλήνων φωτοπολλαπλασιαστή, φωτιζόμενους με επι-λέιζερ, στάδιο σάρωσης και φωτοπολλαπλασιαστή. Η σκηνή μπορούσε να μετακινηθεί κατά μήκος του οπτικού άξονα (άξονας Z), επιτρέποντας οπτικές σειριακές τομές.

Το 1979, ο Fred Brakenhoff και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι τα θεωρητικά οφέλη της οπτικής τομής και της βελτιωμένης ανάλυσης ήταν πραγματικά επιτεύξιμα στην πράξη. Το 1985, αυτή η ομάδα έγινε η πρώτη που δημοσίευσε συναρπαστικές εικόνες ομοεστιακής μικροσκοπίας που μπορούσαν να απαντήσουν σε βιολογικά ερωτήματα. Αμέσως μετά, πολλές περισσότερες ομάδες άρχισαν να χρησιμοποιούν συνεστιακή μικροσκοπία για να απαντήσουν σε επιστημονικά ερωτήματα που παρέμεναν ακόμα μυστήριο λόγω τεχνολογικών περιορισμών.

Το 1983, ο IJ Cox και ο S. Sheppard της Οξφόρδης δημοσίευσαν την πρώτη εργασία για ένα συνεστιακό μικροσκόπιο ελεγχόμενο από υπολογιστή. Το πρώτο εμπορικό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ, ο σαρωτής σκηνής SOM-25 προσφέρθηκε από την Oxford Optoelectronics (μετά από αρκετές εξαγορές TAKE-frame από την BioRad) ξεκινώντας το 1982. Βασίστηκε στο σχέδιο του ομίλου της Οξφόρδης.

Από το 1985: Σαρωτές σημείων λέιζερ με σάρωση δέσμης

Στα μέσα της δεκαετίας του 1980, ο William Bradshaw Amos και ο John Graham White και οι συνεργάτες του που εργάζονταν στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας στο Cambridge κατασκεύασαν το πρώτο μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακής δέσμης. Το στάδιο δείγματος δεν μετακινείται, αντίθετα φωτίζει το σημείο, επιτρέποντας την ταχύτερη λήψη εικόνας: τέσσερις εικόνες ανά δευτερόλεπτο με 512 γραμμές η καθεμία. Οι ενδιάμεσες εικόνες είναι πολύ υπερβολικές, λόγω του μήκους της διαδρομής της δέσμης 1-2 μέτρων, επιτρέποντας τη χρήση ενός συμβατικού διαφράγματος ίριδας ως «τρύπα», με διάμετρο ~1 mm. Οι πρώτες μικρογραφίες λήφθηκαν με παρατεταμένη έκθεση σε φιλμ πριν από την προσθήκη της ψηφιακής κάμερας. Περαιτέρω βελτίωση επέτρεψε την κλιμάκωση στην προετοιμασία για πρώτη φορά. Η Zeiss περίπου την ίδια εποχή οδήγησε στο εμπορικό CLSM που διανέμεται από τη σουηδική εταιρεία Sarastro. Η επιχείρηση εξαγοράστηκε το 1990 από τη Molecular Dynamics, αλλά η CLSM τελικά σταμάτησε. Στη Γερμανία, η Heidelberg Instruments, που ιδρύθηκε το 1984, ανέπτυξε το CLSM, το οποίο αρχικά προοριζόταν για βιομηχανικές εφαρμογές και όχι για βιολογία. Αυτό το έγγραφο μεταφέρθηκε το 1990 στη Leica Lasertechnik. Το Zeiss ήταν ήδη ένα μη ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ σημείων στην αγορά, το οποίο αναβαθμίστηκε σε ομοεστιακό. Η έκθεση του 1990 σημείωσε "ορισμένους" κατασκευαστές συνεστιακού τύπου: Sarastro, Technical Instruments, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic και Zeiss.

Το 1989, ο Fritz Karl Preikschat, με τον γιο του Ekhard Preikschat, εφηύρε το μικροσκόπιο σάρωσης με διόδους λέιζερ για ανάλυση μεγέθους σωματιδίων. Αυτός και ο Ekhard Preikschat συνίδρυσαν τη Lasentec για να την εμπορευματοποιήσουν. Το 2001, η Lasentec εξαγοράστηκε από τη Mettler Toledo (NYSE: MPD). Περίπου δέκα χιλιάδες συστήματα έχουν εγκατασταθεί παγκοσμίως, κυρίως στη φαρμακοβιομηχανία για την παροχή επιτόπου ελέγχου της διαδικασίας κρυστάλλωσης σε μεγάλα συστήματα καθαρισμού.

• Μικροσκόπιο διέγερσης δύο φωτονίων: Αν και χρησιμοποιούν κατάλληλη τεχνολογία (και τα δύο μικροσκόπια σάρωσης λέιζερ), τα μικροσκόπια φθορισμού πολλαπλών φωτονίων δεν είναι αυστηρά ομοεστιακά μικροσκόπια. Ορος ομοεστιακόςπροκύπτει λόγω της παρουσίας άνοιγμα V συζευγμένο εστιακό επίπεδο(ομοεστιακό). Αυτό το διάφραγμα συνήθως λείπει στα πολυφωτονικά μικροσκόπια.
• Μικροσκόπιο φθορισμού ολικής εσωτερικής ανάκλασης (TIRF) o
  ομοεστιακή μικροσκοπία
  • Εικονικό CLSM (βασισμένο σε Java)
  • Κινούμενη εικόνα και επεξήγηση σε διαφορετικούς τύπους μικροσκοπίων, συμπεριλαμβανομένων μικροσκοπίων φθορισμού και ομοεστιακών μικροσκοπίων. (Université Paris Sud)

  

Η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με την παραδοσιακή οπτική μικροσκοπία, όπως ρυθμιζόμενο βάθος πεδίου, εξαίρεση πληροφοριών εκτός εστίασης που υποβαθμίζουν την εικόνα και δυνατότητα διαδοχικής ανάλυσης οπτικών τμημάτων παχύρρευστων δειγμάτων. Η ουσία της συνεστιακής μεθόδου είναι η χρήση χωρικού φιλτραρίσματος για την αποκοπή του φωτός από ένα μέρος του δείγματος εκτός εστίασης (φωτισμός φόντου), όταν το πάχος του δείγματος είναι μεγαλύτερο από το εστιακό επίπεδο. Τα τελευταία χρόνια παρατηρήθηκε έκρηξη στη δημοτικότητα της ομοεστιακής μικροσκοπίας, εν μέρει λόγω της ευκολίας λήψης εξαιρετικά υψηλής ποιότητας εικόνων δειγμάτων που προετοιμάζονται για παραδοσιακή οπτική μικροσκοπία, και εν μέρει λόγω του ευρέος φάσματος εφαρμογών σε πολλούς τομείς ερευνητικού ενδιαφέροντος σήμερα .

ΒΑΣΙΚΕΣ ΕΝΝΟΙΕΣ

Αν και τα σύγχρονα όργανα διαφέρουν σημαντικά από τις παλαιότερες εκδόσεις, η αρχή της ομοεστιακής απεικόνισης που πρωτοστάτησε από τον Marvin Minsky και κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας το 1957 χρησιμοποιείται σε όλα τα σύγχρονα ομοεστιακά μικροσκόπια. Στα παραδοσιακά μικροσκόπια ευρέως πεδίου, ολόκληρο το δείγμα φωτίζεται από μια πηγή φωτός υδραργύρου ή ξένον και η εικόνα είτε παρατηρείται οπτικά είτε προβάλλεται σε συσκευή εγγραφής εικόνας ή φωτογραφικό φιλμ. Η μέθοδος σχηματισμού εικόνας με ομοεστιακό μικροσκόπιο είναι θεμελιωδώς διαφορετική. Ο φωτισμός επιτυγχάνεται με σάρωση ολόκληρης της επιφάνειας του δείγματος με μία ή περισσότερες εστιασμένες δέσμες φωτός, συνήθως από μια πηγή τόξου λέιζερ. Η φωτισμένη περιοχή του δείγματος εστιάζει από έναν φακό και στη συνέχεια σαρώνεται χρησιμοποιώντας μια συσκευή σάρωσης που ελέγχεται από υπολογιστή. Η ακολουθία των ακτίνων φωτός από το δείγμα ανιχνεύεται μέσω ενός διαφράγματος με οπή καρφίτσας (ή σε ορισμένες περιπτώσεις ενός διαφράγματος με σχισμή) από έναν σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή (PMT), του οποίου η έξοδος μετατρέπεται σε εικόνα που εμφανίζεται σε υπολογιστή. Αν και τα μη χρωματισμένα δείγματα μπορούν να παρατηρηθούν από το φως που ανακλάται από αυτά, συνήθως επισημαίνονται με μία ή περισσότερες φθορίζουσες βαφές.

Μέθοδοι λήψης εικόνας

Η ομοεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιεί μια ποικιλία τεχνικών απεικόνισης για να εξετάσει έναν τεράστιο αριθμό διαφορετικών τύπων δειγμάτων. Όλα βασίζονται στην τεχνική ικανότητα λήψης εικόνων υψηλής ευκρίνειας, που ονομάζονται οπτικές τομές, σε μια ακολουθία σχετικά παχύρρευστων τμημάτων ή ολόκληρου του δείγματος (ολόκληρη η βάση). Η οπτική τομή είναι το βασικό στοιχείο της εικόνας. Οι ίδιες οι εικόνες λαμβάνονται με παρατήρηση δεσμευμένων και χρωματισμένων δειγμάτων σε λειτουργίες φωτισμού απλού, διπλού, τριπλού και πολλαπλού μήκους κύματος και οι εικόνες που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας διαφορετικές τεχνικές φωτισμού και χρώσης θα συσχετίζονται με ακρίβεια μεταξύ τους. Είναι δυνατή η λήψη εικόνων ενός ζωντανού κυττάρου και μιας προσωρινά ξεδιπλωμένης ακολουθίας εικόνων (καταχώριση εικόνων σε δεδομένο χρονικό διάστημα) και οι μέθοδοι αριθμητικής επεξεργασίας που εφαρμόζονται σε ακολουθίες εικόνων επιτρέπουν τη δημιουργία μιας ολοκληρωμένης ολόκληρης εικόνας από μια σειρά z- εικόνες άξονα και τρισδιάστατες εικόνες δειγμάτων, καθώς και αναπαράσταση τρισδιάστατων δεδομένων σε χρονική ακολουθία, δηλαδή τετραδιάστατη εικόνα. Πρώιμα ομοεστιακά μικροσκόπια που απεικονίζονται με χρήση ανακλώμενου φωτός, αλλά στην πραγματικότητα, ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε πηγή μεταδιδόμενου φωτός που χρησιμοποιείται συνήθως στη μικροσκοπία.

Δημιουργία εικόνας

Οι διαδικασίες για την προετοιμασία του δείγματος και την απεικόνιση με ομοεστιακά μικροσκόπια είναι ουσιαστικά αυτές που έχουν αναπτυχθεί με τα χρόνια στην παραδοσιακή μικροσκοπία ευρέος πεδίου. Στη βιοϊατρική, η κύρια εφαρμογή της ομοεστιακής μικροσκοπίας είναι η απεικόνιση δεσμευμένων ή ζωντανών κυττάρων και ιστών, οι οποίοι συνήθως χρωματίζονται με μία ή περισσότερες φθορίζουσες ετικέτες. Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών φθοριζόντων χρωστικών που μπορούν να ενσωματωθούν σε σχετικά απλά πρωτόκολλα και να χρησιμοποιηθούν για τη χρώση συγκεκριμένων κυτταρικών οργανιδίων και δομών. Μεταξύ της τεράστιας ποικιλίας χρωστικών που διατίθενται, υπάρχουν, για παράδειγμα, χρωστικές για τον πυρήνα, η συσκευή Golgi, το ενδοπλασματικό δίκτυο, τα μιτοχόνδρια, καθώς και βαφές όπως η φθορίζουσα φαλλοιδίνη, η οποία υποδεικνύει πολυμερισμένη ακτίνη στα κύτταρα. Ανεξάρτητα από τη μέθοδο προετοιμασίας του δείγματος που χρησιμοποιείται, το κύριο πλεονέκτημα της ομοεστιακής μικροσκοπίας είναι η ευελιξία στην παρουσίαση και ανάλυση εικόνας που προκύπτει από την ταυτόχρονη λήψη πολλαπλών εικόνων και την ψηφιακή τους παρουσίαση σε υπολογιστή.

Κρίσιμες πτυχές της ομοεστιακής μικροσκοπίας

Η ποσοτική τρισδιάστατη απεικόνιση στη μικροσκοπία φθορισμού συχνά περιπλέκεται από τεχνουργήματα που εισάγονται κατά την προετοιμασία του δείγματος λόγω ελεγχόμενων και μη ελεγχόμενων πειραματικών ποσοτήτων ή ζητημάτων τοποθέτησης και διάταξης μικροσκοπίου. Αυτό το άρθρο, γραμμένο από τον Δρ. James B. Pauley, συστηματοποιεί τους πιο κοινούς εξωτερικούς παράγοντες που συχνά συγκαλύπτουν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται στον φθορισμό ευρέως πεδίου και στην ομοεστιακή μικροσκοπία. Τα θέματα που συζητήθηκαν περιλαμβάνουν το σύστημα λέιζερ, την ευθυγράμμιση των οπτικών στοιχείων, την αντικειμενική μεγέθυνση, τα τεχνουργήματα λεύκανσης, τις εκτροπές, το λάδι εμβάπτισης, το πάχος της καλυπτρίδας, την κβαντική απόδοση και το περιβάλλον δείγματος.

Εκτροπές σε πολύχρωμη ομοεστιακή μικροσκοπία

Οι βελτιώσεις στο σχεδιασμό έχουν απλοποιήσει την ομοεστιακή μικροσκοπία σε σημείο που έχει γίνει ένα κοινό εργαλείο για την έρευνα της κυτταρικής βιολογίας. Αλλά καθώς τα ομοεστιακά μικροσκόπια έχουν γίνει πιο ισχυρά, έχουν τεθεί μεγαλύτερες απαιτήσεις στα οπτικά τους. Στην πραγματικότητα, οι οπτικές εκτροπές που προκαλούν μικρά ελαττώματα εικόνας στη μικροσκοπία ευρέος πεδίου μπορεί να έχουν καταστροφικά αποτελέσματα στη συνεστιακή μικροσκοπία. Δυστυχώς, οι αυστηρές οπτικές απαιτήσεις της ομοεστιακής μικροσκοπίας συχνά κρύβονται από οπτικά συστήματα που εγγυώνται ευκρινείς εικόνες ακόμη και με αδύναμο μικροσκόπιο. Οι κατασκευαστές οπτικών παράγουν πολλούς διαφορετικούς φακούς μικροσκοπίου σχεδιασμένους για συγκεκριμένες εφαρμογές. Αυτό το άρθρο δείχνει πώς οι αντικειμενικές ανταλλαγές επηρεάζουν την ομοεστιακή μικροσκοπία.

Τρίχρωμη απεικόνιση σε ομοεστιακή μικροσκοπία

Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (LSCM) χρησιμοποιείται συνήθως για τη λήψη ψηφιακών εικόνων δειγμάτων φθορισμού που φέρουν μία, δύο και τρεις ετικέτες. Η χρήση των χρωμάτων κόκκινου, πράσινου και μπλε (RGB) είναι πιο κατατοπιστική για την αναπαράσταση της κατανομής φωτός έως και τριών φθοριζόντων σημαδιών κυψελών όταν χρησιμοποιείται ένα συμπληρωματικό χρώμα για κάθε σχετική θέση και όταν οι εικόνες διαφορετικών χρωμάτων σχηματίζουν ένα ενιαίο μοτίβο χρώματος. Σε αυτήν την ενότητα, θα εξετάσουμε μια απλοποιημένη έκδοση μιας πρόσφατα δημοσιευμένης μεθόδου για τη λήψη τρίχρωμων συνεστιακών εικόνων χρησιμοποιώντας το δημοφιλές πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας, το Adobe Photoshop. Επιπλέον, συζητούνται διάφορες εφαρμογές για τη δημιουργία ενός πρωτοκόλλου απεικόνισης τριών χρωμάτων για ομοεστιακή παρουσίαση εικόνων. Αξίζει να έχετε κατά νου ότι αυτές οι αριθμητικές μέθοδοι δεν περιορίζονται σε εικόνες LSCM και μπορούν να εφαρμοστούν σε ψηφιακές εικόνες που εισάγονται στο Photoshop από άλλες πηγές.

Βασικά στοιχεία της ομοεστιακής μικροσκοπίας ανάκλασης

Το μικροσκόπιο ομοεστιακής ανάκλασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη λήψη πρόσθετων πληροφοριών σχετικά με ένα δείγμα με σχετικά μικρή πρόσθετη προσπάθεια, επειδή οι τεχνικές απαιτούν ελάχιστη προετοιμασία δείγματος και αλλαγή εξοπλισμού. Επιπλέον, με το ομοεστιακό μικροσκόπιο ανάκλασης, οι πληροφορίες από μη χρωματισμένους ιστούς είναι τόσο άμεσα διαθέσιμες όσο τα δεδομένα που λαμβάνονται από χρωματισμένα δείγματα που αντανακλούν το φως. Αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να συνδυαστεί με πιο κοινές τεχνικές απεικόνισης φθορισμού. Παραδείγματα πρόσφατων εφαρμογών περιλαμβάνουν την καταγραφή μη χρωματισμένων κυττάρων σε έναν πληθυσμό κυττάρων που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό και την παρατήρηση αλληλεπιδράσεων μεταξύ κυττάρων που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό που αναπτύσσονται σε ένα αδιαφανές δομημένο υπόστρωμα.

Συνεστιακή συλλογή εικόνων

Το Nikon MicroscopyU Confocal Image Gallery είναι μια ακολουθία ψηφιακών εικόνων που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Nikon PCM-2000 σε συνδυασμό με ένα όρθιο μικροσκόπιο Eclipse E-600. Μια ακολουθία εικόνων οπτικών τμημάτων σε διαφορετικά επίπεδα του δείγματος ελήφθη με σάρωση κατά μήκος του οπτικού άξονα του μικροσκοπίου. Η ακολουθία αντιπροσωπεύεται από μια διαδραστική εφαρμογή Java που σας επιτρέπει είτε να «παίζετε» μια σειρά από slices αυτόματα ή να τις μετακινείτε εμπρός και πίσω σαν διαφάνειες.

Συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ

Έχουν αναπτυχθεί αρκετές τεχνικές για να ξεπεραστεί το φαινόμενο της κακής αντίθεσης που είναι εγγενές σε εικόνες παχύρρευστων δειγμάτων που παράγονται συνήθως από μικροσκόπια. Οι τεχνικές ομοεστιακής και αποσυνέλιξης παράγουν σημαντικά καλύτερες εικόνες δειγμάτων μεσαίου πάχους (5 έως 15 μικρά). Οι εικόνες των παχύτερων δειγμάτων (20 micron ή περισσότερο) υποβαθμίζονται από την έκθεση σε υψηλό φως περιβάλλοντος από περιοχές εκτός εστίασης και ίσως λαμβάνονται καλύτερα με τεχνικές ομοεστιακής μικροσκοπίας. Χρησιμοποιώντας αυτό το σεμινάριο, τα δείγματα παρουσιάζονται ως μια σειρά οπτικών τμημάτων κατά μήκος του άξονα z χρησιμοποιώντας ένα εικονικό ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Συνεστιακή μικροσκοπία ανάκλασης

Χρησιμοποιήστε αυτό το σεμινάριο για να εξερευνήσετε μεμονωμένα επιφανειακά στρώματα ολοκληρωμένων κυκλωμάτων. Οι ψηφιακές εικόνες για καθοδήγηση αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα συνεστιακό μικροσκόπιο ανάκλασης Nikon Optiphot C200. Για κάθε σειρά, καταγράφηκε μια ακολουθία οπτικών τμημάτων κατά μήκος του άξονα z καθώς το μικροσκόπιο διείσδυσε και εστίαζε βαθιά μέσα (σε βήματα του 1 μικρομέτρου) το μωσαϊκό των κυκλωμάτων στην επιφάνεια του κρυστάλλου πυριτίου.

Βασικές διατάξεις

Σε σύγκριση με την παραδοσιακή μικροσκοπία, η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει πολλά πλεονεκτήματα, συμπεριλαμβανομένου του μικρού βάθους διείσδυσης στο υπό μελέτη δείγμα, της απουσίας φωτισμού του φόντου και της δυνατότητας λήψης μιας σειράς οπτικών τμημάτων παχύρρευστων δειγμάτων. Στη βιοϊατρική, η κύρια εφαρμογή της ομοεστιακής μικροσκοπίας είναι η απεικόνιση δεσμευμένων ή ζωντανών κυττάρων και ιστών, οι οποίοι τυπικά επισημαίνονται με μία ή περισσότερες φθορίζουσες ετικέτες.

Ρύζι. 1. Σχέδιο διαδρομής ακτίνων σε ομοεστιακή μικροσκοπία

Κατά την απεικόνιση δειγμάτων φθορισμού με ένα παραδοσιακό μικροσκόπιο ευρέος πεδίου, η δευτερογενής φωταύγεια που εκπέμπεται από το δείγμα από περιοχές εκτός της μελέτης συχνά επηρεάζει την ευκρίνεια της εικόνας των χαρακτηριστικών που βρίσκονται σε εστίαση. Αυτό είναι ιδιαίτερα προβληματικό για πάχη δειγμάτων μεγαλύτερα από 2 μικρόμετρα. Η ομοεστιακή μικροσκοπία παρέχει μέτριες βελτιώσεις τόσο στην αξονική όσο και στην επίπεδη ανάλυση. Αλλά είναι η ικανότητα εξάλειψης του φωτός φόντου που εμφανίζεται σε δείγματα μεγάλου πάχους που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό που έχει προκαλέσει μια πρόσφατη αύξηση της δημοτικότητας αυτής της ερευνητικής μεθόδου. Καθώς είναι σχετικά εύκολο στη χρήση, τα περισσότερα σύγχρονα ομοεστιακά μικροσκόπια έχουν γίνει μέρος του βασικού εξοπλισμού σε πολλά συστήματα απεικόνισης πολλών χρηστών. Δεδομένου ότι η ανάλυση που επιτυγχάνεται με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (LSCM) είναι ελαφρώς καλύτερη από ένα παραδοσιακό οπτικό μικροσκόπιο ευρέος πεδίου, αλλά εξακολουθεί να είναι σημαντικά χαμηλότερη από την ανάλυση ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης, κατά μία έννοια έχει γίνει μια γέφυρα μεταξύ των δύο πιο κοινές μέθοδοι έρευνας. Το σχήμα 1 δείχνει ένα σχηματικό διάγραμμα της διέλευσης του φωτός σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο βασικής διαμόρφωσης.

Στα παραδοσιακά μικροσκόπια ευρέος πεδίου, ολόκληρο το δείγμα φωτίζεται με πηγή φωτός υδραργύρου ή ξένου και η εικόνα είτε παρατηρείται οπτικά είτε προβάλλεται σε συσκευή απεικόνισης ή φωτογραφικό φιλμ. Η μέθοδος λήψης εικόνας με ομοεστιακό μικροσκόπιο είναι θεμελιωδώς διαφορετική. Το δείγμα φωτίζεται σαρώνοντάς το με μία ή περισσότερες εστιασμένες ακτίνες, συνήθως λέιζερ (Εικόνα 2). Οι εικόνες που λαμβάνονται με τη σάρωση του δείγματος ονομάζονται επομένως οπτικές τομές. Αυτή η ορολογία αναφέρεται σε μια μη επεμβατική τεχνική δοκιμής στην οποία οι εικόνες λαμβάνονται χρησιμοποιώντας εστιασμένο φως και όχι με φυσική ανατομή του δείγματος.

Ρύζι. 2. Σάρωση δειγμάτων ευρέως πεδίου και σημείου

Η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει απλοποιήσει πολύ τη μελέτη των ζωντανών δειγμάτων, καθιστώντας δυνατή τη λήψη δεδομένων σε τρεις διαστάσεις (σειρά z) και βελτιώνοντας τη διαδικασία απεικόνισης πολυχρωματισμένων δειγμάτων. Το Σχήμα 3 συγκρίνει μια παραδοσιακή επισκοπική εικόνα φθορισμού με μια ομοεστιακή εικόνα των ίδιων τμημάτων μιας χρυσαλλίδας πεταλούδας ολόκληρου με επιθήλιο χρωματισμένο με ιωδιούχο προπίδιο. Είναι εμφανής μια εντυπωσιακή αύξηση της ανάλυσης και, κατά συνέπεια, η ευκρίνεια της εικόνας των πυρήνων σε μια εικόνα LSCM, λόγω της εξάλειψης της εκπομπής φθορισμού εκτός εστίασης.

Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ (LSCM)

Το LSCM είναι πλέον η πιο κοινή έκδοση ομοεστιακών μικροσκοπίων που χρησιμοποιούνται στη βιοϊατρική. Στην εισαγωγή, δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στο LSCM, καθώς ο σχεδιασμός και η δομή αυτών των μικροσκοπίων επιτρέπει ακόμη και αρχάριους χρήστες να εργαστούν μαζί τους. Άλλες σχεδιαστικές λύσεις έχουν καταλάβει τις δικές τους ειδικές θέσεις στη βιολογία. Για οποιοδήποτε μοντέλο ή τροποποίηση ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου, ισχύουν οι περισσότεροι κανόνες για την προετοιμασία του δείγματος, με μικρές τροποποιήσεις, όπως και άλλες τεχνικές που βασίζονται στην οπτική τομή, όπως η αποσυνέλιξη και οι τεχνικές πολλαπλών φωτονίων.

Ανάπτυξη ομοεστιακής μικροσκοπίας

Η εφεύρεση του ομοεστιακού μικροσκοπίου πιστώνεται στον Marvin Minsky, ο οποίος δημιούργησε ένα μικροσκόπιο εργασίας το 1955. Η ανάπτυξη της ομοεστιακής μικροσκοπίας καθοδηγήθηκε σε μεγάλο βαθμό από την επιθυμία να παρατηρηθούν βιολογικές διεργασίες σε ζωντανούς ιστούς (in vivo) και ο στόχος του Minsky ήταν να απεικονίσει το νευρωνικό δίκτυο σε ένα μη χρωματισμένο παρασκεύασμα ενός ζωντανού εγκεφάλου. Οι αρχές της ομοεστιακής μικροσκοπίας, που πρωτοστάτησε από τον Minsky και κατοχυρώθηκε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας το 1957, χρησιμοποιούνται σε όλα τα σύγχρονα ομοεστιακά μικροσκόπια. Το Σχήμα 1 εξηγεί την ομοεστιακή αρχή, όπως εφαρμόζεται στη μικροσκοπία επιφθορισμού, η οποία αποτελεί τη βάση όλων των σύγχρονων ομοεστιακών συστημάτων που χρησιμοποιούνται στην απεικόνιση φθορισμού. Στην αρχική διαμόρφωση, ο Minsky χρησιμοποίησε μια οπή καρφίτσας (διάφραγμα) τοποθετημένη απέναντι από μια πηγή φωτός τόξου ζιρκονίου που χρησιμοποιείται ως πηγή φωτός με οπή.

Ρύζι. 3. Επιθήλιο φτερού πεταλούδας

Το φως από μια σημειακή πηγή εστιάστηκε με τη μορφή ενός σημείου από έναν φακό σε ένα δεδομένο εστιακό επίπεδο στο δείγμα και, περνώντας μέσα από αυτό, εστιάστηκε από έναν δεύτερο φακό σε μια δεύτερη οπή καρφίτσας (pinhole), η οποία ήταν εστιασμένη με την πρώτον (ήταν ομοεστιακά, δηλ. ομοεστιακά). Οι δέσμες που περνούν από τη δεύτερη οπή καρφίτσας χτύπησαν έναν σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή χαμηλού θορύβου, ο οποίος παρήγαγε ένα σήμα ανάλογα με τη φωτεινότητα του φωτός που προερχόταν από το δείγμα. Μια δεύτερη οπή καρφίτσας έκοψε το φως που προέρχεται από περιοχές πάνω ή κάτω από το εστιακό επίπεδο στο δείγμα από το σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή. Η χρήση χωρικού φιλτραρίσματος για την εξάλειψη του φωτός και της έκλαμψης εκτός εστίασης κατά την εργασία με δείγματα παχύτερα από το εστιακό επίπεδο αποτελεί βασική αρχή της ομοεστιακής μικροσκοπίας. Στο έργο του, ο Minsky περιέγραψε επίσης ένα μικροσκόπιο ανάκλασης με έναν μόνο φακό και έναν διχρωματικό καθρέφτη, ο σχεδιασμός του οποίου έγινε η βάση των συστημάτων που χρησιμοποιούνται σήμερα.

Για να αποκτήσετε μια ομοεστιακή εικόνα, είναι απαραίτητο να σαρώσετε το δείγμα με το φως εστιασμένο σε ένα σημείο. Στην αρχική συσκευή, που συναρμολογήθηκε από τον Minsky, η δέσμη φωτός ήταν ακίνητη και το ίδιο το δείγμα κινήθηκε σε μια δονούμενη σκηνή. Η ακινησία της δέσμης σάρωσης σε σχέση με τον οπτικό άξονα του μικροσκοπίου ήταν ένα πλεονέκτημα αυτής της εγκατάστασης, καθώς εξάλειψε τα περισσότερα οπτικά ελαττώματα που θα μπορούσαν να παραμορφώσουν την εικόνα. Ωστόσο, κατά τη μελέτη βιολογικών δειγμάτων, αυτό θα μπορούσε να προκαλέσει διακυμάνσεις και παραμόρφωση, οδηγώντας τελικά σε απώλεια ανάλυσης και ευκρίνειας εικόνας. Επιπλέον, κατά τη μετακίνηση της σκηνής και του δείγματος, είναι αδύνατο να πραγματοποιηθούν χειρισμοί, όπως, για παράδειγμα, μικροενέσεις κυττάρων που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό.

Όμως, ανεξάρτητα από τη μέθοδο σάρωσης του δείγματος, είναι απαραίτητο να ληφθεί η εικόνα του. Και το αρχικό σχέδιο του Μίνσκι δεν παρήγαγε πραγματική εικόνα επειδή η έξοδος από το σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή τροφοδοτήθηκε σε έναν παλμογράφο μεγάλης αντοχής που χρησιμοποιούσε ο στρατός, ο οποίος δεν είχε συσκευή εγγραφής. Ο Μίνσκι έγραψε αργότερα ότι η απίστευτη ποιότητα των εικόνων του δεν οφειλόταν στη χαμηλή ανάλυση του ίδιου του μικροσκοπίου, αλλά στη χαμηλή ανάλυση της οθόνης του παλμογράφου. Είναι πλέον σαφές ότι λόγω έλλειψης τεχνολογίας, ο Μίνσκι δεν μπόρεσε να αποδείξει πλήρως τις δυνατότητες της συνεστιακής μεθόδου, ειδικά όταν απεικονίζει βιολογικές δομές. Επισήμανε ότι αυτός μπορεί να είναι ο λόγος που η ομοεστιακή μικροσκοπία δεν έγινε αμέσως αποδεκτή από την πολύ απαιτητική κοινότητα των βιολόγων, για τους οποίους η ποιότητα των εικόνων που προέκυπταν ήταν πάντα προτεραιότητα. Τότε είχαν στη διάθεσή τους μικροσκόπια φωτός με εξαιρετική οπτική, που τους επέτρεπε να παρατηρούν και να φωτογραφίζουν έντονα χρωματιστά ιστολογικά τμήματα σε πολύ ευαίσθητο έγχρωμο φιλμ. Στα σύγχρονα ομοεστιακά μικροσκόπια, οι εικόνες παράγονται από σήματα που προέρχονται από ένα σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή ή συλλαμβάνονται από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή συσκευής με σύζευξη φόρτισης, επεξεργάζονται απευθείας από ένα σύστημα απεικόνισης υπολογιστή και εμφανίζονται σε οθόνη υψηλής ανάλυσης και συσκευή τεκμηρίωσης εικόνας ανώτερης ποιότητας. Ένα διάγραμμα ενός σύγχρονου ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ φαίνεται στο Σχήμα 4.

Ρύζι. 4. Σχέδιο σύγχρονου ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ

Η βασική οπτική ενός οπτικού μικροσκοπίου δεν έχει αλλάξει ριζικά για δεκαετίες, αφού η τελική ανάλυση του οργάνου καθορίζεται από το μήκος κύματος, τον αντικειμενικό φακό και τις ιδιότητες του ίδιου του δείγματος. Οι βαφές που χρησιμοποιούνται για την ενίσχυση της αντίθεσης των δειγμάτων και άλλες τεχνικές οπτικής μικροσκοπίας έχουν βελτιωθεί σημαντικά τα τελευταία 20 χρόνια. Η άνοδος και η βελτίωση της συνεστιακής μεθόδου ήταν συνέπεια της αναβίωσης της οπτικής μικροσκοπίας, που προκλήθηκε σε μεγάλο βαθμό από την επιτυχία των σύγχρονων τεχνολογιών. Πολλές από τις τεχνολογικές εξελίξεις που θα μπορούσαν να ωφελήσουν το σχέδιο του Minsky γίνονται σταδιακά διαθέσιμες (και προσιτές) σε βιολόγους και άλλους μικροσκοπιστές. Μεταξύ αυτών, σταθερά λέιζερ πολλαπλών συχνοτήτων που χρησιμοποιούνται ως βελτιωμένες πηγές σημειακού φωτός, βελτιωμένοι διχρωμικοί καθρέφτες, ευαίσθητοι φωτοανιχνευτές χαμηλού θορύβου, μικροϋπολογιστές υψηλής ταχύτητας με βελτιωμένες δυνατότητες (λόγω της διαθεσιμότητας μνήμης υψηλής χωρητικότητας), εξελιγμένο λογισμικό απεικόνισης, υψηλής οθόνες ανάλυσης και ψηφιακοί εκτυπωτές.

Αυτές οι τεχνολογίες αναπτύχθηκαν ανεξάρτητα και έχουν σταδιακά ενσωματωθεί σε συστήματα ομοεστιακής απεικόνισης από το 1955. Για παράδειγμα, οι τεχνικές επεξεργασίας ψηφιακής εικόνας χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά με επιτυχία στις αρχές της δεκαετίας του 1980 από ερευνητές στο Ωκεανογραφικό Ινστιτούτο Woods Hole. Χρησιμοποιώντας αυτό που ονόμασαν «βίντεο μικροσκόπια», μπόρεσαν να λάβουν εικόνες της κυτταρικής δομής μικροσωλήνων μικρότερων από το θεωρητικό όριο ανάλυσης ενός οπτικού μικροσκοπίου. Η φαινομενική αύξηση της ανάλυσης καθίσταται δυνατή με την ψηφιακή βελτιστοποίηση των εικόνων που λαμβάνονται από μια βιντεοκάμερα υψηλής ευαισθησίας υπερπυριτίου (SIT) σε συνδυασμό με έναν ψηφιακό επεξεργαστή εικόνας. Οι κυτταρικές δομές οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας οπτική αντίθεση διαφορικής παρεμβολής (DIC) και περαιτέρω ψηφιακή επεξεργασία εικόνας.

Η ταξινόμηση των σχεδίων ομοεστιακών μικροσκοπίων βασίζεται συνήθως στη μέθοδο σάρωσης του δείγματος. Υπάρχουν δύο κύριες μέθοδοι σάρωσης: σάρωση σταδίου και σάρωση δέσμης φωτισμού. και τουλάχιστον δύο τρόποι σάρωσης της δέσμης. Το αρχικό όργανο του Minsky βασίστηκε σε ένα σύστημα σάρωσης σκηνής που οδηγείται από μια πρωτόγονη γεννήτρια πιρουνιού συντονισμού, η οποία παρήγαγε μια εικόνα μάλλον αργά. Οι σύγχρονες συνεστιακές εγκαταστάσεις με σάρωση σκηνής, οι οποίες έχουν ξεπεράσει πολύ τα πρωτότυπά τους, χρησιμοποιούνται κυρίως στην επιστήμη των υλικών, για παράδειγμα, στην παραγωγή μικροκρυστάλλων. Συστήματα που βασίζονται σε αυτή την αρχή έχουν γίνει πρόσφατα δημοφιλή σε βιοϊατρικά πεδία όπου η ανάλυση DNA πραγματοποιείται σε μικροκρυστάλλους.

Μια πιο πρακτική εναλλακτική λύση για την απεικόνιση βιολογικών συστημάτων είναι η σάρωση ενός σταθερού δείγματος με μια δέσμη. Αυτή η αρχή βασίζεται σε πολλά συστήματα μέτρησης, η βελτίωση των οποίων έχει οδηγήσει στην εμφάνιση των σημερινών δημοφιλών μικροσκοπίων έρευνας. Δεν μπαίνουμε στις τεχνικές λεπτομέρειες της ομοεστιακής μικροσκοπίας σε αυτήν την εισαγωγή, αλλά ουσιαστικά χρησιμοποιεί δύο θεμελιωδώς διαφορετικές τεχνικές σάρωσης δέσμης: σάρωση πολλαπλών ακτίνων και σάρωση μονής δέσμης. Η σάρωση μονής δέσμης είναι η πιο κοινή σήμερα, και αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται στο LSCM. Εδώ, η δέσμη σαρώνεται χρησιμοποιώντας καθρέφτες ελεγχόμενους από υπολογιστή που κινούνται από γαλβανόμετρα με ταχύτητα ενός καρέ ανά δευτερόλεπτο. Για να επιτευχθεί ταχύτερη σάρωση, περίπου με το ρυθμό καρέ βίντεο, ορισμένα συστήματα χρησιμοποιούν ακουστικο-οπτική συσκευή ή ταλαντευόμενους καθρέφτες. Μια εναλλακτική μέθοδος χρησιμοποιεί δύο δέσμες για σάρωση σχεδόν σε πραγματικό χρόνο, συνήθως χρησιμοποιώντας μια παραλλαγή ενός περιστρεφόμενου δίσκου Nipkow. Αυτά τα συστήματα προέκυψαν από την τροποποίηση και τη βελτίωση των μικροσκοπίων διαδοχικής σάρωσης (TSMs) για τη δημιουργία πιο αποτελεσματικών μοντέλων για την απεικόνιση δειγμάτων που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό. Το σχήμα 5 δείχνει ένα τόσο προηγμένο σύστημα με ζευγαρωμένους δίσκους Nipkow και μικροφακούς για τη βελτίωση της ευαισθησίας σε αμυδρή εκπομπή φθορισμού για απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο.

Ρύζι. 5. Οπτική σχεδίαση βασισμένη σε δίσκους Nipkow

Σήμερα, στην ομοεστιακή μικροσκοπία, υπάρχουν δύο εναλλακτικές μέθοδοι για τη λήψη οπτικών τομών: η μέθοδος αποσυνέλιξης και το πολυφωτόνιο. Διαφέρουν τεχνικά, αλλά όπως οι συνεστιακές μέθοδοι, βασίζονται στην παραδοσιακή οπτική μικροσκοπία. Η αποσυνέλιξη βασίζεται σε υπολογιστικούς αλγόριθμους για τον υπολογισμό και την αφαίρεση των πληροφοριών που προέρχονται από περιοχές εκτός εστίασης κατά τη δημιουργία μιας εικόνας. Αυτή η τεχνική έχει γίνει πολύ βολική λόγω αποτελεσματικών αλγορίθμων και μικρών υπολογιστών υψηλής απόδοσης. Το πολυφωτονικό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί το ίδιο σύστημα σάρωσης με το LSCM, αλλά δεν απαιτεί διάφραγμα οπής στο δέκτη. Δεν χρειάζεται, καθώς το λέιζερ διεγείρει το φθοριοχρωμικό σημάδι μόνο στο εστιακό σημείο, εξαλείφοντας έτσι την ακτινοβολία εκτός εστίασης. Κατά την παρατήρηση ζωντανού ιστού, αυτή η μέθοδος έχει πρόσθετα πλεονεκτήματα, συγκεκριμένα: μειωμένη φωτολεύκανση, καθώς μειώνεται η ποσότητα ενέργειας που μεταδίδεται από τη δέσμη λέιζερ και απορροφάται από τον ιστό του δείγματος.

Το παραδοσιακό οπτικό μικροσκόπιο είναι η βάση πάνω στην οποία βασίζεται το LSCM. Αντί για λάμπα βολφραμίου ή υδραργύρου, χρησιμοποιείται λέιζερ, το οποίο συνδέεται με έναν ευαίσθητο σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή (PMT) και έναν υπολογιστή που ελέγχει τους καθρέφτες σάρωσης και άλλες συσκευές σάρωσης και διευκολύνει τη συλλογή και την παρουσίαση εικόνων. Τα δεδομένα που λαμβάνονται αποθηκεύονται σε ψηφιακά μέσα και μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με τη χρήση πολλών πακέτων λογισμικού, είτε στον υπολογιστή του ίδιου του συστήματος είτε σε κάποιο άλλο.

Σύμφωνα με το σχεδιασμό του LSCM, ο φωτισμός και η λήψη σήματος (καταχώρηση) περιορίζονται σε ένα σημείο του δείγματος με όριο περίθλασης. Οι φακοί του μικροσκοπίου εστιάζουν το σημείο φωτισμού και η συσκευή σάρωσης σαρώνει το δείγμα με αυτό το σημείο υπό έλεγχο υπολογιστή. Τα σήματα από τα φωτεινά σημεία του δείγματος εισέρχονται σε ένα σωλήνα φωτοπολλαπλασιαστή μέσω ενός διαφράγματος με οπή (ή σε ορισμένες περιπτώσεις σχισμής) και τα σήματα εξόδου από τον φωτοπολλαπλασιαστή διαμορφώνονται σε εικόνα και αναπαράγονται οπτικά από έναν υπολογιστή. Αν και τα μη χρωματισμένα δείγματα μπορούν να παρατηρηθούν από το φως που ανακλάται από το δείγμα, συνήθως χρωματίζονται με μία ή περισσότερες φθορίζουσες βαφές. Ένα από τα πιο κοινά LSCM, που περιγράφηκε στη βιβλιογραφία γύρω στο 1990, αναπτύχθηκε ως απάντηση σε ένα θεμελιώδες πρόβλημα που αντιμετωπίζουν οι βιολογικοί ερευνητές. Πολλές δομές και μεμονωμένα μακρομόρια εντός εμβρύων που έχουν χρωματιστεί με ανοσοφθορισμό δεν μπορούν να οραματιστούν με ένα παραδοσιακό μικροσκόπιο επιφθορισμού μετά το στάδιο των δύο κυττάρων, καθώς ο όγκος του εμβρύου παραμένει περίπου ο ίδιος όσο αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων. Αυτό σημαίνει ότι με μια πιο πυκνή διάταξη κυττάρων, η φωταύγεια από τα κύτταρα εκτός του εστιακού επιπέδου αυξάνεται, γεγονός που οδηγεί σε επιδείνωση της ανάλυσης της εικόνας.

Ρύζι. 6. Διαμόρφωση ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ Nikon

Μια ομάδα ερευνητών που εργάζονταν πάνω σε αυτό το πρόβλημα διαπίστωσε ότι κανένα από τα συνεστιακά συστήματα που ήταν διαθέσιμα εκείνη την εποχή δεν πληρούσε τις απαιτήσεις τους. Εκείνη την εποχή, τα μικροσκόπια σάρωσης σταδίου ήταν πολύ αργά. Χρειάστηκαν περίπου 10 δευτερόλεπτα για να δημιουργηθεί μια ενιαία εικόνα και τα όργανα σάρωσης πολλαπλών ακτίνων δεν ήταν ακόμη πρακτικά για απεικόνιση φθορισμού. Το LSCM σχεδιάστηκε για να ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις της παραδοσιακής μικροσκοπίας επιφθορισμού και, μαζί με άλλα που αναπτύσσονται ταυτόχρονα, έγινε το πρωτότυπο για τα πολύπλοκα συστήματα που προσφέρονται τώρα στη βιοϊατρική κοινότητα από διάφορες εταιρείες. Ένα παράδειγμα συστήματος που χρησιμοποιείται σήμερα (Nikon E1000) φαίνεται στο Σχήμα 6.

Σε ειδικά σχεδιασμένες συσκευές, το πάχος των οπτικών τμημάτων μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τις αλλαγές στη διάμετρο της οπής καρφίτσας μπροστά από τον φωτοανιχνευτή. Σε σύγκριση με άλλα σχέδια με σταθερό μέγεθος οπής, αυτό το πρόσθετο χαρακτηριστικό είναι εξαιρετικά ευέλικτο κατά την απεικόνιση βιολογικών δομών. Η εικόνα μπορεί να μεγεθυνθεί χωρίς απώλεια ανάλυσης μειώνοντας την σαρωμένη περιοχή του δείγματος και τοποθετώντας τις σαρωμένες πληροφορίες σε μια συστοιχία δεδομένων του ίδιου μεγέθους για αποθήκευση και οπτική παρουσίαση (η μεγέθυνση αλλάζει με παρόμοιο τρόπο σε ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης) . Αυτό δίνει σε έναν μόνο φακό ένα διάστημα ζουμ, το οποίο μπορεί να είναι εξαιρετικά χρήσιμο κατά την απεικόνιση σπάνιων ή φευγαλέων συμβάντων που μπορεί να χαθούν ή να χαθούν κατά την αλλαγή φακών.

Με τις εξελιγμένες και ευέλικτες δυνατότητες του LSCM που προσφέρονται πλέον εμπορικά σε λογικές τιμές, η ομοεστιακή μικροσκοπία έχει εκτιναχθεί σε δημοτικότητα τα τελευταία χρόνια, με πολλά εργαστήρια πολλαπλών χρηστών να επιλέγουν αυτόν τον εξοπλισμό έναντι ηλεκτρονικών μικροσκοπίων. Το πλεονέκτημα της ομοεστιακής μικροσκοπίας είναι η σχετική ευκολία με την οποία μπορούν να ληφθούν υψηλής ποιότητας εικόνες δειγμάτων που προετοιμάζονται για παραδοσιακή οπτική μικροσκοπία και ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών σε διάφορους τομείς έρευνας.

Η πρώτη γενιά LSCM λειτούργησε καλά με σταθερά δείγματα, αλλά απέτυχε να ελέγξει τη φωτεινή ενέργεια των λέιζερ, κάτι που πολύ συχνά είχε ως αποτέλεσμα τη θανατηφόρα καταστροφή του ζωντανού δείγματος, εκτός εάν λαμβάνονταν σοβαρές προφυλάξεις. Παρά τους περιορισμούς αυτούς, οι εικόνες των καταγεγραμμένων δειγμάτων ήταν τόσο υψηλής ποιότητας που η ομοεστιακή προσέγγιση έγινε άνευ όρων αποδεκτή από τους ειδικούς. Οι επόμενες γενιές οργάνων βελτίωσαν κάθε πτυχή της διαδικασίας απεικόνισης. Επιπλέον, οι νέες συσκευές έχουν γίνει πολύ πιο εργονομικές και πιο εύχρηστες, έτσι ώστε οι ρυθμίσεις, η αλλαγή συνδυασμών φίλτρων και η προσαρμογή της ισχύος λέιζερ με χρήση υπολογιστή έχουν γίνει πολύ πιο εύκολες και πιο γρήγορες. Είναι πλέον δυνατή η απεικόνιση με τρία φθοριόχρωμα ταυτόχρονα και με ακόμη περισσότερα στη σειρά. Χάρη στο βελτιωμένο και πιο αξιόπιστο λογισμικό, τους ταχύτερους υπολογιστές, τις μεγαλύτερες μονάδες δίσκου και τις μειωμένες τιμές για συσκευές αποθήκευσης τυχαίας πρόσβασης, η επεξεργασία εικόνας έχει επίσης προχωρήσει σημαντικά.

Λειτουργίες απεικόνισης

Η κύρια εφαρμογή ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου είναι η λήψη εικόνων διαφόρων τύπων παχύρρευστων δειγμάτων. Το πλεονέκτημα της συνεστιακής μεθόδου πηγάζει από τη δυνατότητα δημιουργίας εικόνων του δείγματος ως ακολουθίας μεμονωμένων οπτικών τμημάτων με υψηλή ευκρίνεια και ανάλυση. Σε αυτήν την περίπτωση, χρησιμοποιούνται διάφορες λειτουργίες απεικόνισης. Κάθε ένα από αυτά βασίζεται σε μια οπτική τομή ως βασική μονάδα εικόνας.

Ρύζι. 1. Οπτικά τμήματα με τρία σημάδια

Επιμέρους οπτικά τμήματα

Το οπτικό τμήμα είναι η βασική μονάδα απεικόνισης στις τεχνικές ομοεστιακής μικροσκοπίας. Οι εικόνες δεσμευμένων και χρωματισμένων δειγμάτων μπορούν να ληφθούν σε λειτουργίες φωτισμού μονού, διπλού, τριπλού και πολλαπλού μήκους κύματος, ενώ οι εικόνες πολύχρωμων δειγμάτων θα συνδυαστούν μεταξύ τους (εάν χρησιμοποιούνται φακοί με επαρκή διόρθωση χρωματικής εκτροπής). Η πρόσθετη καταχώριση πραγματοποιείται συνήθως χρησιμοποιώντας μεθόδους ψηφιακής επεξεργασίας εικόνας. Τα περισσότερα ομοεστιακά μικροσκόπια σάρωσης λέιζερ (LSCM) απαιτούν περίπου 1 δευτερόλεπτο για να αποκτήσουν ένα οπτικό τμήμα, αν και οι εικόνες από πολλαπλά οπτικά τμήματα συνήθως υπολογίζονται κατά μέσο όρο για τη βελτίωση της αναλογίας σήματος προς θόρυβο. Ο χρόνος που χρειάζεται για τη λήψη μιας εικόνας, φυσικά, εξαρτάται από το μέγεθος των pixel της εικόνας και την ταχύτητα του υπολογιστή του συστήματος. Για να αποθηκεύσετε μια τυπική εικόνα 8-bit 768x512 pixel, θα απαιτηθούν περίπου 0,3 Mbit μνήμης.

Οι οπτικές τομές που φαίνονται στο Σχήμα 1 ελήφθησαν ταυτόχρονα με φως διέγερσης σε τρία διαφορετικά μήκη κύματος (488, 568 και 647 νανόμετρα) χρησιμοποιώντας ένα απλό λέιζερ κρυπτών/αργού ως πηγή ακτινοβολίας. Ως δείγμα, παρουσιάζεται ο φανταστικός δίσκος ενός φτερού Drosophila στο τρίτο στάδιο, στον οποίο επισημαίνονται τρία γονίδια που εμπλέκονται στο σχηματισμό φτερών. Τα τρία γονίδια που παρουσιάζονται και οι αντίστοιχες ετικέτες φθοροχρωμίου είναι: (α) απομεινάρια (φθοροσκεΐνη - 496 νανόμετρα). (β) χωρίς φτερά (λισσαμίνη ροδαμίνη - 572 νανόμετρα). και © CiD (κυανίνη 5 - 649 νανόμετρα). Μια σύνθετη εικόνα των τριών χωρικά αντιπροσωπευόμενων περιοχών γονιδίων που σχηματίζουν το φτερό βρίσκεται κάτω δεξιά (εικόνα (δ)).

Καταγραφή σε καθορισμένο χρονικό διάστημα και οπτικοποίηση ενός ζωντανού κυττάρου

Οι μελέτες time-lapse ζωντανών κυττάρων έχουν αποκτήσει νέα ώθηση λόγω της αυξημένης ανάλυσης του LSCM. Προηγουμένως, οι μελέτες των κινήσεων των κυτταρικών δομών πραγματοποιούνταν χρησιμοποιώντας φωτογραφικό φιλμ 16 mm και ένα διαστημόμετρο με μηχανισμό ρολογιού συνδεδεμένο σε κάμερα, αργότερα χρησιμοποιώντας συσκευή εγγραφής βίντεο με λειτουργία time-lapse, συσκευή εγγραφής οπτικού δίσκου ή πίνακα ψηφιοποίησης βίντεο . Τώρα, χρησιμοποιώντας το LSCM, είναι δυνατή η λήψη οπτικών τμημάτων σε συγκεκριμένα, προκαθορισμένα διαστήματα σε πραγματικό χρόνο.

Η απεικόνιση ζωντανού ιστού με χρήση LSCM είναι πολύ πιο δύσκολη από την απεικόνιση δεσμευμένων δειγμάτων και δεν είναι πάντα πρακτική επειδή το δείγμα μπορεί να μην αντέχει στις συνθήκες θέασης. Ο Πίνακας 1 συνοψίζει ορισμένους παράγοντες που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την παρατήρηση ζωντανών και σχετιζόμενων κυττάρων χρησιμοποιώντας LSCM. Ορισμένα δείγματα είναι απλά φυσικώς αδύνατο να τοποθετηθούν στη σκηνή του μικροσκοπίου ή δεν θα μπορούν να παραμείνουν ζωντανά σε αυτό καθ' όλη τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης. Το φαινόμενο ή η δομή που μελετάται μπορεί να μην βρίσκεται εντός του οπτικού πεδίου του φακού. Για παράδειγμα, οι φανταστικοί δίσκοι του φτερού Drosophila αναπτύσσονται πολύ βαθιά στην προνύμφη για να παρατηρηθούν. και μετά την ανατομή, δεν μπορούν να αναπτυχθούν στον πολιτισμό. Επομένως, σήμερα η μόνη διαθέσιμη μέθοδος για την παρατήρηση της γονιδιακής έκφρασης σε ιστούς αυτού του τύπου είναι η ανατομή της προνύμφης, η δέσμευση και η χρώση των φανταστικών δίσκων που λαμβάνονται από δείγματα σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης.

Τραπέζι 1. Παρατήρηση δεσμευμένων και ζωντανών κυττάρων με χρήση LSCM

Η επιτυχής παρατήρηση και απεικόνιση ζωντανών κυττάρων απαιτεί εξαιρετική προσοχή καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας Η διατήρηση αποδεκτών συνθηκών στο στάδιο του μικροσκοπίου είναι απαραίτητη. Η ζημιά που προκαλείται σε μια κυψέλη από την ακτινοβολία δέσμης λέιζερ μπορεί να συσσωρευτεί κατά την επαναλαμβανόμενη σάρωση, επομένως αυτή η έκθεση θα πρέπει να διατηρείται στο ελάχιστο απαραίτητο και επαρκή για τη λήψη εικόνας. Αντιοξειδωτικά, όπως το ασκορβικό οξύ, προστίθενται τυπικά στο μέσο καλλιέργειας για να μειώσουν το οξυγόνο που απελευθερώνεται όταν τα φθορίζοντα μόρια ακτινοβολούνται με φως διέγερσης και να προάγουν το σχηματισμό ελεύθερων ριζών που σκοτώνουν τα κύτταρα. Είναι συνήθως απαραίτητο να διεξαχθούν εκτεταμένα προκαταρκτικά πειράματα ελέγχου για την αξιολόγηση της επίδρασης της ακτινοβολίας σε κύτταρα που έχουν χρωματιστεί με φθορισμό, διασφαλίζοντας προσεκτικά ότι όλες οι παράμετροι απεικόνισης είναι συνεπείς με τις παρατηρήσεις που γίνονται. Μετά τις εικόνες δοκιμής, πρέπει να αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των ζωντανών δειγμάτων. Τα έμβρυα, για παράδειγμα, πρέπει να συνεχίσουν να αναπτύσσονται κανονικά καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας παρατήρησης, επομένως πρέπει να ανιχνεύονται τυχόν ανωμαλίες που προκαλούνται από έκθεση σε ακτινοβολία ή φθοριόχρωμα. Το Σχήμα 2 δείχνει μια καταγραφή time-lapse ενός εμβρύου Drosophila που έχει χρωματιστεί με φθορισμό με πράσινο ασβέστιο. Μια σειρά εικόνων δείχνει αλλαγές στην κατανομή της λάμψης φθορισμού με την πάροδο του χρόνου.

Κάθε τύπος κυττάρου απαιτεί τα δικά του μέτρα για τη διατήρηση της βιωσιμότητάς τους κατά την παρατήρηση. Για ορισμένα κύτταρα εντόμων, αρκεί η διατήρηση της θερμοκρασίας δωματίου και η ύπαρξη επαρκώς μεγάλου όγκου κατάλληλου μέσου. Ωστόσο, οι περισσότεροι τύποι κυττάρων απαιτούν ένα θερμαινόμενο στάδιο και μερικές φορές έναν θάλαμο έγχυσης για να διατηρηθεί η σωστή ισορροπία διοξειδίου του άνθρακα ενώ βρίσκεστε στη σκηνή. Η επιλογή του τύπου κυψελών για τα οποία οι συνθήκες παρατήρησης που χρησιμοποιούν LSCM είναι λιγότερο «εχθρικές» θα βοηθήσει στην αποφυγή πολλών πειραματικών προβλημάτων. Οι βελτιώσεις στα σύγχρονα συνεστιακά όργανα είχαν ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση των πιθανών προβλημάτων. Η αυξημένη κβαντική απόδοση, το μεγαλύτερο αριθμητικό άνοιγμα (φωτεινότητα) των αντικειμενικών στόχων και η χρήση λιγότερο τοξικών κυτταρικών βαφών οδήγησαν στη συνεστιακή μικροσκοπία να γίνει μια πρακτική μέθοδος για την ανάλυση ζωντανών κυττάρων. Είναι απαραίτητο να επιδιώξουμε τη χρήση λέιζερ χαμηλότερης ισχύος, επιτρέποντας ταυτόχρονα τη λήψη και την επεξεργασία εικόνας όσο το δυνατόν γρηγορότερα. Εάν το διάφραγμα της οπής αυξηθεί για να επιταχυνθεί η συλλογή και η εγγραφή εικόνας (σε σύγκριση με την παρατήρηση μη ζωντανών δειγμάτων), η επακόλουθη αποσυνέλιξη μπορεί μερικές φορές να αποκαταστήσει τη χαμένη ποιότητα εικόνας.

Ρύζι. 2. Σκοποβολή σε δεδομένο χρονικό διάστημα

Πολλές φυσιολογικές διεργασίες και συμβάντα συμβαίνουν πολύ γρήγορα για να καταγραφούν από τα περισσότερα LSCM, τα οποία έχουν κατά μέσο όρο μία εικόνα ανά δευτερόλεπτο για απεικόνιση. Τα LSCM που χρησιμοποιούν ακουστικο-οπτικές συσκευές και διαφράγματα σχισμής είναι ταχύτερα από τα διεγερμένα με γαλβανόμετρο συστήματα σάρωσης σημείου και είναι πιο πρακτικά για φυσιολογικές μελέτες. Αυτές οι ταχύτερες ρυθμίσεις συνδυάζουν καλή χωρική και χρονική ανάλυση, η οποία μπορεί να φτάσει τα 30 καρέ ανά δευτερόλεπτο σε ανάλυση πλήρους οθόνης ή κοντά στην ταχύτητα εικόνας βίντεο. Σε μικροσκόπια σάρωσης πιο αργής οπής, η χρονική ανάλυση μπορεί να αυξηθεί μόνο με τη μείωση της περιοχής σάρωσης δείγματος. Εάν απαιτείται πλήρης χωρική ανάλυση, ο ρυθμός καρέ πρέπει να μειωθεί, με αποτέλεσμα την απώλεια της χρονικής ανάλυσης. Τα ομοεστιακά συστήματα, τα οποία χρησιμοποιούν σάρωση δίσκου ή ταλαντευόμενου καθρέφτη, είναι επίσης ικανά να απεικονίζουν γρήγορες φυσιολογικές διεργασίες ή άλλα παροδικά συμβάντα.

Σειρά Z και εικόνες 3D

Μια σειρά Z είναι μια ακολουθία οπτικών τμημάτων ενός δείγματος που λαμβάνεται σε διαφορετικά επίπεδα σε ένα επίπεδο κάθετο στον οπτικό άξονα (άξονας z). Οι εικόνες της σειράς Z λαμβάνονται αντιστοιχίζοντας τις αλλαγές βήμα προς βήμα στη λεπτή εστίαση του μικροσκοπίου και στη συνέχεια λαμβάνοντας μια εικόνα σε κάθε βήμα. Η κίνηση της εστίασης βήμα προς βήμα εκτελείται συνήθως από έναν βηματικό κινητήρα ελεγχόμενο από υπολογιστή, ο οποίος αλλάζει την εστίαση κατά ένα προκαθορισμένο ποσό. Χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα μακροεντολής υπολογιστή, μπορείτε να αποκτήσετε και να αποθηκεύσετε μια εικόνα, να εστιάσετε ξανά το μικροσκόπιο σε καθορισμένο βάθος στο δείγμα, να αποκτήσετε και να αποθηκεύσετε μια δεύτερη εικόνα, να εστιάσετε ξανά σε νέο επίπεδο και ούτω καθεξής μέχρι να αποκτηθεί ο προγραμματισμένος αριθμός εικόνων .

Οι επιθυμητές εικόνες μπορούν να ληφθούν από τη σειρά z που λαμβάνονται με λήψη μιας επιλεγμένης περιοχής του δείγματος και να υποβληθούν σε επεξεργασία από ειδικό λογισμικό για μετέπειτα λεπτομερή εξέταση συγκεκριμένων κελιών που ενδιαφέρουν. Η σειρά Z μπορεί να θεωρηθεί ως φωτομοντάζ εικόνων, όπως στο Σχήμα 3. Αυτός ο τύπος συνδυασμού και εμφάνισης εικόνων, καθώς και πολλοί άλλοι χειρισμοί εικόνων, είναι τυπικό χαρακτηριστικό των σύγχρονων πακέτων λογισμικού χειρισμού εικόνων. Οι εικόνες στο Σχήμα 3 είναι μια επιλογή από μια μεγαλύτερη σειρά με ακόμη πιο συχνά βήματα z. Η πράσινη λάμψη προσδιορίζει το περιφερικό νευρικό σύστημα ενός εμβρύου Drosophila που έχει χρωματιστεί με το αντίσωμα 22C10.

Ρύζι. 3. Ζ-σειρά οπτικών τμημάτων

Από μια σειρά πολλών εκατοντάδων οπτικών τμημάτων ενός δείγματος που παράγεται από την LSCM, μπορεί να είναι δύσκολο να αποκτήσετε μια ιδέα για ολόκληρο το σύμπλεγμα των διασυνδεδεμένων δομών. Ωστόσο, η σειρά z, αφού καταχωρηθεί, είναι ένα ιδανικό υλικό για την επακόλουθη τρισδιάστατη αναπαράσταση του δείγματος χρησιμοποιώντας τεχνικές ογκομετρικής απεικόνισης. Αυτή η προσέγγιση χρησιμοποιείται πλέον ευρέως για την αποσαφήνιση της σχέσης μεταξύ της δομής και της λειτουργίας των ιστών στην ιατρική και τη βιολογία. Είναι σημαντικό να ρυθμίσετε το σωστό βήμα σάρωσης δείγματος z που καθορίζεται από το βήμα του κινητήρα αλλαγής εστίασης. Σε αυτήν την περίπτωση, η εικόνα θα αντικατοπτρίζει το πραγματικό βάθος του δείγματος.

Όσο το δείγμα παραμένει ακίνητο ενώ παρατηρείται, οι εικόνες της σειράς z που παράγονται από το LSCM θα καταγράφονται τέλεια και όταν αποθηκεύονται ψηφιακά, θα μετατρέπονται σχετικά εύκολα σε τρισδιάστατη αναπαράσταση του δείγματος. Το Σχήμα 4 συγκρίνει ένα μόνο οπτικό τμήμα (α) με μια προβολή της σειράς z (β) και απεικονίζει την αξία αυτής της τεχνικής στην απεικόνιση του περιφερικού νευρικού συστήματος ενός εμβρύου Drosophila που έχει επισημανθεί με το αντίσωμα 22C10.

Το βήμα του βηματικού κινητήρα που ορίζεται από τον χειριστή του μικροσκοπίου σχετίζεται με το πάχος του οπτικού τμήματος, αλλά μπορεί να έχει άλλες τιμές. Το πάχος του οπτικού τμήματος συνδέεται με το πάχος του τμήματος δείγματος που παρατηρείται μέσω του μικροσκοπίου και εξαρτάται από τον φακό και τη διάμετρο του διαφράγματος της οπής. Σε ορισμένες περιπτώσεις, ωστόσο, το εστιακό βήμα μπορεί να είναι το ίδιο με το πάχος της οπτικής τομής και αυτό μπορεί να οδηγήσει σε σύγχυση.

Μόλις ληφθεί το αρχείο της σειράς z, αποστέλλεται για επεξεργασία από ένα πρόγραμμα 3D ανακατασκευής ειδικά σχεδιασμένο για την επεξεργασία ομοεστιακών εικόνων. Τέτοια προγράμματα είναι εξαιρετικά γρήγορα όταν χρησιμοποιούνται σε γραφικούς σταθμούς, αλλά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία σε έναν προσωπικό υπολογιστή ή στον γραφικό σταθμό του ίδιου του ομοεστιακού μικροσκοπίου, με έναν αρκετά γρήγορο επεξεργαστή και μεγάλη μνήμη RAM. Χρησιμοποιώντας αυτά τα προγράμματα, μπορείτε να δημιουργήσετε τόσο μεμονωμένες τρισδιάστατες αναπαραστάσεις ενός δείγματος όσο και μια ακολουθία αναπαραστάσεων που αντικαθιστούν η μία την άλλη, αποτελούμενη από διαφορετικούς τύπους δείγματος, η οποία παράγει το αποτέλεσμα της περιστροφής ή άλλους χωρικούς μετασχηματισμούς και δίνει καλύτερη αντίληψη του τις τρισδιάστατες ιδιότητες του δείγματος. Το πρόγραμμα σάς επιτρέπει να μεταβάλλετε το μήκος, το βάθος, να κάνετε ογκομετρικές μετρήσεις και επίσης να αλλάξετε διαδραστικά ειδικές παραμέτρους εικόνας, όπως η διαφάνεια του δείγματος, για να επισημάνετε διαφορετικές δομές σε διαφορετικά επίπεδα του δείγματος.

Ρύζι. 4. Προβολή οπτικής τομής και σειράς z

Ένας άλλος τρόπος αναπαράστασης μιας σειράς οπτικών τμημάτων που λαμβάνονται από μια ακολουθία εικόνων που λαμβάνονται σε ένα δεδομένο χρονικό διάστημα είναι μια τρισδιάστατη αναπαράσταση στην οποία ο άξονας z έχει τη συνάρτηση του άξονα χρόνου. Αυτή η προσέγγιση είναι χρήσιμη στην απεικόνιση των φυσιολογικών αλλαγών κατά την ανάπτυξη του οργανισμού. Ένα παράδειγμα εφαρμογής αυτής της μεθόδου ήταν η αποσαφήνιση της δυναμικής των αλλαγών στη συγκέντρωση ασβεστίου κατά την ανάπτυξη των εμβρύων αχινού. Η χρωματική κωδικοποίηση των οπτικών τμημάτων που λαμβάνονται σε διαφορετικά βάθη είναι ένας απλός τρόπος για την αναπαράσταση τρισδιάστατων δεδομένων. Στην πράξη, ένα χρώμα (συνήθως κόκκινο, πράσινο ή μπλε) εκχωρείται σε κάθε οπτικό τμήμα που λαμβάνεται σε διαφορετικά βάθη του δείγματος και στη συνέχεια συνδυάζονται οι έγχρωμες εικόνες και επιτυγχάνεται το επιθυμητό αποτέλεσμα αλλάζοντας τα χρώματα χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα επεξεργασίας εικόνας.

4D απεικόνιση

Με το LCSM, τα δυναμικά φαινόμενα που εμφανίζονται σε ζωντανούς ιστούς ή κατά την προετοιμασία καλλιεργειών ζωντανών ιστών και αντανακλώνται σε μια ακολουθία εικόνων που λαμβάνονται σε ένα δεδομένο χρονικό διάστημα μπορούν να αναπαρασταθούν σε τέσσερις διαστάσεις, με το χρόνο ως την τέταρτη διάσταση. Η σειρά Z, που λαμβάνεται σε τακτά χρονικά διαστήματα, είναι τετραδιάστατα σύνολα δεδομένων: τρεις χωρικές διαστάσεις (x, y και z) και ο χρόνος ως τέταρτος, ο οποίος μπορεί να παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας μια προβολή 4D. Τέτοια προγράμματα σάς επιτρέπουν να συνθέτετε και να αναπαράγετε στερεοφωνικά ζεύγη που λαμβάνονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές ως ταινία ή, εναλλακτικά, να επεξεργάζεστε και να παρουσιάζετε ανακατασκευασμένες τρισδιάστατες εικόνες που λαμβάνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία, όπως μια επεξεργασμένη ταινία.

Εικόνες X-Z

Εάν επιθυμείτε μια πλευρική όψη του δείγματος, όπως μια κατακόρυφη τομή μέσω του επιθηλιακού στρώματος, μια τομή x-z μπορεί να γίνει με έναν από τους δύο τρόπους. Μια πλάγια όψη μπορεί να ληφθεί σαρώνοντας κατά μήκος μίας γραμμής του δείγματος (άξονας x) σε διαφορετικά βάθη (άξονας z), ελέγχοντας την αλλαγή στην εστίαση με έναν βηματικό κινητήρα και, στη συνέχεια, συνδυάζοντας ολόκληρη τη σειρά των τμημάτων σε ένα ενιαίο εικόνα. Μια άλλη μέθοδος είναι η χρήση της επιλογής επιπέδου διατομής σε ένα πρόγραμμα τρισδιάστατης απόδοσης, όπου η πλάγια όψη εξάγεται από μια υπάρχουσα σειρά οπτικών τμημάτων z. Κατά την απεικόνιση του επιθηλίου του φτερού της πεταλούδας στο Σχήμα 5, το λέιζερ σαρώθηκε κατά μήκος μιας μόνο γραμμής (η οριζόντια μαύρη γραμμή στην αριστερή εικόνα) διεισδύοντας στο δείγμα σε διαφορετικές συντεταγμένες z ή βάθη. Η εικόνα x-z που φαίνεται στο Σχήμα 5 δημιουργήθηκε και παρουσιάστηκε από ένα σύστημα ομοεστιακής απεικόνισης. Το επιθήλιο του πτερυγίου αποτελείται από δύο επιθηλιακά στρώματα, αλλά δεδομένου ότι η ένταση φθορισμού μειώνεται με την αύξηση του βάθους διείσδυσης της δέσμης λέιζερ στο δείγμα, μόνο το ανώτερο στρώμα φαίνεται καθαρά.

Ρύζι. 5. Εικόνα σε επίπεδο X-Z

Δημιουργία εικόνας σε ανακλώμενο φως

Όλα τα πρώιμα ομοεστιακά μικροσκόπια λειτουργούσαν σε ανακλώμενο ή οπισθοσκεδασμένο φως. Χρησιμοποιώντας το ανακλώμενο φως, πολλά δείγματα μπορούν να παρατηρηθούν χωρίς χρώση σε ομοεστιακή μικροσκοπία ή μπορούν να επισημανθούν με χρωστικές υψηλής ανακλαστικότητας, όπως μικροκρυστάλλους ανοσοχρυσού ή αλογονιδίου αργύρου. Ένα πλεονέκτημα των παρατηρήσεων ανακλώμενου φωτός, ειδικά για ζωντανούς ιστούς, είναι ότι το δείγμα δεν υπόκειται σε φωτολεύκανση. Αλλά ορισμένοι τύποι βαφών μπορεί να αποδυναμώσουν την ακτίνα λέιζερ. Ένα άλλο πιθανό πρόβλημα είναι ότι ορισμένα μικροσκόπια ενδέχεται να εμφανίσουν εσωτερικές αντανακλάσεις από οπτικά στοιχεία κατά μήκος της διαδρομής της οπτικής δέσμης. Για εκδόσεις πολλαπλών δεσμών των LSCM και των LSCM με σχισμή διαφράγματος, το πρόβλημα του ανακλώμενου φωτός δεν υφίσταται και σε αυτά τα μικροσκόπια που υπάρχει, η χρήση πολωτών, η απεικόνιση περιοχών χωρίς τεχνήματα και η μετατόπιση από τον οπτικό άξονα συμβάλλουν στη μείωση του προβλήματος.

Απεικόνιση μεταδιδόμενου φωτός

Οποιοσδήποτε από τους τρόπους απεικόνισης του εκπεμπόμενου φωτός που χρησιμοποιούνται συνήθως στη μικροσκοπία μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο LFCM, συμπεριλαμβανομένης της αντίθεσης φάσης, της αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC), του σκοτεινού πεδίου ή του πολωμένου φωτός. Το φως που διέρχεται από το δείγμα χτυπά τον δέκτη του εκπεμπόμενου φωτός, το σήμα του οποίου, μέσω ενός οδηγού φωτός οπτικών ινών, αποστέλλεται σε έναν από τους φωτοπολλαπλασιαστές στην κεφαλή σάρωσης του μικροσκοπίου. Το μεταδιδόμενο φως και οι εικόνες συνεστιακού επιφθορισμού μπορούν να ληφθούν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας την ίδια δέσμη φωτισμού, εξασφαλίζοντας ακριβή καταγραφή. Με τη συγχώνευση ή τη σύνθεση εικόνων χρησιμοποιώντας κατάλληλο λογισμικό, μπορεί να αντικατοπτριστεί η ακριβής θέση των επισημασμένων κυττάρων στον ιστό. Ορισμένες μελέτες προτείνουν την ακόλουθη ουσιαστική προσέγγιση: συνδυάστε μια μη ομοεστιακή εικόνα μεταδιδόμενου φωτός με μία ή περισσότερες ομοεστιακές εικόνες φθορισμού επισημασμένων κυττάρων από το ίδιο δείγμα. Αυτή η προσέγγιση θα επιτρέψει, για παράδειγμα, τον προσδιορισμό των χωρικών και χρονικών πτυχών της μετανάστευσης ενός υποπληθυσμού επισημασμένων κυττάρων μέσα σε έναν πληθυσμό μη επισημασμένων κυττάρων για αρκετές ώρες ή και χρόνια.

Σήμερα, χρησιμοποιείται ήδη ευρέως ένας έγχρωμος δέκτης μεταδιδόμενου φωτός, ο οποίος δέχεται μεταδιδόμενα σήματα σε κόκκινο, πράσινο και μπλε (RGB) για να δημιουργήσει μια εικόνα αληθινού χρώματος, παρόμοια με αυτή που γίνεται σε ορισμένες ψηφιακές έγχρωμες κάμερες. Ένας τέτοιος δέκτης είναι ιδιαίτερα χρήσιμος για παθολόγους, οι οποίοι παρατηρούν τακτικά τα πραγματικά χρώματα στον ιστό κάτω από το εκπεμπόμενο φως και επικαλύπτουν αυτές τις εικόνες με δεδομένα φθορισμού για ανάλυση.