Lüminesans mikroskopiyası. Elektron mikroskopiyası
Bu fəsildə nümunə olaraq Leica cihazlarından istifadə edərək konfokal lazer skan edən mikroskopun (CLSM) əsas prinsipləri, dizaynı və tətbiqi müzakirə olunacaq. CLSM prinsipi fokuslar üst-üstə düşdükdə linzanın fokus müstəvisindən çıxan işıq axınının qeydə alınmasıdır, yəni detektorun diafraqması elə yerləşdirilməlidir ki, onun təsviri obyekti işıqlandıran işığın fokusuna tam uyğun olsun. Lazerlər və həssas detektorlar görüntü əldə etmək üçün işıq mənbəyi kimi istifadə olunur.
CLSM-nin əsas xüsusiyyəti tədqiq olunan obyektin (məsələn, hüceyrənin) yüksək ayırdetmə qabiliyyətinə və aşağı səs-küyə malik lay-lay təsvirini əldə etmək qabiliyyətidir. Bu, xüsusi flüoresan zondlardan və işıq axınının məhdudlaşdırılması üçün xüsusi üsullardan istifadə edərək, əlaqəli mənbədən və ya mərhələdən fokuslanmış işıq şüası olan obyektin addım-addım skan edilməsi ilə əldə edilir.
CLSM tarama sistemləri aşağıdakı kimi təsnif edilə bilər.
1. Şüanın skan edilməsi.
A) Güzgü sistemləri: tək güzgülü, iki güzgülü, rezonanslı maqnitoelektrik.
B) Yüngül lifli sistemlər: tək lifli, çox lifli.
B) Lensin skan edilməsi:
· X, Y oxları boyunca lensin piezoelektrik hərəkəti;
· Z oxu boyunca lensin piezoelektrik hərəkəti.
D) Akusto-optik şüa deflektorları: X və Y oxları boyunca skan etmək üçün iki akusto-optik deflektor.
D) Disk sistemləri:
· bir spiral, birtərəfli və ikitərəfli;
· çox spiral birtərəfli və ikitərəfli.
E) Kombinə edilmiş sistemlər: Y oxu boyunca akusto-optik deflektor və X oxu boyunca güzgü ilə skanlama.
2. Cədvəllə skan edilməsi.
A) Step sürücü: X, Y, Z oxları boyunca pilləli mühərrikləri olan skan masası.
B) Birləşdirilmiş sürücü: X, Y oxları boyunca pilləli mühərrik və Z oxu boyunca piezoelektrik sürücü ilə skan etmə mərhələsi.
düyü. 5. CLSM-in işinin sxematik diaqramı.
1 - tarama masası; 2 - sınaq nümunəsi; 3, 7 - linzalar; 4 - skan edən cihaz; 5 - şüa ayırıcı; 6 - lazerdən gələn işıq şüası; 8, 12 - B və C nöqtələrinin təsviri; 9 - iynə diafraqması; 10 - iynə diafraqmasının mərkəzindəki A nöqtəsinin şəkli; 11 - radiasiya qəbuledicisi; 13, 15 - lens 3-ün fokusundan kənarda yerləşən B və C nöqtələrinin parıltısı; 14 - lens 3-ün fokusunda yerləşən A nöqtəsinin parıltısı.
Lazer mənbəyindən gələn həyəcan işıq axını 6 şüa ayırıcı lövhədən 5, skan sistemi 4 vasitəsilə linzaya 3 daxil olur və fokusda olan sınaq nümunəsinin (məsələn, hüceyrə) müstəvisinin A nöqtəsinə fokuslanır. . İnanırıq ki, hüceyrədaxili strukturlar flüoresan zondlarla əlaqələndirilir və şüanın fokuslanma nöqtəsi A işıq nöqtəsi mənbəyi kimi qəbul edilə bilər, ondan linza 3, şüa ayırıcı lövhə 5, lens 7 vasitəsilə iynə diafraqma 9 müstəvisində fokuslanan flüoresan axını. (“pinhole”) və fotodetektor tərəfindən qeydə alınır 11 Optik ox boyunca (B və C nöqtələri) linza fokusundan kənarda yerləşən dərman fraqmentlərinin həyəcan axını ilə işıqlandırılması A nöqtəsindən aşağıdır. Nəticədə detektorun işıqlandırma komponenti B və C nöqtələrindən hədəf əhəmiyyətli dərəcədə azaldıla bilər. Fokusdan kənarda yerləşən B və C nöqtələrindən çıxan flüoresan axınlar sancaq deşikli diafraqma ilə məhdudlaşır və detektora çatmır və ya onların kiçik bir hissəsi çatır. Beləliklə, təyyarədə bir preparatı skan edərkən XY Detektor bir siqnalı qeydə alır, onun səviyyəsi Z koordinatı boyunca skan müstəvisindən olan məsafə ilə müəyyən edilir. "konfokallıq" termini. Skan müstəvisinin Z oxu boyunca addım-addım hərəkəti bir sıra ziddiyyətli lay-lay təsvirləri əldə etməyə və tədqiq olunan obyektin daxili üçölçülü strukturunu (3-D) yenidən qurmağa imkan verir. Şəkil keyfiyyəti, müstəvidə qətnamə XY və Z oxu boyunca optikanın keyfiyyətindən, skan sistemlərinin keyfiyyətindən, sancaq deşik diafraqmasının ölçüsündən və istehsal dəqiqliyindən, strukturun sərtliyindən, istifadə olunan siqnal emal alqoritmlərinin səmərəliliyindən və spesifikliyindən asılıdır. floresan zondlar.
Mikroskopun məkan ayırdetmə qabiliyyətini müəyyən etmək üçün nöqtə işıq mənbəyinin təsvir analizi aparılır. Adi linzanın yaratdığı nöqtə mənbəyinin təsviri parlaq mərkəzi nüvədən və daha zəif xarici halqalardan ibarət olan Airy difraksiya nöqtəsidir.
düyü. 6. Havalı difraksiya nöqtəsi.
Parlaqlığı bərabər olan iki nöqtə mənbəyi, aralarındakı məsafə d-dir , Airy dairələrinin mərkəzləri arasındakı məsafə aşağıdakı dəyəri keçərsə, iki fərqli nöqtə kimi görünür:
r A = XY =0,6 λ/NA,
harada r A - Airy dairəsindəki ilk qaranlıq halqanın radiusu, λ işıq mənbəyinin nm-də dalğa uzunluğu, NA ədədi aperturadır.
Bu ifadə Rayleigh kriteriyası adlanır. Nümunə müstəvisində (XY) mikroskopun ayırdetmə qabiliyyətini təyin edir. Bu halda, ayırdetmə həddi ilk növbədə işığın dalğa təbiəti ilə müəyyən edilir və buna görə də çox vaxt NA=1 nəzərə alınmaqla sadələşdirilir. CLSM-də görüntüləmə Airy ləkəsinin ölçüsündə bir qədər azalma ilə nəticələnir. Standart mikroskop üçün Airy ləkəsinin intensivliyi n -2 qanununa uyğun olaraq azalır, burada n eninə yerdəyişmədir və CLSM üçün intensivlik n -4 kimi azalır. Bu, CLSM-in ayırdetmə qabiliyyətinin 1,5 dəfə artmasına səbəb olur. Konfokal mikroskop üçün Rayleigh meyarının forması var:
XY c r =0,4 λ/NA,
burada XY c r CLSM-in həllidir.
CLSM-nin üstünlüklərini qiymətləndirmək üçün biz instrumental funksiyanı (Ay ləkəsinin quruluşunu) nəzərdən keçiririk və mikroskopun eksenel istiqamətdə (Z) ayırdetmə qabiliyyətini təhlil edirik. Üç ölçülü Airy nöqtəsi (intensivliyin paylanması) obyektin təsvirini təyin edən üçölçülü aparat funksiyasıdır (THF). Adi mikroskop üçün TAF mərkəzdən yuxarı və aşağı genişlənən konusvari formaya malikdir, konfokal mikroskop üçün isə o, elliptik formaya malikdir və eksenel istiqamətdə daha az uzanır.
düyü. 7. Adi mikroskopun nöqtə mənbəyinin üçölçülü aparat funksiyasının görünüşü - (a) və CLSM - (b).
Mikroskopun optik ox istiqamətində ayırdetmə qabiliyyətini təyin etmək üçün də Rayleigh meyarı tətbiq olunur. Adi bir mikroskop üçün, optik ox boyunca müəyyən məsafədə yerləşən iki nöqtə mənbəyi, onların Hava nöqtələrinin maksimalları məsafədə olarsa, həll edilə bilər:
Z r =2 λ/NA 2,
burada Z r mikroskopun eksenel ayırdetmə qabiliyyətidir.
CLSM üçün Airy nöqtəsində enerji paylanması daha dar, eksenel istiqamətdə həlledicilik isə 1,4 dəfə yüksəkdir. Konfokal mikroskop üçün Rayleigh meyarının forması var:
Z r c =1,4 λ/NA 2,
burada Z r c CLSM-in eksenel ayırdetmə qabiliyyətidir.
Müasir CLSM-in bir əsas üstünlüyü var - nazik optik bölmələr əldə etmək imkanı. İncə optik kəsiklər əldə edərkən görüntü keyfiyyətinə aşağıdakı parametrlər təsir göstərir:
· konfokal apertura ölçüsü;
· lensin ədədi diyaframı NA;
· qırılma əmsalı;
· nümunədə işığın udulması.
Nümunənin qalınlığı artdıqca işıq intensivliyinin azalması optik Z oxu boyunca mikroskopun ayırdetmə qabiliyyətinə təsir edir. Konfokal mikroskopda optik hissənin qalınlığı adətən intensivlik zirvəsinin ∆z 1/2 = 0,65 μm yarı hündürlüyündə paylanmanın eni ilə xarakterizə olunur. Nümunə və detektor idealdırsa, bu parametr obyektin ədədi diafraqmasından, dalğa uzunluğundan λ və daldırma mühitinin sınma indeksindən asılıdır n i .
düyü. 8. Mikroskopun eksenel ayırdetmə qabiliyyətinin ∆z 1/2 linzanın ədədi diafraqmasından asılılığı.
CLSM-də detektorun qarşısına işığın miqdarını dəyişən tənzimlənən diafraqma yerləşdirilir. İğne diafraqmaları fokus müstəvisi ilə üst-üstə düşməyən və ya fokus müstəvisində obyektin təhlil edilən elementinin yanında yerləşən nöqtələrdən təsvirin formalaşma müstəvisinə daxil olan işığın maksimum və ya tam filtrasiyası üçün şərait yaratmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur. İğne diafraqmasının ölçüsü sonludur və cihazın yanal həlli, nümunənin işıqlandırılmış elementlərinin parlaqlığı Z oxu boyunca fokus müstəvisinə nisbətən yerdəyişmə və sahənin dərinliyi ondan asılıdır. Diafraqmanın ölçüsü yaranan hissənin qalınlığına təsir göstərir. Apertura nə qədər kiçik olarsa, kəsik qalınlığı nəzəri həddə (intensivlik zirvəsinin yarı hündürlüyündə paylanma eni) bir o qədər yaxın olar və çox böyük diametrlərdə nazik kəsik əldə etmək mümkün olmur.
Daha əvvəl qeyd edildiyi kimi, CLSM nümunənin səthindən əhəmiyyətli bir dərinlikdə optik kəsiyi əldə etməyə imkan verir, vacib məqam qırılma əmsalı və dərinlik məsələsidir. Hadisənin və əks olunan şüanın nümunədən keçməsi görüntü keyfiyyətinə təsir göstərir. Daldırma mühitinin və nümunənin sındırma göstəriciləri yaxın olarsa (immersion mayenin və cismin sındırma göstəriciləri fərqinin səpələnmiş işığın görünüşünə təsiri, təsvirin kontrastını azaldır və sferik aberasiya effekti kimi çıxış edir) , işıq konusu birləşəcək. Kırılma göstəriciləri fərqli olarsa, sferik aberrasiya görünür.
düyü. 9. Daldırma mühitinin və nümunənin sınma göstəriciləri.
a – aberasiya olmadan immersion lensdən istifadə edərək təsvirin formalaşması; b – göstəricilər arasında uyğunsuzluq nəticəsində yaranan sferik aberasiya.
Fərqli sındırma göstəriciləri ilə optik oxdan müxtəlif məsafələrdə gələn işıq şüaları bir nöqtəyə fokuslanmır, bu da görüntü keyfiyyətinin itirilməsinə səbəb olur. Mümkünsə, nümunənin sındırma göstəriciləri və obyektiv uyğunlaşdırılmalıdır. Nümunənin və immersion mühitin sındırma göstəriciləri fərqli olarsa, dərinlikdəki obyektin təsviri optik ox boyunca bulanıqlaşır və fokus müstəvisi yerdəyişir. Nüfuz dərinliyini artırmaq üçün linzada yağlı linza kimi böyük ədədi diafraqma olmalıdır. Bununla belə, bu cür linzalar obyektiv lensdən fokus müstəvisinə qədər kiçik bir maksimum məsafəyə malikdir. Nüfuz dərinliyi nümunənin heterojenliyindən təsirlənir, bu da böyük dərinliklərdə işıq intensivliyinin azalmasına və kölgənin görünüşünə səbəb olur. İdeal olaraq, maksimum nüfuz dərinliyinə və maksimum ayırdetmə qabiliyyətinə nail olmaq üçün nümunə lensinkinə bərabər bir sındırma indeksinə malik olacaq, lakin bu, homojen bir nümunədir və belə bioloji nümunələr mövcud deyil.
Tarama zamanı CLSM nümunənin səthindən müntəzəm olaraq artan dərinliklərə malik bir sıra optik bölmələr əldə edir. Əksər CLSM-lər üçün yüzlərlə 2D təsvirin əldə edilməsi cəmi bir neçə dəqiqə çəkir. Optik görüntü iki yolla əldə edilə bilər:
1) bir-birindən ∆z məsafədə yerləşən XY müstəvisində optik kəsiklər ardıcıllığının alınması. Müxtəlif kəsiklərdə cisimlərin mərkəzlərinin koordinatlarının müqayisəsi onların oriyentasiyasını və uzunluq paylanmasını müəyyən etməyə imkan verir.
düyü. 10. XY müstəvisində üçölçülü quruluşun tədqiqi.
2) ∆y məsafədə yerləşən XZ müstəvisində bir sıra optik kəsiklərin alınması. Nümunə bölmə müstəvisinə paraleldirsə, onda onun XZ müstəvisindəki kəsimi müxtəlif XZ bölmələrindəki təsvirləri müqayisə etməklə demək olar ki, dairəvi olacaq, tədqiq olunan obyektin əyriliyi müəyyən edilə bilər;
düyü. 11. XZ müstəvisində üçölçülü quruluşun tədqiqi.
CLSM metodlarından istifadə etməklə tədqiq olunan obyektlərin üçölçülü yenidən qurulması iki problemin həllinə yönəlmişdir:
· obyektin optik bölmələrinin “yığılması” nəticəsində əldə edilən üçölçülü təsvirinin vizuallaşdırılması;
· obyektin daxili strukturlarının kəmiyyət təhlili.
Bu gün CLSM istehsal edən kifayət qədər çox şirkət var. CLSM istehsal şirkətlərinin yenilikləri:
· 2002 Leica lazer həyəcan şüası və lüminessensiyanı səmərəli şəkildə ayırmağa imkan verən akusto-optik şüa splitterini (AOBS) elan etdi;
· 2002 Carl Zeiss eyni vaxtda 32 spektral kanalda siqnalları qeydə alan orijinal fotodetektoru olan LSM 510 META konfokal mikroskopunu istehsal etməyə başladı;
· 2004 Zeiss adi CLSM-dən 20 dəfə yüksək tarama sürətinə malik yüksək sürətli LSM 5 Live-ni yaradır;
· Olympus, məsələn, FRAP texnikasından daha səmərəli istifadə etməyə imkan verən iki skanerli cihaz hazırlayıb;
· Nikon - sadələşdirilmiş dizaynla kompakt və ucuz CLSM yaradır;
· 2007 Leica eksenel ayırdetmə qabiliyyətini 4-7 dəfə yaxşılaşdıran 4Pi-konfokal mikroskopun buraxıldığını elan etdi.
Yeni, daha təkmil nəsil cihazlara aid olan CLSM cihazını nəzərdən keçirək - Leica-dan TCS SP5.
düyü. 12. Multifoton/konfokal genişzolaqlı sistem TCS SP5 (ters çevrilmiş mikroskop).
CLSM TCS SP5-in əsas elementləri: AOTF – akustik-optik tənzimlənən filtr, AOBS – akusto-optik şüa ayırıcı, SP-Detector – spektral fotometr sensoru.
AOTF - Akustik-Optik Tənzimlənən Filtr - optik ekspozisiyanı minimuma endirməyə xidmət edir və nümunə və flüoroxromdan asılı olaraq lazer gücünü tənzimləyir. Lazımi dalğa uzunluğunu seçməyə və həyəcan işığının intensivliyinə nəzarət etməyə imkan verir. AOTF, qırılma indeksinin qeyri-bərabərliyi ilə işıq şüasının həcmli difraksiyası prinsipi əsasında işləyən elektrik tənzimlənən filtrdir. Belə qeyri-bərabərliklər ultrasəs akustik dalğa iki qırılma kristallarında həyəcanlandıqda yaranır. Biroxlu kristallarda anizotropik difraksiya ilə, enmə və difraksiya bucaqlarının üst-üstə düşdüyü minimum ultrasəs tezliyi var və sözdə kollinear akusto-optik qarşılıqlı təsir baş verir.
düyü. 13. Akustik-optik tənzimlənən filtr.
AOBS - akusto-optik şüa ayırıcı, akusto-optik kristaldır - əks rejimdə işləyən tənzimlənən sındıran cihaz. AOBS-dən istifadə sizə nə verir:
1. Aydın, aşağı səs-küylü təsvir əldə etmək üçün yüksək dərəcədə işıq ötürülməsi tələb olunur. Bir çox ardıcıl skan zamanı təsvirin orta hesabla çıxarılması ilə səs-küyün azaldılması mütləq öyrənilən obyektin fotoağardılmasına gətirib çıxarır. AOBS-in işıq keçiriciliyi bütün görünən spektrdə əksər dikroik güzgülərdən üstündür. Buna görə də, daha az sayda taramanın orta hesabla aparılması tələb olunur. Nəticədə, dərman daha uzun sürəcək;
2. Parlaq və aydın təsvirlər obyektdən detektora keçmək üçün mümkün qədər çox foton tələb edir ki, bu da təsvirin keyfiyyətini artırır. AOBS mümkün olan ən geniş flüoresan zolaqların, yəni fotonların maksimum sayının qeydiyyatını təmin edir;
3. Şəklin alınması zamanı aşağı ağartma nümunəni solğunlaşmadan və canlı obyektləri zəhərli flüoroxrom fotoliz məhsullarından qorumaq üçün vacibdir. AOBS-in işıq ötürmə əyriləri çox dik yamaclara malikdir, bu da flüoroxromun flüoresansını onun həyəcan zolağına mümkün qədər yaxın qeyd etməyə imkan verir;
4. Görünən diapazonda olan istənilən boya həyəcanlana bilər, çünki əksi fərdi qaydada tənzimləmək olar;
5. Çoxparametrli flüoresans məsələsi həll olundu: səkkizə qədər lazer emissiya xətti proqramlaşdırıla bilər, flüoresansın qeydə alınması üçün kifayət qədər yer ayrılır, eyni zamanda tezliklər tənzimlənə bilər;
6. Boyaların nisbəti, metabolitlərin həyəcanlanma nisbəti kimi - nümunələr, məsələn, Ca 2+, membran potensialı, pH dəyəri, ardıcıl tarama zamanı tez dəyişməlidir. AOBS bir neçə mikrosaniyə ərzində açar;
7. Əks olunan işıqda təsvirin qeydiyyatı başqa bir istifadə imkanıdır. AOBS əks olunan həyəcan işığının ötürülməsini fərdi olaraq tənzimləməyə imkan verir;
8. ROI-nin skan edilməsi (ardıcıl skan və xüsusi sahənin skan edilməsi) də təkmilləşdirilmişdir: bir skan zamanı müxtəlif həyəcan rejimləri müxtəlif sahələrə tətbiq edilə bilər;
9. Ardıcıl rejimdə böyük həcmli 3D qeydlər sürətli keçid cihazlarından faydalanır, çünki sürət sistemin səmərəliliyini artırır;
10. Flüoressensiya korrelyasiya spektroskopiyası (FCS) aşağı fon və aşağı işıq səpilməsi tələb edir Yalnız AOBS yaxınlıqdakı emissiya xətlərini, məsələn, Ar lazerlərindən effektiv şəkildə bloklayır;
11. Spektral qeyd (Lambda skanı) dəqiq spektri təmin edir, çünki AOBS-nin işıq ötürülməsi “ağdır”, yəni emissiya spektrində dəyişikliklər yaratmır – dikroik güzgü sistemində spektral skanlar apararkən ümumi problem;
12. Həqiqi konfokal optik kəsmə üçün spot işıqlandırma və flüoresansın ləkə aşkarlanması tələb olunur. AOBS spot skan edən konfokal cihazlarla istifadə üçün uyğundur;
13. Multifoton rejimində və ya ultrabənövşəyi həyəcanlandırma ilə görüntüləmə səhvlər və məhdudiyyətlər olmadan paralel olaraq həyata keçirilə bilər. AOBS görünməz lazerlərin həyəcanını dəyişdirmir və flüoresan spektrini dəyişdirmir;
14. AOBS AOTF (Acousto-Optical Tunable Filter) istifadə edərək həyəcan nəzarəti ilə birlikdə idarə edildiyi üçün səhv əməliyyatı yerinə yetirmək mümkün deyil. Həyəcan xətti seçilərsə, AOBS ona uyğun olaraq proqramlaşdırılır. Operatorun qərar qəbul etməsinə ehtiyac yoxdur - iş düzgün və avtomatik həyata keçirilir;
15. Heç bir tənzimləmə yoxdur, çünki filtr barabanlarına və sürgülərə xas olan hərəkətli elementlər yoxdur. Kristal möhkəm quraşdırılıb və proqramlaşdırma elektron şəkildə həyata keçirilir;
16. Filtr kubları, dikroik güzgü sürgüləri və s. kimi bahalı əlavə avadanlıqlara ehtiyac yoxdur. Buna görə də, yeni optik elementlərin quraşdırılması üçün texniki yardımın dəyəri xeyli aşağıdır.
düyü. 14. AOBS – akusto-optik şüa ayırıcı.
SP-Detector – spektral fotometr sensoru. İnduksiya edilmiş flüoresan spektrlərinin cəmi olan nümunədən gələn işıq konfokal optik bölmə meydana gətirən sancaq deşik diafraqmasından keçir. Sonra bir prizmadan istifadə edərək, bu işıq bir spektrə parçalanır. Birinci detektordan keçərkən işıq iki motorlu pərdədən ibarət yarıq fotometr qurğusundan keçir. Bu pərdələr diapazonun hər iki tərəfindəki spektrin kənarlarını kəsərək onları 2-ci və 3-cü dərəcəli sensorlara yönəldir. Nəticədə spektr eyni vaxtda beş kanala bölünür. Nəticədə, SP detektorundan istifadə edərkən nümunədə müxtəlif boyalardan radiasiya qeydə alınır.
düyü. 15. Spektral detektor SP.
SP detektoru lambda skanına imkan verir: eksperimentdə iştirak edən boyaların xüsusiyyətlərini dərhal təhlil etmək üçün spektral təsvirlər toplanır.
4 iyun 2013-cü ilMoskva Dövlət Universitetinin Biologiya fakültəsində aparılan elmi tədqiqatların əhəmiyyətli bir hissəsini və yaxından əlaqəli təhsil proqramlarının uğurla həyata keçirilməsini ən müasir mikroskopik texnologiyadan istifadə etmədən təsəvvür etmək mümkün deyil. Moskva Universitetinin İnkişaf Proqramı çərçivəsində Biologiya fakültəsində lazımi avadanlıqla tam təchiz olunmuş və səmərəli fəaliyyət göstərən kafedralararası konfokal mikroskopiya laboratoriyası yaradılmışdır.
3T3 fibroblastlar matrisin makroporunun divarlarında
Mətn: Tretyakov Artemy
Nə edə bilər?
İstifadə etməklə konfokal mikroskop hüceyrənin virtual bölmələrinin bir neçə şəklini və ya onlardan yığılmış üçölçülü modeli əldə edə bilərsiniz. Bu cür imkanlar şüası hüceyrənin istənilən nöqtəsinə fokuslana bilən lazerlə təmin edilir. Təsviri əldə etmək üçün obyekt flüoresan aktiv olmalıdır, yəni lazer şüası ilə vurulduqda o (daha doğrusu, tərkibindəki müəyyən molekullar) üzərinə düşən hadisədən daha uzun dalğa uzunluğunda işıq yaymalıdır. mikroskop. Təsvir məhz bu flüoresans əsasında qurulub.
Şəkil
Bu necə işləyir?
“Fundamental və tətbiqi fənlərarası elmi tədqiqatların hazırkı inkişaf səviyyəsi, habelə fənlərarası səriştələrə malik mütəxəssislərin hazırlanması vəzifələri maddi-texniki bazanın intensiv inkişafını və müasirləşdirilməsini tələb edir” (Moskva Universitetinin İnkişaf Proqramı, səh. 5 ;) .
Elektron-mexaniki cihaz lazerlə yanaşı, lazer şüasını ötürən, lakin daha uzun dalğa uzunluğunda işığı “pinhole” adlanan diafraqmaya əks etdirən optik filtri də əhatə edir (ingilis dilindən Pinhole – sancaqla açılan dəlik, hərfi tərcüməsi). bütün lazımsız fon işığını kəsən və bununla da hüceyrənin skan edilmiş sahəsinin ekranının aydınlığına əsas optik təbəqələrin təsirini azaldan və ya tamamilə inkar edən pinhole cihazını mükəmməl xarakterizə edir. Arxa fon işığı sancaq dəliyi ilə kəsilməsəydi, optik təbəqələr bir-birinin ardınca düşəcək və tamaşaçıya mane olacaqdı - sanki o, yarpaqların arasından uzaqlara baxır. Diafraqmanın arxasında alınan məlumatı rəqəmsallaşdıran bir fotodetektor var.
Aydındır ki, bu cür “nöqtə” skan edilməsi vaxt tələb edir. Bu prosesi sürətləndirmək üçün konfokal sistem fırlanan disk adlanan başqa moduldan istifadə edir ki, bu da lazer əməliyyatının bir aktında təkcə bir nöqtənin deyil, bütün xəttin təsvirini əldə etməyə imkan verir.
Belə bir sistem üçün patent 1961-ci ildə MIT professoru Marvin Minski tərəfindən alınıb. Onun aktiv istifadəsi 80-ci illərdə başladı və indi konfokal mikroskopiya öz çiçəklənmə dövrünü yaşayır. İlk mikroskop Rusiyada 2003-cü ildə ortaya çıxdı, bu Axiovert 200M LSM510 Meta idi. Digərləri də izlədi və indi ölkəmizdə bir neçə böyük laboratoriya, o cümlədən Moskva Dövlət Universitetinin Biologiya fakültəsində kafedralararası laboratoriya fəaliyyət göstərir. Laboratoriyada beş mikroskop var, o cümlədən: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.
Konfokal mikroskopiya nəinki ən yüksək kontrasta və üçölçülülüyə nail olub, həm də dördüncü ölçüsü - vaxtı mənimsəmiş, hüceyrələrdə baş verən dəyişiklikləri öyrənməyə imkan vermişdir. Bu məqsədlər üçün hər bir qurğu öz ömrünü saxlamaq üçün sistemlərlə təchiz edilmişdir. Bütün bunlar bu imkanlardan uğurla istifadə edən tədqiqatçılar üçün geniş imkanlar yaradır.
Və söhbət Moskva Dövlət Universitetinin Biologiya fakültəsinin laboratoriyasından getdiyi üçün bu laboratoriyada aparılan tədqiqatları nümunə kimi qeyd etmək lazımdır.
İpək və tor
Konfokal mikroskopiya nəinki ən yüksək kontrasta və üçölçülülüyə nail olub, həm də dördüncü ölçüsü - vaxtı mənimsəmiş, hüceyrələrdə baş verən dəyişiklikləri öyrənməyə imkan vermişdir.
Maraqlı işlərdən biri də qan damarlarının və digər içi boş orqanların bərpası üçün bioloji parçalana bilən protezlərin yaradılmasıdır. Ən sadə hallarda, belə toxuma mühəndisliyi strukturları zədələnmiş yerə yerləşdirilən borulara və ya filmlərə bənzəyir və beləliklə, "yamaq" rolunu oynayır. Onlar müxtəlif materiallardan, o cümlədən ipəkqurdu baramalarından ipək fibroindən hazırlana bilər. Bu materialın üstünlüyü ondan ibarətdir ki, o, sabitdir və protezin çevik və davamlı strukturunu təşkil edir. Protezin özü yalnız çılpaq gözlə baxdıqda filmə bənzəyir, əslində bu, matrisdir - mesh çox qatlı baza, canlı toxumanın quruluşunu təqlid edən bir çərçivə; Bu iskele yeni hüceyrələrin düzgün mövqe tutmasına kömək edir, onların bərabər paylanmasını təmin edir. Nəticədə zədələnmiş orqan divarı bərpa olunur və lazımsız çərçivə biodeqradasiyaya məruz qalır. Ancaq hüceyrələrin çərçivə boyunca nə qədər bərabər paylandığını və matrisin dərin təbəqələrində yaxşı yaşayıb-yaşamadığını (qaz mübadiləsində və metabolik məhsulların mübadiləsində hər hansı bir çətinlik olub-olmadığını) yoxlamaq o qədər də asan deyil. içərisinə nüfuz etdikdə morfologiyanı dəyişir. Məhz bu mərhələdə mikroskopun (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) istifadəsi işi xeyli asanlaşdırdı. Əsasən obyekti məhv etmədən yoxlamaq qabiliyyətinə, həmçinin mikroskopun 600 mikron dərinliyə qədər matrisin içərisinə baxmaq qabiliyyətinə görə.
Şəkil
Oxşar iş sümük toxuması ilə də aparıldı, onun matrisi həm eyni fibroindən, həm də hörümçəyin bədənində kəşf edilmiş və onun tərəfindən tor toxumaq üçün istifadə edilən bir protein olan spidroindən hazırlanmışdır. Laboratoriya şəraitində zülal ümumiyyətlə hörümçəklər tərəfindən deyil, genomuna bu zülalın sintezindən məsul olan bir qədər dəyişdirilmiş hörümçək geni daxil edilən maya tərəfindən istehsal olunur.
O qədər də sadə deyil
Ancaq toxumalarda zədələnmənin baş verməsi sadə və başa düşülən bir prosesdirsə, digər patologiyalar həmişə aydın deyil. Effektiv müalicəyə başlamazdan əvvəl və xüsusən də onların inkişafının qarşısını almaq üçün onların baş vermə mexanizmini tapmaq lazımdır. Bunlara ateroskleroz daxildir - damarların xəstəliyi, bunun nəticəsində lipidlər damar divarında, daha dəqiq desək, intimada - onun daxili təbəqəsində toplanır, divarı qalınlaşdırır və nəticədə hətta damarın tam tıxanmasına səbəb ola bilər. . Bu xəstəliyə səbəb olan şey tam aydın deyil, necə ki, immunokompetent hüceyrələrin hansı rol oynadığı aydın deyil, onların yığıldığı yerlərdə aterogenez tezliklə başlayır. Bu suallara tam cavablar hələ tapılmayıb, lakin aterogenezin öyrənilməsi davam edir, baxmayaraq ki, bu mövzuda toxuma mühəndisliyi protezləri mövzusundan daha az nəşr var.
Şəkil
Molekulların taleyi
Kafedralararası konfokal mikroskopiya laboratoriyasından 10-a yaxın kafedranın 20-dən çox bakalavr və magistratura tələbələri öz işlərində müntəzəm olaraq istifadə edirlər.
Yuxarıda təsvir edilən tədqiqatlar əsasən hüceyrələrin vəziyyətini izləyir. Ancaq konfokal mikroskopun imkanları bununla məhdudlaşmır; o, flüoresan aktivliyə malik olduğu müddətcə hüceyrədəki fərdi molekulun taleyini belə izləyə bilir. Bunun üçün molekullar adətən flüoroxromlarla etiketlənir - bu aktivliyə malik olan xüsusi boyalar. Flüoroxromlar fərdi molekullar kimi mövcuddur və onların etiketlənməsi floroxromun tədqiqatçı üçün maraqlı olan molekula kimyəvi şəkildə bağlanmasını nəzərdə tutur. Bundan sonra belə etiketlənmiş molekullar hüceyrəyə daxil olur və onların sonrakı taleyi mikroskop vasitəsilə izlənilir. Bu yolla, məsələn, risin və viskuminin hüceyrəsindəki aktivlik və hərəkət müqayisə edildi. Hər iki maddə zülal toksinləridir, hər ikisi bitki mənşəlidir və iki hissədən ibarətdir - alt hissələrdən biri hüceyrəyə bağlanmaq və içəriyə nüfuz etmək, digəri isə ribosomu təsirsiz hala gətirmək üçün cavabdehdir və nəticədə hüceyrə ölümünə səbəb olur. Praktiki fayda yenə başqa bir təhlükəli xəstəliyin - xərçəngin müalicəsi ilə bağlıdır. Alt bölmələr arasında bu aydın "məsuliyyətlərin ayrılması" birinci alt bölməni, məsələn, bir antikorla əvəz etməyə imkan verir. Nəticə yalnız bu antikorun uyğun olduğu müəyyən hüceyrələrə təsir edən “immunotoksin”dir. İki əsas problem var. Birincisi: xərçəng hüceyrələrinə yaxınlaşacaq və toksinin sağlam hüceyrələrə nüfuz etməsinə mane olacaq bir antikor seçmək. İkincisi: immunotoksinə çevrildikdə yüksək təsirli qalacaq bir toksin seçmək.
Şəkil: Yeni doğulmuş siçovul balalarının ürək hüceyrələrinin ilkin kulturası: A - nəzarət, B - 24 saat ərzində 20 µM izoproterenol ilə müalicə olunur. 1 - mitoxondrilərin TMRE ilə boyanması; 2 - fazalı kontrast. Ölçek 10 µm. (Smirnova T.A., Saprunova V.B. “İzoproterenolun təsiri altında yeni doğulmuş siçovulların mədəni kardiomiositlərinin mitoxondrilərində adaptiv dəyişikliklər.” Beynəlxalq konfrans “Reseptorlar və hüceyrədaxili siqnalizasiya” 24-26 MAY 2011. Puşçino).
Təhsil
Konfokal mikroskopiya ilə aparılan işlərin siyahısını uzun müddət davam etdirmək olar. Canlı hüceyrələrlə işləməyə də imkan verən bu effektiv üsul, demək olar ki, hər bir elmi araşdırmada tələb olunur. Ona görə də tələbələri bu laboratoriyada işləməyə hazırlamaq çox böyük rol oynayır. Burada mütəmadi olaraq kurs işi, kursqabağı iş və diplom işi ilə məşğul olan 20-dən çox bakalavr və magistr tələbələri iştirak edir.
Obyektlərdə embrioloqlar, molekulyar bioloqlar, sitoloqlar, biomühəndislər, immunoloqlar və zooloqlar çalışır.
Konfokal Mikroskopiya Laboratoriyası 2004-cü ildə yaradılmışdır.
Laboratoriya müdiri – dosent M.M.Moisenoviç
Laboratoriyada gənc mütəxəssislər A.A.Ramonova və A.Yu
Hazırda laboratoriyada 2 konfokal sistem quraşdırılıb:
- Konfokal əlavə ilə Axiovert 200M LSM510 META (Carl Zeiss, Almaniya)
- Konfokal lazer skan sistemi, NIKON CORPORATION (Yaponiya) tərəfindən istehsal edilmişdir - laboratoriya tədqiqatları üçün ters çevrilmiş tibbi və bioloji mikroskop Eclipse aksesuarları ilə: Ti-E stendli, TIRF işıqlandırıcı ilə, A1 konfokal modulu və fırlanan disk əsaslı konfokal. modul.
Bütün xəbərlər"
Margolin 389p.
Optik mikroskopiyada həm texnikanın, həm texnologiyanın, həm də informasiya və kompüter texnologiyalarının bütün nailiyyətlərindən istifadə edilmişdir. Bu, mövcud avadanlıqların və onlardan istifadə üsullarının əhəmiyyətli dərəcədə təkmilləşdirilməsinə səbəb oldu, bu da öz növbəsində yeni metodların, xüsusən də konfokal mikroskopiyanın yaranmasına səbəb oldu. Konfokal mikroskop klassik optik mikroskopdan onunla fərqlənir ki, hər an obyektin bir nöqtəsinin təsviri qeydə alınır və skan etməklə (nümunənin hərəkət etdirilməsi və ya optik sistemin yenidən qurulması) tam təsvir qurulur. Beləliklə, elektron mikroskopiyasının skan edilməsi prinsipi unikal formada həyata keçirilir ki, bu da hər bir ayrı-ayrı nöqtədən gələn siqnalı istədiyiniz qədər qeyd etməyə və emal etməyə imkan verir.
Klassik mikroskopda nümunənin müxtəlif nöqtələrindən gələn işıq fotodetektora daxil olur. Konfokal mikroskopda yalnız bir nöqtədən işığı qeyd etmək üçün obyektiv linzadan sonra kiçik diafraqma yerləşdirilir ki, təhlil edilən nöqtənin buraxdığı işıq diafraqmadan keçsin və qeydə alınsın. Qalan nöqtələr əsasən diafraqma tərəfindən bloklanır, Şəkil 1-də göstərildiyi kimi. 7.28.
düyü. 7.28. Konfokal optik mikroskopda şüa ötürülməsi sxemi
Başqa bir xüsusiyyət ondan ibarətdir ki, işıqlandırıcı baxış sahəsinin vahid işıqlandırması yaratmır, işığı təhlil edilən nöqtəyə yönəldir. Buna nümunənin arxasına ikinci fokuslama sistemi yerləşdirməklə nail olmaq olar, lakin bu, nümunənin şəffaf olmasını tələb edir. Bundan əlavə, obyektiv linzalar adətən bahalıdır, ona görə də işıqlandırma üçün ikinci fokuslama sistemindən istifadə etmək az üstünlük təşkil edir. Alternativ olaraq, həm düşən, həm də əks olunan işığın bir obyektiv tərəfindən fokuslanması üçün şüa ayırıcıdan istifadə etmək olar. Bu sxem həm də tənzimləməni asanlaşdırır.
İndi konfokal mikroskopiyadan istifadə edərkən kontrastın necə və necə kəmiyyətcə dəyişdiyini nəzərdən keçirək. İşıq konfokal mikroskopda linzadan iki dəfə keçdiyi üçün nöqtə bulanıqlığı funksiyası (bundan sonra PSF adlandırılacaq) fotonun koordinatları ilə bir nöqtəyə dəyməsi və ya bu nöqtədən fotonun aşkarlanması ilə bağlı müstəqil ehtimalların məhsulu olacaqdır.
Rezolyutsiya meyarından istifadə etsək, konfokal mikroskopda ayırdetmə qabiliyyəti artır, lakin əhəmiyyətli dərəcədə deyil. Konfokal mikroskop üçün r həlli üçün bir ifadəmiz var:
Ənənəvi mikroskop üçün isə:
Bununla belə, konfokal mikroskopun əsas üstünlüyü Rayleigh meyarının mənasında ayırdetmə qabiliyyətinin artması deyil, kontrastın əhəmiyyətli dərəcədə artmasıdır. Xüsusilə, fokus müstəvisində şərti PSF üçün birinci tərəfdəki maksimumdakı amplitudanın mərkəzdəki amplituda nisbəti 2%, konfokal mikroskop üçün isə bu nisbət 0,04% olacaqdır. Buradan belə nəticə çıxır ki, intensivliyi, məsələn, parlaq bir obyektinkindən 200 dəfə az olan tutqun bir cismi adi mikroskopda aşkar etmək mümkün deyil, baxmayaraq ki, obyektlər arasındakı məsafə Rayleigh meyarında nəzərdə tutulmuş məsafədən əhəmiyyətli dərəcədə böyük ola bilər. . Eyni zamanda, belə bir obyekt konfokal mikroskopda yaxşı qeyd edilməlidir.
Əhəmiyyətli bir parametr, şüalanma və toplayıcı linzaların fokus müstəvisindəki diyaframların ölçüsüdür. Obyekt müstəvisindəki diyaframın təsviri fotodetektor tərəfindən işığın hansı bölgələrdən aşkar edildiyini müəyyən edir. Aydındır ki, diyafram ölçüsünün azaldılması ötürülən işığın miqdarının azalmasına gətirib çıxarır, səs-küy səviyyəsini artırır və nəticədə əldə edilən kontrast faydalarını inkar edə bilər. Beləliklə, diyafram ölçüsünün optimal seçimi və ağlabatan bir kompromis haqqında sual yaranır.
Açıq nöqtədən daha kiçik bir çuxur ölçüsü olan bir diafraqma sadəcə intensivliyin itirilməsi ilə nəticələnir və həllediciliyə heç bir təsir göstərmir. Tək nöqtəli Havalı diyafram obyektiv lensin həlledici gücündən maksimum istifadə etməyə imkan verir. Bununla belə, açılış ölçüsü Airy nöqtəsindən təxminən 3-5 dəfə böyük olan diafraqma ən uyğun kompromis kimi görünür. Anlamaq lazımdır ki, burada müzakirə olunan ölçü obyekt müstəvisində təsvirin ölçüsünə aiddir və buna görə də diyafram dəliyinin faktiki ölçüsü lensin böyüdülməsindən asılıdır. Xüsusilə, 100x lens istifadə edərkən, 1 mm diyaframı olan bir diyafram obyekt müstəvisinə 10 mikron radiuslu bir dairəyə proyeksiya edəcəkdir.
Konfokal mikroskopiya ideyasının inkişafı, müşahidə olunan obyektlərin formasını və məkan quruluşunu təhlil etmək üçün daha həssas və metroloji cəhətdən ciddi üsullara ehtiyacdan qaynaqlanan konfokal lazer skan edən mikroskopun (KJICM) inkişafı idi. Əsas funksional əlaqələri olan CLSM-nin sxematik diaqramı Şek. 7.29.
CLSM-in əsas xüsusiyyəti tədqiq olunan obyektin yüksək ayırdetmə və aşağı səs-küy səviyyəsi ilə lay-lay təsvirinin mümkünlüyüdür. Bu, obyektin ardıcıl mənbədən fokuslanmış işıq şüası ilə addım-addım skan edilməsi və ya xüsusi flüoresan zondlar və işıq axınının məhdudlaşdırılması üçün xüsusi üsullardan istifadə edərək səhnənin hərəkət etdirilməsi ilə əldə edilir.
düyü. 7.29. KJICM-in blok diaqramı:
1 - skaner cədvəli; 2 - sınaq nümunəsi; 3, 6 - linzalar; 4 - tarama cihazı; 5 - şüa ayırıcı lövhə; 7, 9 - iynə diafraqmaları; 8 - radiasiya qəbuledicisi; 10 - lazer; 11 - İdarəetmə bloku; 12 - kompüter; 13 - ox skan edən sürücü z.
Ölçüləri mikroskopun böyüdülməsi və dalğa uzunluğu ilə əlaqələndirilən CLSM-də pinhole diaphragmanın istifadəsi ayırdetmə qabiliyyətini 10% -dən çox artırmağa imkan verir. Aydındır ki, CLSM-in həlli və müvafiq olaraq incə strukturları təhlil etmək imkanları nümunənin nazik bir şüa ilə skan edilməsi şəraitində adi mikroskopun oxşar imkanlarını 40% -dən çox ola bilməz. KLCM-nin həlli mikroskopiya üsulundan və işıqlandırmadan asılıdır. KLCM həlli müəyyən edilir həm optik sistem, həm də elektron yol informasiya emalı. Buna görə də, KLCM-in layihələndirilməsində onun sxemləri, optik sistemin həlli, skan etmə addımı, detektorun xüsusiyyətləri kimi parametrlər əlaqələndirilməli, optimal emal alqoritmləri və müvafiq proqram təminatı seçilməlidir.
Ümumiyyətlə, KLCM sahəsinin dərinliyi diafraqma, dalğa uzunluğu, işıq mənbələrinin uyğunluğu və pin diafraqmasının ölçüsündən asılıdır. İynə diafraqması KLCM-ni digər mikroskop növlərindən fərqləndirən əsas dizayn elementidir. İğne diafraqmaları fokus müstəvisi ilə üst-üstə düşməyən və ya fokus müstəvisində obyektin təhlil edilən elementinin yanında yerləşən nöqtələrdən təsvirin formalaşma müstəvisinə daxil olan işığın maksimum və ya tam filtrasiyası üçün şərait yaratmaq üçün nəzərdə tutulmuşdur.
Optimal iynə diafraqma diametrinin seçilməsi tələb olunan cihazın xüsusiyyətlərini əldə etmək üçün vacibdir. KJICM-in yanal rezolyusiyasını və sahəsinin dərinliyini qiymətləndirmək üçün əlaqələr, iynə diafraqmasının işıqlı bir nöqtə olan kiçik bir diyaframa sahib olduğu fərziyyəsi ilə əldə edilir. Əslində, iynə diafraqmasının ölçüsü sonludur və cihazın eninə qətnaməsi və ox boyunca fokus müstəvisinə nisbətən sürüşdürülmüş nümunənin işıqlandırılmış elementlərinin parlaqlığı ondan asılıdır. z, və sahə dərinliyi. Kiçik iynə diafraqma diametrləri ilə işıq axını azalır, bu da siqnalın səs-küy nisbətini azaldır və kontrastı azaldır. Daha böyük diametrlərdə iynə diafraqmasının effektivliyi diyaframı azaltmaqla azalır.
Əsas anlayış
Minsk patentindən konfokal nöqtə sensoru prinsipi
Konfokal mikroskopiya prinsipi 1957-ci ildə Marvin Minsky tərəfindən patentləşdirilmişdir və ənənəvi geniş sahəli flüoresan mikroskopların bəzi məhdudiyyətlərini aradan qaldırmağa çalışır. Adi (yəni geniş sahəli) flüoresan mikroskopda bütün nümunə işıq mənbəyindən gələn işıqla bərabər şəkildə su altında qalır. Nümunənin optik yoldakı bütün hissələri eyni vaxtda həyəcanlanır və nəticədə yaranan flüoresan, fokusdan kənar böyük fon hissəsi də daxil olmaqla, fotodetektor mikroskop və ya kameralar vasitəsilə aşkar edilir. Bunun əksinə olaraq, konfokal mikroskop işıqlandırma nöqtəsindən (nöqtə yayılma funksiyasına baxın) və siqnalın fokusunu aradan qaldırmaq üçün detektorun qarşısında optik birləşmiş müstəvidə kiçik bir dəlikdən istifadə edir - "konfokal" adı bu konfiqurasiyadan gəlir. Fokus müstəvisinə çox yaxın olan flüoresans tərəfindən yayılan işıq aşkar edildikdə, optik ayırdetmədə, xüsusən də nümunənin dərinlik istiqamətində təsvir geniş sahəli mikroskoplardan daha yaxşı olur. Bununla belə, nümunədən gələn flüoresan işığın çoxu ponksiyonla bloklandığından, bu artan ayırdetmə siqnal intensivliyinin azalması hesabına baş verir - buna görə də çox vaxt uzun məruz qalma tələb olunur. Sonra bu siqnal düşməsini kompensasiya etmək üçün ponksiyonİşığın intensivliyi həssas bir detektor, adətən fotoçoxaltma borusu (PMT) və ya uçqun fotodiodundan istifadə edərək, işıq siqnalını kompüter tərəfindən qeydə alınan elektrik siqnalına çevirərək aşkar edilir.
Nümunənin bir nöqtəsi bir dəfə işıqlandırıldıqdan sonra nümunədə adi raster (yəni, paralel skan xətlərinin düzbucaqlı nümunəsi) üzərində 2D və ya 3D təsvirlərin skan edilməsi tələb olunur. Şüa üfüqi müstəvidə bir və ya bir neçə (servo-nəzarətli) salınan güzgülərdən istifadə etməklə nümunə üzrə skan edilir. Bu skanlama metodu ümumiyyətlə aşağı reaksiya gecikməsinə malikdir və tarama sürəti dəyişə bilər. Yavaş tarama daha yaxşı siqnal-küy nisbəti təmin edir, nəticədə daha yaxşı kontrast və yüksək ayırdetmə təmin edilir.
Əldə edilə bilən fokus müstəvisinin qalınlığı, ilk növbədə, istifadə olunan işığın dalğa uzunluğu, bu lensin ədədi diyaframı ilə bölünməsi, həm də nümunənin optik xüsusiyyətləri ilə müəyyən edilir. İncə optik kəsiklər bu tip mikroskopları 3D təsvirdə və nümunələrin səthinin profilində xüsusilə yaxşı edir.
Ardıcıl dilimlər ya 3D təsvir yaratmaq üçün müəyyən proqram təminatı tərəfindən emal edilə bilən, ya da 2D yığınına birləşdirilə bilən "Z-stack" təşkil edir (əsasən maksimum piksel intensivliyi götürülür; digər ümumi üsullar standart istifadəni əhatə edir. sapma və ya piksel yığılması).
Konfokal mikroskopiya minimum nümunə hazırlama və yanal ayırdetmədə az təkmilləşdirmə ilə bütöv, yağlı və canlı nümunələrin birbaşa, qeyri-invaziv, seriyalı optik kəsimini təmin edir. Seçilmiş obyektlərin görünməsi üçün bioloji nümunələr tez-tez flüoresan boyalarla müalicə olunur. Bununla belə, bioloji sistemlərin pozulmasını minimuma endirmək üçün faktiki boya konsentrasiyası aşağı səviyyədə saxlanıla bilər: bəzi alətlər fərdi flüoresan molekulları izləyə bilər. Bundan əlavə, transgen üsulları öz kimerik flüoresan molekullarını istehsal edən orqanizmlər yarada bilər (məsələn, GFP, yaşıl flüoresan zülal, maraq doğuran zülal ilə birləşmə). Konfokal mikroskoplar nümunədə nöqtə həyəcanlanması (nöqtə ilə məhdudlaşan difraksiya) və yaranan flüoresan siqnal nöqtəsinin aşkarlanması prinsipi əsasında işləyir. Detektorun üzərindəki sancaq dəliyi fokusdan kənar flüoresansa mane olan fiziki bir maneə təmin edir. Yalnız fokus və ya Airy diskinin mərkəzi nöqtəsi qeydə alınır. Raster nümunəni bir nöqtədə skan edin, eyni zamanda Z-fokusunu sadəcə dəyişdirməklə nazik optik bölmələrin toplanmasına imkan verir. Nəticədə alınan şəkillər nümunənin 3D görüntüsünü yaratmaq üçün yığıla bilər.
Üfüqi skan üçün istifadə olunan üsullar
Dörd növ konfokal mikroskop ticari olaraq mövcuddur:
Konfokal lazer skan edən mikroskoplar lazeri nümunəyə skan etmək və sabit sancaq dəliyi və detektor vasitəsilə təsviri "deskan etmək" üçün çoxlu güzgülərdən (adətən x və y oxu boyunca xətti olaraq 2 və ya 3 skan edir) istifadə edir.
Faydaları
CLSM hüceyrə biologiyası və genetikadan mikrobiologiya və inkişaf biologiyasına qədər bir çox bioloji elmi fənlərdə geniş istifadə olunur. O, həmçinin kvant optikası və nanokristal görüntüləmə və spektroskopiyada istifadə olunur.
Biologiya və Tibb
Hüceyrə boyunca aktin filamentlərinin paylanmasını göstərən konfokal mikroskop şəkillərinin yığını nümunəsi.
Klinik olaraq, CLSM müxtəlif göz xəstəliklərinin qiymətləndirilməsində istifadə olunur və buynuz qişada endotel hüceyrələrinin görüntülənməsi, keyfiyyət analizi və kəmiyyətinin müəyyən edilməsi üçün xüsusilə faydalıdır. Keratomikoz hallarında kornea stromasında filamentli göbələk elementlərinin mövcudluğunu lokallaşdırmaq və müəyyən etmək üçün istifadə olunur, bu, sürətli diaqnoz qoymağa və bununla da qəti müalicənin erkən qurulmasına imkan verir. Endoskopik prosedurlar (endomikroskopiya) üçün CLSM üsullarının tədqiqi də ümid verir. Əczaçılıq sənayesində dərmanların paylanmasının keyfiyyətinə və vahidliyinə nəzarət etmək üçün nazik əczaçılıq film formalarının istehsal prosesinə nəzarət etmək tövsiyə edilmişdir.
Optika və kristalloqrafiya
CLSM bəzi 3D optik məlumat saxlama sistemlərində məlumat axtarış mexanizmi kimi istifadə olunur və Magdalena papirusunun yaşını təyin etməyə kömək etmişdir.
Seçimlər və təkmilləşdirmə
Təkmilləşdirilmiş eksenel ayırdetmə
Nöqtə yayma funksiyası bir nöqtə ellipsoiddir, uzunluq bir neçə dəfə genişdir. Bu, mikroskopun eksenel ayırdetmə qabiliyyətini məhdudlaşdırır. Bunu aradan qaldırmaq üçün bir üsul 4π mikroskopiyasıdır, burada hadisə və yayılan işıq və ya ellipsoidin həcmini azaltmaq üçün nümunənin həm yuxarı, həm də aşağı hissəsinə müdaxilə edə bilər. Alternativ texnika konfokal mikroskopiya teta. Bu texnikada işıqlandırıcı işığın konusu və aşkarlama işığı bir-birinə bucaq altında yerləşdirilir (onlar perpendikulyar olduqda ən yaxşı nəticələr verir). İki handikap funksiyasının kəsişməsi daha kiçik effektiv nümunə həcmi verir. Bundan tək müstəvili işıqlandırma mikroskopu yarandı. Əlavə olaraq, eksperimental olaraq əldə edilmiş nöqtə yayılma funksiyasından istifadə edərək dekonvolyutsiya fokusdan kənar işığı aradan qaldırmaq, həm eksenel, həm də yan müstəvilərdə kontrastı yaxşılaşdırmaq üçün istifadə edilə bilər.
Super rezolyusiya
Stimullaşdırılmış emissiya tükənməsi mikroskopiyası (STED) kimi difraksiya həddinin altında həllediciliyə nail olan konfokal variantlar var. Bu texnika ilə yanaşı, palma, (e)STORM, SİM kartlar və s. kimi geniş çeşidli digər (konfokal əsaslı olmayan) super həlledici üsullar mövcuddur. Onların hamısının üstünlükləri var, məsələn, istifadə rahatlığı, həlli və xüsusi avadanlıq, bufer və ya flüorofor ehtiyacı.
Aşağı Temperatur Performansı
Aşağı temperaturda nümunələrin görüntülənməsi üçün iki əsas yanaşma istifadə edilmişdir, hər ikisi lazer skan edən konfokal mikroskopiya əsaslı arxitekturadır. Bir yanaşma davamlı axın kriostatından istifadə etməkdir: yalnız nümunə aşağı temperaturda saxlanılır və şəffaf pəncərə vasitəsilə optik olaraq ünvanlanır. Digər mümkün yanaşma optikanın bir hissəsini (xüsusilə də obyektiv mikroskop) kriogen saxlama Devar kolbasına yerləşdirməkdir. Bu ikinci yanaşma, daha çətin olsa da, daha yaxşı mexaniki dayanıqlığa zəmanət verir və pəncərə səbəbindən itkilərin qarşısını alır.
Şəkillər
Nipkow diskinin konfokal mikroskopiyası ilə ölçülən 1 avroluq sikkənin səthinin qismən profili.
1 avro sikkə üçün məlumatların əks olunması.
hekayə
Başlanğıc: 1940-1957
Birinci konfokal skan edir Mikroskop 1955-ci ildə Marvin Minskow tərəfindən hazırlanmış və 1957-ci ildə patent verilmişdir. Fokus müstəvisinin işıqlandırma nöqtəsinin skan edilməsi səhnəni hərəkət etdirərək əldə edilmişdir. Heç bir elmi nəşr təqdim edilmədi və ondan hazırlanmış heç bir təsvir qorunmadı.
Tandem skan edən mikroskop
Petran tandem skan mikroskopunun sxemi. Nipkow diskini göstərmək üçün qırmızı çubuq əlavə edildi.
1960-cı ildə Pilsendəki Çarlz Universitetinin Çexoslovakiya Mojmir Petran Tibb Fakültəsi ilk kommersiyalaşdırılmış konfokal mikroskop olan Tandem tarama mikroskopunu inkişaf etdirdi. O, Çexoslovakiyada və ABŞ-da Tracor-North (sonradan NORAN) tərəfindən kiçik bir şirkətə satıldı və çoxsaylı mikro deşik həyəcanları və emissiyaları yaratmaq üçün fırlanan Nipkow diskindən istifadə etdi.
Çexoslovak patenti 1966-cı ildə Çexoslovakiyalı həmkarı Petran və Milan Hadravski tərəfindən verilmişdir. Bu mikroskopla əldə edilən məlumat və şəkillərlə ilk elmi nəşr 1967-ci ildə Yale Universitetindən M. David Egger və Petranın müəllifi olduğu "Science" jurnalında dərc edilmişdir. Bu məqalənin qeydində Petranın mikroskopu dizayn etdiyi və onun tikintisinə nəzarət etdiyi və qismən Yel Universitetində "tədqiqat işçisi" olduğu qeyd edilir. 1968-ci ildəki ikinci nəşrdə alətin nəzəriyyəsi və texniki təfərrüatları təsvir edilmiş və əlavə müəlliflər kimi Yale Universitetində qrup rəhbəri Hadravski və Robert Qalambos olmuşdur. ABŞ patenti 1970-ci ildə verilmişdir. 1967-ci ildə təqdim edilib.
1969: İlk konfokal lazer skan edən mikroskop
1969 və 1971-ci illərdə Yale Universitetindən M. David Egger və Paul Davidovits, ilk konfokalları təsvir edən iki məqalə dərc etdilər. lazer skan edən mikroskop. Bu, skaner ləkəsi idi, yəni yalnız bir nöqtə işıqlandırması yaradıldı. Sinir toxumasını müşahidə etmək üçün epi-işıqlandırma-əks mikroskopiyasından istifadə edir. 633 nm dalğa uzunluğuna malik 5 mVt gücündə helium-neon lazer şəffaf güzgüdən gələn işığı hədəfə doğru əks etdirdi. Məqsəd fokus uzunluğu 8,5 mm olan sadə lens idi. Bütün əvvəlki və ən son sistemlərdən fərqli olaraq, nümunə fokus nöqtəsinin hərəkətinə səbəb olan bu lensi (skan edən hədəf) hərəkət etdirərək skan edilmişdir. Yansıtılan işıq şəffaf güzgüyə qayıtdı, ötürülən hissə başqa bir obyektiv tərəfindən nöqtə aşkarlanmasına yönəldildi, arxasına fotoçoğaltıcı boru yerləşdirildi. Siqnal bir CRT osiloskopu ilə vizuallaşdırıldı; elektron şüası eyni vaxtda hədəfə ötürüldü. Xüsusi cihaz Polaroid fotoşəkillərini çəkməyə imkan verdi, onlardan üçü 1971-ci ildə nəşr olunan bir nəşrdə yer aldı.
Müəlliflər in vivo tədqiqatlar üçün flüoresan boyalar üzərində düşünürlər. Minski patentinə istinad edirlər, o vaxt Nyu Yorkdakı Albert Eynşteyn Tibb Məktəbinin doktorantı Stiv Baer, burada "Minsky mikroskopu" ilə lazerdən istifadə etməyi təklif edən konfokal xətt tarama mikroskopunu inkişaf etdirdi və təşəkkür etdi. Qalambos, Hadravsky və Petrana onun mikroskopunun inkişafına səbəb olan müzakirələr üçün. Onların inkişafı üçün motivasiya o idi ki, Tandem skan edən mikroskopiyada işıqlandırıcı işığın yalnız 10-7 hissəsi gözün bir hissəsində təsvirin yaranmasında iştirak edir. Beləliklə, görüntü keyfiyyəti əksər bioloji tədqiqatlar üçün kifayət deyildi.
1977-1985: Lazerli spot skanerlər və səhnə taraması
1977-ci ildə Colin JR Sheppard və Tony Wilson konfokal epi-lazerlə işıqlandırılan, skan edən mərhələ və fotoçoğaltıcı boru detektorlarını təsvir etdi. Mərhələ optik ox (Z oxu) boyunca hərəkət etdirə bilər ki, bu da optik seriyalı bölmələrə imkan verir.
1979-cu ildə Fred Brakenhoff və onun həmkarları göstərdilər ki, optik kəsmə və təkmilləşdirilmiş ayırdetmənin nəzəri faydaları praktikada həqiqətən əldə edilə bilər. 1985-ci ildə bu qrup bioloji suallara cavab verə bilən konfokal mikroskopiya şəkillərini dərc edən ilk qrup oldu. Tezliklə daha bir çox qruplar texnoloji məhdudiyyətlər səbəbindən hələ də sirr olaraq qalan elmi suallara cavab vermək üçün konfokal mikroskopiyadan istifadə etməyə başladılar.
1983-cü ildə Oksforddan IJ Cox und S. Sheppard kompüterlə idarə olunan konfokal mikroskop haqqında ilk işi nəşr etdi. İlk kommersiya lazer skan edən mikroskopu, səhnə skaneri SOM-25 1982-ci ildən başlayaraq Oxford Optoelektronik (BioRad tərəfindən bir neçə TAKE çərçivə əldə etdikdən sonra) tərəfindən təklif edildi. O, Oksford qrupunun dizaynına əsaslanırdı.
1985-ci ildən: şüa skan edən lazer nöqtəli skanerlər
1980-ci illərin ortalarında William Bradshaw Amos və John Graham White və Kembricdəki Molekulyar Biologiya Laboratoriyasında çalışan həmkarları ilk konfokal şüa skan edən mikroskop qurdular. Nümunə mərhələsi hərəkət etmir, əksinə, ləkəni işıqlandırır və daha sürətli təsvir əldə etməyə imkan verir: hər biri 512 sətirlə saniyədə dörd şəkil. Şüa yolunun 1-2 metr uzunluğunda olması, diametri ~1 mm olan adi iris diafraqmasını "pinhole" kimi istifadə etməyə imkan verən aralıq şəkillər çox şişirdilmişdir. İlk mikroqraflar rəqəmsal kamera əlavə edilməzdən əvvəl filmə uzun müddət məruz qalma yolu ilə çəkilmişdir. Sonrakı təkmilləşdirmə ilk dəfə hazırlıq üçün miqyas almağa imkan verdi. Zeiss eyni vaxtda İsveç şirkəti Sarastro tərəfindən paylanmış kommersiya CLSM-ə səbəb oldu. Müəssisə 1990-cı ildə Molecular Dynamics tərəfindən alındı, lakin CLSM sonda dayandırıldı. Almaniyada 1984-cü ildə qurulan Heidelberg Instruments, əvvəlcə biologiyadan daha çox sənaye tətbiqləri üçün nəzərdə tutulmuş CLSM-i inkişaf etdirdi. Bu sənəd 1990-cı ildə Leica Lasertechnik-ə verilib. Zeiss artıq bazarda konfokal olmayan uçan spot lazer skan edən mikroskop idi və o, konfokal birinə təkmilləşdirildi. 1990-cı il hesabatında sadalanan "bəzi" istehsalçı konfokalları qeyd edildi: Sarastro, Texniki Alətlər, Meridian Alətləri, Bio-Rad, Leica, Tracor-Nordic və Zeiss.
1989-cu ildə Fritz Karl Preikschat oğlu Ekhard Preikschat ilə hissəcik ölçüsünün təhlili üçün lazer diod skan edən mikroskop icad etdi. O və Ekhard Preikschat kommersiyalaşdırmaq üçün Lasentec-in həmtəsisçisi oldular. 2001-ci ildə Lasentec Mettler Toledo (NYSE: MPD) tərəfindən alındı. Böyük təmizləmə sistemlərində kristallaşma prosesinin yerində nəzarəti təmin etmək üçün bütün dünyada, əsasən əczaçılıq sənayesində təxminən on min sistem quraşdırılmışdır.
- İki fotonlu həyəcan mikroskopiyası: Müvafiq texnologiyadan (hər ikisi lazer skan edən mikroskoplardan) istifadə etsələr də, çoxfotonlu flüoresan mikroskoplar qəti şəkildə konfokal mikroskoplar deyil. Müddət konfokal olması ilə əlaqədar yaranır diyafram V konjugat fokus müstəvisi(konfokal). Bu diafraqma adətən multifoton mikroskoplarda yoxdur.
- Ümumi daxili əks etdirən flüoresan mikroskop (TIRF) o
konfokal mikroskopiya- Virtual CLSM (Java əsaslı)
- Flüoresan və konfokal mikroskoplar da daxil olmaqla müxtəlif növ mikroskoplarda animasiya və izahat. (Université Paris Sud)
Əsas anlayışlar
Müasir alətlər ilkin versiyalardan əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənsə də, Marvin Minski tərəfindən irəli sürülən və 1957-ci ildə patentləşdirilmiş konfokal görüntüləmə prinsipi bütün müasir konfokal mikroskoplarda istifadə olunur. Ənənəvi geniş sahəli mikroskoplarda bütün nümunə civə və ya ksenon işıq mənbəyi ilə işıqlandırılır və görüntü ya vizual olaraq müşahidə edilir, ya da şəkil yazıcısına və ya foto plyonkaya proqnozlaşdırılır. Konfokal mikroskopla təsvirin formalaşması üsulu əsaslı şəkildə fərqlidir. İşıqlandırma, adətən lazer qövs mənbəyindən olan bir və ya daha çox fokuslanmış işıq şüaları ilə nümunənin bütün səthini skan etməklə həyata keçirilir. Nümunənin işıqlandırılmış sahəsi obyektiv tərəfindən fokuslanır və sonra kompüter tərəfindən idarə olunan skan cihazı ilə skan edilir. Nümunədən gələn işıq şüalarının ardıcıllığı, çıxışı kompüterdə göstərilən görüntüyə çevrilən fotoçoğaltıcı boru (PMT) tərəfindən sancaq deşikli diafraqma (və ya bəzi hallarda yarıq diafraqma) vasitəsilə aşkar edilir. Ləkələnməmiş nümunələr onlardan əks olunan işıqla müşahidə olunsa da, onlar adətən bir və ya bir neçə flüoresan boya ilə işarələnirlər.
Şəkil əldə etmə üsulları
Konfokal mikroskopiya çox sayda müxtəlif növ nümunələri araşdırmaq üçün müxtəlif təsvir üsullarından istifadə edir. Onların hamısı nisbətən qalın hissələr və ya bütün nümunə (bütün montaj) ardıcıllığı ilə optik bölmələr adlanan yüksək dəqiqlikli təsvirləri əldə etmək üçün texniki imkanlara əsaslanır. Optik dilim görüntünün əsas elementidir. Şəkillərin özləri tək, ikili, üçlü və çox dalğa uzunluğunda işıqlandırma rejimləri altında birləşdirilmiş və ləkələnmiş nümunələri müşahidə etməklə əldə edilir və müxtəlif işıqlandırma və rəngləmə üsullarından istifadə etməklə yaradılan şəkillər bir-biri ilə dəqiq əlaqələndiriləcəkdir. Canlı hüceyrənin təsvirlərini və şəkillərin müvəqqəti açılmış ardıcıllığını (müəyyən vaxt intervalında təsvirlərin qeydiyyatı) əldə etmək mümkündür və təsvir ardıcıllığına tətbiq olunan ədədi emal üsulları z- seriyasından inteqrasiya olunmuş bütöv təsvir yaratmağa imkan verir. ox şəkilləri və nümunələrin üçölçülü təsvirləri, həmçinin üçölçülü məlumatların zaman ardıcıllığında təqdim edilməsi, yəni dördölçülü təsvir. Erkən konfokal mikroskoplar əks olunan işıqdan istifadə edərək təsvir edilmişdir, lakin əslində, lazer skan edən konfokal mikroskop, mikroskopiyada geniş istifadə olunan hər hansı ötürülən işıq mənbəyindən istifadə edərək şəkil çəkmək üçün istifadə edilə bilər.
Şəklin yaradılması
Nümunələrin hazırlanması və konfokal mikroskoplarla görüntülənməsi prosedurları, əsasən, ənənəvi geniş sahəli mikroskopiyada illər ərzində işlənib hazırlanmış prosedurlardır. Biotibbdə konfokal mikroskopiyanın əsas tətbiqi adətən bir və ya bir neçə flüoresan etiketlə boyanmış bağlı və ya canlı hüceyrələrin və toxumaların təsviridir. Nisbətən sadə protokollara daxil edilə bilən və xüsusi hüceyrə orqanoidlərini və strukturlarını ləkələmək üçün istifadə edilə bilən çox sayda müxtəlif flüoresan boyalar var. Mövcud boyaların böyük çeşidi arasında, məsələn, nüvə, Golgi aparatı, endoplazmatik retikulum, mitoxondriya üçün boyalar, həmçinin hüceyrələrdə polimerləşmiş aktini göstərən floresan phalloidin kimi boyalar var. İstifadə olunan nümunənin hazırlanması üsulundan asılı olmayaraq, konfokal mikroskopiyanın əsas üstünlüyü birdən çox təsvirin eyni vaxtda alınması və onların kompüterdə rəqəmsal təqdim edilməsi nəticəsində yaranan təsvirin təqdimatı və təhlilində çeviklikdir.
Konfokal mikroskopiyanın kritik aspektləri
Flüoresan mikroskopiyada kəmiyyət 3D təsviri çox vaxt nəzarət edilən və nəzarət olunmayan eksperimental kəmiyyətlər və ya mikroskopun yerləşdirilməsi və tərtibatı ilə bağlı problemlər səbəbindən nümunənin hazırlanması zamanı təqdim edilən artefaktlarla çətinləşir. Doktor James B. Pauley tərəfindən yazılmış bu məqalə, geniş sahəli flüoresan və konfokal mikroskopiyada əldə edilən nəticələri tez-tez qaranlıq edən ən ümumi xarici amilləri sistemləşdirir. Müzakirə olunan mövzulara lazer sistemi, optik komponentlərin uyğunlaşdırılması, obyektiv böyütmə, ağartma artefaktları, aberrasiyalar, immersion yağ, örtük qalınlığı, kvant səmərəliliyi və nümunə mühiti daxildir.
Çox rəngli konfokal mikroskopiyada aberrasiyalar
Dizayn təkmilləşdirmələri konfokal mikroskopiyanı o qədər sadələşdirdi ki, o, hüceyrə biologiyasının tədqiqatı üçün ümumi alətə çevrildi. Lakin konfokal mikroskoplar gücləndikcə onların optikasına daha çox tələblər qoyuldu. Əslində, geniş sahəli mikroskopiyada kiçik təsvir qüsurlarına səbəb olan optik aberrasiyalar konfokal mikroskopiyada dağıdıcı təsirlərə malik ola bilər. Təəssüf ki, konfokal mikroskopiyanın sərt optik tələbləri çox vaxt zəif mikroskopla belə kəskin təsvirlərə zəmanət verən optik sistemlər tərəfindən gizlədilir. Optik istehsalçıları xüsusi tətbiqlər üçün nəzərdə tutulmuş bir çox müxtəlif mikroskop linzaları istehsal edirlər. Bu məqalə obyektiv mübadilələrin konfokal mikroskopiyaya necə təsir etdiyini göstərir.
Konfokal mikroskopda üç rəngli görüntüləmə
Lazer skan edən konfokal mikroskop (LSCM) adətən bir, iki və üç etiketlə etiketlənmiş flüoresan nümunələrin rəqəmsal şəkillərini əldə etmək üçün istifadə olunur. Qırmızı, yaşıl və mavi (RGB) rənglərin istifadəsi hər bir nisbi mövqe üçün tamamlayıcı rəng istifadə edildikdə və müxtəlif rənglərin təsvirləri tək üçlü şəkil təşkil etdikdə üç flüoresan hüceyrə işarəsinin işıq paylanmasını təmsil etmək üçün ən informativdir. rəng nümunəsi. Bu bölmədə biz məşhur şəkil emal proqramı olan Adobe Photoshop-dan istifadə edərək üç rəngli konfokal təsvirləri əldə etmək üçün bu yaxınlarda dərc edilmiş metodun sadələşdirilmiş versiyasına baxacağıq. Bundan əlavə, konfokal görüntü təqdimatı üçün üç rəngli təsvir protokolu yaratmaq üçün bir neçə proqram müzakirə olunur. Nəzərə almaq lazımdır ki, bu ədədi üsullar LSCM şəkilləri ilə məhdudlaşmır və başqa mənbələrdən Photoshop-a idxal edilən rəqəmsal şəkillərə tətbiq oluna bilər.
Konfokal əks etdirən mikroskopiyanın əsasları
Konfokal əks etdirici mikroskopiya nisbətən az əlavə səylə nümunə haqqında əlavə məlumat əldə etmək üçün istifadə edilə bilər, çünki üsullar minimum nümunənin hazırlanması və avadanlıqların dəyişdirilməsini tələb edir. Bundan əlavə, konfokal əks etdirən mikroskopiya ilə ləkələnməmiş toxumalardan alınan məlumatlar işığı əks etdirən ləkələnmiş nümunələrdən əldə edilən məlumatlar kimi asanlıqla əldə edilir. Bu üsul daha çox yayılmış flüoresan görüntüləmə üsulları ilə də birləşdirilə bilər. Son tətbiqlərə misal olaraq flüoresanla boyanmış hüceyrələrin populyasiyasında ləkələnməmiş hüceyrələrin qeydə alınması və qeyri-şəffaf strukturlaşdırılmış substratda böyüyən flüoresanla boyanmış hüceyrələr arasında qarşılıqlı əlaqənin müşahidə edilməsi daxildir.
Konfokal Şəkil Qalereyası
Nikon MicroscopyU Konfokal Şəkil Qalereyası Eclipse E-600 dik mikroskopu ilə birləşdirilmiş Nikon PCM-2000 konfokal mikroskopundan istifadə etməklə əldə edilən rəqəmsal təsvirlər ardıcıllığıdır. Mikroskopun optik oxu boyunca skan etməklə nümunənin müxtəlif müstəvilərində optik kəsiklərin təsvirlərinin ardıcıllığı əldə edilmişdir. Ardıcıllıq ya avtomatik olaraq bir sıra dilimləri “oynamağa” və ya slaydlar kimi onları irəli-geri sürüşdürməyə imkan verən interaktiv Java proqramı ilə təmsil olunur.
Lazer skan edən konfokal mikroskopiya
Tipik olaraq mikroskoplar tərəfindən istehsal olunan qalın nümunələrin şəkillərinə xas olan zəif kontrast fenomenini aradan qaldırmaq üçün bir neçə üsul hazırlanmışdır. Konfokal və dekonvolyutsiya üsulları orta qalınlıqdakı nümunələrin (5-15 mikron) əhəmiyyətli dərəcədə yaxşı şəkillərini yaradır. Ən qalın nümunələrin şəkilləri (20 mikron və ya daha çox) fokusdan kənar ərazilərdən yüksək mühit işığına məruz qaldıqda pisləşir və bəlkə də ən yaxşı şəkildə konfokal mikroskopiya üsulları ilə əldə edilir. Bu təlimatdan istifadə edərək nümunələr virtual konfokal mikroskopdan istifadə edərək z oxu boyunca bir sıra optik bölmələr kimi təqdim olunur.
Yansıtma konfokal mikroskopiyası
İnteqral sxemlərin fərdi səth təbəqələrini araşdırmaq üçün bu təlimatdan istifadə edin. Rəhbərlik üçün rəqəmsal şəkillər Nikon Optiphot C200 əks etdirən konfokal mikroskopdan istifadə etməklə əldə edilmişdir. Mikroskop silisium kristalının səthindəki sxemlərin mozaikasına (1 mikrometrlik artımlarla) nüfuz etdikcə və fokuslanarkən hər bir seriya üçün z oxu boyunca optik kəsiklər ardıcıllığı qeyd edildi.
Əsas müddəalar
Ənənəvi mikroskopiya ilə müqayisədə konfokal mikroskopiya bir sıra üstünlüklərə malikdir, o cümlədən tədqiq olunan nümunəyə dayaz nüfuz dərinliyi, fon işıqlandırmasının olmaması və qalın nümunələrin bir sıra optik bölmələrini əldə etmək imkanı. Biotibbdə konfokal mikroskopiyanın əsas tətbiqi, adətən bir və ya daha çox flüoresan etiketlə etiketlənən bağlı və ya canlı hüceyrə və toxumaların təsviridir.
düyü. 1. Konfokal mikroskopiyada şüa yolunun sxemi
Ənənəvi geniş sahəli mikroskopla flüoresan nümunələri təsvir edərkən, tədqiqatdan kənar ərazilərdən nümunə tərəfindən buraxılan ikincil lüminesans çox vaxt fokusda olan xüsusiyyətlərin təsvirinin aydınlığına təsir göstərir. Bu, qalınlığı 2 mikrometrdən çox olan nümunələr üçün xüsusilə problemlidir. Konfokal mikroskopiya həm eksenel, həm də müstəvidə ayırdetmədə təvazökar təkmilləşdirmələr təmin edir; Lakin bu tədqiqat metodunun populyarlığının son zamanlarda artmasına səbəb olan böyük qalınlığın flüoresan ləkəli nümunələrində baş verən fon işığını aradan qaldırmaq qabiliyyətidir. İstifadəsi nisbətən asan olduğundan, əksər müasir konfokal mikroskoplar bir çox çox istifadəçi görüntüləmə sistemlərində əsas avadanlıqların bir hissəsinə çevrilmişdir. Lazer skan edən konfokal mikroskop (LSCM) tərəfindən əldə edilən ayırdetmə ənənəvi geniş sahəli optik mikroskopdan bir qədər yaxşı, lakin hələ də ötürücü elektron mikroskopunun ayırdetmə qabiliyyətindən əhəmiyyətli dərəcədə aşağı olduğu üçün, o, müəyyən mənada, mikroskoplar arasında körpü olmuşdur. Ən çox yayılmış iki tədqiqat metodu. Şəkil 1 əsas konfiqurasiyalı konfokal mikroskopda işığın keçməsinin sxematik diaqramını göstərir.
Ənənəvi geniş sahəli mikroskoplarda bütün nümunə civə və ya ksenon işıq mənbəyi ilə işıqlandırılır və görüntü ya vizual olaraq müşahidə edilir, ya da görüntüləyici və ya foto filmə proyeksiya edilir. Konfokal mikroskopla görüntü əldə etmək üsulu əsaslı şəkildə fərqlidir. Nümunə bir və ya bir neçə fokuslanmış şüa ilə, adətən lazerlə skan edilərək işıqlandırılır (Şəkil 2). Nümunəni skan etməklə əldə edilən təsvirlər beləliklə optik kəsiklər adlanır. Bu terminologiya nümunənin fiziki olaraq parçalanması ilə deyil, fokuslanmış işıqdan istifadə etməklə şəkillərin əldə edildiyi qeyri-invaziv sınaq texnikasına aiddir.
düyü. 2. Nümunələrin geniş sahəli və spot skan edilməsi
Konfokal mikroskopiya canlı nümunələrin tədqiqini xeyli sadələşdirib, üç ölçülü (z seriyası) məlumat əldə etməyə imkan verib və çoxboyanmış nümunələrin təsviri prosesini təkmilləşdirib. Şəkil 3 ənənəvi episkopik flüoresan şəklini propidium yodidlə boyanmış epiteli ilə bütöv bir kəpənək pupasının eyni hissələrinin konfokal təsviri ilə müqayisə edir. Fokusdan kənar flüoresan emissiyanın aradan qaldırılması ilə əlaqədar olaraq, qətnamədə təsirli artım və nəticədə LSCM görüntüsündə nüvələrin təsvirinin kəskinliyi aydın görünür.
Lazer skan edən konfokal mikroskop (LSCM)
LSCM indi biotibbdə istifadə edilən konfokal mikroskopların ən geniş yayılmış versiyasıdır. Girişdə LSCM-ə xüsusi diqqət yetirilir, çünki bu mikroskopların dizaynı və quruluşu hətta təcrübəsiz istifadəçilərə də onlarla işləməyə imkan verir. Digər dizayn həlləri biologiyada öz xüsusi nişlərini tutdu. Konfokal mikroskopun hər hansı modeli və ya modifikasiyası üçün nümunənin hazırlanması qaydalarının əksəriyyəti kiçik dəyişikliklərlə, eləcə də dekonvolyutsiya və multifoton üsulları kimi optik bölmələrə əsaslanan digər üsullar tətbiq olunur.
Konfokal mikroskopiyanın inkişafı
Konfokal mikroskopun ixtirası 1955-ci ildə işləyən mikroskop yaradan Marvin Minskinin əmanətidir. Konfokal mikroskopiyanın inkişafı əsasən canlı toxumada (in vivo) bioloji prosesləri müşahidə etmək istəyi ilə bağlı idi və Minskinin məqsədi neyron şəbəkəni canlı beynin boyanmamış preparatında təsvir etmək idi. Minski tərəfindən irəli sürülən və 1957-ci ildə patentləşdirilmiş konfokal mikroskopiya prinsipləri bütün müasir konfokal mikroskoplarda istifadə olunur. Şəkil 1, flüoresan görüntüləmədə istifadə olunan bütün müasir konfokal sistemlərin əsasını təşkil edən epiflüoresan mikroskopiyaya tətbiq edilən konfokal prinsipi izah edir. Orijinal konfiqurasiyada Minsky, pinhole işıq mənbəyi kimi istifadə edilən sirkonium qövslü işıq mənbəyinin qarşısına yerləşdirilmiş sancaq dəliyindən (diafraqma) istifadə etdi.
düyü. 3. Kəpənək qanadının epiteli
Nöqtə mənbəyindən gələn işıq nümunədəki müəyyən bir fokus müstəvisində bir obyektiv tərəfindən nöqtə şəklində fokuslandı və ondan keçərək, ikinci bir obyektiv tərəfindən fokusda olan ikinci pin dəliyinə (pin dəliyinə) fokuslandı. birinci (onlar kofokal, yəni konfokal idi). İkinci sancaq dəliyindən keçən şüalar, nümunədən gələn işığın parlaqlığından asılı olaraq bir siqnal yaradan, aşağı səs-küylü fotoçoğaltıcı boruya dəydi. İkinci sancaq dəliyi fotoçoğaltıcı borudan nümunədəki fokus müstəvisinin yuxarısında və ya altındakı bölgələrdən gələn işığı kəsdi. Fokus müstəvisindən daha qalın nümunələrlə işləyərkən fokusdan kənar işığın və parıltının aradan qaldırılması üçün məkan filtrindən istifadə konfokal mikroskopiyanın əsas prinsipidir. Minski öz işində eyni zamanda dizaynı bu gün istifadə olunan sistemlərin əsasını təşkil edən tək lensli və dikromatik güzgülü əks etdirici mikroskopdan da bəhs etmişdir.
Konfokal görüntü əldə etmək üçün nümunəni bir nöqtəyə yönəldilmiş işıqla skan etmək lazımdır. Minsky tərəfindən yığılmış orijinal cihazda işıq şüası stasionar idi və nümunənin özü titrəmə mərhələsində hərəkət etdi. Mikroskopun optik oxuna nisbətən skan şüasının hərəkətsizliyi bu quraşdırmanın üstünlüyü idi, çünki o, təsviri təhrif edə biləcək əksər optik qüsurları aradan qaldırırdı. Bununla belə, bioloji nümunələri tədqiq edərkən, bu, dalğalanmalara və təhriflərə səbəb ola bilər, nəticədə qətnamənin və təsvirin aydınlığının itirilməsinə səbəb ola bilər. Üstəlik, səhnəni və nümunəni hərəkət etdirərkən, məsələn, floresan ləkələnmiş hüceyrələrin mikroinyeksiyaları kimi hər hansı bir manipulyasiya etmək mümkün deyil.
Ancaq nümunəni skan etmə üsulundan asılı olmayaraq, onun görüntüsünü əldə etmək lazımdır. Minskinin orijinal dizaynı isə real görüntü yaratmadı, çünki fotoçoxaltıcı borudan çıxan məhsul heç bir qeyd cihazı olmayan hərbçilər tərəfindən istifadə edilən uzun davamlı osiloskopa verilirdi. Minski daha sonra yazdı ki, onun təsvirlərinin keyfiyyətsiz olması mikroskopun özünün aşağı ayırdetmə qabiliyyəti ilə deyil, osiloskopun ekranının aşağı dəqiqliyi ilə bağlıdır. İndi aydın olur ki, texnologiya çatışmazlığı səbəbindən Minski konfokal metodun tam potensialını, xüsusən də bioloji strukturları təsvir edərkən tam olaraq nümayiş etdirə bilmədi. O, konfokal mikroskopiyanın çox tələbkar bioloqlar birliyi tərəfindən dərhal qəbul edilməməsinin səbəbi ola biləcəyinə diqqət çəkdi, nəticədə ortaya çıxan şəkillərin keyfiyyəti həmişə prioritet idi. O zaman onların ixtiyarında əla optikaya malik işıq mikroskopları var idi ki, bu da onlara yüksək həssas rəngli film üzərində parlaq rəngli histoloji bölmələri müşahidə etməyə və fotoşəkil çəkməyə imkan verirdi. Müasir konfokal mikroskoplarda təsvirlər fotoçoğaltıcı borudan gələn siqnallardan yaradılır və ya rəqəmsal yüklə birləşdirilmiş cihaz kamerası tərəfindən çəkilir, birbaşa kompüter görüntüləmə sistemi tərəfindən emal edilir və yüksək keyfiyyətli ekranda və təsvir sənədləşdirmə cihazında göstərilir. Müasir lazer skan edən konfokal mikroskopun diaqramı Şəkil 4-də göstərilmişdir.
düyü. 4. Müasir lazer skan edən konfokal mikroskopun sxemi
Optik mikroskopun əsas optikası onilliklər ərzində əsaslı şəkildə dəyişməyib, çünki alətin son qətnaməsi dalğa uzunluğu, obyektiv lens və nümunənin özünün xüsusiyyətləri ilə müəyyən edilir. Nümunələrin kontrastını artırmaq üçün istifadə olunan boyalar və digər optik mikroskopiya üsulları son 20 il ərzində əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşmışdır. Konfokal metodun yüksəlişi və təkmilləşdirilməsi optik mikroskopiyanın dirçəlişinin nəticəsi idi, böyük ölçüdə müasir texnologiyaların uğuru səbəb oldu. Minskinin dizaynından faydalana biləcək bir çox texnoloji irəliləyişlər tədricən bioloqlar və digər mikroskopistlər üçün əlçatan olur (və münasib qiymətə). Onların arasında təkmil nöqtəli işıq mənbələri kimi istifadə edilən sabit çoxtezlikli lazerlər, təkmilləşdirilmiş dixromatik güzgülər, həssas aşağı səs-küylü fotodetektorlar, gücləndirilmiş imkanlara malik yüksək sürətli mikrokompüterlər (yüksək tutumlu yaddaşın olması səbəbindən), mürəkkəb təsvir proqram təminatı, yüksək qətnamə monitorları və rəqəmsal printerlər.Bu texnologiyalar müstəqil şəkildə inkişaf etmiş və 1955-ci ildən tədricən konfokal görüntüləmə sistemlərinə inteqrasiya edilmişdir. Məsələn, rəqəmsal təsvirin emal üsulları ilk dəfə 1980-ci illərin əvvəllərində Woods Hole Okeanoqrafiya İnstitutunun tədqiqatçıları tərəfindən uğurla istifadə edilmişdir. "Video mikroskoplar" adlandırdıqları şeydən istifadə edərək, onlar optik mikroskopun nəzəri ayırdetmə limitindən kiçik mikrotubaların hüceyrə quruluşunun şəkillərini əldə edə bildilər. Rəqəmsal təsvir prosessoru ilə birləşdirilmiş yüksək həssaslıqlı super-silikon (SIT) videokamera tərəfindən çəkilmiş şəkillərin rəqəmsal optimallaşdırılması ilə aydın şəkildə təsvir artımı mümkündür. Hüceyrə strukturları diferensial müdaxilə kontrastının (DIC) optikası və sonrakı rəqəmsal görüntü emalından istifadə edərək vizuallaşdırıldı.
Konfokal mikroskop dizaynlarının təsnifatı adətən nümunənin skan edilməsi metoduna əsaslanır. İki əsas skan etmə üsulu var: səhnə skanı və işıq şüalarının skan edilməsi; və şüanı skan etməyin ən azı iki yolu. Minskinin orijinal aləti ibtidai tüninq çəngəl generatoru ilə idarə olunan səhnə skan sisteminə əsaslanırdı ki, bu da görüntünü olduqca yavaş istehsal edirdi. Prototiplərindən xeyli kənara çıxan səhnə skanına malik müasir konfokal qurğular əsasən materialşünaslıqda, məsələn, mikrokristalların istehsalında istifadə olunur. Bu prinsipə əsaslanan sistemlər son zamanlarda mikrokristallar üzərində DNT analizinin aparıldığı biotibbi sahələrdə məşhur olmuşdur.
Bioloji sistemlərin görüntülənməsi üçün daha praktik alternativ stasionar nümunəni şüa ilə skan etməkdir. Bu prinsip bir çox ölçmə sistemlərinin əsasını təşkil edir, onların təkmilləşdirilməsi bu gün məşhur olan tədqiqat mikroskoplarının yaranmasına səbəb olmuşdur. Biz bu girişdə konfokal mikroskopiyanın texniki təfərrüatlarına girmirik, lakin mahiyyət etibarilə o, iki əsas fərqli şüa skan etmə texnikasından istifadə edir: çox şüalı skan və tək şüalı skan. Tək şüa taraması bu gün ən çox yayılmışdır və LSCM-də məhz bu üsul istifadə olunur. Burada şüa galvanometrlər tərəfindən saniyədə bir kadr sürətlə idarə olunan kompüterlə idarə olunan güzgülərdən istifadə etməklə skan edilir. Təxminən video kadr sürətində daha sürətli skan etmək üçün bəzi sistemlər akusto-optik cihazdan və ya salınan güzgülərdən istifadə edir. Alternativ üsul, adətən fırlanan Nipkow diskinin variasiyasından istifadə edərək, yaxın real vaxt rejimində tarama üçün iki şüadan istifadə edir. Bu sistemlər flüoresanla ləkələnmiş nümunələrin təsviri üçün daha səmərəli modellər yaratmaq üçün tandem skan edən mikroskopların (TSM) modifikasiyası və təkmilləşdirilməsi nəticəsində əldə edilmişdir. Şəkil 5, real vaxt görüntüləri üçün zəif flüoresan emissiyaya həssaslığı artırmaq üçün qoşalaşmış Nipkow diskləri və mikrolinzaları olan belə inkişaf etmiş sistemi göstərir.
düyü. 5. Nipkow diskləri əsasında optik dizayn
Bu gün konfokal mikroskopiyada optik kəsiklər əldə etmək üçün iki alternativ üsul var: dekonvolyutsiya üsulu və multifoton. Onlar texniki cəhətdən fərqlənirlər, lakin konfokal üsullar kimi ənənəvi optik mikroskopiyaya əsaslanırlar. Dekonvolyutsiya təsvir yaratarkən fokusdan kənar sahələrdən gələn məlumatların hesablanması və silinməsi üçün hesablama alqoritmlərinə əsaslanır. Bu texnika səmərəli alqoritmlər və yüksək məhsuldar minikompüterlər sayəsində çox rahat olmuşdur. Multifoton mikroskopiyası LSCM ilə eyni skan etmə sistemindən istifadə edir, lakin qəbuledicidə pinhole diaphragma tələb etmir. Buna ehtiyac yoxdur, çünki lazer flüoroxrom işarəsini yalnız fokus nöqtəsində həyəcanlandırır və bununla da fokusdan kənar radiasiyanı aradan qaldırır. Canlı toxumanı müşahidə edərkən bu metodun əlavə üstünlükləri var, yəni: azaldılmış fotoağartma, çünki lazer şüası ilə ötürülən və nümunənin toxuması tərəfindən udulmuş enerjinin miqdarı azalır.
Ənənəvi optik mikroskop LSCM-nin qurulduğu əsasdır. Volfram və ya civə lampası əvəzinə, həssas fotoçoğaltıcı boruya (PMT) və skan edən güzgüləri və digər skan cihazlarını idarə edən və şəkillərin toplanması və təqdim edilməsini asanlaşdıran kompüterə birləşdirilən lazer istifadə olunur. Alınan məlumatlar rəqəmsal daşıyıcılarda saxlanılır və ya sistemin özündə, ya da başqa bir kompüterdə çoxsaylı proqram paketlərindən istifadə etməklə emal edilə bilər.
LSCM-nin dizaynına görə, işıqlandırma və siqnal qəbulu (qeydiyyat) nümunədə diffraksiya həddi olan bir nöqtə ilə məhdudlaşır. Mikroskop linzaları işıqlandırma nöqtəsini diqqət mərkəzinə gətirir və skan cihazı kompüterin nəzarəti altında bu nöqtə ilə nümunəni skan edir. Nümunənin işıq saçan nöqtələrindən gələn siqnallar sancaq dəliyindən (və ya bəzi hallarda yarıqdan) diafraqma vasitəsilə fotoçoxaltıcı boruya daxil olur və fotoçoxaldan çıxan siqnallar şəkilə çevrilir və kompüter tərəfindən vizual olaraq təkrar istehsal olunur. Ləkələnməmiş nümunələr nümunədən əks olunan işıqla müşahidə olunsa da, onlar adətən bir və ya bir neçə flüoresan boya ilə boyanır. 1990-cı illərdə ədəbiyyatda təsvir edilən ən çox yayılmış LSCM-lərdən biri bioloji tədqiqatçıların üzləşdiyi fundamental problemə cavab olaraq hazırlanmışdır. İmmunofluoressensiya ilə boyanmış embrionlardakı bir çox strukturları və fərdi makromolekulları iki hüceyrəli mərhələdən sonra ənənəvi epiflüoresan mikroskopla görmək mümkün deyil, çünki hüceyrələrin sayı artdıqca embrionun həcmi təxminən eyni qalır. Bu o deməkdir ki, hüceyrələrin daha sıx düzülüşü ilə fokus müstəvisindən kənarda olan hüceyrələrdən gələn lüminesans artır və bu, təsvirin qətnaməsinin pisləşməsinə səbəb olur.
düyü. 6. Nikon lazer skan edən konfokal mikroskop konfiqurasiyası
Bu problem üzərində işləyən bir qrup tədqiqatçı aşkar etdi ki, o zaman mövcud olan konfokal sistemlərdən heç biri onların tələblərinə cavab vermir. O zaman səhnə skan edən mikroskoplar çox yavaş idi. Tək təsvirin yaradılması təxminən 10 saniyə çəkdi və çox şüalı skan alətləri flüoresan görüntüləmə üçün hələ praktik deyildi. LSCM ənənəvi epiflüoresan mikroskopiya tələblərinə cavab vermək üçün nəzərdə tutulmuşdur və eyni zamanda inkişaf etdirilən digərləri ilə birlikdə müxtəlif şirkətlər tərəfindən biotibbi ictimaiyyətə təklif olunan kompleks sistemlərin prototipinə çevrilmişdir. Bu gün istifadə olunan sistemin nümunəsi (Nikon E1000) Şəkil 6-da göstərilmişdir.
Xüsusi hazırlanmış cihazlarda optik kəsiklərin qalınlığı fotodetektorun qarşısındakı sancaq dəliyinin diametrinin dəyişməsi ilə dəyişə bilər. Sabit sancaq ölçüsü ilə digər dizaynlarla müqayisədə, bu əlavə xüsusiyyət bioloji strukturların təsviri zamanı olduqca çevikdir. Nümunənin skan edilmiş sahəsini azaltmaqla və skan edilmiş məlumatı saxlama və vizual təqdimat üçün eyni ölçülü məlumat massivinə yerləşdirməklə təsviri qətnamə itirmədən böyütmək olar (böyütmə skan edən elektron mikroskopda oxşar şəkildə dəyişir) . Bu, tək linzaya böyütmə intervalı verir ki, bu da linzaları dəyişdirərkən qaçırıla və ya itirilə bilən nadir və ya müvəqqəti hadisələri vizuallaşdırarkən çox faydalı ola bilər.
İndi münasib qiymətlərlə kommersiya baxımından təklif olunan LSCM-nin mürəkkəb və çevik imkanları ilə son illərdə konfokal mikroskopiya populyarlıq qazandı və bir çox çox istifadəçili laboratoriyalar bu avadanlığı elektron mikroskoplar əvəzinə seçdilər. Konfokal mikroskopiyanın üstünlüyü ənənəvi optik mikroskopiya üçün hazırlanmış nümunələrin yüksək keyfiyyətli şəkillərinin əldə edilməsinin nisbi asanlığı və tədqiqatın müxtəlif sahələrində geniş tətbiq imkanlarıdır.
LSCM-lərin birinci nəsli sabit nümunələrlə yaxşı işləyirdi, lakin onlar lazerlərin işıq enerjisinə nəzarət edə bilmədilər, bu da ciddi ehtiyat tədbirləri görülmədikdə canlı nümunənin çox vaxt ölümcül məhvinə səbəb olurdu. Bu məhdudiyyətlərə baxmayaraq, qeydə alınan nümunələrin şəkilləri o qədər yüksək keyfiyyətli idi ki, konfokal yanaşma mütəxəssislər tərəfindən qeyd-şərtsiz qəbul edildi. Sonrakı nəsil alətlər görüntüləmə prosesinin bütün aspektlərini təkmilləşdirdi. Bundan əlavə, yeni cihazlar daha erqonomik və istifadəsi daha asan oldu, beləliklə, kompüterdən istifadə edərək tənzimləmələr, filtr birləşmələrini dəyişdirmək və lazer gücünü tənzimləmək daha asan və daha sürətli oldu. İndi üç flüoroxrom ilə eyni vaxtda və daha çox ardıcıllıqla şəkil çəkmək mümkündür. Təkmilləşdirilmiş və daha etibarlı proqram təminatı, daha sürətli kompüterlər, daha böyük disklər və təsadüfi giriş saxlama cihazlarının ucuzlaşması sayəsində təsvirin işlənməsi də əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmişdir.
Təsvir rejimləri
Konfokal mikroskopun əsas tətbiqi müxtəlif növ qalın nümunələrin şəkillərini əldə etməkdir. Konfokal metodun üstünlüyü yüksək dəqiqlik və qətnamə ilə fərdi optik bölmələrin ardıcıllığı kimi nümunənin şəkillərini yaratmaq qabiliyyətindən qaynaqlanır. Bu halda, bir neçə vizuallaşdırma rejimi istifadə olunur; Onların hər biri təsvirin əsas vahidi kimi optik dilimə əsaslanır.
düyü. 1. Üç işarə ilə etiketlənmiş optik bölmələr
Fərdi optik bölmələr
Optik bölmə konfokal mikroskopiya üsullarında əsas görüntüləmə vahididir. Bağlanmış və ləkələnmiş nümunələrin şəkilləri tək, ikili, üçlü və çox dalğa uzunluğunda işıqlandırma rejimlərində əldə edilə bilər, çoxrəngli nümunələrin təsvirləri isə bir-biri ilə birləşdiriləcək (adekvat xromatik aberasiya korreksiyası olan linzalar istifadə edilərsə). Əlavə qeydiyyat adətən rəqəmsal təsvirin emal üsullarından istifadə etməklə həyata keçirilir. Əksər lazer skan edən konfokal mikroskoplar (LSCMs) optik bölmə əldə etmək üçün təxminən 1 saniyə tələb edir, baxmayaraq ki, siqnal-küy nisbətini yaxşılaşdırmaq üçün bir çox optik bölmələrdən olan şəkillər adətən orta hesabla götürülür. Şəkli əldə etmək üçün lazım olan vaxt, əlbəttə ki, təsvirin piksel ölçüsündən və sistem kompüterinin sürətindən asılıdır. Tipik 8 bitlik 768x512 piksel təsviri saxlamaq üçün təxminən 0,3 Mbit yaddaş tələb olunacaq.
Şəkil 1-də göstərilən optik kəsiklər eyni vaxtda şüalanma mənbəyi kimi tək kripton/arqon lazerindən istifadə etməklə üç müxtəlif dalğa uzunluğunda (488, 568 və 647 nanometr) həyəcan işığı ilə əldə edilmişdir. Nümunə olaraq, qanadın formalaşmasında iştirak edən üç genin etiketləndiyi üçüncü mərhələdəki Drosophila qanadının xəyali diski təqdim olunur. Təqdim olunan üç gen və müvafiq flüoroxrom etiketləri bunlardır: (a) vestigial (flüoresan - 496 nanometr); (b) qanadsız (lissamin rodamin - 572 nanometr); və © CiD (siyanin 5 - 649 nanometr). Qanadı meydana gətirən üç məkanda təmsil olunan gen sahəsinin birləşdirilmiş təsviri sağ altda yerləşir (şəkil (d)).
Müəyyən bir vaxt intervalında qeyd etmək və canlı hüceyrəni vizuallaşdırmaq
Canlı hüceyrələrin vaxtaşırı tədqiqatları LSCM-nin artan həlli sayəsində yeni təkan qazandı. Əvvəllər hüceyrə strukturlarının hərəkətlərinin tədqiqi 16 mm-lik fotoplyonka və kameraya qoşulmuş saat mexanizmi olan intervalölçən, daha sonra isə time-lapse funksiyalı videoregistrator, optik disk yazıcı və ya video rəqəmsallaşdırma lövhəsindən istifadə etməklə aparılırdı. . İndi LSCM-dən istifadə edərək, real vaxt rejimində müəyyən, əvvəlcədən təyin edilmiş intervallarda optik bölmələri əldə etmək mümkündür.
LSCM-dən istifadə edərək canlı toxumanın təsviri bağlı nümunələrin görüntülənməsindən qat-qat çətindir və həmişə praktiki deyil, çünki nümunə baxış şərtlərinə tab gətirə bilməz. Cədvəl 1 LSCM istifadə edərək canlı və əlaqəli hüceyrələri müşahidə edərkən nəzərə alınmalı olan bəzi amilləri ümumiləşdirir. Bəzi nümunələri mikroskop səhnəsinə yerləşdirmək sadəcə olaraq fiziki olaraq qeyri-mümkündür və ya onlar bütün müşahidə müddəti ərzində orada sağ qala bilməyəcəklər. Tədqiq olunan fenomen və ya quruluş linzanın görmə sahəsində olmaya bilər. Məsələn, Drosophila qanadının xəyali diskləri sürfədə müşahidə edilə bilməyəcək qədər dərin inkişaf edir; parçalandıqdan sonra isə mədəniyyətdə inkişaf edə bilmirlər. Buna görə də, bu gün bu tip toxumalarda gen ifadəsini müşahidə etmək üçün yeganə mövcud üsul, inkişafın müxtəlif mərhələlərində nümunələrdən götürülmüş larvaları parçalamaq, bağlamaq və ləkələməkdir.
Cədvəl 1. LSCM istifadə edərək bağlı və canlı hüceyrələrin müşahidəsi
Canlı hüceyrələrin uğurlu müşahidəsi və təsviri bütün proses boyunca həddindən artıq qayğı tələb edir. Lazer şüasının şüalanması nəticəsində hüceyrəyə dəyən zərər təkrar skan zamanı toplana bilər, ona görə də bu məruz qalma minimum lazımi və görüntü əldə etmək üçün kifayət qədər saxlanılmalıdır. Antioksidantlar, məsələn, askorbin turşusu, flüoresan molekulları həyəcanlandırma işığı ilə şüalandıqda sərbəst buraxılan oksigeni azaltmaq və hüceyrələri öldürən sərbəst radikalların meydana gəlməsini təşviq etmək üçün mədəniyyət mühitinə əlavə edilir. Şüalanmanın fluoressensiya ilə boyanmış hüceyrələrə təsirini qiymətləndirmək üçün adətən geniş ilkin nəzarət təcrübələri aparmaq lazımdır, bütün görüntüləmə parametrlərinin aparılan müşahidələrə uyğun olmasını diqqətlə təmin etmək lazımdır. Test şəkillərindən sonra canlı nümunələrin canlılığı qiymətləndirilməlidir. Məsələn, embrionlar müşahidə prosesi boyu normal inkişaf etməyə davam etməlidirlər, ona görə də radiasiyaya məruz qalma və ya flüoroxromlar nəticəsində yaranan hər hansı anormallıqlar aşkar edilməlidir. Şəkil 2-də kalsium yaşılı ilə floresan rəngə boyanmış Drosophila embrionunun vaxtaşırı fotoşəkili göstərilir. Bir sıra şəkillər zamanla flüoresan parıltının paylanmasında dəyişiklikləri göstərir.
Hər bir hüceyrə növü müşahidə zamanı həyat qabiliyyətini qorumaq üçün öz tədbirləri tələb edir. Bəzi həşərat hüceyrələri üçün otaq temperaturunun saxlanılması və kifayət qədər böyük həcmdə uyğun mühitin olması kifayətdir. Bununla belə, əksər hüceyrə növləri səhnədə olarkən düzgün karbon dioksid balansını saxlamaq üçün qızdırılan mərhələ və bəzən perfuziya kamerası tələb edir. LSCM-dən istifadə edərək müşahidə şərtlərinin ən az “düşmən” olduğu hüceyrələrin növünün seçilməsi bir çox eksperimental problemlərdən qaçmağa kömək edəcəkdir. Müasir konfokal alətlərdəki təkmilləşdirmələr potensial problemlərin əhəmiyyətli dərəcədə azalması ilə nəticələndi. Artan kvant səmərəliliyi, obyektlərin daha böyük ədədi aperturası (parlaqlığı) və daha az zəhərli hüceyrə boyalarının istifadəsi konfokal mikroskopiyanın canlı hüceyrələrin təhlili üçün praktiki üsula çevrilməsinə səbəb oldu. Daha az gücə malik lazerlərdən istifadə etməyə çalışmaq lazımdır, eyni zamanda təsvirin alınması və işlənməsinin mümkün qədər tez həyata keçirilməsinə imkan verir. Şəklin əldə edilməsini və qeydə alınmasını sürətləndirmək üçün sancaq deşik aperturası artırılsa (cansız nümunələri müşahidə etməklə müqayisədə), sonrakı dekonvolyutsiya bəzən itirilmiş görüntü keyfiyyətini bərpa edə bilər.
düyü. 2. Verilmiş vaxt intervalında çəkiliş
Bir çox fizioloji proseslər və hadisələr görüntüləmə üçün saniyədə orta hesabla bir şəkil olan əksər LSCM-lər tərəfindən tutula bilməyəcək qədər tez baş verir. Akusto-optik cihazlardan və yarıq diafraqmalardan istifadə edən LSCM-lər galvanometrlə həyəcanlanan nöqtə skan sistemlərindən daha sürətlidir və fizioloji tədqiqatlar üçün daha praktikdir. Bu daha sürətli quraşdırmalar yaxşı məkan və müvəqqəti ayırdetməni birləşdirir, tam ekran həllində saniyədə 30 kadr və ya video təsvir sürətinə yaxın ola bilər. Daha yavaş pinhole scanning mikroskoplarında müvəqqəti ayırdetmə yalnız nümunənin skan sahəsini azaltmaqla artırıla bilər. Tam məkan ayırdetmə tələb olunarsa, kadr sürəti azaldılmalıdır ki, bu da müvəqqəti ayırdetmə qabiliyyətinin itirilməsi ilə nəticələnir. Disk və ya salınan güzgü taramasından istifadə edən konfokal sistemlər həmçinin sürətli fizioloji prosesləri və ya digər keçici hadisələri təsvir etmək qabiliyyətinə malikdir.
Z seriyası və 3D şəkillər
Z seriyası optik oxa perpendikulyar müstəvidə müxtəlif səviyyələrdə götürülmüş nümunənin optik kəsiklərinin ardıcıllığıdır (z oxu). Z seriyalı şəkillər mikroskopun incə fokusunda addım-addım dəyişiklikləri uyğunlaşdırmaqla və sonra hər addımda bir şəkil əldə etməklə əldə edilir. Addım-addım fokus hərəkəti adətən kompüter tərəfindən idarə olunan pilləli mühərrik tərəfindən həyata keçirilir ki, bu da diqqəti əvvəlcədən müəyyən edilmiş miqdarda dəyişir. Kompüter makro proqramından istifadə edərək, siz şəkil əldə edə və saxlaya, mikroskopun fokusunu nümunədə müəyyən bir dərinliyə çevirə, ikinci şəkli əldə edib saxlaya, yeni müstəvidə yenidən fokuslana və proqramlaşdırılmış şəkillərin sayı əldə olunana qədər davam edə bilərsiniz. .
İstədiyiniz şəkillər nümunənin seçilmiş sahəsini çəkməklə əldə edilən z seriyasından götürülə bilər və xüsusi maraq doğuran hüceyrələrin sonrakı təfərrüatlı tədqiqi üçün xüsusi proqram təminatı ilə işlənə bilər. Z seriyasını Şəkil 3-də olduğu kimi şəkillərin fotomontajı kimi təsəvvür etmək olar. Şəkillərin bu cür kombinasiyası və nümayişi, eləcə də bir çox başqa təsvir manipulyasiyaları müasir təsvirin manipulyasiya proqram paketlərinin standart xüsusiyyətidir. Şəkil 3-dəki şəkillər daha tez-tez z-addımları olan daha böyük seriyadan seçilmişdir. Yaşıl parıltı 22C10 antikoru ilə ləkələnmiş Drosophila embrionunun periferik sinir sistemini müəyyən edir.
düyü. 3. Optik bölmələrin Z seriyası
LSCM tərəfindən hazırlanmış bir nümunənin bir neçə yüz optik bölməsindən bir-birinə bağlı strukturların bütün kompleksi haqqında fikir əldə etmək çətin ola bilər. Bununla belə, qeydiyyatdan keçdikdən sonra z seriyası həcmli təsvir üsullarından istifadə edərək nümunənin sonrakı üçölçülü təsviri üçün ideal materialdır. Bu yanaşma indi tibb və biologiyada toxuma strukturu və funksiyası arasındakı əlaqəni aydınlaşdırmaq üçün geniş istifadə olunur. Fokus dəyişdirən motorun addımı ilə müəyyən edilən düzgün nümunə z-scan addımını təyin etmək vacibdir; bu halda şəkil nümunənin faktiki dərinliyini əks etdirəcək.
Nümunə müşahidə edilərkən stasionar qaldığı müddətcə LSCM tərəfindən hazırlanmış z seriyalı təsvirlər mükəmməl şəkildə qeydə alınacaq və rəqəmsal olaraq saxlandıqda, onlar nisbətən asanlıqla nümunənin 3D təsvirinə çevriləcəklər. Şəkil 4 tək optik bölməni (a) z seriyası proyeksiyası (b) ilə müqayisə edir və 22C10 antikoru ilə etiketlənmiş Drosophila embrionunun periferik sinir sisteminin təsvirində bu texnikanın dəyərini göstərir.
Mikroskop operatoru tərəfindən təyin olunan pilləli motorun hündürlüyü optik bölmənin qalınlığı ilə bağlıdır, lakin başqa dəyərlər də ola bilər. Optik hissənin qalınlığı mikroskop vasitəsilə müşahidə edilən nümunə hissəsinin qalınlığına bağlıdır və linzadan və pin deşik diafraqmasının diametrindən asılıdır. Bəzi hallarda isə fokus hündürlüyü optik dilimin qalınlığı ilə eyni ola bilər və bu, çaşqınlığa səbəb ola bilər.
Z seriyalı fayl qəbul edildikdən sonra konfokal şəkilləri emal etmək üçün xüsusi olaraq hazırlanmış 3D rekonstruksiya proqramı tərəfindən işlənmək üçün göndərilir. Bu cür proqramlar qrafik stansiyalarda istifadə edildikdə olduqca sürətlidir, lakin kifayət qədər sürətli prosessor və böyük RAM ilə fərdi kompüterdə və ya konfokal mikroskopun özünün qrafik stansiyasında uğurla istifadə edilə bilər. Bu proqramlardan istifadə etməklə siz həm nümunənin fərdi üçölçülü təsvirlərini, həm də bir-birini əvəz edən, müxtəlif növ nümunələrdən ibarət olan, fırlanma və ya digər məkan çevrilmələrinin effektini yaradan və nümunənin daha yaxşı qavranılmasını təmin edən təsvirlər ardıcıllığını yarada bilərsiniz. nümunənin üçölçülü xüsusiyyətləri. Proqram uzunluğu, dərinliyi dəyişməyə, həcm ölçmələr aparmağa, həmçinin nümunənin müxtəlif səviyyələrində müxtəlif strukturları vurğulamaq üçün nümunənin şəffaflığı kimi xüsusi təsvir parametrlərini interaktiv şəkildə dəyişməyə imkan verir.
düyü. 4. Optik bölmə və z seriyası proyeksiyası
Müəyyən bir zaman intervalında əldə edilmiş şəkillər ardıcıllığından götürülmüş bir sıra optik dilimləri təmsil etməyin başqa bir yolu, z oxunun zaman oxu funksiyasına malik olduğu üçölçülü təsvirdir. Bu yanaşma orqanizmin inkişafı zamanı fizioloji dəyişikliklərin vizuallaşdırılmasında faydalıdır. Bu metodun tətbiqinə misal olaraq dəniz kirpisi embrionlarının inkişafı zamanı kalsium konsentrasiyasının dəyişmə dinamikasının aydınlaşdırılması göstərilmişdir. Müxtəlif dərinliklərdə çəkilmiş optik bölmələrin rəng kodlaması 3D verilənləri təmsil etməyin sadə üsuludur. Təcrübədə nümunənin müxtəlif dərinliklərində çəkilmiş hər bir optik hissəyə rəng (adətən qırmızı, yaşıl və ya mavi) təyin edilir və daha sonra rəngli təsvirlər birləşdirilir və təsvirin işlənməsi proqramı vasitəsilə rənglərin dəyişdirilməsi ilə istənilən effekt əldə edilir.
4D Görüntü
LCSM ilə canlı toxumalarda və ya canlı toxuma mədəniyyətlərinin hazırlanması zamanı baş verən və müəyyən bir zaman intervalında çəkilmiş şəkillər ardıcıllığında əks olunan dinamik hadisələr dördüncü ölçü kimi zaman olmaqla, dörd ölçüdə təmsil oluna bilər. Müntəzəm fasilələrlə əldə edilən Z seriyası dördölçülü məlumat dəstləridir: üç məkan ölçüsü (x, y və z) və dördüncü kimi vaxt, 4D görüntüləyicidən istifadə etməklə müşahidə edilə bilər. Bu cür proqramlar sizə film kimi zamanın müxtəlif nöqtələrində çəkilmiş stereo cütləri tərtib etməyə və oynatmağa və ya alternativ olaraq, redaktə edilmiş film kimi müxtəlif vaxtlarda çəkilmiş rekonstruksiya edilmiş üçölçülü şəkilləri emal etməyə və təqdim etməyə imkan verir.
X-Z şəkilləri
Nümunənin yanal görünüşü istəsəniz, məsələn, epitel təbəqəsi vasitəsilə şaquli bir hissə, x-z bölməsi iki üsuldan biri ilə edilə bilər. Nümunənin tək xətti (x oxu) boyunca müxtəlif dərinliklərdə (z oxu) skan etməklə, pilləli mühərriklə fokus dəyişikliyinə nəzarət etməklə və sonra bütün dilimlər seriyasını vahid bir xəttdə birləşdirməklə yan görünüş əldə edilə bilər. şəkil. Başqa bir üsul, yan görünüşün mövcud z seriyalı optik dilimlərdən çıxarıldığı 3D göstərmə proqramında bölmə müstəvisi seçimindən istifadə etməkdir. Şəkil 5-də kəpənək qanadının epitelini təsvir edərkən, lazer nümunəyə müxtəlif z-koordinatlarında və ya dərinliklərində nüfuz edən bir xətt (soldakı üfüqi qara xətt) boyunca skan edildi. Şəkil 5-də göstərilən x-z təsviri konfokal görüntüləmə sistemi tərəfindən yaradılmış və təqdim edilmişdir. Qanad epiteli iki epitel təbəqəsindən ibarətdir, lakin lazer şüasının nümunəyə nüfuz etmə dərinliyi artdıqca flüoresans intensivliyi azaldığından yalnız yuxarı təbəqə aydın şəkildə görünür.
düyü. 5. X-Z müstəvisində şəkil
Yansıtılan işıqda görüntü yaratmaq
Bütün erkən konfokal mikroskoplar əks olunan və ya geri səpələnmiş işıqda işləyirdi. Yansıtılan işıqdan istifadə edərək, bir çox nümunə konfokal mikroskopiyada ləkəsiz müşahidə edilə bilər və ya onlar immunoqold və ya gümüş halid mikrokristalları kimi yüksək əks etdirən boyalarla etiketlənə bilər. Xüsusilə canlı toxuma üçün əks olunan işıq müşahidələrinin üstünlüyü nümunənin fotoağartmaya məruz qalmamasıdır. Ancaq bəzi boya növləri lazer şüasını zəiflədə bilər. Digər potensial problem, bəzi mikroskopların optik şüa yolu boyunca optik elementlərdən daxili əks oluna bilməsidir. LSCM-lərin və yarıq-diafraqma LSCM-lərin çox şüa versiyaları üçün əks olunan işıq problemi mövcud deyil və belə olan mikroskoplarda polarizatorların istifadəsi, artefaktsız sahələrin təsviri və optik oxdan ofsetin göstərilməsi problemi azaltmağa kömək edir.
Köçürülən işıq görüntüləmə
Mikroskopiyada geniş istifadə olunan ötürülən işıq görüntüləmə rejimlərindən hər hansı biri faza kontrastı, diferensial müdaxilə kontrastı (DIC), qaranlıq sahə və ya qütblü işıq daxil olmaqla LFCM-də istifadə edilə bilər. Nümunədən keçən işıq ötürülən işıq qəbuledicisinə dəyir, onun siqnalı fiber-optik işıq bələdçisi vasitəsilə mikroskopun skan edən başındakı fotoçoğaltıcılardan birinə göndərilir. Keçirilmiş işıq və konfokal epiflüoresan şəkilləri eyni işıqlandırıcı şüadan istifadə etməklə eyni vaxtda çəkilə bilər, bu da dəqiq qeydiyyatı təmin edir. Müvafiq proqram təminatından istifadə edərək şəkilləri birləşdirərək və ya sintez edərək, toxumada etiketlənmiş hüceyrələrin dəqiq yerini əks etdirmək olar. Bəzi tədqiqatlar aşağıdakı mənalı yanaşmanı təklif edir: qeyri-konfokal ötürülən işıq şəklini eyni nümunədən etiketlənmiş hüceyrələrin bir və ya daha çox konfokal flüoresan təsvirləri ilə birləşdirin. Bu yanaşma, məsələn, bir neçə saat və ya hətta il ərzində etiketlənməmiş hüceyrələrin populyasiyası daxilində etiketlənmiş hüceyrələrin subpopulyasiyasının miqrasiyasının məkan və müvəqqəti aspektlərini müəyyən etməyə imkan verəcəkdir.
Bu gün, bəzi rəqəmsal rəngli kameralarda edilənlərə bənzər həqiqi rəngli görüntü yaratmaq üçün qırmızı, yaşıl və mavi (RGB) ilə ötürülən siqnalları qəbul edən rəngli ötürülən işıq qəbuledicisi artıq geniş şəkildə istifadə olunur. Belə bir qəbuledici, ötürülən işıq altında toxumada faktiki rəngləri müntəzəm olaraq müşahidə edən və bu təsvirləri analiz üçün floresan məlumatları ilə örtən patoloqlar üçün xüsusilə faydalıdır.