Луминесцентна микроскопия. Електронна микроскопия
Тази глава ще обсъди основните принципи, дизайн и приложение на конфокален лазерен сканиращ микроскоп (CLSM), използвайки устройства Leica като пример. Принципът на CLSM е регистриране на светлинния поток, излъчван от фокалната равнина на лещата, когато фокусите съвпадат, т.е. диафрагмата на детектора трябва да бъде позиционирана така, че изображението й да съвпада точно с фокуса на светлината, осветяваща обекта. Като източник на светлина за получаване на изображение се използват лазери и чувствителни детектори.
Основната характеристика на CLSM е възможността за получаване на послойно изображение на изследвания обект (например клетка) с висока разделителна способност и нисък шум. Това се постига чрез поетапно сканиране на обект с фокусиран лъч светлина от кохерентен източник или сцена, като се използват специфични флуоресцентни сонди и специални методи за ограничаване на светлинните потоци.
Сканиращите системи CLSM могат да бъдат класифицирани както следва.
1. Лъчево сканиране.
А) Огледални системи: едноогледални, двуогледални, резонансни магнитоелектрични.
Б) Светлинни системи: едновлакнести, многовлакнести.
B) Сканиране на обектив:
· пиезоелектрическо движение на лещата по осите X, Y;
· пиезоелектрично движение на лещата по оста Z.
Г) Акустооптични дефлектори на лъча: два акустооптични дефлектора за сканиране по осите X и Y.
D) Дискови системи:
· едноспирални, едностранни и двустранни;
· многоспирални едностранни и двустранни.
Д) Комбинирани системи: акустооптичен дефлектор по оста Y и сканиране с огледало по оста X.
2. Сканиране с таблица.
A) Стъпково задвижване: сканираща маса със стъпкови двигатели по осите X, Y, Z.
Б) Комбинирано задвижване: сканиращо стъпало със стъпков двигател по осите X, Y и пиезоелектрическо задвижване по оста Z.
Ориз. 5. Принципна схема на работа на CLSM.
1 - маса за сканиране; 2 - тестова проба; 3, 7 - лещи; 4 - сканиращо устройство; 5 - разделител на лъча; 6 - лъч светлина от лазера; 8, 12 - изображение на точки B и C; 9 - игла диафрагма; 10 - изображение на точка А в центъра на диафрагмата на иглата; 11 - радиационен приемник; 13, 15 - блясък на точки B и C, разположени извън фокуса на леща 3; 14 - блясък на точка А, разположена във фокуса на леща 3.
Възбуждащият светлинен поток 6 от лазерния източник влиза през плочата за разделяне на лъча 5, сканиращата система 4 върху лещата 3 и се фокусира към точка А от равнината на тестовия образец (например клетка), която е на фокус . Ние вярваме, че вътреклетъчните структури са свързани с флуоресцентни сонди и точката на фокусиране на лъча А може да се разглежда като точков източник на светлина, флуоресцентният поток от който през леща 3, пластина за разделяне на лъчи 5, леща 7 се фокусира в равнината на диафрагмата на иглата 9 („дупка“) и записана от фотодетектор 11. Осветяването от потока на възбуждане на фрагменти от лекарството, разположени извън фокуса на лещата по протежение на оптичната ос (точки B и C), е по-ниско, отколкото в точка A. Следователно, компонентът на осветяване на целта на детектора от точки B и C може да бъде значително намалена. Флуоресцентните потоци, излъчвани от точки B и C, които са извън фокуса, са ограничени от диафрагма с дупка и не достигат детектора или малка част от тях. Така при сканиране на препарат в самолета XYДетекторът регистрира сигнал, чието ниво се определя от разстоянието от равнината на сканиране по координатата Z. Изравняването на фокуса на леща 3 с равнината на сканиране и фокуса на леща 7 с иглена диафрагма се отразява в терминът "конфокалност". Стъпка по стъпка движение на равнината на сканиране по оста Z ви позволява да получите серия от контрастни изображения слой по слой и да реконструирате вътрешната триизмерна структура (3-D) на обекта, който се изследва. Качество на изображението, разделителна способност в равнина XYи по оста Z зависи от качеството на оптиката, качеството на сканиращите системи, размера и точността на производство на диафрагмата с пинхол, твърдостта на структурата, ефективността на използваните алгоритми за обработка на сигнала и спецификата на флуоресцентни сонди.
За определяне на пространствената разделителна способност на микроскопа се извършва анализ на изображението на точков източник на светлина. Изображението на точков източник, образувано от конвенционална леща, е дифракционно петно на Airy, състоящо се от ярко централно ядро и по-бледи външни пръстени.
Ориз. 6. Ефирно дифракционно петно.
Два точкови източника с еднаква яркост, разстоянието между които е d , се виждат като две различни точки, ако разстоянието между центровете на кръговете на Airy надвишава следната стойност:
r A = XY =0,6 λ/NA,
където r A - радиусът на първия тъмен пръстен в кръга на Airy, λ е дължината на вълната на светлинния източник в nm, NA е числовата апертура.
Този израз се нарича критерий на Rayleigh. Той определя разделителната способност на микроскопа в равнината на пробата (XY). В този случай границата на разделителната способност се определя основно от вълновата природа на светлината и затова често се опростява, като се вземе предвид NA=1. При CLSM изобразяването води до леко намаляване на размера на петното на Airy. Интензитетът на петното на Airy за стандартен микроскоп намалява по закона n -2, където n е напречното изместване, а за CLSM интензитетът намалява като n -4. Това води до увеличаване на разделителната способност на CLSM с 1,5 пъти. За конфокален микроскоп критерият на Rayleigh има формата:
XY c r =0,4 λ/NA,
където XY c r е разделителната способност на CLSM.
За да оценим предимствата на CLSM, ние разглеждаме инструменталната функция (структурата на Airy spot) и анализираме разделителната способност на микроскопа в аксиална посока (Z). Триизмерното място Airy (разпределение на интензитета) е триизмерна хардуерна функция (THF), която дефинира изображението на обект. TAF за конвенционален микроскоп има конична форма, разширяваща се нагоре и надолу от центъра, докато за конфокален микроскоп има елипсовидна форма и е по-малко удължена в аксиална посока.
Ориз. 7. Изглед на триизмерната хардуерна функция на точков източник на конвенционален микроскоп - (a) и CLSM - (b).
Критерият на Rayleigh е приложим и за определяне на разделителната способност на микроскоп по посока на оптичната ос. За конвенционален микроскоп два точкови източника, разположени на известно разстояние по протежение на оптичната ос, могат да бъдат разрешени, ако максимумите на техните петна на Airy са на разстояние:
Z r =2 λ/NA 2,
където Z r е аксиалната разделителна способност на микроскопа.
Разпределението на енергията в петното на Airy за CLSM е по-тясно, а разделителната способност в аксиална посока е 1,4 пъти по-висока. За конфокален микроскоп критерият на Rayleigh има формата:
Z r c =1,4 λ/NA 2,
където Z r c е аксиалната разделителна способност на CLSM.
Съвременните CLSM имат едно основно предимство - възможността за получаване на тънки оптични сечения. Следните параметри влияят върху качеството на изображението при получаване на тънки оптични секции:
· размер на конфокалната апертура;
· цифрова апертура на обектива NA;
· индекс на пречупване;
· абсорбция на светлина в пробата.
Намаляването на интензитета на светлината с увеличаване на дебелината на пробата влияе върху разделителната способност на микроскопа по оптичната ос Z. Разделителната способност зависи от оптиката на микроскопа и пробата. Дебелината на оптичната секция в конфокален микроскоп обикновено се характеризира с ширината на разпределението на полувисочината на пика на интензитета ∆z 1/2 = 0,65 μm. Ако пробата и детекторът са идеални, този параметър зависи от цифровата апертура на обектива, дължината на вълната λ и индекса на пречупване на средата на потапяне n i .
Ориз. 8. Зависимост на аксиалната разделителна способност на микроскопа ∆z 1/2 от числовата апертура на обектива.
В CLSM регулируема диафрагма е поставена пред детектора, променяйки количеството светлина. Иглените диафрагми са предназначени да създадат условия за максимално или пълно филтриране на светлината, влизаща в равнината на формиране на изображението от точки, които не съвпадат с фокалната равнина или са разположени до анализирания елемент на обекта във фокалната равнина. Размерът на диафрагмата на иглата е ограничен и от него зависи страничната разделителна способност на устройството, яркостта на осветените елементи на образеца, изместени спрямо фокалната равнина по оста Z, и дълбочината на полето. Размерът на диафрагмата влияе върху дебелината на получения участък. Колкото по-малък е отворът, толкова по-близо е дебелината на сечението до теоретичната граница (ширината на разпределението на половината от височината на пика на интензитета), а при много големи отвори възможността за получаване на тънък участък става невъзможна.
Както бе споменато по-рано, CLSM дава възможност да се получи оптично напречно сечение на значителна дълбочина от повърхността на пробата, като важната точка е индексът на пречупване и проблемът с дълбочината. Преминаването на падащия и отразения лъч през пробата влияе върху качеството на изображението. Ако показателите на пречупване на средата за потапяне и пробата са близки (ефектът от разликата в показателите на пречупване на течността за потапяне и обекта върху появата на разсеяна светлина, което намалява контраста на изображението и действа като ефект на сферична аберация) , светлинният конус ще се сближи. Ако индексите на пречупване се различават, се появява сферична аберация.
Ориз. 9. Показатели на пречупване на имерсионната среда и пробата.
a – формиране на изображение с помощта на потапяща леща без аберация; b – сферична аберация, причинена от несъответствието между показателите.
При различни индекси на пречупване светлинните лъчи, идващи на различни разстояния от оптичната ос, не се фокусират в една точка, което води до загуба на качество на изображението. Ако е възможно, индексите на пречупване на пробата и обектива трябва да бъдат съпоставени. Ако показателите на пречупване на образеца и средата за потапяне са различни, изображението на обекта в дълбочина е замъглено по оптичната ос и равнината на фокусиране се измества. За да се увеличи дълбочината на проникване, лещата трябва да има голяма цифрова апертура, като маслена имерсионна леща. Такива лещи обаче имат малко максимално разстояние от лещата на обектива до фокалната равнина. Дълбочината на проникване се влияе от хетерогенността на пробата, което води до намаляване на интензитета на светлината на голяма дълбочина и появата на сянка. В идеалния случай проба за постигане на максимална дълбочина на проникване и максимална разделителна способност би имала индекс на пречупване, равен на този на лещата, но това е хомогенна проба и такива биологични проби не съществуват.
По време на сканиране CLSM получава серия от оптични секции с редовно нарастваща дълбочина от повърхността на пробата. За повечето CLSM получаването на стотици 2D изображения отнема само няколко минути. Оптичен образ може да се получи по два начина:
1) получаване на последователност от оптични сечения в равнината XY, разположени на разстояние ∆z един от друг. Сравнението на координатите на центровете на обектите в различни секции дава възможност да се определи тяхната ориентация и разпределение по дължина.
Ориз. 10. Изследване на тримерна структура в равнината XY.
2) получаване на множество оптични сечения в равнината XZ, разположени на разстояние ∆y. Ако пробата е успоредна на равнината на сечението, тогава нейното сечение в равнината XZ ще бъде почти кръгло; чрез сравняване на изображения в различни секции XZ може да се определи кривината на изследвания обект.
Ориз. 11. Изследване на тримерна структура в равнина XZ.
Триизмерната реконструкция на изследваните обекти с помощта на CLSM методите е насочена към решаване на два проблема:
· визуализация на триизмерно изображение на обект, получено чрез “сглобяване” на неговите оптични сечения;
· количествен анализ на вътрешните структури на обект.
Днес има доста компании, произвеждащи CLSM. Иновации на компаниите производители на CLSM:
· 2002 Leica обяви акустично-оптичен разделител на лъча (AOBS), който позволява ефективно разделяне на лазерния възбуждащ лъч и луминесценция;
· 2002 г. Carl Zeiss започва производството на конфокален микроскоп LSM 510 META с оригинален фотодетектор, който едновременно записва сигнали в 32 спектрални канала;
· 2004 г. Zeiss създава високоскоростния LSM 5 Live, който има скорост на сканиране 20 пъти по-висока от конвенционалния CLSM;
· Olympus разработи устройство с два скенера, което прави възможно по-ефективното използване например на техниката FRAP;
· Nikon - създава компактен и евтин CLSM с опростен дизайн;
· 2007 г. Leica обяви пускането на 4Pi-конфокален микроскоп, подобряващ аксиалната разделителна способност от 4 - 7 пъти.
Нека разгледаме CLSM устройство, принадлежащо към ново, по-модерно поколение устройства - TCS SP5 от Leica.
Ориз. 12. Мултифотонна/конфокална широколентова система TCS SP5 (инвертиран микроскоп).
Ключови елементи на CLSM TCS SP5: AOTF – акустично-оптичен регулируем филтър, AOBS – акусто-оптичен разделител на лъчи, SP-Detector – спектрален фотометър.
AOTF - Акустично-оптичен регулируем филтър - служи за минимизиране на оптичната експозиция и регулира мощността на лазера в зависимост от пробата и флуорохрома. Позволява ви да изберете необходимата дължина на вълната и да контролирате интензитета на възбуждащата светлина. AOTF е електрически регулируем филтър, който работи на принципа на обемна дифракция на светлинен лъч от нехомогенности на индекса на пречупване. Такива нехомогенности възникват, когато ултразвукова акустична вълна се възбужда в двойнопречупващи кристали. При анизотропна дифракция в едноосни кристали има минимална ултразвукова честота, при която ъглите на падане и дифракция съвпадат и възниква така нареченото колинеарно акустооптично взаимодействие.
Ориз. 13. Акустично-оптичен регулируем филтър.
AOBS - акустооптичен разделител на лъчи, е акустооптичен кристал - регулируемо пречупващо устройство, работещо в обратен режим. Какво ви дава използването на AOBS:
1. За да се получи ясно изображение с нисък шум, е необходима висока степен на пропускливост на светлина. Намаляването на шума чрез осредняване на изображението за много последователни сканирания непременно води до фотоизбелване на обекта, който се изследва. Светлинната пропускливост на AOBS превъзхожда повечето дихроични огледала в целия видим спектър. Следователно е необходимо осредняване за по-малък брой сканирания. В резултат на това лекарството ще продължи много по-дълго;
2. Ярките и ясни изображения изискват възможно най-много фотони да преминат от обекта към детектора, което подобрява качеството на изображението. AOBS осигурява регистриране на възможно най-широките флуоресцентни ленти, тоест максималния брой фотони;
3. Ниското избелване по време на получаване на изображение е важно за защита на пробата от избледняване и живи обекти от токсични продукти на флуорохромна фотолиза. Кривите на светлинно пропускане на AOBS имат много стръмни наклони, което прави възможно записването на флуоресценцията на флуорохром възможно най-близо до неговата лента на възбуждане;
4. Всяко багрило във видимия диапазон може да бъде възбудено, тъй като отражението може да се регулира индивидуално;
5. Проблемът с многопараметричната флуоресценция е разрешен: до осем лазерни емисионни линии могат да бъдат програмирани, оставяйки достатъчно място за запис на флуоресценция, докато честотите могат да се регулират;
6. Съотношението на багрилата, подобно на съотношението на възбуждане на метаболит - проби, например за Ca 2+, мембранен потенциал, стойност на рН, трябва бързо да се променя по време на последователно сканиране. AOBS превключва за няколко микросекунди;
7. Друга възможност за използване е регистриране на изображение в отразена светлина. AOBS позволява предаването на отразена възбуждаща светлина да бъде индивидуално регулирано;
8. Сканирането на ROI (последователно сканиране и сканиране на специфична област) също е подобрено: различни режими на възбуждане са приложими за различни области по време на едно сканиране;
9. Голям обем 3D записи в последователен режим се възползват от бързо превключващите устройства, тъй като скоростта увеличава ефективността на системата;
10. Флуоресцентната корелационна спектроскопия (FCS) изисква нисък фон и слабо разсейване на светлината.Само AOBS ефективно блокира близките емисионни линии, например от Ar лазери;
11. Спектрален запис (ламбда сканиране) осигурява точен спектър, тъй като светлинното предаване на AOBS е „бяло“, което означава, че не въвежда промени в емисионния спектър – често срещан проблем при извършване на спектрални сканирания на дихроична огледална система;
12. Истинското конфокално оптично сечение изисква точково осветяване и точково откриване на флуоресценция. AOBS е подходящ за използване с конфокални устройства за точково сканиране;
13. Изобразяването в многофотонен режим или с ултравиолетово възбуждане може да се извършва паралелно без грешки или ограничения. AOBS не променя възбуждането на невидимите лазери и не променя спектъра на флуоресценция;
14. Не е възможно да се изпълни погрешна операция, тъй като AOBS се управлява във връзка с контрола на възбуждането с помощта на AOTF (Акусто-оптичен регулируем филтър). Ако линията на възбуждане е избрана, тогава AOBS се програмира според нея. Операторът не трябва да взема решения - работата се извършва правилно и автоматично;
15. Няма настройка, тъй като няма движещи се елементи, присъщи на филтърните барабани и плъзгачи. Кристалът е стабилно монтиран и програмирането става електронно;
16. Няма нужда от скъпоструващо допълнително оборудване, като филтърни кубове, дихроични огледални плъзгачи и др. Следователно цената на техническата помощ за инсталиране на нови оптични елементи е много по-ниска.
Ориз. 14. AOBS – акустооптичен лъчеделител.
SP-Detector – спектрален фотометър сензор. Светлината от пробата, която е сумата от индуцираните флуоресцентни спектри, преминава през диафрагма с дупка, която образува конфокална оптична секция. След това с помощта на призма тази светлина се разлага на спектър. При преминаване през първия детектор, светлината преминава през прорезно фотометърно устройство, състоящо се от две моторизирани завеси. Тези завеси отрязват краищата на спектъра от двете страни на диапазона и ги насочват към сензорите от 2-ри и 3-ти ред. В резултат на това спектърът се разделя едновременно на пет канала. В резултат на това, когато се използва SP детектор, се записва радиация от различни багрила в пробата.
Ориз. 15. Спектрален детектор SP.
SP детекторът позволява ламбда сканиране: спектралните изображения се натрупват, за да се анализират незабавно характеристиките на багрилата, включени в експеримента.
4 юни 2013 гЗначителна част от научните изследвания, извършвани в Биологическия факултет на Московския държавен университет, и успешното прилагане на тясно свързани образователни програми са немислими без използването на най-модерната микроскопична технология. Като част от Програмата за развитие на Московския университет в Биологическия факултет е създадена междуведомствена лаборатория по конфокална микроскопия, напълно оборудвана с необходимото оборудване и работеща ефективно.
3T3 фибробласти по стените на матриксната макропора
Текст: Третяков Артемий
Какво може да направи?
Като се използва конфокален микроскопможете да получите няколко изображения на виртуални секции на клетка или триизмерен модел, сглобен от тях. Такива възможности предоставя лазер, чийто лъч може да се фокусира във всяка точка на клетката. За да се получи изображение, обектът трябва да е флуоресцентно активен, тоест, когато бъде ударен от лазерен лъч, той (или по-скоро определени молекули в състава му) трябва да излъчва светлина с по-голяма дължина на вълната от падащата върху него, която се улавя от микроскопът. Образът се изгражда именно на базата на тази флуоресценция.
снимка
Как работи?
„Настоящото ниво на развитие на фундаменталните и приложни интердисциплинарни научни изследвания, както и задачите за подготовка на специалисти с интердисциплинарни компетенции изискват интензивно развитие и модернизация на материално-техническата база“ (Програма за развитие на Московския университет, стр. 5;) .
В допълнение към лазера, електронно-механичното устройство включва и оптичен филтър, който пропуска лазерния лъч, но отразява светлината с по-голяма дължина на вълната върху диафрагма, наречена “pinhole” (от англ. Pinhole - дупка, направена от щифт, буквален превод идеално характеризира устройството с дупки), което прекъсва цялата ненужна фонова светлина и по този начин намалява или напълно отрича влиянието на подлежащите оптични слоеве върху яснотата на дисплея на сканираната област на клетката. Ако фоновата светлина не беше отрязана от дупката, оптичните слоеве щяха да се припокриват един друг и да пречат на зрителя - сякаш той гледаше през зеленина в далечината. Зад диафрагмата има фотодетектор, който дигитализира получената информация.
Ясно е, че такова „точково“ сканиране отнема време. За да ускори този процес, конфокалната система използва друг модул, наречен въртящ се диск, който прави възможно получаването на изображение не само на една точка, а на цяла линия в един акт на лазерна работа.
Патент за такава система е получен през 1961 г. от професора от MIT Марвин Мински. Активното му използване започва през 80-те години, а сега конфокалната микроскопия изживява своя разцвет. Първият микроскоп се появи в Русия през 2003 г., това беше Axiovert 200M LSM510 Meta. Последваха други и сега в нашата страна има няколко големи лаборатории, включително междукатедралната лаборатория към Биологическия факултет на Московския държавен университет. Лабораторията разполага с пет микроскопа, сред които: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
Конфокалната микроскопия е постигнала не само най-високия контраст и триизмерност, но е усвоила и четвъртото измерение - времето, което прави възможно изследването на промените, настъпващи в клетките. За тази цел всяка инсталация е оборудвана със системи за поддържане на техния живот. Всичко това предоставя широки възможности за изследователите, които успешно използват тези възможности.
И тъй като става дума за лабораторията на Биологическия факултет на Московския държавен университет, изследванията, проведени в тази лаборатория, трябва да бъдат посочени като примери.
Коприна и мрежа
Конфокалната микроскопия е постигнала не само най-високия контраст и триизмерност, но е усвоила и четвъртото измерение - времето, което прави възможно изследването на промените, настъпващи в клетките.
Една от интересните работи е създаването на биоразградими протези за възстановяване на кръвоносни съдове и други кухи органи. В най-простите случаи такива тъканно инженерни структури изглеждат като тръби или филми, които се поставят върху мястото на увреждане и по този начин действат като „лепенка“. Те могат да бъдат направени от различни материали, включително копринен фиброин от пашкули на копринени буби. Предимството на този материал е, че е стабилен и образува гъвкава и издръжлива структура на протезата. Самата протеза изглежда като филм само когато се гледа с просто око, всъщност това е матрица - мрежеста многослойна основа, рамка, която имитира структурата на живата тъкан. Това скеле помага на новите клетки да заемат правилната позиция, осигурявайки равномерното им разпределение. В резултат на това повредената стена на органа се възстановява и ненужната рамка се подлага на биоразграждане. Но не е толкова лесно да се провери колко равномерно са разпределени клетките в рамката и дали живеят добре в дълбоките слоеве на матрицата (дали има затруднения в обмена на газ и обмена на метаболитни продукти) и дали промяна на морфологията при проникване в него. Именно на този етап използването на микроскоп (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) значително опрости задачата. Основно поради възможността да се изследва обект без разрушаване, както и поради способността на микроскопа да гледа вътре в матрицата на дълбочина от 600 микрона.
снимка
Подобна работа беше извършена с костна тъкан, матрицата за която беше направена както от същия фиброин, така и от спидроин, протеин, първоначално открит в тялото на паяка и използван от него за тъкане на мрежи. В лабораторни условия протеинът се произвежда не от паяци, а от дрожди, в чийто геном е въведен леко модифициран ген на паяк, отговорен за синтеза на този протеин.
Не толкова просто
Но ако появата на увреждане на тъканите е прост и разбираем процес, други патологии не винаги са ясни. И преди да започнете ефективно лечение и особено да предотвратите тяхното развитие, е необходимо да разберете механизма на тяхното възникване. Те включват атеросклероза - заболяване на артериите, в резултат на което липидите се натрупват в стената на съда или по-точно в интимата - вътрешния й слой, което прави стената по-дебела, което в крайна сметка може да доведе дори до пълно запушване на съда . Какво причинява това заболяване не е напълно ясно, както не е ясно каква роля играят имунокомпетентните клетки, на местата, където се натрупват, скоро започва атерогенеза. Пълните отговори на тези въпроси все още не са намерени, но изследването на атерогенезата продължава, въпреки че има много по-малко публикации по тази тема, отколкото по темата за тъканно инженерните протези.
снимка
Съдби на молекулите
Междукатедрената лаборатория по конфокална микроскопия се използва редовно в работата си от повече от 20 студенти и докторанти от почти 10 катедри.
Описаните по-горе изследвания следят основно състоянието на клетките. Но възможностите на конфокалния микроскоп не се ограничават до това; той е напълно способен да проследи дори съдбата на отделна молекула в клетка, стига да има флуоресцентна активност. За да направите това, молекулите обикновено се маркират с флуорохроми - специални багрила, които имат тази активност. Флуорохромите съществуват като отделни молекули и тяхното етикетиране включва химическо свързване на флуорохрома с молекулата, която представлява интерес за изследователя. След това такива белязани молекули влизат в клетката и по-нататъшната им съдба се наблюдава с помощта на микроскоп. По този начин например се сравнява активността и движението в клетката на рицина и вискумина. И двете вещества са протеинови токсини, и двете са от растителен произход и се състоят от две части - субединици, едната от които отговаря за свързването с клетката и проникването вътре, а другата за инактивирането на рибозомата, което в крайна сметка води до клетъчна смърт. Практическата полза отново е свързана с лечението на друго опасно заболяване – рак. Това ясно „разделяне на отговорностите“ между субединиците прави възможно заместването на първата субединица, например, с антитяло. Резултатът е „имунотоксин“, който действа само върху определени клетки, за които това антитяло е подходящо. Има два основни проблема. Първо: избор на антитяло, което ще се доближи до раковите клетки и ще попречи на токсина да проникне в здравите. И второ: избор на токсин, който, когато се превърне в имунотоксин, ще остане високоефективен.
снимка: Първична култура от сърдечни клетки на новородени малки плъхове: А - контрола, В - третирани с 20 цМ изопротеренол за 24 часа. 1 - TMRE оцветяване на митохондриите; 2 - фазов контраст. Мащаб 10 µm. (Смирнова Т.А., Сапрунова В.Б. „Адаптивни промени в митохондриите на култивирани кардиомиоцити на новородени плъхове под въздействието на изопротеренол.” Международна конференция „Рецептори и вътреклетъчна сигнализация” 24-26 МАЙ 2011 г. Пущино).
образование
Списъкът с работи, извършени с помощта на конфокална микроскопия, може да продължи дълго време. Този ефективен метод, който също позволява да се работи с живи клетки, е търсен в почти всички научни изследвания. И затова подготовката на студентите за работа в тази лаборатория играе огромна роля. Той се посещава редовно от повече от 20 студенти и докторанти, ангажирани в курсова, предкурсова и дипломна работа.
В съоръженията работят ембриолози, молекулярни биолози, цитолози, биоинженери, имунолози и зоолози.
Лабораторията по конфокална микроскопия е основана през 2004 г.
Ръководител на лабораторията – доц. М. М. Мойсенович
В лабораторията работят млади специалисти А. А. Рамонова и А. Ю. Архипова
В момента в лабораторията има инсталирани 2 конфокални системи:
- Axiovert 200M с конфокална приставка LSM510 META (Carl Zeiss, Германия)
- Конфокална лазерна сканираща система, произведена от NIKON CORPORATION (Япония) - обърнат медицински и биологичен микроскоп за лабораторни изследвания Eclipse с аксесоари: с Ti-E стойка, с TIRF осветител, с A1 конфокален модул и въртящ се диск базиран конфокал модул.
Всички новини"
Марголин 389стр.
Оптичната микроскопия използва всички постижения както на технологиите и технологиите, така и на информационните и компютърните технологии. Това доведе до значителни подобрения в съществуващото оборудване и методите за неговото използване, което от своя страна доведе до появата на нови методи, по-специално конфокална микроскопия. Конфокалният микроскоп се различава от класическия оптичен микроскоп по това, че във всеки момент се записва изображение на една точка от обект и пълното изображение се изгражда чрез сканиране (преместване на пробата или пренареждане на оптичната система). Така принципът на сканиращата електронна микроскопия е реализиран в уникална форма, която позволява да се записва и обработва сигналът от всяка отделна точка за толкова дълго, колкото желаете.
В класическия микроскоп светлината от различни точки на пробата влиза във фотодетектора. В конфокален микроскоп, за да се записва светлина само от една точка, малка диафрагма се поставя след лещата на обектива по такъв начин, че светлината, излъчвана от анализираната точка, преминава през диафрагмата и ще бъде записана, а светлината от останалите точки се блокират главно от диафрагмата, както е показано на фиг. 7.28.
Ориз. 7.28. Схема на предаване на лъча в конфокален оптичен микроскоп
Друга особеност е, че осветителят не създава равномерно осветяване на зрителното поле, а фокусира светлината върху анализираната точка. Това може да се постигне чрез поставяне на втора система за фокусиране зад пробата, но това изисква пробата да бъде прозрачна. Освен това обективните лещи обикновено са скъпи, така че използването на втора система за фокусиране за осветяване е малко предпочитано. Алтернатива е да използвате разделител на лъча, така че както падащата, така и отразената светлина да се фокусират от една леща. Тази схема също улеснява настройката.
Нека сега разгледаме как и колко количествено се променя контрастът при използване на конфокална микроскопия. Тъй като светлината преминава през лещата два пъти в конфокален микроскоп, функцията за замъгляване на точката (наричана по-нататък PSF) ще бъде продукт на независимите вероятности, че фотон ще удари точка с нейните координати или фотон ще бъде открит от тази точка.
Ако използваме критерия на Rayleigh за разделителна способност, се оказва, че резолюцията в конфокален микроскоп се увеличава, но не значително. За конфокален микроскоп имаме израз за разделителна способност r:
Докато за конвенционален микроскоп:
Основното предимство на конфокалния микроскоп обаче не е увеличаването на разделителната способност по смисъла на критерия на Rayleigh, а значително увеличаване на контраста. По-специално, за конвенционален PSF във фокалната равнина съотношението на амплитудата при първия страничен максимум към амплитудата в центъра е 2%, а за конфокален микроскоп това съотношение ще бъде 0,04%. От това следва, че слаб обект с интензитет, например 200 пъти по-малък от този на ярък обект, не може да бъде открит в конвенционален микроскоп, въпреки че разстоянието между обектите може да бъде значително по-голямо от разстоянието, предписано от критерия на Rayleigh . В същото време такъв обект трябва да бъде добре записан в конфокален микроскоп.
Важен параметър е размерът на апертурите във фокалната равнина на облъчващите и събирателните лещи. Изображението на отвора в равнината на обекта определя от кои области светлината се засича от фотодетектора. Очевидно намаляването на размера на блендата води до намаляване на количеството пропускана светлина, повишава нивото на шума и в крайна сметка може да отмени всички постигнати ползи от контраста. По този начин възниква въпросът за оптималния избор на размер на блендата и разумен компромис.
Апертура с отвор, по-малък от Airy spot, просто води до загуба на интензитет и няма ефект върху разделителната способност. Едноточковата бленда Airy позволява максимално използване на разделителната способност на лещата на обектива. Въпреки това, диафрагма с размер на отвора приблизително 3 до 5 пъти по-голям от Airy spot изглежда е най-подходящият компромис. Трябва да се разбере, че обсъжданият тук размер се отнася до размера на изображението в равнината на обекта и следователно действителният размер на отвора на блендата зависи от увеличението на лещата. По-конкретно, когато използвате 100x обектив, отвор с 1 mm отвор ще се проектира в равнината на обекта в кръг с радиус 10 µm.
Развитието на идеята за конфокална микроскопия беше разработването на конфокален лазерен сканиращ микроскоп (KJICM), което беше причинено от необходимостта от по-чувствителни и метрологично строги методи за анализиране на формата и пространствената структура на наблюдаваните обекти. Схематична диаграма на CLSM с основните функционални връзки е показана на фиг. 7.29.
Основната характеристика на CLSM е възможността за послойно изобразяване на изследвания обект с висока разделителна способност и ниско ниво на шум. Това се постига чрез поетапно сканиране на обекта с фокусиран сноп светлина от кохерентен източник или чрез преместване на сцената с помощта на специални флуоресцентни сонди и специални методи за ограничаване на светлинните потоци.
Ориз. 7.29. Блокова схема на KJICM:
1 - сканираща маса; 2 - тестова проба; 3, 6 - лещи; 4 - сканиращо устройство; 5 - светлоразделителна пластина; 7, 9 - иглени диафрагми; 8 - приемник на радиация; 10 - лазер; 11 - Контролен блок; 12 - компютър; 13 - устройство за сканиране на оси z.
Използването на pinhole диафрагма в CLSM, чиито размери са координирани с увеличението на микроскопа и дължината на вълната, прави възможно увеличаването на разделителната способност с повече от 10%. Очевидно е, че разделителната способност на CLSM и съответно възможностите за анализ на фини структури могат да надвишат подобните възможности на конвенционален микроскоп с не повече от 40% при условия на сканиране на проба с тънък лъч. Разделителната способност на KLCM зависи от метода на микроскопия и осветлението. Определя се разделителната способност на KLCM както оптична система, така и електронен пътобработка на информация. Следователно, при проектирането на KLCM, неговите схеми, параметри като разделителна способност на оптичната система, стъпка на сканиране, характеристики на детектора трябва да бъдат координирани и трябва да бъдат избрани оптимални алгоритми за обработка и подходящ софтуер.
Като цяло дълбочината на рязкост на KLCM зависи от апертурата, дължината на вълната, кохерентността на светлинните източници и размера на щифтовата диафрагма. Иглената диафрагма е основният елемент на дизайна, който отличава KLCM от другите видове микроскопи. Иглените диафрагми са предназначени да създадат условия за максимално или пълно филтриране на светлината, влизаща в равнината на формиране на изображението от точки, които не съвпадат с фокалната равнина или са разположени до анализирания елемент на обекта във фокалната равнина.
Изборът на оптималния диаметър на диафрагмата на иглата е важен за получаване на необходимите характеристики на устройството. Взаимоотношенията за оценка на страничната разделителна способност и дълбочината на рязкост на KJICM се получават при допускането, че иглената диафрагма има малък отвор, като е светеща точка. В действителност размерът на диафрагмата на иглата е ограничен и от него зависи напречната разделителна способност на устройството и яркостта на осветените елементи на пробата, изместени спрямо фокалната равнина по оста z,и дълбочина на полето. При малки диаметри на диафрагмата на иглата, светлинният поток става нисък, което намалява съотношението сигнал/шум и намалява контраста. При по-големи диаметри ефективността на иглената диафрагма се намалява чрез намаляване на отвора.
Основна концепция
Принцип на сензора за конфокална точка от патента на Минск
Принципът на конфокалната микроскопия е патентован през 1957 г. от Марвин Мински и се стреми да преодолее някои от ограниченията на традиционните флуоресцентни микроскопи с широко поле. В конвенционален (т.е. широко поле) флуоресцентен микроскоп, цялата проба се залива равномерно със светлина от светлинния източник. Всички части на пробата в оптичния път се възбуждат едновременно и получената флуоресценция се открива с помощта на фотодетекторен микроскоп или камери, включително голямата част от фона извън фокус. За разлика от тях, конфокалният микроскоп използва точка на осветяване (вижте функцията за разпространение на точки) и малка дупка в оптично свързана равнина в предната част на детектора, за да разфокусира сигнала - името "конфокален" идва от тази конфигурация. След като светлината, излъчвана от флуоресценция много близо до фокалната равнина, може да бъде открита, изображението при оптична разделителна способност, особено в посока на дълбочина на пробата, е много по-добро от това на микроскопи с широко поле. Въпреки това, тъй като по-голямата част от флуоресцентната светлина от пробата е блокирана от пункцията, тази повишена разделителна способност идва за сметка на намаления интензитет на сигнала - така че често се изискват дълги експозиции. За да се компенсира този спад на сигнала след пункцияИнтензитетът на светлината се открива с помощта на чувствителен детектор, обикновено фотоумножителна тръба (PMT) или лавинен фотодиод, преобразуващ светлинния сигнал в електрически сигнал, който се записва от компютър.
След като една точка в пробата бъде осветена в даден момент, 2D или 3D изображения трябва да бъдат сканирани върху нормален растер (т.е. правоъгълен модел от паралелни сканиращи линии) в пробата. Лъчът се сканира през образеца в хоризонтална равнина с помощта на едно или повече (сервоуправляеми) осцилиращи огледала. Този метод на сканиране обикновено има ниско забавяне на реакцията и скоростта на сканиране може да варира. Бавното сканиране осигурява по-добро съотношение сигнал/шум, което води до по-добър контраст и по-висока разделителна способност.
Достижимата дебелина на фокалната равнина се определя основно от дължината на вълната на използваната светлина, разделена на числовата апертура на тази леща, но също и от оптичните свойства на пробата. Финото оптично нарязване прави тези видове микроскопи особено добри при 3D изображения и повърхностно профилиране на проби.
Последователните срезове образуват „Z-стек“, който може или да бъде обработен от определен софтуер за създаване на 3D изображение, или да се комбинира в 2D стек (вземат се предимно максималния интензитет на пикселите; други общи методи включват използването на стандартни отклонение или наслагване на пиксели).
Конфокалната микроскопия осигурява капацитет за директно, неинвазивно, серийно оптично разрязване на непокътнати, мазни и живи проби с минимална подготовка на пробата и малко подобрение в страничната разделителна способност. Биологичните проби често се третират с флуоресцентни багрила, за да направят избраните обекти видими. Действителната концентрация на багрилото обаче може да се поддържа ниска, за да се сведе до минимум прекъсването на биологичните системи: някои инструменти могат да проследяват отделни флуоресцентни молекули. В допълнение, трансгенните техники могат да създадат организми, които произвеждат свои собствени химерни флуоресцентни молекули (като сливане на GFP, зелен флуоресцентен протеин, с протеин, представляващ интерес). Конфокалните микроскопи работят на принципа на точково възбуждане в проба (дифракцията е ограничена до точка) и откриване на получената флуоресцентна сигнална точка. Отворът на детектора осигурява физическа бариера, която блокира флуоресценцията извън фокуса. Записва се само фокусът или централното място на диска Airy. Растерно сканиране на пробата в една точка, като същевременно позволява събирането на тънки оптични секции чрез проста промяна на Z-фокуса. Получените изображения могат да бъдат подредени, за да се получи 3D изображение на пробата.
Използвани методи за хоризонтално сканиране
В търговската мрежа се предлагат четири вида конфокални микроскопи:
Конфокалните лазерни сканиращи микроскопи използват множество огледала (обикновено 2 или 3 сканирания линейно по оста x и y), за да сканират лазера върху пробата и да "десканират" изображението през фиксирана дупка и детектор.
Ползи
CLSM се използва широко в много биологични научни дисциплини, от клетъчна биология и генетика до микробиология и биология на развитието. Използва се също в квантовата оптика и нанокристалното изобразяване и спектроскопия.
Биология и медицина
Пример за набор от конфокални микроскопски изображения, показващи разпределението на актинови нишки в клетка.
Клинично, CLSM се използва при оценката на различни очни заболявания и е особено полезен за изобразяване, качествен анализ и количествено определяне на ендотелните клетки в роговицата. Използва се за локализиране и идентифициране на наличието на филаментозни гъбични елементи в стромата на роговицата в случаи на кератомикоза, което позволява бърза диагностика и по този начин ранно установяване на окончателна терапия. Изследванията на техниките на CLSM за ендоскопски процедури (ендомикроскопия) също са обещаващи. Във фармацевтичната индустрия се препоръчва да се наблюдава производственият процес на тънки фармацевтични филмови форми, за да се контролира качеството и равномерността на разпределението на лекарствата.
Оптика и кристалография
CLSM се използва като механизъм за извличане на данни в някои 3D оптични системи за съхранение на данни и е помогнал да се определи възрастта на папируса на Магдалена.
Опции и подобрения
Подобрена аксиална разделителна способност
Функцията за разпространение на точки е точков елипсоид, няколко пъти по-дълъг от ширината му. Това ограничава аксиалната разделителна способност на микроскопа. Един метод за преодоляване на това е 4π микроскопия, при която падаща и излъчена светлина или може да пречи както на горната, така и на долната част на пробата, за да намали обема на елипсоида. Алтернативна техника конфокална микроскопия тета. При тази техника конусът на осветяващата светлина и светлината за откриване са разположени под ъгъл една спрямо друга (най-добри резултати, когато са перпендикулярни). Пресичането на две хендикап функции дава много по-малък ефективен обем на пробата. От това се разви микроскоп с едноплоско осветяване. Освен това може да се използва деконволюция, като се използва експериментално получена функция за разпространение на точки за премахване на светлината извън фокуса, подобрявайки контраста както в аксиалната, така и в страничната равнина.
Супер резолюция
Има конфокални варианти, които постигат разделителна способност под границата на дифракция, като микроскопия с изчерпване на стимулирани емисии (STED). Освен тази техника, има голямо разнообразие от други (неконфокални) техники за супер разделителна способност като длан, (e)STORM, SIM карти и т.н. Всички те имат своите предимства, като лекота на използване, разделителна способност и необходимост от специално оборудване, буфер или флуорофор.
Нискотемпературна производителност
За образни проби при ниски температури са използвани два основни подхода, като и двата са базирани на конфокална микроскопия с лазерно сканиране. Един подход е да се използва криостат с непрекъснат поток: само пробата се поддържа при ниска температура и се адресира оптически през прозрачен прозорец. Друг възможен подход е да се постави част от оптиката (особено обективен микроскоп) в криогенна колба на Дюар за съхранение. Този втори подход, макар и по-тромав, гарантира по-добра механична стабилност и избягва загубите, дължащи се на прозореца.
Изображения
Частичен профил на повърхността на монета от 1 евро, измерен с помощта на дискова конфокална микроскопия на Nipkow.
Отразяване на данни за монета от 1 евро.
история
Начало: 1940-1957г
Първи конфокален сканиранеМикроскопът е конструиран от Марвин Минскоу през 1955 г. и патентът е подаден през 1957 г. Сканирането на точка на осветяване на фокалната равнина се постига чрез преместване на платформата. Не е представена научна публикация и не са запазени изображения, направени от нея.
Тандемен сканиращ микроскоп
Схема на тандемна сканираща микроскопия на Петран. Добавена е червена лента за обозначаване на диска на Nipkow.
През 1960 г. чехословашкият факултет по медицина Моймир Петран в Карловия университет в Пилзен разработи тандемния сканиращ микроскоп, първата комерсиализирана конфокална микроскопия. Той беше продаден на малка компания в Чехословакия и в Съединените щати от Tracor-North (по-късно NORAN) и използваше въртящ се диск на Nipkow за генериране на множество възбуждания и емисии от микродупки.
Чехословашкият патент е подаден през 1966 г. от Петран и Милан Хадравски, чехословашки колега. Първата научна публикация с данни и изображения, получени с този микроскоп, е публикувана в списание Science през 1967 г., с автор М. Дейвид Егер от университета Йейл и Петран. В бележка под линия към тази статия се споменава, че Петран е проектирал микроскопа и е ръководил конструкцията му и че той е бил отчасти „научен сътрудник“ в университета Йейл. Второ издание от 1968 г. описва теорията и техническите детайли на инструмента и включва Хадравски и Робърт Галамбос, ръководител на групата в Йейлския университет, като допълнителни автори. През 1970 г. е издаден американски патент. Подадена е през 1967 г.
1969: Първата конфокална лазерна сканираща микроскопия
През 1969 г. и 1971 г. М. Дейвид Егър и Пол Давидовиц от Йейлския университет публикуват две статии, описващи първата конфокална лазерсканираща микроскопия. Това беше петно от скенер, което означава, че е генерирано само едно точково осветление. Той използва епи-осветително-отражателна микроскопия за наблюдение на нервната тъкан. 5 mW хелиево-неонов лазер с дължина на вълната 633 nm отразява светлината от полупрозрачно огледало към целта. Целта беше обикновен обектив с фокусно разстояние 8,5 мм. За разлика от всички предишни и най-нови системи, пробата беше сканирана чрез преместване на този обектив (мишената за сканиране), което кара фокусната точка да се премести. Отразената светлина се връщаше към полупрозрачното огледало, предаваната част беше ориентирана от друга леща към точково откриване, зад която беше поставена фотоумножителната тръба. Сигналът се визуализира с помощта на CRT осцилоскоп; електронният лъч се прехвърля едновременно към целта. Специално устройство направи възможно заснемането на полароидни снимки, три от които бяха представени в публикация от 1971 г.
Авторите отразяват флуоресцентните багрила за in vivo изследвания. Те цитират патента на Мински, благодарение на Стив Баер, тогава докторант в Медицинския факултет на Алберт Айнщайн в Ню Йорк, където той разработи конфокален линеен сканиращ микроскоп, който предложи използването на лазер с "микроскоп на Мински" и благодаря на Галамбос, Хадравски и Петран за дискусии, водещи до разработването на неговия микроскоп. Мотивацията за тяхното развитие е, че при тандемната сканираща микроскопия само 10 -7 част от осветяващата светлина участва в генерирането на изображението в част от окото. По този начин качеството на изображението не е достатъчно за повечето биологични изследвания.
1977-1985: Точкови скенери с лазери и сканиране на сцени
През 1977 г. Colin JR Sheppard и Tony Wilson описват конфокални детектори с епи-лазерно осветяване, сканиращи етапи и фотоумножителни тръбни детектори. Сцената може да се движи по оптичната ос (Z-ос), позволявайки оптични серийни секции.
През 1979 г. Фред Бракенхоф и неговите колеги показаха, че теоретичните ползи от оптичното разделяне и подобрената разделителна способност всъщност са постижими на практика. През 1985 г. тази група стана първата, която публикува завладяващи изображения от конфокална микроскопия, които могат да отговорят на биологични въпроси. Скоро след това много повече групи започнаха да използват конфокална микроскопия, за да отговорят на научни въпроси, които все още остават загадка поради технологични ограничения.
През 1983 г. IJ Cox и S. Sheppard от Оксфорд публикуват първата работа върху компютърно контролиран конфокален микроскоп. Първият комерсиален лазерен сканиращ микроскоп, сценичният скенер SOM-25, беше предложен от Oxford Optoelectronics (след няколко придобивания на TAKE-frame от BioRad) в началото на 1982 г. Той се основаваше на дизайна на Oxford group.
От 1985: Лазерни точкови скенери с лъчево сканиране
В средата на 80-те години Уилям Брадшоу Амос и Джон Греъм Уайт и колеги, работещи в Лабораторията по молекулярна биология в Кеймбридж, построиха първия сканиращ микроскоп с конфокален лъч. Сцената за проба не се движи, вместо това осветява мястото, което позволява по-бързо получаване на изображение: четири изображения в секунда с 512 реда всяко. Междинните изображения са силно преувеличени, поради дължината на пътя на лъча от 1-2 метра, което позволява използването на конвенционална диафрагма на ириса като "отвор" с диаметър ~1 mm. Първите микроснимки са направени чрез продължително излагане на филм преди добавянето на цифровата камера. По-нататъшното подобрение позволи мащабиране в подготовка за първи път. По същото време Zeiss доведе до комерсиалния CLSM, разпространяван от шведската компания Sarastro. Предприятието е придобито през 1990 г. от Molecular Dynamics, но CLSM в крайна сметка е прекратено. В Германия Heidelberg Instruments, основана през 1984 г., разработи CLSM, който първоначално е бил предназначен за индустриални приложения, а не за биология. Този документ е прехвърлен през 1990 г. на Leica Lasertechnik. Zeiss вече беше неконфокален летящ точков лазерен сканиращ микроскоп на пазара, който беше надграден до конфокален. Докладът от 1990 г. отбелязва изброените "някои" конфокални стъкла на производителя: Sarastro, Technical Instruments, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic и Zeiss.
През 1989 г. Фриц Карл Прейкшат, със сина си Екхард Прейкшат, изобретява сканиращия микроскоп с лазерен диод за анализ на размера на частиците. Той и Ekhard Preikschat съосновават Lasentec за комерсиализация. През 2001 г. Lasentec беше придобита от Mettler Toledo (NYSE: MPD). Около десет хиляди системи са инсталирани по целия свят, главно във фармацевтичната индустрия, за да осигурят контрол на място на процеса на кристализация в големи пречиствателни системи.
- Микроскопия с двуфотонно възбуждане: Въпреки че използват подходяща технология (и двата лазерни сканиращи микроскопа), многофотонните флуоресцентни микроскопи не са строго конфокални микроскопи. Срок конфокаленвъзниква поради наличието бленда V спрегната фокална равнина(конфокален). Този отвор обикновено липсва в многофотонните микроскопи.
- Флуоресцентен микроскоп с пълно вътрешно отражение (TIRF) o
конфокална микроскопия- Виртуален CLSM (базиран на Java)
- Анимация и обяснение за различни видове микроскопи, включително флуоресцентни и конфокални микроскопи. (Université Paris Sud)
Основни понятия
Въпреки че съвременните инструменти се различават значително от най-ранните версии, принципът на конфокалното изобразяване, въведен от Марвин Мински и патентован през 1957 г., се използва във всички съвременни конфокални микроскопи. В традиционните микроскопи с широко поле цялата проба се осветява от живачен или ксенонов светлинен източник и изображението се наблюдава или визуално, или се проектира върху записващо устройство или фотографски филм. Методът за формиране на изображение с конфокален микроскоп е коренно различен. Осветяването се осъществява чрез сканиране на цялата повърхност на пробата с един или повече фокусирани лъча светлина, обикновено от източник на лазерна дъга. Осветената зона на пробата се фокусира от леща и след това се сканира с помощта на компютърно контролирано сканиращо устройство. Последователността от светлинни лъчи от пробата се открива през диафрагма с дупка (или в някои случаи диафрагма с процеп) от фотоумножителна тръба (PMT), чийто изход се преобразува в изображение, показвано на компютър. Въпреки че неоцветените образци могат да се наблюдават чрез отразена от тях светлина, те обикновено се маркират с едно или повече флуоресцентни багрила.
Методи за получаване на изображения
Конфокалната микроскопия използва различни техники за изобразяване, за да изследва огромен брой различни видове проби. Всички те се основават на техническата възможност за получаване на изображения с висока разделителна способност, наречени оптични секции, в последователност от относително дебели секции или цялата проба (цялата монтировка). Оптичният срез е основният елемент на изображението. Самите изображения се получават чрез наблюдение на свързани и оцветени проби при единични, двойни, тройни и многовълнови режими на осветяване, а изображенията, генерирани с помощта на различни техники за осветяване и оцветяване, ще бъдат точно корелирани едно с друго. Възможно е да се получат изображения на жива клетка и разгъната във времето поредица от изображения (регистриране на изображения в даден интервал от време), а методите за числена обработка, приложени към поредици от изображения, позволяват създаването на интегрирано цяло изображение от поредица от z- изображения на оси и триизмерни изображения на проби, както и представяне на триизмерни данни във времева последователност, тоест четириизмерно изображение. Ранните конфокални микроскопи изобразяват с помощта на отразена светлина, но всъщност лазерно сканиращият конфокален микроскоп може да се използва за изобразяване с помощта на всеки източник на предавана светлина, който обикновено се използва в микроскопията.
Създаване на изображение
Процедурите за подготовка на проби и изобразяване с конфокални микроскопи са по същество тези, които са разработени през годините в традиционната широкополова микроскопия. В биомедицината основното приложение на конфокалната микроскопия е изобразяването на свързани или живи клетки и тъкани, които обикновено се оцветяват с един или повече флуоресцентни етикети. Има голям брой различни флуоресцентни багрила, които могат да бъдат включени в сравнително прости протоколи и използвани за оцветяване на специфични клетъчни органели и структури. Сред огромното разнообразие от налични багрила има например багрила за ядрото, апарата на Голджи, ендоплазмения ретикулум, митохондриите, както и багрила като флуоресцентен фалоидин, който показва полимеризиран актин в клетките. Независимо от използвания метод за подготовка на пробата, основното предимство на конфокалната микроскопия е гъвкавостта при представяне и анализ на изображението, което е резултат от едновременното получаване на множество изображения и тяхното цифрово представяне на компютър.
Критични аспекти на конфокалната микроскопия
Количественото 3D изобразяване при флуоресцентна микроскопия често се усложнява от артефакти, въведени по време на подготовката на пробата поради контролирани и неконтролирани експериментални количества или проблеми с позиционирането и оформлението на микроскопа. Тази статия, написана от д-р Джеймс Б. Поли, систематизира най-честите външни фактори, които често затъмняват резултатите, получени при флуоресценция с широко поле и конфокална микроскопия. Обсъжданите теми включват лазерна система, подравняване на оптични компоненти, увеличение на обектива, артефакти на избелване, аберации, масло за потапяне, дебелина на покривното стъкло, квантова ефективност и среда на пробата.
Аберации при многоцветна конфокална микроскопия
Подобренията в дизайна опростиха конфокалната микроскопия до такава степен, че тя се превърна в общ инструмент за изследване на клетъчната биология. Но тъй като конфокалните микроскопи станаха по-мощни, бяха поставени по-големи изисквания към тяхната оптика. Всъщност оптичните аберации, които причиняват незначителни дефекти на изображението при микроскопия с широко поле, могат да имат опустошителни ефекти при конфокална микроскопия. За съжаление, строгите оптични изисквания на конфокалната микроскопия често са скрити от оптични системи, които гарантират резки изображения дори при слаб микроскоп. Производителите на оптика произвеждат много различни лещи за микроскопи, предназначени за специфични приложения. Тази статия показва как обективните компромиси влияят върху конфокалната микроскопия.
Трицветно изображение при конфокална микроскопия
Лазерно сканиращ конфокален микроскоп (LSCM) обикновено се използва за получаване на цифрови изображения на флуоресцентни проби, маркирани с един, два и три етикета. Използването на червени, зелени и сини (RGB) цветове е най-информативно за представяне на разпределението на светлината на до три флуоресцентни клетъчни маркировки, когато се използва допълнителен цвят за всяка относителна позиция и когато изображенията с различни цветове образуват единичен три- цветен модел. В този раздел ще разгледаме опростена версия на наскоро публикуван метод за получаване на трицветни конфокални изображения с помощта на популярната програма за обработка на изображения, Adobe Photoshop. Освен това се обсъждат няколко приложения за създаване на трицветен протокол за изображения за конфокално представяне на изображения. Струва си да се има предвид, че тези числени методи не се ограничават до LSCM изображения и могат да се прилагат към цифрови изображения, импортирани във Photoshop от други източници.
Основи на конфокалната рефлекторна микроскопия
Конфокалната отразяваща микроскопия може да се използва за получаване на допълнителна информация за проба с относително малко допълнителни усилия, тъй като техниките изискват минимална подготовка на пробата и смяна на оборудването. В допълнение, с конфокална отражателна микроскопия, информацията от неоцветени тъкани е толкова лесно достъпна, колкото данните, получени от оцветени проби, които отразяват светлина. Този метод може също да се комбинира с по-често срещаните техники за флуоресцентно изобразяване. Примери за скорошни приложения включват записване на неоцветени клетки в популация от флуоресцентно оцветени клетки и наблюдение на взаимодействия между флуоресцентно оцветени клетки, растящи върху непрозрачен структуриран субстрат.
Галерия с конфокални изображения
Галерията с конфокални изображения Nikon MicroscopyU е поредица от цифрови изображения, получени с помощта на конфокален микроскоп Nikon PCM-2000, комбиниран с вертикален микроскоп Eclipse E-600. Последователност от изображения на оптични сечения в различни равнини на пробата се получава чрез сканиране по протежение на оптичната ос на микроскопа. Последователността е представена от интерактивно Java приложение, което ви позволява или да „възпроизвеждате“ поредица от резени автоматично, или да ги превъртате напред-назад като слайдове.
Лазерна сканираща конфокална микроскопия
Разработени са няколко техники за преодоляване на феномена на лошия контраст, присъщ на изображенията на дебели образци, обикновено произведени от микроскопи. Конфокалните и деконволюционните техники произвеждат значително по-добри изображения на средно дебели проби (5 до 15 микрона). Изображенията на най-дебелите образци (20 микрона или повече) се влошават при излагане на силна околна светлина от зони извън фокус и може би се получават най-добре чрез техники на конфокална микроскопия. Използвайки този урок, пробите се представят като серия от оптични секции по оста z с помощта на виртуален конфокален микроскоп.
Отражателна конфокална микроскопия
Използвайте този урок, за да изследвате отделни повърхностни слоеве на интегрални схеми. Цифрови изображения за насочване бяха получени с помощта на отразяващ конфокален микроскоп Nikon Optiphot C200. За всяка серия беше записана последователност от оптични секции по оста z, докато микроскопът проникваше и фокусираше дълбоко в (на стъпки от 1 микрометър) мозайката от вериги на повърхността на силициевия кристал.
Основни положения
В сравнение с традиционната микроскопия, конфокалната микроскопия има няколко предимства, включително плитка дълбочина на проникване в изследваната проба, липса на фоново осветление и възможност за получаване на серия от оптични срезове на дебели проби. В биомедицината основното приложение на конфокалната микроскопия е изобразяването на свързани или живи клетки и тъкани, които обикновено са маркирани с един или повече флуоресцентни тагове.
Ориз. 1. Схема на пътя на лъча при конфокална микроскопия
При изобразяване на флуоресцентни проби с традиционен микроскоп с широко поле, вторичната луминесценция, излъчвана от пробата от области извън изследването, често влияе върху яснотата на изображението на фокусирани характеристики. Това е особено проблематично за образци с дебелина над 2 микрометра. Конфокалната микроскопия осигурява скромни подобрения както в аксиалната, така и в равнинната разделителна способност; Но способността да се елиминира фоновата светлина, която се появява във флуоресцентно оцветени проби с голяма дебелина, е причината за неотдавнашния скок в популярността на този изследователски метод. Тъй като са относително лесни за работа, повечето съвременни конфокални микроскопи са станали част от основното оборудване в много системи за изображения с много потребители. Тъй като разделителната способност, постигната от лазерно сканиращ конфокален микроскоп (LSCM), е малко по-добра от традиционен оптичен микроскоп с широко поле, но все пак значително по-ниска от разделителната способност на трансмисионен електронен микроскоп, той в известен смисъл се превърна в мост между два най-често срещани изследователски метода. Фигура 1 показва схематична диаграма на преминаването на светлина в конфокален микроскоп с основна конфигурация.
В традиционните микроскопи с широко поле цялата проба се осветява с живачен или ксенонов източник на светлина и изображението се наблюдава визуално или се проектира върху устройство за изображения или фотографски филм. Методът за получаване на изображение с конфокален микроскоп е коренно различен. Пробата се осветява чрез сканиране с един или повече фокусирани лъча, обикновено лазер (Фигура 2). Изображенията, получени чрез сканиране на пробата, се наричат оптични сечения. Тази терминология се отнася до неинвазивна техника за тестване, при която изображенията се получават с помощта на фокусирана светлина, а не чрез физическо дисекция на пробата.
Ориз. 2. Широкополево и точково сканиране на проби
Конфокалната микроскопия значително опрости изследването на живи проби, като направи възможно получаването на данни в три измерения (z-серия) и подобри процеса на изобразяване на многооцветени проби. Фигура 3 сравнява традиционно епископско флуоресцентно изображение с конфокално изображение на същите участъци от цяла какавида на пеперуда с оцветен с пропидиев йодид епител. Очевидно е впечатляващо увеличение на разделителната способност и, като следствие, острота на изображението на ядрата в LSCM изображение, поради елиминирането на извънфокусната флуоресцентна емисия.
Лазерно сканиращ конфокален микроскоп (LSCM)
Сега LSCM е най-разпространената версия на конфокални микроскопи, използвани в биомедицината. Във въведението се обръща специално внимание на LSCM, тъй като дизайнът и структурата на тези микроскопи позволяват дори на начинаещи потребители да работят с тях. Други дизайнерски решения са заели свои собствени специални ниши в биологията. За всеки модел или модификация на конфокален микроскоп се прилагат повечето от правилата за подготовка на пробата, с малки модификации, както и други техники, базирани на оптично разделяне, като деконволюция и многофотонни техники.
Развитие на конфокалната микроскопия
Изобретяването на конфокалния микроскоп се приписва на Марвин Мински, който създава работещ микроскоп през 1955 г. Развитието на конфокалната микроскопия до голяма степен се ръководи от желанието да се наблюдават биологични процеси в живата тъкан (in vivo), а целта на Мински беше да изобрази невронната мрежа в неоцветен препарат на жив мозък. Принципите на конфокалната микроскопия, въведени от Мински и патентовани през 1957 г., се използват във всички съвременни конфокални микроскопи. Фигура 1 обяснява конфокалния принцип, приложен към епифлуоресцентната микроскопия, която формира основата на всички съвременни конфокални системи, използвани при флуоресцентно изобразяване. В оригиналната конфигурация Мински използва отвор (диафрагма), поставен срещу източник на светлина с циркониева дъга, използван като източник на светлина от отвор.
Ориз. 3. Епител на крилото на пеперудата
Светлината от точков източник се фокусира под формата на точка от леща върху дадена фокална равнина в образеца и, преминавайки през нея, се фокусира от втора леща върху втора дупка (пинхол), която е във фокус с първо (те бяха кофокални, т.е. конфокални). Лъчите, преминаващи през втория отвор, удрят фотоумножителна тръба с нисък шум, която генерира сигнал в зависимост от яркостта на светлината, идваща от пробата. Втора дупка прекъсва светлината, идваща от области над или под фокалната равнина в пробата от фотоумножителната тръба. Използването на пространствено филтриране за елиминиране на светлината извън фокуса и отблясъците при работа с проби, по-дебели от фокалната равнина, е ключов принцип на конфокалната микроскопия. В работата си Мински също така описва отразяващ микроскоп с единична леща и дихроматично огледало, чийто дизайн става основата на системите, използвани днес.
За да се получи конфокално изображение, е необходимо пробата да се сканира със светлина, фокусирана в точка. В оригиналното устройство, сглобено от Мински, светлинният лъч беше неподвижен, а самата проба се движеше на вибрираща платформа. Неподвижността на сканиращия лъч спрямо оптичната ос на микроскопа беше предимство на тази инсталация, тъй като елиминира повечето оптични дефекти, които биха могли да изкривят изображението. Въпреки това, когато се изучават биологични проби, това може да причини колебания и изкривявания, което в крайна сметка води до загуба на разделителна способност и яснота на изображението. Освен това при преместване на стола и пробата е невъзможно да се извършват каквито и да било манипулации, като например микроинжекции на флуоресцентно оцветени клетки.
Но, независимо от метода на сканиране на пробата, е необходимо да се получи нейното изображение. И оригиналният дизайн на Мински не създава реално изображение, тъй като изходът от фотоумножителната тръба се подава към дълготраен осцилоскоп, използван от военните, който няма записващо устройство. Мински по-късно пише, че незадоволителното качество на неговите изображения не се дължи на ниската разделителна способност на самия микроскоп, а на ниската разделителна способност на дисплея на осцилоскопа. Сега е ясно, че поради липса на технология Мински не може да демонстрира напълно пълния потенциал на конфокалния метод, особено при изобразяване на биологични структури. Той посочи, че това може да е причината конфокалната микроскопия да не бъде приета веднага от много взискателната общност на биолозите, за които качеството на получените изображения винаги е било приоритет. По това време те имаха на разположение светлинни микроскопи с отлична оптика, позволяващи им да наблюдават и снимат ярко оцветени хистологични срезове върху високочувствителен цветен филм. В съвременните конфокални микроскопи изображенията се генерират от сигнали, идващи от фотоумножителна тръба или заснети от камера на цифрово зарядно устройство, обработват се директно от компютърна система за изображения и се показват на екран с висока разделителна способност и устройство за документиране на изображения с превъзходно качество. Диаграма на модерен лазерен сканиращ конфокален микроскоп е показана на фигура 4.
Ориз. 4. Схема на модерен лазерен сканиращ конфокален микроскоп
Основната оптика на оптичния микроскоп не се е променила фундаментално от десетилетия, тъй като крайната разделителна способност на инструмента се определя от дължината на вълната, лещата на обектива и свойствата на самата проба. Багрилата, използвани за подобряване на контраста на пробите, и други техники за оптична микроскопия са се подобрили значително през последните 20 години. Възходът и усъвършенстването на конфокалния метод е следствие от възраждането на оптичната микроскопия, причинено до голяма степен от успеха на съвременните технологии. Много от технологичните постижения, които биха могли да бъдат от полза за дизайна на Мински, постепенно стават достъпни (и достъпни) за биолози и други микроскописти. Сред тях стабилни многочестотни лазери, използвани като подобрени точкови източници на светлина, подобрени дихроматични огледала, чувствителни фотодетектори с нисък шум, високоскоростни микрокомпютри с подобрени възможности (поради наличието на памет с голям капацитет), усъвършенстван софтуер за изображения, високо- монитори с резолюция и цифрови принтери.Тези технологии се развиват независимо и постепенно се интегрират в конфокални системи за изображения от 1955 г. Например техниките за цифрова обработка на изображения бяха използвани за първи път успешно в началото на 80-те години на миналия век от изследователи в Океанографския институт Уудс Хоул. Използвайки това, което те нарекоха „видео микроскопи“, те успяха да получат изображения на клетъчната структура на микротръби, по-малки от теоретичната граница на разделителна способност на оптичен микроскоп. Очевидното увеличение на разделителната способност е възможно чрез цифрова оптимизация на изображения, заснети от високочувствителна суперсиликонова (SIT) видеокамера, свързана с цифров процесор за изображения. Клетъчните структури бяха визуализирани с помощта на диференциална интерферентна контрастна оптика (DIC) и допълнителна обработка на цифрови изображения.
Класификацията на конфокалните микроскопи обикновено се основава на метода на сканиране на пробата. Има два основни метода на сканиране: сценично сканиране и сканиране на осветителен лъч; и поне два начина за сканиране на лъча. Оригиналният инструмент на Мински се основава на система за сценично сканиране, управлявана от примитивен генератор на камертон, който произвежда изображение доста бавно. Съвременните конфокални инсталации със сценично сканиране, които далеч надхвърлят своите прототипи, се използват главно в материалознанието, например при производството на микрокристали. Системи, базирани на този принцип, наскоро станаха популярни в биомедицинските области, където ДНК анализът се извършва върху микрокристали.
По-практична алтернатива за изобразяване на биологични системи е сканирането на неподвижна проба с лъч. Този принцип е в основата на много измервателни системи, чието усъвършенстване доведе до появата на популярните днес изследователски микроскопи. В това въведение не навлизаме в техническите детайли на конфокалната микроскопия, но по същество тя използва две фундаментално различни техники за сканиране на лъчи: многолъчево сканиране и еднолъчево сканиране. Еднолъчевото сканиране е най-често срещаното днес и именно този метод се използва в LSCM. Тук лъчът се сканира с помощта на компютърно контролирани огледала, задвижвани от галванометри със скорост от един кадър в секунда. За постигане на по-бързо сканиране, приблизително с кадровата честота на видео, някои системи използват акустооптично устройство или осцилиращи огледала. Алтернативен метод използва два лъча за сканиране почти в реално време, обикновено използвайки вариант на въртящ се диск на Nipkow. Тези системи са резултат от модификацията и усъвършенстването на тандемни сканиращи микроскопи (TSM) за създаване на по-ефективни модели за изобразяване на флуоресцентно оцветени проби. Фигура 5 показва такава усъвършенствана система със сдвоени дискове на Nipkow и микролещи за подобряване на чувствителността към слабо флуоресцентно излъчване за изображения в реално време.
Ориз. 5. Оптичен дизайн на базата на дискове на Nipkow
Днес в конфокалната микроскопия има два алтернативни метода за получаване на оптични сечения: метод на деконволюция и многофотон. Те се различават технически, но като конфокалните методи се основават на традиционната оптична микроскопия. Деконволюцията се основава на изчислителни алгоритми за изчисляване и премахване на информацията, която идва от зони извън фокус при създаване на изображение. Тази техника стана много удобна благодарение на ефективните алгоритми и високопроизводителните миникомпютри. Многофотонната микроскопия използва същата система за сканиране като LSCM, но не изисква диафрагма с дупка в приемника. Няма нужда от това, тъй като лазерът възбужда флуорохромния знак само във фокусната точка, като по този начин елиминира излъчването извън фокуса. При наблюдение на жива тъкан този метод има допълнителни предимства, а именно: намалено фотоизбелване, тъй като количеството енергия, предавано от лазерния лъч и абсорбирано от тъканта на пробата, е намалено.
Традиционният оптичен микроскоп е основата, върху която е изграден LSCM. Вместо волфрамова или живачна лампа се използва лазер, който е свързан към чувствителна фотоумножителна тръба (PMT) и компютър, който управлява сканиращи огледала и други сканиращи устройства и улеснява събирането и представянето на изображения. Получените данни се съхраняват на цифров носител и могат да се обработват с помощта на множество софтуерни пакети, както на компютъра на самата система, така и на някой друг.
Съгласно дизайна на LSCM, осветяването и приемането на сигнала (регистрация) са ограничени до точка от пробата с граница на дифракция. Микроскопските лещи фокусират осветеното петно и сканиращото устройство сканира пробата с това петно под компютърен контрол. Сигналите от светлинните петна на пробата влизат във фотоумножителна тръба през диафрагма с дупка (или в някои случаи процеп), а изходните сигнали от фотоумножителя се формират в изображение и се възпроизвеждат визуално от компютър. Въпреки че неоцветените проби могат да се наблюдават чрез светлина, отразена от пробата, те обикновено се оцветяват с едно или повече флуоресцентни багрила. Един от най-разпространените LSCM, описан в литературата около 1990 г., е разработен в отговор на фундаментален проблем, пред който са изправени биологичните изследователи. Много структури и отделни макромолекули в рамките на имунофлуоресцентно оцветени ембриони не могат да бъдат визуализирани с традиционен епифлуоресцентен микроскоп след двуклетъчния стадий, тъй като обемът на ембриона остава приблизително същият, тъй като броят на клетките се увеличава. Това означава, че при по-плътно разположение на клетките се увеличава луминесценцията от клетки извън фокалната равнина, което води до влошаване на разделителната способност на изображението.
Ориз. 6. Конфигурация на лазерно сканиращ конфокален микроскоп Nikon
Група изследователи, работещи по този проблем, установиха, че нито една от конфокалните системи, налични по това време, не отговаря на техните изисквания. По това време сканиращите микроскопи бяха твърде бавни. Създаването на едно изображение отне приблизително 10 секунди, а многолъчевите сканиращи инструменти все още не бяха практични за флуоресцентно изобразяване. LSCM е проектиран да отговаря на изискванията на традиционната епифлуоресцентна микроскопия и, заедно с други, разработвани по същото време, се превърна в прототип на сложните системи, предлагани сега на биомедицинската общност от различни компании. Пример за система, използвана днес (Nikon E1000), е показан на фигура 6.
В специално проектирани устройства дебелината на оптичните секции може да варира в зависимост от промените в диаметъра на отвора пред фотодетектора. В сравнение с други дизайни с фиксиран размер на отвора, тази допълнителна функция е изключително гъвкава при изобразяване на биологични структури. Изображението може да бъде увеличено без загуба на разделителна способност чрез намаляване на сканираната област на пробата и поставяне на сканираната информация в масив от данни със същия размер за съхранение и визуално представяне (увеличението се променя по подобен начин в сканиращ електронен микроскоп) . Това дава на един обектив интервал на увеличение, което може да бъде изключително полезно при визуализиране на редки или мимолетни събития, които могат да бъдат пропуснати или изгубени при смяна на обективи.
С усъвършенстваните и гъвкави възможности на LSCM, които сега се предлагат в търговската мрежа на разумни цени, конфокалната микроскопия експлодира в популярност през последните години, като много лаборатории с много потребители избират това оборудване пред електронни микроскопи. Предимството на конфокалната микроскопия е относителната лекота, с която могат да се получат висококачествени изображения на проби, подготвени за традиционна оптична микроскопия, и широк спектър от приложения в различни области на изследване.
Първото поколение LSCM работи добре с фиксирани проби, но не успяха да контролират светлинната енергия на лазерите, което твърде често водеше до фатално унищожаване на живата проба, освен ако не бяха взети сериозни предпазни мерки. Въпреки тези ограничения, изображенията на записаните проби бяха с толкова високо качество, че конфокалният подход беше безусловно приет от специалистите. Следващите поколения инструменти са подобрили всеки аспект от процеса на изобразяване. В допълнение към това, новите устройства са станали много по-ергономични и по-лесни за използване, така че настройките, промяната на комбинациите от филтри и регулирането на лазерната мощност с помощта на компютър са станали много по-лесни и по-бързи. Вече е възможно да се снима с три флуорохрома едновременно и с още повече последователно. Благодарение на подобрения и по-надежден софтуер, по-бързите компютри, по-големите дискови устройства и падащите цени на устройствата за съхранение с произволен достъп, обработката на изображения също напредна значително.
Режими на изображения
Основното приложение на конфокалния микроскоп е да се получат изображения на различни видове дебели проби. Предимството на конфокалния метод произтича от възможността за създаване на изображения на пробата като последователност от отделни оптични секции с висока дефиниция и разделителна способност. В този случай се използват няколко режима на визуализация; Всеки от тях се основава на оптичен срез като основна единица на изображението.
Ориз. 1. Оптични секции, обозначени с три знака
Индивидуални оптични секции
Оптичната секция е основната единица за изобразяване в техниките на конфокална микроскопия. Изображения на свързани и оцветени проби могат да бъдат получени в режими на осветяване с единична, двойна, тройна и много вълна, докато изображенията на многоцветни проби ще бъдат комбинирани помежду си (ако се използват лещи с подходяща корекция на хроматична аберация). Допълнителната регистрация обикновено се извършва с помощта на методи за обработка на цифрови изображения. Повечето конфокални микроскопи с лазерно сканиране (LSCM) изискват приблизително 1 секунда за получаване на оптична секция, въпреки че изображенията от множество оптични секции обикновено се осредняват, за да се подобри съотношението сигнал/шум. Времето, необходимо за получаване на изображение, разбира се, зависи от размера на пикселите на изображението и скоростта на системния компютър. За да съхраните типично 8-битово изображение от 768x512 пиксела, ще са необходими около 0,3 Mbit памет.
Оптичните секции, показани на Фигура 1, са получени едновременно чрез възбуждаща светлина с три различни дължини на вълната (488, 568 и 647 нанометра), като се използва единичен криптон/аргонов лазер като източник на радиация. Като проба е представен въображаемият диск на крило на Drosophila на трети етап, в който са маркирани три гена, участващи във формирането на крилото. Представените три гена и съответните флуорохромни етикети са: (а) рудиментарни (флуоресцеин - 496 нанометра); б) безкрили (лисамин родамин - 572 нанометра); и © CiD (цианин 5 - 649 нанометра). Съставно изображение на трите пространствено представени генни домена, които образуват крилото, се намира долу вдясно (изображение (d)).
Запис на определен интервал от време и визуализиране на жива клетка
Изследванията на живи клетки с изтичане на времето са получили нов тласък поради повишената разделителна способност на LSCM. Преди това изследванията на движенията на клетъчните структури се извършваха с помощта на 16 mm фотографски филм и интервалометър с часовников механизъм, свързан с камера, по-късно с помощта на видеорекордер с функция за изтичане на времето, записващо устройство с оптичен диск или платка за цифровизация на видео . Сега, използвайки LSCM, е възможно да се получат оптични сечения на определени, предварително зададени интервали в реално време.
Изобразяването на жива тъкан с помощта на LSCM е много по-трудно от изобразяването на обвързани проби и не винаги е практично, тъй като пробата може да не издържи на условията на гледане. Таблица 1 обобщава някои фактори, които трябва да се имат предвид при наблюдение на живи и свързани клетки с помощта на LSCM. Някои проби е просто физически невъзможно да се поставят на стола на микроскопа или няма да могат да останат живи върху него през целия период на наблюдение. Феноменът или структурата, които се изследват, може да не са в зрителното поле на лещата. Например имагиналните дискове на крилото на Drosophila се развиват твърде дълбоко в ларвата, за да бъдат наблюдавани; и след дисекция те не могат да се развият в култура. Следователно днес единственият наличен метод за наблюдение на генната експресия в тъкани от този тип е дисекцията на ларвата, завързване и оцветяване на имагинални дискове, взети от проби на различни етапи на развитие.
Таблица 1. Наблюдение на свързани и живи клетки с помощта на LSCM
Успешното наблюдение и изобразяване на живи клетки изисква изключително внимание по време на целия процес.Поддържането на приемливи условия на стола на микроскопа е задължително. Увреждането, причинено на клетката от облъчване с лазерен лъч, може да се натрупа при многократно сканиране, така че тази експозиция трябва да бъде сведена до минимума, необходим и достатъчен за получаване на изображение. Антиоксиданти, като аскорбинова киселина, обикновено се добавят към културалната среда, за да намалят кислорода, освободен, когато флуоресцентните молекули се облъчват с възбуждаща светлина и насърчават образуването на свободни радикали, убиващи клетките. Обикновено е необходимо да се проведат обширни предварителни контролни експерименти, за да се оцени ефектът от облъчването върху флуоресцентно оцветени клетки, като внимателно се гарантира, че всички параметри на изображението са в съответствие с направените наблюдения. След тестовите изображения трябва да се оцени жизнеспособността на живите екземпляри. Ембрионите, например, трябва да продължат да се развиват нормално през целия процес на наблюдение, така че всички аномалии, причинени от излагане на радиация или флуорохроми, трябва да бъдат открити. Фигура 2 показва снимка с изтичане на времето на ембрион на Drosophila, флуоресцентно оцветен с калциево зелено. Серия от изображения показва промени в разпределението на флуоресцентното сияние във времето.
Всеки тип клетки изисква свои собствени мерки за поддържане на тяхната жизнеспособност по време на наблюдение. За някои клетки на насекоми е достатъчно поддържането на стайна температура и наличието на достатъчно голям обем подходяща среда. Въпреки това, повечето видове клетки изискват нагрята сцена и понякога перфузионна камера, за да се поддържа подходящ баланс на въглероден диоксид, докато сте на сцената. Изборът на типа клетки, за които условията на наблюдение с помощта на LSCM са най-малко „враждебни“, ще помогне да се избегнат много експериментални проблеми. Подобренията в съвременните конфокални инструменти доведоха до значително намаляване на потенциалните проблеми. Повишената квантова ефективност, по-голямата цифрова апертура (яркост) на обективите и използването на по-малко токсични клетъчни багрила доведоха до превръщането на конфокалната микроскопия в практичен метод за анализ на живи клетки. Необходимо е да се стремим към използването на лазери с по-малка мощност, като същевременно позволяваме получаването и обработката на изображения да се извършват възможно най-бързо. Ако апертурата на пинхол се увеличи, за да се ускори събирането и записването на изображения (в сравнение с наблюдението на неживи проби), последващата деконволюция понякога може да възстанови загубеното качество на изображението.
Ориз. 2. Снимане на зададен интервал от време
Много физиологични процеси и събития се случват твърде бързо, за да бъдат уловени от повечето LSCM, които имат средно едно изображение в секунда за изображения. LSCM, използващи акусто-оптични устройства и прорезни диафрагми, са по-бързи от системите за сканиране на точки, възбудени от галванометър, и са по-практични за физиологични изследвания. Тези по-бързи настройки комбинират добра пространствена и времева разделителна способност, която може да достигне 30 кадъра в секунда при разделителна способност на цял екран или близка до скоростта на видео изображението. При по-бавни сканиращи микроскопи с дупки, временната разделителна способност може да се увеличи само чрез намаляване на зоната за сканиране на пробата. Ако се изисква пълна пространствена разделителна способност, кадровата честота трябва да бъде намалена, което води до загуба на времева разделителна способност. Конфокалните системи, които използват сканиране на диск или осцилиращо огледало, също са способни да изобразяват бързи физиологични процеси или други преходни събития.
Z-серия и 3D изображения
Z-серия е последователност от оптични сечения на проба, взети на различни нива в равнина, перпендикулярна на оптичната ос (z-ос). Изображенията от серия Z се получават чрез съпоставяне на промените стъпка по стъпка във финото фокусиране на микроскопа и след това получаване на изображение на всяка стъпка. Движението на фокуса стъпка по стъпка обикновено се извършва от компютърно контролиран стъпков двигател, който променя фокуса с предварително определена стойност. С помощта на компютърна програма за макроси можете да получите и запишете изображение, да префокусирате микроскопа на определена дълбочина в пробата, да получите и запишете второ изображение, да префокусирате отново в нова равнина и така нататък, докато не бъде получен програмираният брой изображения .
Желаните изображения могат да бъдат взети от z-серията, получена чрез заснемане на избрана област от пробата и обработена със специален софтуер за последващо подробно изследване на специфични клетки, представляващи интерес. Z-серията може да се разглежда като фотомонтаж на изображения, както е на фигура 3. Този тип комбинация и показване на изображения, както и много други манипулации на изображения, е стандартна характеристика на съвременните софтуерни пакети за манипулиране на изображения. Изображенията на фигура 3 са селекция от по-голяма серия с още по-чести z-стъпки. Зеленото сияние идентифицира периферната нервна система на ембрион на Drosophila, оцветен с антитялото 22C10.
Ориз. 3. Z-серия оптични секции
От серия от няколкостотин оптични секции на проба, произведена от LSCM, може да бъде трудно да се добие представа за целия комплекс от взаимосвързани структури. Въпреки това, z-серията, след като бъде регистрирана, е идеален материал за последващо триизмерно представяне на пробата, използвайки техники за обемно изобразяване. Този подход сега се използва широко за изясняване на връзката между структурата и функцията на тъканите в медицината и биологията. Важно е да зададете правилната стъпка на z-сканиране на пробата, определена от стъпката на двигателя за промяна на фокуса; в този случай изображението ще отразява действителната дълбочина на пробата.
Докато пробата остава неподвижна, докато се наблюдава, изображенията от z-серията, произведени от LSCM, ще бъдат перфектно записани и когато се съхраняват цифрово, те ще бъдат относително лесно преобразувани в 3D представяне на пробата. Фигура 4 сравнява единична оптична секция (a) с проекция на z-серия (b) и илюстрира стойността на тази техника при изобразяване на периферната нервна система на ембрион на Drosophila, белязан с антитялото 22C10.
Стъпката на стъпковия двигател, зададена от оператора на микроскопа, е свързана с дебелината на оптичната секция, но може да има други стойности. Дебелината на оптичния участък е свързана с дебелината на участъка на пробата, наблюдаван през микроскопа, и зависи от лещата и диаметъра на диафрагмата с дупка. В някои случаи обаче фокусната стъпка може да бъде същата като дебелината на оптичния срез и това може да доведе до объркване.
След като файлът от z-серията бъде получен, той се изпраща за обработка от програма за 3D реконструкция, специално предназначена за обработка на конфокални изображения. Такива програми са изключително бързи, когато се използват на графични станции, но могат успешно да се използват и на персонален компютър или графичната станция на самия конфокален микроскоп, с достатъчно бърз процесор и голяма RAM памет. С помощта на тези програми можете да създадете както отделни триизмерни представяния на проба, така и поредица от представяния, които се заменят взаимно, съставени от различни типове проби, което създава ефекта на въртене или други пространствени трансформации и дава по-добро възприемане на триизмерните свойства на пробата. Програмата ви позволява да променяте дължината, дълбочината, да правите обемни измервания и също интерактивно да променяте специални параметри на изображението, като прозрачност на пробата, за да подчертаете различни структури на различни нива на пробата.
Ориз. 4. Оптичен разрез и z-серия проекция
Друг начин за представяне на поредица от оптични срезове, взети от последователност от изображения, получени в даден интервал от време, е триизмерно представяне, в което z-оста има функцията на времевата ос. Този подход е полезен при визуализиране на физиологичните промени по време на развитието на организма. Пример за прилагането на този метод е да се изясни динамиката на промените в концентрацията на калций по време на развитието на ембриони на морски таралеж. Цветното кодиране на оптични секции, взети на различни дълбочини, е лесен начин за представяне на 3D данни. На практика на всяка оптична секция, направена на различни дълбочини на пробата, се задава цвят (обикновено червен, зелен или син), след което цветните изображения се комбинират и желаният ефект се постига чрез промяна на цветовете с помощта на програма за обработка на изображения.
4D изображения
С LCSM динамичните явления, възникващи в живи тъкани или по време на подготовката на живи тъканни култури и отразени в поредица от изображения, направени през даден интервал от време, могат да бъдат представени в четири измерения, като времето е четвъртото измерение. Z-сериите, получени на редовни интервали, са четириизмерни набори от данни: три пространствени измерения (x, y и z) и време като четвърто, което може да се наблюдава с помощта на 4D визуализатор. Такива програми ви позволяват да съставяте и възпроизвеждате стерео двойки, заснети в различни моменти във времето като филм, или, алтернативно, да обработвате и представяте реконструирани триизмерни изображения, заснети в различни моменти във времето, като редактиран филм.
X-Z изображения
Ако се желае страничен изглед на образеца, като например вертикален разрез през епителния слой, може да се направи разрез x-z по един от двата начина. Страничен изглед може да се получи чрез сканиране по една линия на пробата (ос x) на различни дълбочини (ос z), контролиране на промяната на фокуса със стъпков двигател и след това комбиниране на цялата поредица от срезове в един изображение. Друг метод е да се използва опцията за равнина на сечение в програма за 3D изобразяване, където страничният изглед се извлича от съществуваща z-серия от оптични срезове. При изобразяване на епитела на крилата на пеперудата на Фигура 5, лазерът сканира по една линия (хоризонталната черна линия в лявото изображение), прониквайки в пробата на различни z-координати или дълбочини. X-z изображението, показано на фигура 5, е генерирано и представено от конфокална система за изображения. Епителът на крилото се състои от два епителни слоя, но тъй като интензитетът на флуоресценция намалява с увеличаване на дълбочината на проникване на лазерния лъч в пробата, само горният слой се визуализира ясно.
Ориз. 5. Изображение в равнината X-Z
Създаване на изображение в отразена светлина
Всички ранни конфокални микроскопи работеха в отразена или обратно разсеяна светлина. Използвайки отразена светлина, много проби могат да бъдат наблюдавани неоцветени при конфокална микроскопия или могат да бъдат маркирани със силно отразяващи багрила като микрокристали имунозлато или сребърен халид. Предимство на наблюденията на отразена светлина, особено за жива тъкан, е, че пробата не подлежи на фотоизбелване. Но някои видове багрила могат да отслабят лазерния лъч. Друг потенциален проблем е, че някои микроскопи могат да изпитат вътрешни отражения от оптични елементи по пътя на оптичния лъч. За многолъчевите версии на LSCM и LSCM с прорезна диафрагма проблемът с отразената светлина не съществува, а в тези микроскопи, които съществуват, използването на поляризатори, изобразяване на зони без артефакти и отместване спрямо оптичната ос помагат за намаляване на проблема.
Изобразяване в пропусната светлина
Всеки от режимите на изобразяване на предавана светлина, често използвани в микроскопията, може да се използва в LFCM, включително фазов контраст, диференциален интерферентен контраст (DIC), тъмно поле или поляризирана светлина. Светлината, преминаваща през пробата, попада в приемника на пропусната светлина, чийто сигнал чрез оптичен световод се изпраща към един от фотоумножителите в сканиращата глава на микроскопа. Пропуснатата светлина и конфокалните епифлуоресцентни изображения могат да бъдат заснети едновременно с помощта на един и същ лъч на осветителя, като се гарантира точна регистрация. Чрез обединяване или синтезиране на изображения с помощта на подходящ софтуер може да се отрази точното местоположение на белязаните клетки в тъканта. Някои проучвания предлагат следния смислен подход: комбинирайте неконфокално изображение на пропусната светлина с едно или повече конфокални флуоресцентни изображения на белязани клетки от една и съща проба. Този подход ще позволи, например, да се определят пространствените и времеви аспекти на миграцията на субпопулация от белязани клетки в рамките на популация от немаркирани клетки за няколко часа или дори години.
Днес вече широко се използва приемник на предавана цветна светлина, който приема предавани сигнали в червено, зелено и синьо (RGB), за да създаде изображение с истински цветове, подобно на това, което се прави в някои цифрови цветни камери. Такъв приемник е особено полезен за патолозите, които рутинно наблюдават действителните цветове в тъканите под предавана светлина и наслагват тези изображения с флуоресцентни данни за анализ.