Репродукция вирусов. Основные стадии репродукции вируса в клетке хозяина
1 . Продуктивная вирусная инфекция осуществляется в 3 периода :
начальный период включает стадии адсорбции вируса на клетке, проникновения в клетку, дезинтеграции (депротеинизации) или "раздевания" вируса. Вирусная нуклеиновая кислота была доставлена в соответствующие клеточные структуры и под действием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникальная биологическая структура: инфицированная клетка содержит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный);
после этого начинается вторая группа процессов репродукциивируса, включающая средний и заключительный периоды, во время которых происходят репрессия клеточного и экспрессия вирусного генома. Репрессию клеточного генома обеспечивают низкомолекулярные регуляторные белки типа гистонов, синтезируемые в любой клетке. При вирусной инфекции этот процесс усиливается, теперь клетка представляет собой структуру, в которой генетический аппарат представлен вирусным геномом, а синтетический аппарат - синтетическими системами клетки.
Дальнейшее течение событий в клетке направлено на репликацию вирусной нуклеиновой кислоты (синтез генетического материала для новых вирионов) и реализацию содержащейся в ней генети ческой информации (синтез белковых компонентов для новых вирионов). У ДНК-содержащих вирусов, как в прокариотиче-ских, так и в эукариотических клетках, репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы. При этом у однонитевых ДНК-содержащих вирусов сначала образуетсякомплементарная нить - так называемая репликативная форма, которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК.
Реализация генетической информации вируса, содержащейся в ДНК, происходит следующим образом: при участии ДНК-зависимой РНК-полимеразы синтезируются и-РНК, которые поступают на рибосомы клетки, где и синтезируются вирусспе-цифические белки. У двунитевых ДНК-содержащих вирусов, геном которых транскрибируется в цитоплазме клетки хозяина, это собственный геномный белок. Вирусы, геномы которых транскрибируются в ядре клетки, используют содержащуюся там клеточную ДНК-зависимую РНК-полимеразу.У РНК-содержащих вирусов процессы репликации их генома, транскрипции и трансляции генетической информации осуществляются иными путями. Репликация вирусных РНК, как минус-, так и плюс-нитей, осуществляется через регошкатив-ную форму РНК (комплементарную исходной), синтез которой обеспечивает РНК-зависимая РНК-полимераза - это геномный белок, который есть у всех РНК-содержащих вирусов. Репликативная форма РНК минус-нитевых вирусов (плюс-нить) служит не только матрицей для синтеза дочерних молекул вирусной РНК (минус-нитей), но и выполняет функции и-РНК, т. е. идет на рибосомы и обеспечивает синтез вирусных белков(трансляцию).
У плюс-нитевых РНК-содержащих вирусов функцию трансляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минус-нить) при участии вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз.
У некоторых РНК-содержащих вирусов (реовирусы) имеется совершенно уникальный механизм транскрипции. Он обеспечивается специфическим вирусным ферментом - ревертазой (обрат ной транскриптазой) и называется обратной транскрипцией. Суть ее состоит в том, что вначале на матрице вирусной РНК при участии обратной транскрипции образуется транскрипт, представляющий собой одну нить ДНК. На нем с помощью клеточной ДНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется вторая нить и формируется двунитевой ДНК-транскрипт. С него обычным путем через образование и-РНК происходит реализация информации вирусного генома.
Результатом описанных процессов репликации, транскрипции и трансляции является образование дочерних молекул вирусной нуклеиновой кислоты ивирусных белков, закод-х в геноме вируса.
После этого наступает третий, заключительный период взаимодействия вируса и клетки. Из структурных компонентов (нуклеиновых кислот и белков) на мембранах цитоплазматического ретикулума клетки собираются новые вирионы. Клетка, геном которой был репрессирован (подавлен), обычно гибнет. Вновь сформировавшиеся вирионыпассивно (в результате гибели клетки) илиактивно (путем почкования) покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.
Таким образом, синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходят в определенной последовательности (разобщены во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пр-ве), в связи с чем способ репродукции вирусов и был названдизъюнктивным (разобщенным).
При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализована не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка сохраняет свои функции неизменными.
При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточного, функционирует и наследуется вместе с ним.
Стратегия генома ДНК-содержащих вирусов (за исключением вирусов семейства Hepadnaviridae) сходна в основных чертах со стратегией генома клетки, поскольку реализация генетической информации происходит по схеме ДНК --> мРНК --> белок. Тем не менее сама геномная ДНК у вирусов намного разнообразнее, чем ДНК клетки. У многих вирусов он представлен как у клетки - линейной двунитевой ДНК. Однако у ряда семейств геномная ДНК представляет собой однонитевую ДНК или двунитевую кольцевую. В этих случаях репликация вирусной ДНК имеет ряд особенностей. У вирусов, содержащих однонитевую ДНК ( Parvoviridae), геномная ДНК имеет на конце аутокомплементарный участок, который при репликации образует двунитевую шпильку, с которой и начинается синтез комплементарной нити ДНК. Даже у некоторых вирусов, содержащих линейную двунитевую ДНК, механизм репликации отличается от механизма репликации клеточной ДНК. Например, у вирусов семейства Adenoviridae он осуществляется не посредством синтеза коротких фрагментов на двух нитях ДНК ( фрагменты Оказаки), как в клетке, а посредством синтеза полноразмерной нити вирусной ДНК с вытеснением одной из нитей геномной ДНК из двойной спирали.
ДНК-содержащие вирусы различаются по клеточной локализации репликации и транскрипции вирусного генома. У большинства ДНК-содержащих вирусов эукариот эти процессы протекают в клеточном ядре. У вирусов семейства Herpesviridae вирусная ДНК проникает в ядро, где подвергается транскрипции, которую осуществляет клеточный фермент - ДНК-зависимая РНК-полимераза II . Но при этом транскрибируются лишь некоторые вирусные гены. Синтезированные молекулы вирусной мРНК транспортируются в цитоплазму, транслируются рибосомами, и образовавшиеся вирусные белки переносятся в ядро. Некоторые из них обладают функцией деблокирования вирусных генов, в результате чего еще одна группа генов становится доступной для транскрипции. Среди белков, кодируемых этими генами, - вирусная ДНК-полимераза . Она осуществляет репликацию ДНК. Новосинтезированная ДНК полностью доступна для транскрипции. Такая последовательность событий называется каскадной регуляцией. Использование клеточной РНК-полимеразы II для транскрипции, как и синтез собственной ДНК-полимеразы, вообще характерно для ДНК-содержащих вирусов, имеющих ядерную локализацию репликации и транскрипции. Напротив, у вирусов семейства Poxviridae , у которых репликация и транскрипция генома протекают в цитоплазме, оба эти процесса осуществляются вирусными ферментами, причем транскриптаза , инициирующая транскрипцию вирусного генома, присутствует в вирусной частице и вносится в клетку при заражении вместе с геномной ДНК.
Вирусы семейства Hepadnaviridae занимают особое место среди ДНК-содержащих вирусов. Их геном представлен частично двунитевой ДНК, причем концы нитей замкнуты в кольцо нековалентной связью. В ядре клетки вирусная ДНК достраивается до полного кольца клеточной ДНК-полимеразой, после чего транскрибируется клеточной РНК-полимеразой II. Часть транскриптов используется как мРНК для синтеза вирусных белков. Один из этих белков обладает функцией обратной транскриптазы , т.е. он способен синтезировать ДНК на вирусной РНК-матрице. Часть РНК-транскриптов комплементарна всей минус-цепи ДНК, т.е. содержит всю генетическую информацию вирусного генома. Эта полноразмерная, соответствующая всему геному нить РНК служит матрицей для синтеза вирусной ДНК, который осуществляется вирусной обратной транскриптазой. Таким образом, у вирусов семейства Hepadnaviridae репликация ДНК проходит через стадию, на которой вирусный геном представлен в форме РНК. Эта особенность вирусов семейства Hepadnaviridae сближает их с представителями Retroviridae , у которых тоже при репликации чередуются стадии, на которых вирусный геном присутствует поочередно: то в форме РНК, то в форме ДНК.
Приведенные примеры иллюстрируют, хотя и не исчерпывают, разнообразие стратегий, используемых вирусами в ходе их жизнедеятельности.
Репродукция вирусов (от англ, reproduce . воспроизводить) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:
· адсорбция вируса на клетке;
· проникновение вируса в клетку;
· «раздевание» вируса;
· биосинтез вирусных компонентов в клетке;
· формирование вирусов;
· выход вирусов из клетки
Адсорбция.
Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е.
прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны, так называемых, рецепторах.
Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.
Поверхностные структуры вируса, «узнающие» специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Способность вирусов избирательно поражать определенные клетки органов и тканей организма называют тропизмом вирусов (от греч. tropos . направление).
Проникновение в клетку .
Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.
«Раздевание» вируса
Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и
освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.
Биосинтез компонентов вируса .
Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства. Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с хорошо известными из биологии процессами транскрипции (от лат.transcriptio . переписывание, т.е. синтез информационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК), трансляции (от лат. translatio . передача, т. е. синтез белков на рибосомах клетки с участием иРНК) и репликации (от лат. replicatio . повторение, т. е. синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному). Поскольку генетический аппарат вирусов остаточно разнообразен, то передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК различна. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть представлены следующим образом:
Для синтеза иРНК одни вирусы используют клеточные ферменты, другие - собственный набор ферментов (полимераз).
Вирусная нуклеиновая кислота кодирует синтез двух классов белков: неструктурных белков-ферментов, которые обслуживают процесс репродукции вирусов на разных его этапах, и структурных белков, которые войдут в состав вирусных частиц потомства. Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, т. е. протекает в разных структурах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ размножения вирусов называется дисъюнктивным (от лат. disjunctus - разобщенный).
Формирование (сборка) вирусов .
Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически узнавать друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, ионных и водородных связей.
Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:
· формирование вирусов является многоступенчатым процессом і с образованием промежуточных форм;
· сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);
· формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;
· сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).
Выход вирусов из клетки.
Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип. взрывной. характеризуется одновременным выходом большого
количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.
Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5-6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.).
Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.
Питательные Среды. Требования, предъявляемые к питательным средам. Типы питательных сред.
Питательные среды должны содержать в достаточном количестве источники углерода, азота, неорганические соли, в ряде случаев - ростовые факторы (витамины, аминокислоты), быть влажными, чтобы процесс простой диффузии проходил без затруднения, прозрачными (по возможности), чтобы визуально или под микроскопом можно было наблюдать рост микробов, стерильными, иметь оптимальные концентрации водородных ионов (рН среды) и окислительно-восстановительный потенциал. Источником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство микробов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются продукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин.
Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, свернутой крови. К основе добавляют хлорид натрия, пептон
Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Для получения мясной воды нежирное мясо, очищенное от сухожилий, измельчают на мясорубке, заливают двойным объемом воды, кипятят на огне, фильтруют, доливают водопроводной воды до первоначального объема, разливают по бутылкам истерилизуют.
Казеин пищевой кислотный содержит полноценный набор аминокислот, характеризуется высокой питательностью, является отходом молочной промышленности. Из казеина готовят перевар.
Пептон – продукт неполного переваривания белка, содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном количестве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.
При приготовлении сред все компоненты смешивают воде, греют или кипятят для растворения агар-агара, прозрачность придают путем фильтрования через ватно-марлевые или тканевые фильтры или осветляют добавлением куриного белка или свежей сыворотки крови, устанавливают рН среды с помощью индикаторов колориметрическим или электрометрическим способом и стерилизуют.
Классификация питательных сред
Питательные Транспортные Консервирующие
Естественные Искусственные
Синтетические
Простые Специальные Дифференциально- Элективные (Селективные)
диагностические
Плотные Жидкие
Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.
Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85-100°С, а при охлаждении до 45-48°С образует гель.
Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.
Простые среды.
Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:
а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясопептонный бульон;
б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).
Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (l,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.
Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах. Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков. Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек. Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.
Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20-22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.
Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.
Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.
Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).
Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.
Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.
Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.
Селенитовая среда - является лучшей средой обогащена для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрии, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.
Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавлют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.
Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».
Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.
Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.
Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются когда нет возможности быстрого посева на питательные среды. Для бактерий наиболее употребительны консерванты:
а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого
глицерина и 1,0 л физиологического раствора.
б) боратная смесь
в) фосфатно-буферная смесь
Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.
Специальные среды.
В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин). Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.
Термостаты
Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.
Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.
11. Условия успешной антибиотикотерапии. Отрицательные стороны антибиотикотерапии. Действие антибиотиков на микробы в зависимости от дозы препарата. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.
Рациональная антибиотикотерапия
Врач всегда должен помнить, что назначать антибиотики следует только при инфекциях бактериальной этиологии. Выбор антибиотиков должен основываться на знании их природной активности в отношении предполагаемых или установленных возбудителей заболевания, а также на локальных и региональных данных о резистентности микроорганизмов. Следует назначать только препараты с доказанной клинической эффективностью при инфекциях данной локализации, обращая при этом внимание на форму выпуска, профиль безопасности, возможность межлекарственных взаимодействий и др.
Обеспечить высокую эффективность лечения может только своевременное начало антибактериальной терапии. Не менее важными являются адекватное дозирование, оптимальная длительность курса антибактериальной терапии и своевременная оценка эффективности стартового антибиотика (через 48-72 ч от начала лечения). Существенную роль играет и оптимальное соотношение стоимость/эффективность. При выборе препарата и проведении антибактериальной терапии обязательно учитываются особенности пациента (возраст, масса тела, физиологические состояния (беременность, период лактации), иммунодефицитные состояния, сопутствующие заболевания, поведенческие стереотипы и др.) и течение заболевания (локализация, клинические проявления, тяжесть и др.).
Отрицательные стороны антибиотикотерапии
- Дисбактериоз: антибиотики убивают полезную и патогенную микрофлору. Выраженность дисбактериоза зависит от дозы, продолжительности, типа лекарства и возраста человека. Как правило, после основной болезни маленьким детям приходится восстанавливать микрофлору. Как этого избежать? Параллельно с антибиотиками (2–3 раза в день) и 2 недели после лечения пить пробиотики (эубиотики) – бактерии для микрофлоры кишечника. Тогда дисбактериоза не будет либо его проявления уменьшатся.
- Опасно пить женщинам в первом триместре беременности. Но если имеется болезнь, угрожающая жизни матери и ребенку, врач выбирает наименьшее зло. Не рекомендуется принимать кормящим грудью женщинам.
- Индивидуальная непереносимость, аллергия или побочные эффекты. Об этом необходимо уведомить врача перед назначением антибиотика или после назначения, если побочные явления появились впервые, и врач сменит лекарство.
Важное условие рациональной антибиотикотерапии - правильный выбор препарата и назначение достаточных доз, способных оказать пагубное действие на
микроорганизм. Назначение препарата в малых дозах может способствовать развитию резистентности микробов.
Определение чувствительности к антибиотикам
А) методом дисков.
На поверхность питательного агара засевают газоном испытуемую культуру (стафилококк, кишечная палочка). Чашки приоткрывают и подсушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Затем накладывают диски пинцетом на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Чашки помещают в термостат для инкубации на 18-20 часов, перевернутыми кверху дном, после чего учитывают результат. Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность, учет проводят в отраженном свете. С помощью линейки и измерителя определяют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков. Оценку результатов проводят по таблицам, которые содержат пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных микроорганизмов.
Б) методом серийных разведении.
Этот метод является количественным, так как позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию, т.е. наименьшую концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры. Исследование начинают с приготовления основного раствора, из которого готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. Для контроля используют посев культуры на бульон без антибиотика. Посевы инкубируют при 37°С 18-20 часов. В контроле появится рост (пробирка станет мутной). Пробирки с прозрачной питательной средой указывают на задержку роста испытуемой культуры, а последняя пробирка с прозрачной питательной средой содержит наименьшую ингибирующую дозу антибиотика, определяющую степень чувствительности испытуемой культуры к антибиотику.
Синтез группы ранних белков (репрессоры клеточного метаболизма, вирус-специфичные полимеразы), Синтез вирус-специфичных белков и НК, Синтез структурных (поздних) белков вируса, Формирование зрелых вирионов В основе этого синтеза лежит тот же механизм, что и при синтезе белка в нормальных клетках. У РНК-содержащих пикорнавирусов функцию иРНК выполняют плюс-нити. У них односпиральная вирионная РНК транслируется с образованием одного гигантского полипептида, который затем расщепляется на отдельные функциональные белки. В синтезе полновирусного белка выражена постоянная во времени трансляция всех генов вирусной РНК. У орто-, рабдо- и парамиксовнрусов вирионная односпиральная РНК не транслируется, а транслируется комплементарная ей плюс-нить, поэтому синтез вирусных специфических белков начинается после образования вирусной иРНК (плюс-нити), которая комплементарна вирионной РНК-Минус-нити синтезируются на плюс-нити вирионной РНК-зависимой полимеразой (РНК-транскриптазой), находящейся в составе вириона в качестве структурного компонента. Синтезирующиеся вирионной полимеразой иРНК являются моноцистронными и значительно короче вирионной РНК. В процессе вирусной инфекции происходят распад клеточных полисом и образование вирусспецифических полисом. Синтез вирусспецифического белка зависит от синтеза вирусной иРНК, но и влияет на него: если синтез белка нарушен, происходит затоваривание вновь образующейся иРНК в местах ее синтеза и тормозится дальнейший ее синтез. Вирусные белки в процессе инфекции синтезируются в избыточном количестве, чем требуется для образования инфекционного вируса. Например, в клетках, инфицированных вирусами герпеса, в вирусное потомство включается только около 35% от общей массы вирусспецифических белков, синтезированных в клетках. У большинства вирусов синтез белков осуществляется в цитоплазме; относительно ядерной локализации синтеза белков некоторых вирусов существует сомнение. Известно, что вирусные белки могут синтезироваться в одних структурах, а накапливаться- в других. Механизмы, ответственные за миграцию вирусных белков в ядро, не выяснены. Известно лишь, что отсутствие аргинина в среде приводит к подавлению миграции структурных белков вируса герпеса от места их синтеза (цитоплазмы) к месту сборки вирионов (ядру), хотя синтез ДНК и белка вируса не нарушен. На разных стадиях инфекционного цикла могут преимущественно образовываться то одни, то другие группы вирусспецифических белков. Скорость их регулируется либо на уровне транскрипции (с образованием иРНК), либо на уровне трансляции (считывание иРНК на рибосомах). В зараженной клетке непропорционально накапливаются иРНК с разных вирусных генов. Механизм этой непропорциональности заложен в самой вирусной частице. Этот же механизм определяет разную эффективность образования различ- ых белков. Стандартная вирусная частица содержит одну молекулу РНК и до 10 тыс. молекул белков. Помимо структур-ных белков, в зараженной клетке могут синтезироваться и не-структурные (но кодируемые вирусной РНК) белки. Наряду с синтезом белков в клетке при репродукции вируса гриппа происходит синтез и углеводных цепей, входящих в состав гликопротеидов. Присоединение углеводов осуществляется с помощью трансфераз, которые являются клеточными ферментами. Синтез липидов также осуществляется клеткой. Вирусная оболочка формируется при включении липидов из плазматической мембраны клетки-хозяина. Синтез вирусных нуклеиновых кислот и вирусспецифических белков происходит почти одновременно и не менее чем на 1 ч опережает созревание вирусных частиц.
Этапы взаимодействия вируса с клеткой: адсорбция и проникновение бактериофагов.
Адсорбция: неспецифическая, специфическая.
Проникновение: Инъекция (остаются оболочки - «тени» фагов),Трансфекция.
+ Вопрос № 6
Этапы взаимодействия вируса с клеткой: проникновение и распространение фитопатогенных вирусов.
Адсорбция : нет. Проникновение : Контактный (через повреждения) От материнского растения к дочернему Переносчики-членистоногие. Репродукция: Синтез группы ранних белков (репрессоры клеточного метаболизма, вирус-специфичные полимеразы) Синтез вирус-специфичных белков и НК. Синтез структурных (поздних) белков вируса. Формирование зрелых вирионов Сборка: автоматическая. Выход:
Этапы взаимодействия вируса с клеткой: типы выхода вирусных частиц из клетки.
Вирусы животных : Выталкивание участков цитоплазмы. Выход отдельных вирионов или их групп. Вирусы растений: Через межклеточные соединения. Клетки продуцируют вирус, не подвергаясь лизису. Бактериофаги: После гибели клетки (литический тип).
Типы взаимодействия вируса и клетки: продуктивный тип.
Продуктивная инфекция – происходит формирование новых вирусных частиц.
Литическая – зараженная клетка может погибнуть, образовав при этом большое количество вируса. Бактериофаги, образующие в зараженных клетках новое поколение фаговых частиц, что приводит к лизису(разрушению) бактериальной клетки, называются вирулентными фагами. Некоторые бактериофаги внутри клетки хозяина не реплицируются. Вместо этого их нуклеиновая кислота включается в ДНК хозяина, образуя с ней единую молекулу, способную к репликации. Такие фаги получили названия умеренных фагов, или профагов. Профаг не оказывает литического воздействия на клетку-хозяина и при делении реплицируется вместе клеточной ДНК. Бактерии, содержащие профаг, называются лизогенными.Они проявляют устойчивость к содержащемуся в них фагу, а так же к близким к нему другим фагам. Связь профага с бактерией весьма прочная, но она может быть нарушена под воздействием индуцирующих факторов(УФ - лучами, ионизирующая радиация, химические мутагены). Персистентная – клетка продолжает жить и делиться, синтезируя небольшие количества вируса. Характерна для вирусов животных. Формы персистентной инфекции: латентная (герпес), хроническая (гепатит), медленная инфекция (ВИЧ).
Типы взаимодействия вируса и клетки: лизогенный тип.
Интегративная инфекция – геном вируса встраивается в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с ним. Продукции вируса нет. Вирусоносительство. Умеренные фаги – способны лизогенизировать заражаемые бактерии. Вирулентные фаги – не могут лизогенизировать бактерии. Профаг – фаг, передающийся дочерним клеткам при делении.
Классификация вирусов.
Вирусы подразделяются на 6 классов по строению нуклеиновой кислоты: Двух цепочечная ДНК, Одно цепочечная ДНК,Двух цепочечная РНК,Одно цепочечная РНК «+»цепь,Одно цепочечная РНК «-»цепь,Ретровирусы Классификация вирусов по Балтимору основывается на механизме образования мРНК. Вирусы должны синтезировать мРНК из собственных геномов для образования белков и репликации своей нуклеиновой кислоты, однако каждое семейство вирусов имеет собственный механизм осуществления этого. Вирусные геномы могут быть одноцепоченые (оц) или двухцепочечные (дц), ДНК- или РНК-содержащие, могут использовать или не использовать обратную транскриптазу. Кроме того, одноцепочечные РНК-вирусы могут иметь положительную (+) или отрицательную (-) цепь РНК в составе своего генома.
Эта система включает в себя семь основных групп: (I) Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и не имеющие РНК-стадии (например, герпесвирусы, поксвирусы, паповавирусы,мимивирус). (II) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу ДНК (например, парвовирусы). В этом случае ДНК всегда положительной полярности. (III) Вирусы, содержащие двуцепочечную РНК (например, ротавирусы). (IV) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности (например, пикорнавирусы, флавивирусы). (V) Вирусы, содержащие одноцепочечную молекулу РНК негативной или двойной полярности (например, ортомиксовирусы, филовирусы). (VI) Вирусы, содержащие одноцепочечную положительную молекулу РНК и имеющие в своем жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретровирусы (например,ВИЧ). (VII) Вирусы, содержащие двуцепочечную ДНК и имеющие в своём жизненном цикле стадию синтеза ДНК на матрице РНК, ретроидные вирусы (например, вирус гепатита B). Дальнейшее деление производится на основе таких признаков как структура генома (наличие сегментов, кольцевая или линейная молекула), генетическое сходство с другими вирусами, наличие липидной оболочки, таксономическая принадлежность организма-хозяина и так далее.
Репродукция вириона происходит только внутри восприимчивой клетки как в организме, так и вне организма. Механизм репродукции вирусов сложен и состоит из ряда последовательных этапов.
Адсорбция вирионов на клетке. Механизм адсорбции вириона на восприимчивой клетке основан на взаимодействии его рецепторов с комплементарными рецепторами клетки. Рецепторы клетки и вириона являются специфическими структурами, расположенными на их поверхности. Миксовирусы и аденовирусы адсорбируются на мукопротеиновых рецепторах, а пикорнавирусы и арбовирусы ― на липопротеиновых рецепторах. Нейраминидаза у вириона миксовирусов разрушает мукогфотеиновые рецепторы и отщепляет N-ацетилнейраминовую кислоту от олигосахарида, содержащего галактозамин и галактозу. Их взаимодействия на этом этапе обратимы, так как на них влияют температура, солевые компоненты и реакция среды. Адсорбции вириона на клетке препятствуют сульфатированные полисахариды и гепарин, несущие отрицательный заряд, но их ингибирующее действие снимается поликар-тионами (ДЭАЭ-декстран, экмолин, протамннсулъфат), которые нейтрализуют отрицательный заряд сульфатированных полисахаридов.
Проникновение вириона в клетку. Процесс проникновения вирионов в клетку у миксовирусов осуществляется ферментом нейраминидазой, который вступает в непосредственный контакт с мукопротеидами клетки. Научные факты, накопленные за последние годы, показывают, что РНК и ДНК вирионов не отделяются от внешней их оболочки, т. е. вирионы целиком проникают в чувствительную клетку путем виропексиса или пиноцитоза. Это доказано в отношении вирусов оспы, осповакцины и других вирусов живот ных. Что касается фагов, то они заражают клетки своей нуклеиновой кислотой. Механизм заражения основан на том, что вирионы, содержащиеся в вакуолях клетки, гидролизуются ферментами (протеаз, липаз). При этом освобождается ДНК от внешней оболочки фага и проникает в клетку.
Рис.1. Основные этапы репродукции вирусов
В эксперименте заражают клетки нуклеиновой кислотой, выделенной от некоторых вирусов, и вызывают один цикл репродукции "вирионов. Но в естественных условиях передача инфекции с помощью инфекционной кислоты не происходит.
Синтез вирусных структурных компонентов. Процессы синтеза компонентов РНК-вирусов происходят после проникновения нуклеопротеидов (вирионов) в клетку, где образуются вирусные полисомы путем комплексирования вирусной РНК с рибосомами. Затем синтезируются ранние белки: репрессоры клеточного метаболизма и РНК-полимеразы, транслируемые с родительской молекулой вирусной РНК. В цитоплазме мелких вирусов или в ядре (вирусы гриппа) образуется двунитчатая вирусная РНК путем комплексирования родительской «плюс»-цепочки с вновь синтезированной и комплементарной ей «минус»-цепочкой. Соединение этих нитей нуклеиновой кислоты обусловливает образование однонитчатой структуры РНК, называемой репликативной формой (РФ), которая устойчива к РНК-азе и необходима для репродукции всех РНК-вирусов. Синтез вирусной РНК осуществляется реплекативным комплексом, в котором участвуют фермент РНК-полимеразы, полисомы, репликативная форма РНК. Существуют два типа РНК-полимераз: РНК-полимераза I катализирует образование репликативной формы на матрице «плюс»-цепочки; РНК-полимераза II участвует в синтезе вирусной однонитчатой РНК на матрице репликативной формы. Синтез нуклеиновой кислоты у мелких вирусов осуществляется в цитоплазме. У вируса гриппа в ядре синтезируются РНК и внутренний белок. РНК выходит из ядра и поступает в цитоплазму, где с рибосомами синтезирует вирусный белок, и образующийся рибонуклеопротеид входит в химический состав вириона.
Синтез компонентов ДНК-вирусов. После проникновения вирионов в клетку в ней подавляется синтез нуклеиновых кислот и клеточных белков. В ядре на матрице ДНК-вируса синтезируется и-РНК, несущая информацию для синтеза белков. Механизм синтеза вирусных белков осуществляется на клеточных рибосомах, и источником их построения является аминокислотный фонд клетки. Активизация аминокислот происходит ферментами, с помощью и-РНК переносятся в рибосомы (полисомы), где они располагаются в синтезированной молекуле белка.
Таким образом, в зараженной клетке синтез нуклеиновой кислоты и белков вириона происходит в составе сложного репликатив-но-транскриптивного комплекса, который, по-видимому, регулируется определенной системой контрольного механизма.
Формирование вириона осуществляется с участием структурных компонентов клетки. Вирусы полиомиелита, герпеса и осповакцины формируются в цитоплазме, а аденовирусов ― в ядре. Синтез вирусной РНК и образование нуклеокапсида (S-анти-гена) происходит в ядре, а гемаглютцина (V-антигена) ―в цитоплазме. Затем S-антиген переходит из ядра в цитоплазму, где осуществляется формирование оболочки вириона. S-антиген покрывается вирусными белками, и в состав вириона включаются-гемагглютинины и нейраминидаза. И так происходит формирование потомства вируса гриппа.
Выход вирусов из клетки. Вирионы освобождаются из клеток двумя способами. Первый способ ― после полного созревания вирионов внутри клетки последние округляются, в них образуются вакуоли, разрушается клеточная оболочка; вирионы выходят одновременно и полностью из клетки (рикорнавирусы). Этот способ называется литическим. Второй способ ― вирионы освобождаются по мере созревания их на цитоплазматической мембране в течение 2―6 часов (арбовирусы и миксовирусы). Освобождению макровирусов из клетки, по-видимому, способствует нейраминидаза, которая разрушает клеточную оболочку. При этом способе 75― 90% вирионов спонтанно выходят в культуральную среду и клетки погибают постепенно.