Видове взаимодействие между вирус и клетка. Продуктивен тип взаимодействие вирус-клетка

Взаимодействието на вириона с жива клетка протича на няколко етапа.

IN начален (подготвителен) период Вирионът се прикрепя към клетката, прониква в нея, след което протеиновата обвивка на вириона се разрушава, освобождавайки нуклеиновата киселина.

идвам скрит (латентен) период вирусна инфекция, по време на която наличието на вирусни частици в заразената клетка не може да бъде открито с никакви методи - родителският вирион изглежда изчезва. През този период вирусната нуклеинова киселина, която е влязла в клетката, организира синтеза на вирусните компоненти на потомството, използвайки за тази цел ензимната система на гостоприемника. Цикълът на възпроизвеждане завършва с образуването на дъщерни вириони и освобождаването им от клетката ( финален период ).

По-простите бактерии не са способни сами да улавят частици от околната среда. Следователно бактериофагите имат специални устройства за преодоляване на плътна бактериална стена. Краят на опашката съдържа специален ензим, който разтваря бактериалната мембрана. След това микроскопичните „мускули“ на опашката се свиват и нуклеиновата киселина на фага се „инжектира“ в клетката, сякаш се инжектира със спринцовка.

В резултат на това протеиновата обвивка на фага остава на повърхността на клетката и само нуклеиновата киселина навлиза в клетката.

Нуклеиновите киселини на вирусите изпълняват програма за създаване на ново вирусно потомство в клетката. Това е доказано с оригинални експерименти. Беше възможно да се разделят вирусите на техните съставни компоненти - протеини и нуклеинови киселини. Оказа се, че клетъчната инфекция и размножаването на вируса се случват само след добавяне на вирусна нуклеинова киселина към клетките. С други думи, самите нуклеинови киселини на вирусите могат да предизвикат възпроизвеждането на вируси, т.е. те имат инфекциозни свойства. В друг експеримент два вируса бяха разделени на техните съставни компоненти и след това „облечени“: нуклеиновата киселина на единия вирус беше „облечена“ в обвивката на другия. Получените хибриди заразяват чувствителни клетки. Открито е, че и двата „маскирани“ вируса са способни да се размножават и полученото потомство винаги е подобно на вируса, чиято нуклеинова киселина съдържа хибридът.

Вирусната нуклеинова киселина, която е влязла в клетката, контролира всички процеси на възпроизвеждане на вируса. Първо, той принуждава клетката да синтезира така наречените ранни протеини, които потискат собствения метаболизъм на клетката и осигуряват синтеза на нуклеинови киселини на дъщерни частици. Образуването им става в резултат на самокопиране на родителската нуклеинова киселина. Генетичната информация, съдържаща се в нуклеиновата киселина на вируса, определя състава на протеините, от които са изградени дъщерните частици на т. нар. късни протеини. В ДНК-съдържащите вируси тази информация се реализира по обичайния за клетката начин: върху ДНК се синтезира информационна РНК (транскрипция), която контролира последващата биосинтеза на протеини (транслация). Нуклеиновата киселина на много вируси, съдържащи РНК, съчетава както генетични, така и информационни функции: РНК участва както в репликацията, така и в транслацията (при възпроизвеждането на нуклеинови киселини и вирусен протеин). При много вируси изграждането на протеинови черупки и вътрешно съдържание се извършва отделно. Клетката "натрупва" отделни части, които след това се комбинират, за да образуват вирусни частици. Когато в заразената клетка се натрупат достатъчен брой „заготовки“ за бъдещи вирусни частици, започва своеобразно сглобяване на части (композиция). Този процес обикновено протича в близост до клетъчната мембрана, която участва в него. Вирусната частица често съдържа вещества, които

характеристика на клетката, в която се размножава вирусът. Например, за грипния вирус последният етап от образуването на вирусна частица е вид обвиване със слой от клетъчна мембрана. Тоест клетката не само „храни“ и „пои“ вируса, но и ги „облича“ за сбогом. Последният етап на взаимодействие между вируса и клетката обикновено е краткотраен. Получените пълноценни вирусни частици бързо излизат във външната среда. Производството на потомство в бактериофагите става по много уникален начин. Обикновено се придружава от разтваряне (лизис) на бактериални клетки под действието на специален ензим, който се натрупва в клетката успоредно с размножаването на фага и води до неговото унищожаване и смърт. Под микроскоп можете ясно да видите как става това. Понякога бактерията сякаш експлодира, в други случаи в бактерията се образува дупка (в средата или в един от краищата), през която съдържанието й изтича. От една мъртва бактерия могат да се отделят до няколкостотин нови фагови частици. Процесът на възпроизвеждане на фаг продължава, докато всички бактерии, чувствителни към този фаг, бъдат унищожени. Вирусите на едра шарка, полиомиелит и енцефалит също се характеризират с бързо освобождаване на стотици, а понякога и хиляди дъщерни вириони в околната среда. Други човешки и животински вируси (херпесен вирус, вирус на паротит, реовирус) напускат клетките, докато узряват. Тези вируси успяват да завършат няколко цикъла на възпроизвеждане, преди клетките да умрат, като постепенно изчерпват синтетичните ресурси на клетките и причиняват тяхното унищожаване. В някои случаи V. може да се натрупва вътре в клетките, образувайки кристални клъстери (V. бяс, аденовируси и др.), Които се наричат ​​тела на включване.

При грип, бяс, пситакоза, едра шарка такива тела се намират в цитоплазмата на клетките, с пролетно-летен енцефалит, жълта треска, херпес и полиомиелит - в ядрото; При някои инфекции телата на включване са открити както в ядрото, така и в цитоплазмата. Изследванията през последните години показват, че в по-голямата част от случаите тези включвания са колонии на вируса и тяхното образуване е естествено на определен етап от размножаването на инфекциозните агенти. Високата специфичност на вътреклетъчните включвания при вирусни заболявания прави възможно използването на този знак за диагностика. Например, цитоплазмените включвания (т.нар. телца на Негри), открити в нервните клетки на мозъка, са основното доказателство за бяс, а специфични кръгли или овални образувания (т.нар. телца на Гуарниери), открити в епителните клетки, показват едра шарка. Описани са включвания и при енцефалит, гръбначна парализа, шап и други заболявания. Растителните вируси образуват много особени включвания, които имат кристална форма. Тоест възпроизвеждането на вируси става по специален, несравним начин. Първо, вирусните частици проникват в клетките и се освобождават вирусни нуклеинови киселини. След това се подготвят детайлите на бъдещите вирусни частици. Възпроизвеждането завършва със сглобяването на нови вирусни частици и освобождаването им в околната среда. Загубата на който и да е от тези етапи води до нарушаване на нормалния цикъл и води или до пълно потискане на репродукцията на V., или до появата на непълноценно потомство.

Основните етапи на взаимодействие между вируса и клетката гостоприемник.

1. Адсорбция - задействащ механизъм, свързан с взаимодействието на специфични рецептори на вируса и гостоприемника (в грипния вирус - хемаглутинин, в човешкия имунодефицитен вирус - гликопротеин gp 120).

2. Проникване - чрез сливане на суперкапсида с клетъчната мембрана или чрез ендоцитоза (пиноцитоза).

3. Освобождаване на нуклеинова киселина - ―събличане на нуклеокапсида и активиране на нуклеиновата киселина.

4. Синтез на нуклеинови киселини и вирусни протеини , т.е. подчинение на системите на клетката гостоприемник и тяхната работа за възпроизвеждане на вируса.

5. Вирион монтаж - свързване на репликирани копия на вирусна нуклеинова киселина с капсиден протеин.

6. Излизане на вирусни частици от клетката , придобиване на суперкапсид от вируси с обвивка.

Форми на вирусна инфекция.

На ниво макроорганизъм основните форми на вирусни лезии не се различават фундаментално от тези, наблюдавани при инфектиране на отделни клетки от вируси.

Продуктивна вирусна инфекция с образуването на дъщерни популации и характерни клинични прояви е възможно само ако в заразеното тяло има чувствителни клетки, в които се осъществява репродуктивният цикъл на патогена. Например, полиомиелитният патоген може да се репликира само в клетките на стомашно-чревния тракт и централната нервна система на примати и хора.

Инфекция при аборт се развива, когато патогенът проникне в нечувствителни клетки (например, когато вирусът на левкемия по говедата навлезе в човешкото тяло) или в клетки, които не са в състояние да осигурят пълен репродуктивен цикъл (например тези на етап G0 от клетъчния цикъл). Способността на клетките да поддържат специфични за вируса репродуктивни процеси също потиска IFN, чийто антивирусен ефект е насочен срещу голямо разнообразие от вируси.

Устойчива вирусна инфекция възниква по време на такова взаимодействие между вируса и заразената клетка, когато последната продължава да изпълнява собствените си клетъчни функции. Ако заразените клетки се делят, се образува заразен клонинг. По този начин увеличаването на броя на заразените клетки допринася за увеличаване на общата популация на патогена в тялото. Въпреки това, упоритите вирусни инфекции обикновено нарушават клетъчните функции, което в крайна сметка води до клинични прояви. При хората развитието на персистиращи инфекции зависи до известна степен от възрастта. Например вътрематочната инфекция с вируса на рубеола, морбили или цитомегаловирус (CMV) води до ограничено във времето персистиране на патогена. Появата на симптомите е свързана със способността на плода да развие имунен отговор към инфекциозния агент.

Латентна (скрита) вирусна инфекция . Докато персистиращите инфекции са придружени от постоянно освобождаване на дъщерни вирусни популации, при латентни лезии те се образуват спорадично. Репродуктивният цикъл на такива патогени рязко се забавя в по-късните етапи и се активира под въздействието на различни фактори.

Латентните инфекции са характерни за повечето херпесни вируси, причинявайки рецидивиращи и обикновено непрогресивни заболявания.

Неапаратни инфекции *от лат. in-, denial, + appareo, be+ са придружени от асимптоматична циркулация на малки количества от патогена в отделни органи. В този случай патогенът може да бъде идентифициран само чрез специални методи. Това, което отличава такива лезии от безсимптомното носителство, е високата вероятност от клинични прояви. Този термин се използва за редица инфекции, при които няма явни признаци на заболяване. В практиката на вирусните инфекции при хората често се използва алтернативният термин „субклинична инфекция“. Всъщност латентните инфекции могат да се разглеждат като хронично възникващи инфекции в устройството, при които се установява баланс между тялото и патогена.

Спяща (криптогенна) вирусна инфекция - форма на проявление на вирусна инфекция, при която патогенът е в неактивно състояние в отделни огнища (например в нервните ганглии). Клинично инфекцията се проявява само когато защитните сили на организма са рязко отслабени. Например херпесен вирус тип 3, който причинява варицела по време на първоначалната инфекция, остава в тялото за цял живот. Повтарянето на заболяването под формата на херпес зостер е възможно само при нарушен имунен статус (най-често в напреднала възраст).

Бавни вирусни инфекции характеризиращ се с дълъг инкубационен период (месеци и години), през който патогенът се размножава, причинявайки все по-очевидно увреждане на тъканите. Първоначално патогенът се размножава в ограничена група клетки, но постепенно инфектира все по-голям брой от тях. Болестите завършват с развитие на тежки лезии и смърт на пациента. Бавните вирусни инфекции включват подостър склерозиращ паненцефалит, HIV инфекция и др.

№ 19 Видове взаимодействие вирус-клетка. Етапи на вирусна репродукция.
Видове взаимодействие вирус-клетка. Има три вида взаимодействие между вируса и клетката: продуктивно, абортивно и интегративно.
Продуктивен тип- завършва с образуването на ново поколение вириони и смъртта (лизис) на заразените клетки (цитолитична форма). Някои вируси напускат клетките, без да ги разрушават (нецитолитична форма).
Абортивен тип- не завършва с образуването на нови вириони, тъй като инфекциозният процес в клетката се прекъсва на един от етапите.
Интегративен тип,или вирогения- характеризира се с включване (интегриране) на вирусна ДНК под формата на провирус в клетъчната хромозома и тяхното съвместно съществуване (съвместна репликация).
Възпроизвеждане на вирусиизвършват се на няколко етапа, последователно заменящи се един друг: адсорбция на вируса върху клетката; проникване на вируса в клетката; „събличане“ на вируса; биосинтеза на вирусни компоненти в клетката; образуване на вируси; освобождаване на вируси от клетката.
Адсорбция.Взаимодействието на вируса с клетката започва с процеса на адсорбция, т.е. прикрепването на вирусите към клетъчната повърхност. Това е много специфичен процес. Вирусът се адсорбира върху определени участъци от клетъчната мембрана – така наречените рецептори. Клетъчните рецептори могат да имат различна химическа природа, представляващи протеини, въглехидратни компоненти на протеини и липиди, липиди. Броят на специфичните рецептори на повърхността на една клетка варира от 10 4 до 10 5. Следователно десетки и дори стотици вирусни частици могат да бъдат адсорбирани върху клетката.
Проникване в клетката. Има два начина животинските вируси да навлязат в клетка: виропексия и сливане на вирусната обвивка с клетъчната мембрана. При виропексис, след адсорбция на вируси, настъпва инвагинация (инвагинация) на участък от клетъчната мембрана и образуване на вътреклетъчна вакуола, която съдържа вирусна частица. Вакуолата с вируса може да се транспортира във всяка посока до различни части на цитоплазмата или клетъчното ядро. Процесът на сливане се осъществява от един от повърхностните вирусни протеини на капсидната или суперкапсидната обвивка. Очевидно и двата механизма на проникване на вируса в клетката не се изключват, а взаимно се допълват.
"Лента".Процесът на „събличане“ включва премахване на защитните вирусни черупки и освобождаване на вътрешния компонент на вируса, което може да причини инфекциозен процес. „Събличането“ на вирусите става постепенно, на няколко етапа, в определени области на цитоплазмата или ядрото на клетката, за което клетката използва набор от специални ензими. В случай на проникване на вируса чрез сливане на вирусната обвивка с клетъчната мембрана, процесът на проникване на вируса в клетката се комбинира с първия етап на нейното „събличане“. Крайните продукти на "събличането" са сърцевината, нуклеокапсида или нуклеиновата киселина на вируса.
Биосинтеза на вирусни компоненти. Попадналата в клетката вирусна нуклеинова киселина носи генетична информация, която успешно се конкурира с генетичната информация на клетката. Той дезорганизира функционирането на клетъчните системи, потиска собствения метаболизъм на клетката и я принуждава да синтезира нови вирусни протеини и нуклеинови киселини, които се използват за изграждане на вирусно потомство.
Внедряването на генетичната информация на вируса се осъществява в съответствие с процесите на транскрипция, транслация и репликация.
Образуване (сглобяване) на вируси. Синтезираните вирусни нуклеинови киселини и протеини имат способността специфично да се „разпознават“ и при достатъчна концентрация те спонтанно се комбинират в резултат на хидрофобни, солеви и водородни връзки.
Съществуват следните общи принципи за сглобяване на вируси с различни структури:
1. Образуването на вируси е многоетапен процес с образуването на междинни форми;
2. Сглобяването на просто подредени вируси включва взаимодействието на молекулите на вирусната нуклеинова киселина с капсидните протеини и образуването на нуклеокапсиди (например полиомиелитни вируси). В сложните вируси първо се образуват нуклеокапсиди, с които взаимодействат протеините на суперкапсидната обвивка (например грипни вируси);
3. Образуването на вируси не се случва във вътреклетъчната течност, а върху ядрените или цитоплазмените мембрани на клетката;
4. Сложно организираните вируси по време на процеса на образуване включват компоненти на клетката гостоприемник (липиди, въглехидрати).
Излизане на вируси от клетката. Има два основни вида освобождаване на вирусно потомство от клетката. Първият тип - експлозивен - се характеризира с едновременно освобождаване на голям брой вируси. В този случай клетката бързо умира. Този метод на излизане е типичен за вируси, които нямат суперкапсидна обвивка. Вторият вид е пъпкуващ. Характерно е за вируси, които имат суперкапсидна обвивка. В последния етап на сглобяване нуклеокапсидите на сложните вируси се фиксират върху клетъчната плазмена мембрана, модифицирана от вирусни протеини, и постепенно я изпъкват. В резултат на изпъкналост се образува "пъпка", съдържаща нуклеокапсид. След това „пъпката“ се отделя от клетката. Така външната обвивка на тези вируси се формира при излизането им от клетката. С този механизъм клетката може да произвежда вирус за дълго време, като поддържа в една или друга степен основните си функции.
Времето, необходимо за завършване на пълния цикъл на възпроизвеждане на вируса, варира от 5-6 часа (грипни вируси, едра шарка и др.) до няколко дни (морбилни вируси, аденовируси и др.). Получените вируси са в състояние да инфектират нови клетки и да преминат през гореспоменатия цикъл на възпроизвеждане в тях.

Процесът на възпроизвеждане на вируса може грубо да бъде разделен на 2 фази . Първата фаза включва 3 етапа: 1) адсорбция на вируса върху чувствителни клетки; 2) проникване на вируса в клетката; 3) депротеинизация на вируса . Втората фаза включва етапите на внедряване на вирусния геном: 1) транскрипция, 2) транслация, 3) репликация, 4) сглобяване, узряване на вирусни частици и 5) излизане на вируса от клетката.

Взаимодействието на вируса с клетката започва с процеса на адсорбция, т.е. с прикрепването на вируса към клетъчната повърхност.

Адсорбцияе специфично свързване на вирионния протеин (антирецептор) към комплементарната структура на клетъчната повърхност - клетъчния рецептор. Според химическата си природа рецепторите, върху които се фиксират вирусите, принадлежат към две групи: мукопротеинови и липопротеинови. Вирусите на грипа, параинфлуенцата и аденовирусите са фиксирани върху мукопротеиновите рецептори. Ентеровирусите, херпесните вируси, арбовирусите се адсорбират върху липопротеиновите рецептори на клетката. Адсорбцията се осъществява само в присъствието на определени електролити, по-специално Ca2+ йони, които неутрализират излишните анионни заряди на вируса и клетъчната повърхност и намаляват електростатичното отблъскване.Адсорбцията на вирусите зависи малко от температурата.Първоначалните процеси на адсорбция са неспецифични по природа и са резултат от електростатично взаимодействие на положително и отрицателно заредени структури на повърхността на вируса и клетката, след което възниква специфично взаимодействие между прикрепващия протеин на вириона и специфични групи на плазмената мембрана на клетката. Простите човешки и животински вируси съдържат прикрепващи протеини като част от капсида. При сложните вируси прикрепващите протеини са част от суперкапсида. Те могат да имат формата на нишки (влакна при аденовирусите) или шипове, подобни на гъби структури при миксо-, ретро-, рабдо- и други вируси. Първоначално възниква единична връзка на вириона с рецептора - такова прикрепване е крехко - адсорбцията е обратима. За да възникне необратима адсорбция, трябва да се появят множество връзки между вирусния рецептор и клетъчния рецептор, т.е. стабилно многовалентно прикрепване. Броят на специфичните рецептори на повърхността на една клетка е 10 4 -10 5. Рецептори за някои вируси, например арбовируси. се съдържат в клетките както на гръбначни, така и на безгръбначни; за други вируси само в клетки на един или повече видове.

Проникването на човешки и животински вируси в клетките става по два начина: 1) виропексис (пиноцитоза); 2) сливане на вирусната суперкапсидна обвивка с клетъчната мембрана. Бактериофагите имат свой собствен механизъм за проникване, така наречената спринцовка, когато в резултат на свиване на протеиновия придатък на фага нуклеиновата киселина се инжектира в клетката.

Депротеинизацията на вируса, освобождаването на вирусния хемом от вирусните защитни черупки се извършва или с помощта на вирусни ензими, или с помощта на клетъчни ензими. Крайните продукти на депротеинизацията са нуклеинови киселини или нуклеинови киселини, свързани с вътрешния вирусен протеин. След това протича втората фаза на вирусното възпроизвеждане, което води до синтеза на вирусни компоненти.

Транскрипцията е пренаписване на информация от ДНК или РНК на вируса в иРНК според законите на генетичния код.

Транслацията е процес на транслиране на генетична информация, съдържаща се в иРНК, в специфична последователност от аминокиселини.

Репликацията е процесът на синтез на молекули нуклеинови киселини, хомоложни на вирусния геном.

Внедряването на генетична информация в ДНК-съдържащи вируси е същото като в клетките:

ДНК транскрипция иРНК транслационен протеин

Транскрипция на РНК i-РНК транслационен протеин

Вирусите с положителен РНК геном (тогавируси, пикорнавируси) нямат транскрипция:

Транслация на РНК протеин

Ретровирусите имат уникален начин за предаване на генетична информация:

РНК обратна транскрипция ДНК транскрипция мРНК транслационен протеин

ДНК се интегрира с генома на клетката гостоприемник (провирус).

След като клетката натрупа вирусни компоненти, започва последният етап от вирусната репродукция: сглобяването на вирусни частици и освобождаването на вириони от клетката. Вирионите излизат от клетката по два начина: 1) чрез „взривяване” на клетката, в резултат на което клетката се разрушава. Този път е присъщ на прости вируси (пикорна-, рео-, папова- и аденовируси), 2) излизане от клетките чрез пъпкуване. Присъщи на вируси, съдържащи суперкапсид. При този метод клетката не умира незабавно и може да произведе множество вирусни потомци, докато ресурсите й не бъдат изчерпани.

Методи за култивиране на вируси

За култивиране на вируси в лабораторни условия се използват следните живи обекти: 1) клетъчни култури (тъкани, органи); 2) пилешки ембриони; 3) лабораторни животни.

Клетъчна култура

Най-често срещаните са еднослойни клетъчни култури, които могат да бъдат разделени на 1) първични (първично трипсинизирани), 2) полунепрекъснати (диплоидни) и 3) непрекъснати.

По произходте се класифицират на ембрионални, туморни и от възрастни организми; чрез морфогенеза- фибробластни, епителни и др.

Първичен Клетъчните култури са клетки от всяка човешка или животинска тъкан, които имат способността да растат под формата на монослой върху пластмасова или стъклена повърхност, покрита със специална хранителна среда. Продължителността на живота на такива култури е ограничена. Във всеки конкретен случай те се получават от тъканта след механично смилане, третиране с протеолитични ензими и стандартизиране на броя на клетките. Първичните култури, получени от бъбреци на маймуни, бъбреци на човешки ембриони, човешки амнион и пилешки ембриони, се използват широко за изолиране и натрупване на вируси, както и за производството на вирусни ваксини.

Полукожени (или диплоиден ) клетъчни култури - клетки от същия тип, способни да издържат до 50-100 пасажа in vitro, като същевременно запазват своя оригинален диплоиден набор от хромозоми. Диплоидни щамове на човешки ембрионални фибробласти се използват както за диагностика на вирусни инфекции, така и при производството на вирусни ваксини.

Непрекъснато клетъчните линии се характеризират с потенциално безсмъртие и хетерплоиден кариотип.

Източник на трансплантируеми линии могат да бъдат първични клетъчни култури (например SOC, PES, BHK-21 - от бъбреци на еднодневни сирийски хамстери; PMS - от бъбрек на морско свинче и др.) отделни клетки на които показват склонност към безкрайно размножаване in vitro. Наборът от промени, водещи до появата на такива характеристики от клетките, се нарича трансформация, а клетките на непрекъснати тъканни култури се наричат ​​трансформирани.

Друг източник на трансплантируеми клетъчни линии са злокачествените неоплазми. В този случай клетъчната трансформация се извършва in vivo. Във вирусологичната практика най-често се използват следните линии трансплантирани клетки: HeLa - получени от цервикален карцином; Ner-2 - от карцином на ларинкса; Детройт-6 - от метастази на рак на белия дроб до костния мозък; RH - от човешки бъбрек.

За култивиране на клетки са необходими хранителни среди, които според предназначението си се делят на растежни и поддържащи. Растежната среда трябва да съдържа повече хранителни вещества, за да се осигури активна клетъчна пролиферация за образуване на монослой. Поддържащата среда трябва само да гарантира, че клетките оцеляват във вече образуван монослой по време на размножаването на вируси в клетката.

Стандартните синтетични среди, като синтетична среда 199 и среда на Eagle, са широко използвани. Независимо от предназначението, всички среди за клетъчни култури са формулирани с помощта на балансиран солев разтвор. Най-често това е решение на Ханкс. Неразделен компонент на повечето хранителни среди е животински кръвен серум (телешки, говежди, конски), без 5-10% от който не се осъществява възпроизвеждане на клетки и образуване на монослой. Серумът не е включен в поддържащата среда.

Изолиране на вируси в клетъчни култури и методи за тяхното индициране.

При изолиране на вируси от различни инфекциозни материали от пациент (кръв, урина, изпражнения, мукозен секрет, измиване на органи) се използват клетъчни култури, които са най-чувствителни към предполагаемия вирус. За инфекция се използват култури в епруветки с добре развит монослой от клетки. Преди да се заразят клетките, хранителната среда се отстранява и във всяка епруветка се добавят 0,1-0,2 ml суспензия от изследвания материал, предварително обработен с антибиотици за унищожаване на бактерии и гъбички. След 30-60 мин. След контакт на вируса с клетките, излишният материал се отстранява, в епруветката се добавя поддържаща среда и се оставя в термостат, докато се открият признаци на репликация на вируса.

Индикатор за наличието на вирус в заразени клетъчни култури може да бъде:

1) развитието на специфична клетъчна дегенерация - цитопатичният ефект на вируса (CPE), който има три основни типа: кръгла или малка клетъчна дегенерация; образуване на многоядрени гигантски клетки - симпласти; развитие на огнища на клетъчна пролиферация, състоящи се от няколко слоя клетки;

2) откриване на вътреклетъчни включвания, разположени в цитоплазмата и ядрата на засегнатите клетки;

3) положителна реакция на хамаглутинация (RHA);

4) положителна реакция на хемадсорбция (RHAds);

5) феномен на образуване на плака: монослой от инфектирани с вирус клетки е покрит с тънък слой агар с добавяне на неутрален червен индикатор (фон - розов). При наличие на вирус върху розовия агаров фон в клетките се образуват безцветни зони (“плаки”).

6) при липса на CPD или GA може да се извърши реакция на интерференция: изследваната култура се заразява повторно с вируса, който причинява CPD. В положителен случай няма да има CPP (реакцията на смущение е положителна). Ако в тестовия материал няма вирус, се наблюдава CPE.

Изолиране на вируси в пилешки ембриони.

За вирусологични изследвания се използват пилешки ембриони на възраст 7-12 дни.

Преди заразяването се определя жизнеспособността на ембриона. По време на овоскопирането живите ембриони са подвижни и съдовият модел е ясно видим. Границите на въздушния мехур са маркирани с обикновен молив. Пилешките ембриони се заразяват при асептични условия, като се използват стерилни инструменти, след предварителна обработка на черупката над въздушното пространство с йод и алкохол.

Методите за заразяване на пилешки ембриони могат да бъдат различни: прилагане на вируса върху хорион-алантоисната мембрана, в амниотичните и алантоисните кухини, в жълтъчната торбичка. Изборът на метод на заразяване зависи от биологичните свойства на изследвания вирус.

Индикация за наличието на вирус в пилешки ембрион се прави чрез смъртта на ембриона, положителна реакция на хемаглутинация върху стъкло с алантоична или околоплодна течност и чрез фокални лезии („плаки“) върху хорион-алантоичната мембрана.

III. Изолиране на вируси в лабораторни животни.

Лабораторни животни могат да се използват за изолиране на вируси от инфекциозен материал, когато не могат да се използват по-удобни системи (клетъчни култури или пилешки ембриони). Те вземат основно новородени бели мишки, хамстери, морски свинчета и плъхове. Животните се заразяват по принципа на вирусния цитотропизъм: пневмотропните вируси се инжектират интраназално, невротропните вируси - интрацеребрално, дерматотропните вируси - върху кожата.

Индикацията за вируса се основава на появата на признаци на заболяване при животните, тяхната смърт, патоморфологични и патохистологични промени в тъканите и органите, както и положителна реакция на хемаглотинация с екстракти от органи.

Абстрактни вируси

Вирусите играят голяма роля в човешкия живот. Те са причинители на редица опасни заболявания – едра шарка, хепатит, енцефалити, рубеола, бяс, грип и др.

През 1892 г. руският учен Д.И. Ивановски описва необичайните свойства на причинителя на болестта по тютюна - тютюневата мозайка.Този патоген преминава през бактериални филтри и освен това не расте върху изкуствени хранителни среди. По този начин здравите тютюневи растения могат да бъдат заразени с безклетъчен филтрат от сок на болно растение.

Колко години по-късно е открит причинителят на шапа, който е преминал и през бактериални филтри.

През 1898 г. Beijerinck въвежда новата дума "вирус" (от латински отрова), за да посочи инфекциозния характер на някои филтрирани растителни течности.

През 1917 г. Ф. д'Ерел открива бактериофаг - вирус, който заразява бактериите. Дълго време обаче структурата на вируса остава загадка за учените. Ето защо вирусите са сред първите обекти, изследвани под електронен микроскоп веднага след откриването му през 30-те години.

Разлики между вируси и други организми:

1. Вирусите са най-малките организми (средно са 50 пъти по-малки от бактериите), не могат да се видят със светлинен микроскоп. 30-300 nm.

2. Вирусите нямат клетъчна структура. Ако разглеждаме клетъчната структура като задължителен признак на живот, тогава вирусите не са живи. Те обаче притежават генетичен материал и са способни на самовъзпроизвеждане. Има предположение, че вирусите са генетичен материал, който веднъж е избягал от клетката и е запазил способността си да се възпроизвежда, когато се е върнал в клетъчната среда.

3. Вирусите могат да се възпроизвеждат само в жива клетка и не са независими организми.

4. Вирусите се състоят от една малка молекула нуклеинова киселина (ДНК или РНК) и са заобиколени от протеинова обвивка

5. За разлика от клетъчните организми, вирусите не могат сами да синтезират протеини. Вирусът въвежда в клетката само своята нуклеинова киселина, която изключва ДНК на гостоприемника и дава на клетката команда да синтезира необходимите й протеини (за сглобяването и освобождаването на нови копия на вируса).

Структура на вирусите

Вирусна частица, наричана още вирион, се състои от нуклеинова киселина (ДНК или РНК), заобиколена от протеинова обвивка. Тази черупка се нарича капсид. Капсидът се състои от субединици - капсомери.Капсид с нуклеинова киселина – нуклеокапсид- може да е гол или да има допълнителна черупка ( грипни и херпесни вируси).

Най-простите вируси, като вируса на тютюневата мозайка, имат само протеинов капсид. Структурата на вируса на брадавиците и аденовирусите е подобна..

Вирусните частици могат да бъдат пръчковидни или нишковидни или да имат форма на полиедър.

Взаимодействие вирус-клетка

1. Разпознаване от вируса на неговата клетка. По правило навлизането на вируса се предшества от свързването му със специален рецепторен протеин на клетъчната повърхност.

2. Адсорбция – прикрепване на вириона към клетъчната повърхност. Свързването се осъществява с помощта на специални протеини на повърхността на вирусната частица, които разпознават съответния рецептор на клетъчната повърхност. Като ключ към ключалка.

3. Проникване през мембраната. Частта от мембраната, към която се е прикрепил вирусът, се потапя в цитоплазмата и се превръща във вакуола, която след това може да се слее с ядрото.

4. “Събличане” - освобождаване от капсида. Възниква или на клетъчната повърхност, или в резултат на разрушаване на капсида от клетъчните ензими в цитоплазмата.

5. Копиране (редупликация) на вирусна нуклеинова киселина.

6. Синтез на вирусни протеини.

7. Сглобяване на вириони в ядрото или цитоплазмата.

8. Излизане на вириони от клетката. При някои вируси това става чрез „експлозия“, в резултат на което се нарушава целостта на клетката и тя умира. Други вируси се освобождават по начин, напомнящ на пъпкуване. В този случай клетките гостоприемници могат да поддържат своята жизнеспособност за дълго време. Вирионите се освобождават от клетката с различна скорост. При някои видове инфекции вирионите могат да останат вътре в клетката за доста дълго време, без да я разрушат.

Бактерии вируси

Вируси, които атакуват бактерии , се наричат ​​бактериофаги или просто фаги.

Структура на бактериофагитеосновно изследван с помощта на Т-фаг като пример Екерихия коли(колифаг). Колифагът се състои от многостенна глава и опашка. Главата се състои от капсомери и съдържа ДНК вътре. Опашката има сложна структура и се състои от куха пръчка, контрактилна обвивка около нея и основна пластина с шипове и нишки (необходими за адсорбция върху клетката гостоприемник).

Проникване на бактериофаг в клетка

Дебелите клетъчни стени на бактериите не позволяват на вируса да навлезе в цитоплазмата, както при заразяване на животински клетки. Следователно бактериофагът вкарва куха пръчка в клетката и изтласква през нея нуклеиновата киселина, намираща се в главата.

Откриване на вируси от Д. И. Ивановски през 1892 г постави началото на развитието на науката вирусология. По-бързото му развитие е улеснено от изобретяването на електронния микроскоп и разработването на метод за култивиране на микроорганизми в клетъчни култури.

В момента вирусологията е бързо развиваща се наука, което се дължи на редица причини:

Водещата роля на вирусите в човешката инфекциозна патология (примери - грипен вирус, HIV човешки имунодефицитен вирус, цитомегаловирус и други херпесни вируси) на фона на почти пълното отсъствие на специфична химиотерапия;

Използването на вируси за решаване на много фундаментални въпроси в биологията и генетиката.

Основни свойства на вирусите (и плазмидите), по което се различават от останалия жив свят.

1. Ултрамикроскопични размери (измерени в нанометри). Големите вируси (вирус на едра шарка) могат да достигнат размери от 300 nm, малки - от 20 до 40 nm. 1mm=1000µm, 1µm=1000nm.

3. Вирусите не са способни на растеж и бинарно делене.

4. Вирусите се възпроизвеждат, като се самовъзпроизвеждат в заразена клетка гостоприемник, използвайки собствена геномна нуклеинова киселина.

6. Местообитанието на вирусите са живи клетки - бактерии (това са бактериални вируси или бактериофаги), растителни, животински и човешки клетки.

Всички вируси съществуват в две качествено различни форми: извънклетъчна - вирион и вътреклетъчна - вирус. Таксономията на тези представители на микрокосмоса се основава на характеристиките на вирионите - крайната фаза на развитие на вируса.

Структура (морфология) на вирусите

1. Вирусен геномобразуват нуклеинови киселини, представени от едноверижни РНК молекули (в повечето РНК вируси) или двуверижни ДНК молекули (в повечето ДНК вируси).

2. Капсид- протеинова обвивка, в която е опакована геномната нуклеинова киселина. Капсидът се състои от идентични протеинови субединици - капсомери.Има два начина за опаковане на капсомерите в капсид - спирален (спирални вируси) и кубичен (сферични вируси).

Със спираловидна симетрияпротеиновите субединици са разположени спираловидно, а между тях, също спираловидно, е разположена геномната нуклеинова киселина (нишковидни вируси). С кубичен тип симетриявирионите могат да бъдат под формата на полиедри, най-често - двадесет хедра - Икосаедри.

3. Имат само просто проектирани вируси нуклеокапсид, т.е. геномният комплекс с капсида се нарича „гол“.

4. Други вируси имат допълнителна мембраноподобна обвивка върху капсида, придобита от вируса в момента на излизане от клетката гостоприемник - суперкапсид.Такива вируси се наричат ​​„облечени“.

В допълнение към вирусите има още по-просто организирани форми на агенти, способни да се предават - плазмиди, вироиди и приони.

Основните етапи на взаимодействие между вируса и клетката гостоприемник

1. Адсорбцията е задействащ механизъм, свързан с взаимодействие специфиченрецептори на вируса и гостоприемника (в грипния вирус - хемаглутинин, в човешкия имунодефицитен вирус - гликопротеин gp 120).

2. Проникване – чрез сливане на суперкапсида с клетъчната мембрана или чрез ендоцитоза (пиноцитоза).

3. Освобождаване на нуклеинови киселини - “събличане” на нуклеокапсида и активиране на нуклеиновата киселина.

4. Синтез на нуклеинови киселини и вирусни протеини, т.е.

5. Сглобяване на вириони - свързване на репликирани копия на вирусна нуклеинова киселина с капсиден протеин.

6. Излизане на вирусни частици от клетката, придобиване на суперкапсид от вируси с обвивка.

Резултати от взаимодействието между вируси и клетки гостоприемници

1. Процес на аборт- когато клетките се освободят от вируса:

При заразяване дефектенвирус, чиято репликация изисква помощен вирус; независимото репликиране на тези вируси е невъзможно (така наречените вирусоиди). Например делта (D) вирусът на хепатит може да се репликира само в присъствието на вируса на хепатит В, неговия Hbs - антиген, адено-асоцииран вирус - в присъствието на аденовирус);

Когато вирус зарази клетки, които са генетично нечувствителни към него;

Когато чувствителните клетки са заразени с вирус при недопустими условия.

2. Продуктивен процес- репликация (производство) на вируси:

- смърт (лизис) на клетките(цитопатичен ефект) - резултат от интензивно размножаване и образуване на голям брой вирусни частици - характерен резултат от продуктивен процес, причинен от вируси с висока цитопатогенност. Цитопатичният ефект върху клетъчните култури за много вируси е от доста разпознаваем специфичен характер;

- стабилно взаимодействие, което не води до клетъчна смърт (персистиращи и латентни инфекции) – т.нар вирусна трансформация на клетка.

3. Интегративен процес- интегриране на вирусния геном с генома на клетката гостоприемник. Това е специална версия на продуктивен процес, подобен на стабилно взаимодействие. Вирусът се репликира заедно с генома на клетката гостоприемник и може да остане латентен за дълго време. Само ДНК вируси могат да се интегрират в генома на ДНК на гостоприемника (принципът „ДНК в ДНК“). Единствените РНК вируси, които могат да се интегрират в генома на клетката гостоприемник, са ретровирусите, които имат специален механизъм за това. Особеността на тяхното възпроизвеждане е синтезът на провирусна ДНК на базата на геномна РНК с помощта на ензима обратна транскриптаза, последвано от интегриране на ДНК в генома на гостоприемника.

Основни методи за култивиране на вируси

1. В тялото на лабораторни животни.

2. В пилешки ембриони.

3. В клетъчни култури - основен метод.

Видове клетъчни култури

1. Първични (трипсинизирани) култури- фибробласти на пилешки ембриони (CHF), човешки фибробласти (CHF), бъбречни клетки на различни животни и др. Първичните култури се получават от клетки на различни тъкани, най-често чрез раздробяване и трипсинизация, и се използват еднократно, т.е. винаги е необходимо да има съответните органи или тъкани.

2. Диплоидни клетъчни линииподходящи за многократно разпръскване и растеж, обикновено не повече от 20 пасажа (губят първоначалните си свойства).

3. Взаимосвързани линии(хетероплоидни култури), способни на многократна дисперсия и трансплантация, т.е. множество пасажи, са най-удобни при вирусологична работа - например туморни клетъчни линии Hela, Hep и др.

Специални хранителни среди за клетъчни култури

Използват се различни синтетични вирусологични хранителни среди със сложен състав, включващи голям набор от различни растежни фактори - среда 199, Игла, разтвор на Ханкс, лакталбумин хидролизат. Към средата се добавят стабилизатори на pH (Hepes), кръвен серум от различни видове (фетален телешки серум се счита за най-ефективен), L-цистеин и L-глутамин.

В зависимост от функционалното използване на средата може да има височина(с високо съдържание на кръвен серум) - те се използват за отглеждане на клетъчни култури преди добавяне на вирусни проби и поддържащ(с по-малко съдържание на серум или без серум) - за поддържане на инфектирани с вируси клетъчни култури.

Откриваеми прояви на вирусна инфекция на клетъчни култури

1. Цитопатичен ефект.

2. Идентифициране на телата на включване.

3. Откриване на вируси чрез флуоресцентни антитела (MFA), електронна микроскопия, авторадиография.

4. Цветен тест. Обичайният цвят на използваната културална среда, съдържаща фенолно червено като pH индикатор, при оптимални условия на клетъчна култура (рН около 7,2) е червен. Клетъчната пролиферация променя рН и съответно цвета на средата от червено до жълто поради изместване на рН към киселата страна. Когато вирусите се размножават в клетъчни култури, настъпва клетъчен лизис и pH и цветът на средата не се променят.

5. Откриване на вирусен хемаглутинин - хемадсорбция, хемаглутинация.

6. Плаков метод (плакообразуване). В резултат на цитолитичния ефект на много вируси върху клетъчни култури се образуват зони на масова клетъчна смърт. Идентифицират се плаки - вирусни "клетъчно-отрицателни" колонии.

Номенклатура на вирусите.

Името на семейството на вирусите завършва на „viridae“, родът - „вирус“, обикновено се използват специални имена за вида, например вирус на рубеола, вирус на човешка имунна недостатъчност - HIV, човешки параинфлуенца вирус тип 1 и др.

Бактериални вируси (бактериофаги)

Естественото местообитание на фагите е бактериална клетка, така че фагите се разпространяват навсякъде (например в отпадъчните води). Фагите имат биологични характеристики, които са характерни и за други вируси.

Най-често срещаният морфологично тип фаги се характеризира с наличието на глава - икосаедър, процес (опашка) със спирална симетрия (често има куха пръчица и контрактилна обвивка), шипове и процеси (нишки), т.е. донякъде напомня на сперматозоид на външен вид.

Взаимодействието на фагите с клетка (бактерия) е строго специфично, т.е. бактериофагите са в състояние да заразят само определени видове и фаготиповебактерии.

Основни етапи на взаимодействие между фаги и бактерии

1. Адсорбция (взаимодействие на специфични рецептори).

2. Въвеждането на вирусна ДНК (фагова инжекция) се извършва чрез лизиране на част от клетъчната стена с вещества като лизозим, свиване на обвивката, изтласкване на опашката през цитоплазмената мембрана в клетката и инжектиране на ДНК в цитоплазмата .

3. Възпроизвеждане на фаги.

4. Излизане на дъщерни популации.

Основни свойства на фагите

Разграничете вирулентни фаги, способни да предизвикат продуктивна форма на процеса и умерени фаги, причинявайки редуктивна фагова инфекция (фагова редукция). В последния случай геномът на фага в клетката не се репликира, а се въвежда (интегрира) в хромозомата на клетката гостоприемник (ДНК в ДНК), фагът се превръща в профагТози процес се нарича лизогения. Ако в резултат на въвеждането на фаг в хромозомата на бактериална клетка той придобие нови наследствени характеристики, тази форма на бактериална променливост се нарича лизогенна (фагова) конверсия.Бактериална клетка, носеща профаг в своя геном, се нарича лизогенна, тъй като профагът, ако синтезът на специален репресорен протеин е нарушен, може да премине в литичен цикъл на развитие и да причини продуктивна инфекция с лизиране на бактерията.

Умерените фаги са важни за обмена на генетичен материал между бактериите - в трансдукция(една от формите на генетичен обмен). Например, само причинителят на дифтерията има способността да произвежда екзотоксин, в чиято хромозома е интегриран умерен профаг, носител оперон tox, отговорен за синтеза на дифтериен екзотоксин. Токсът на умерения фаг предизвиква лизогенно превръщане на нетоксигенния дифтериен бацил в токсигенен.

Според спектъра на действие върху бактериите фагите се делят на:

Поливалентни (лизират близкородствени бактерии, като салмонела);

Моновалентен (лизиращи бактерии от един тип);

Типово специфични (лизират само определени фагови продукти на патогена).

Върху твърди среди фагите се откриват по-често с помощта на точков тест (образуване на отрицателно петно ​​по време на растежа на колонията) или метода на агарния слой (титруване по Gracia).

Практическо приложение на бактериофагите.

1. За идентификация (определяне на фаготип).

2. За фагопрофилактика (спиране на огнища).

3. За фаготерапия (лечение на дисбактериоза).

4. Оценка на санитарното състояние на околната среда и епидемиологичен анализ.